酒曲根霉糖化性质的研究
收稿日期:2002-09-07.
作者简介:田国政(1964-),男(土家族),实验师,主要从事食品生化的研究.
酒曲根霉糖化性质的研究
田国政
(湖北民族学院园艺系,湖北恩施445000)
摘要:研究了Rhiz op us 34产生糖化酶、液化酶、蛋白酶的最佳培养条件.利用Rhiz op us 34制曲的最佳培养时间为3~4d;在制曲过程中添加5%~10%的玉米粉能显著提高3种酶的活性;制曲和糖化过程中产生3种酶的最佳pH 为5.8;3种酶的最佳作用pH 值范围为4.6~5.2.关键词:酒曲;根霉;糖化性质
中图分类号:T S261.1+2 文献标识码:A 文章编号:1008-8423(2003)02-0019-03
目前在我国的许多地区的一些小型酒厂仍然沿袭传统工艺,以玉米为原料生产小曲白酒,生产成本高,出酒率低,技术落后.随着酿造技术的改进和纯种根霉酒曲的使用,少数酒厂使用了根霉酒曲,出酒率有了较大幅度的提高,由于市场上酒曲质量不稳定,给许多酒厂造成了人力、物力、资源的损失和浪费.为此笔者考察了湖北省恩施自治州的5个酒曲厂,对其生产的酒曲进行了糖化能力的分析,结果表明各厂生产的酒曲质量差异较大,通过对不同酒曲中的根霉菌分离纯化得到14个菌株,分析比较它们的糖化能力发现差异更大.认为造成酒曲质量不稳定的原因是由于根霉菌种在长期使用过程中严重衰退而引起的.因而笔者对这些酒曲中的根霉进行了提纯复壮工作,通过大量的筛选比较得到了糖化能力较强的Rhiz op us 34,并对它的最佳糖化条件进行了初步研究.
1 材料与方法
1.1 菌株
Rhiz op us 34由恩施州5个酒曲厂提供酒曲,通过分离、纯化、筛选、比较而得,现存于湖北民族学院生物科学与技术学院微生物实验室.1.2 培养基
(1)PDA 培养基:马铃薯200g,蔗糖20g,水1000ml,pH 自然.
(2)发酵培养基:250ml 三角瓶装入10g 麸皮,加入12ml 蒸馏水,润料1h,灭菌(121 ,40min)后迅速摇散.
(3)不同质量分数的玉米粉培养基:在发酵培养基中分别加入5%、10%、15%、20%、25%、30%、50%的玉米粉.灭菌(121 ,40min)后迅速摇散.
(4)不同pH 值的培养基:分别配置不同浓度的Na 2HPO 4-柠檬酸缓冲液[1]pH 值范围是3.4,4.0,4.6,5.2,5.8,6.4,7.0,杀菌(121 ,40min)后迅速摇散.1.3 方法
(1)Rhizopus34的孢子悬液的制备:将其接种于PDA 培养基上,25 培养3d,加入20ml 无菌水,制备接种用的孢子悬液.
(2)不同发酵时间的样品制备:取孢子悬液0.5ml 接种于发酵培养基中,摇匀,30 培养2、3、4、5、6、7、8d 得鲜曲,测定糖化酶、液化酶、蛋白酶活性.
(3)不同玉米粉浓度发酵样品的制备:取孢子悬液0.5ml 接种于玉米粉培养基中,摇匀30 培养4d 得
第21卷第2期2003年6月湖北民族学院学报(自然科学版)
Journal of Hubei Institute for Nationalities(Natural Science Edition)Vol.21 N o.2
Jun.2003
20湖北民族学院学报(自然科学版)第21卷
鲜曲,测定糖化酶、液化酶、蛋白酶活性.
(4)不同pH值培养基发酵样品制备:取孢子悬液0.5ml接种于不同pH值培养基中,摇匀,30 培养4 d得鲜曲,测定糖化酶、液化酶、蛋白酶活性.
(5)粗酶液提取:取1g鲜曲,加入20ml蒸馏水,40 水浴1h(间隔4~5min搅拌一次),用纱布过滤得粗酶液.
1.4 酶活力测定
液化酶和糖化酶的活力测定按文献[2]方法进行.
不同反应pH值条件下糖化酶、液化酶活力测定:用发酵培养基将Rhizopus34培养4d得鲜曲,提取粗酶液,按pH值3.4、4.0、4.6、5.2、5.8、6.4、7.0的Na2H PO4-柠檬酸缓冲液分别配制1.33%的可溶性淀粉液,测定糖化酶、液化酶活力.
蛋白酶活力测定按文献[3]方法进行.
1.5 标准曲线制作
葡萄糖标准曲线制作按文献[2]方法进行,得回归方程A=0.71775C+0.01024(相关系数r=0.9970).
酪氨酸标准曲线按文献[3]方法制作,得回归方程A=0.0019205C-0.0051859(相关系数r=0.9996).
2 结果与分析
2.1 培养时间对Rhizopus34酶活性的影响
不同培养时间对Rhizop us34酶活性的影响见表1.从表1可看出Rhizopgus34的糖化酶、液化酶、蛋白酶酶活性最高的最佳培养时间分别为3~4d、3~5d、3~4d,3种酶活性最高时其培养时间为3~4d.培养5d后,随培养时间的延长,糖化酶、液化酶活性急剧下降.但蛋白酶在培养6d后有所回升.
表1 不同培养时间对Rhizop us34酶活性的影响
Tab.1 T he effect of di fferent culturing time on the enzyme activity of Rhiz op us34
时间/d2345678
糖化酶/ 102mol min-1 4.47 6.257.46 4.79 3.28 2.35 3.15
液化酶/ 102mol min-1 1.43 3.72 3.01 2.77 1.26 1.040.46
蛋白酶/ 102mol min-1 1.56 1.86 1.81 1.560.93 1.68 2.40
2.2 玉米粉的质量分数对Rhiz opus34酶活性的影响
不同玉米粉的质量分数对Rhizop us34酶活性的影响见表2.从表2可看出在制曲的过程中加入5%~10%的玉米粉能显著的提高3种酶的活性,但当玉米粉的质量分数超过15%后,对于糖化酶、液化酶的产生和活性影响不大.
表2 不同玉米粉浓度对Rhiz op us34酶活性的影响
Tab.2 T he effect of different consistencies of powdered maize on the enzyme activity of Rhiz op us34
玉米粉的质量分数/%05101520253050糖化酶/ 102 mol min-1 4.418.629.968.18 5.24 5.40 5.30 5.25液化酶/ 102 mol min-1 3.12 4.27 3.91 3.92 3.12 2.95 3.40 2.85蛋白酶/ 102 mol min-1 1.83 2.65 3.06 3.12 2.81 2.47 2.57 2.04
2.3 pH值对Rhizop us34酶活性的影响
(1)不同pH值培养基对Rhiz o p us34酶活性的影响见表3.
表3 不同p H值培养基对Rhiz op us34酶活性的影响
Tab.3 T he effect of acltues different p H on the enzyme activity of Rhiz op us34
p H值 3.4 4.0 4.6 5.2 5.8 6.47.0糖化酶/ 102 mol min-10.96 1.03 1.31 1.59 1.57 1.20 1.07
液化酶/ 102 mol min-1 1.02 1.060.84 1.19 1.140.740.81
蛋白酶/ 102 mol min-10.950.88 1.05 1.47 2.38 1.150.89
从表3可看出Rhiz o p us34产生糖化酶和液化酶的最适pH值为5.2~5.8,产生蛋白酶的最适pH值为5.8,
因而认为在制曲和糖化过程中将pH 值调节至5.8,有利于3种酶的产生和活性的提高.
(2)不同反应pH 值条件对Rhizopus 34酶活性的影响见表4.
表4 不同反应p H 值条件对Rhiz op us 34糖化酶、液化酶活性的影响
Tab.4 T he effect of different pH on the culivity sacchridase and a-amylase produced by Rhizopus 34p H 值
3.4
4.0 4.6
5.2 5.8
6.4
7.0糖化酶/ 102 mol min -1 1.65
1.66
2.95 1.77 1.18 1.090.14液化酶/ 102 mol min -1
0.00
0.61
0.72
1.24
0.93
0.35
0.00
从表4可见Rhizop us 34产生的糖化酶在pH 值3.4~5.2的范围内活性较高,最适反应pH 值为4.6.液化酶在pH 值4.6~5.8的范围内活性较高.适合于两酶反应的最适pH 值为4.6~5.2.
3 结论与讨论
结果表明,Rhizop us 34制曲的最佳培养时间为3~4d;在制曲的过程中添加5%~10%的玉米粉能显著提高3种酶的酶活性;制曲和糖化过程中产生3种酶的最适pH 值为5.8;糖化淀粉的最适pH 值范围为4.6~5.2.但是,有人发现不同物质不同的质量分数调节pH 值对酶活力的影响较大[4],其调节物质的选择,对pH 值影响的作用机理有待于进一步研究.参考文献
[1]袁晓化,杨中权.植物生理实验[M ].北京:高等教育出版社,1993.
[2]刘红,潘红春,丁洪,等.核酸酶P 1固定化研究[J].食品与发酵工业,1994(4):42~46.[3]中山大学生物系生化微生物教研室.生化技术导论[M ].北京:人民出版社,1978.[4]吴东儒.糖类的生物化学[M ].北京:高等教育出版社,1987.326.
S tu dy on Saccharfing C haracteristics of Yeast S tarter Rhizopus 34
TIAN Guo-zheng
(Hubei Institute for Nationalities,Enshi 445000,China)
A bstract:The optimal culture condition of Rhizopus 34produced saccharidase,a-amylase and proteinase was reported in this paper.The optimal culture time to make use of Rhizop us 34in producing leaven was 3~4days.5%~10%of pow dered-maize in medium c ould obviously enhance the ac tivity of saccharidase,a-amylase and proteinase.The optimum pH of producing saccharida se,a-amylase and proteinase in producing leaven and saccharifing was 5.8.The optimum pH range of the reaction of sac charidase,a-amylase and proteinase was 4.6~5.2.Key w ords:yeast starter Rhizop us ;Saccharfing;characteristics
21
第2期田国政:酒曲根霉糖化性质的研究