乳酸菌抗氧化特性和耐酸耐胆盐特性的研究
安徽农业大学
硕士学位论文
乳酸菌抗氧化特性和耐酸耐胆盐特性的研究
姓名：周晓莹
申请学位级别：硕士
专业：微生物学
指导教师：张明; 陈晓琳
2011-06
乳酸菌在发酵过程中能产生超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶、过氧化氢酶及NADH氧化酶，这使得乳酸菌具有防癌能力及提高机体免疫力的能力。含有乳酸菌的微生态制剂在养殖业、乳制品及医药等方面有着广泛的应用。本文重点研究三株乳酸菌的抗氧化性及耐胆盐、耐酸特性。
本实验研究超声波破粹仪处理的样品与未处理样品的抗氧化性。首先，采用脱氧核糖氧化法测定各样品对·OH的消除率。在60mmol/L 2-脱氧-D-核糖的体系中，菌株1以处理的发酵液对·OH的消除率最强，最高消除率为83. 4%，其他两株菌在本实验中对·OH无清除作用。
再次，采用邻苯三酚氧化法测定各样品对O2·的消除率。在2. 5mmol/L邻苯三酚的体系中，菌株1、菌株5、菌株34分别以处理的菌体、处理的发酵液及未处理的菌体对O2·的消除率最高，最高消除率分别为96. 5%、86. 3%及88. 8%。
在0. 12mmol/L DPPH的体系中，菌株1、菌株5、菌株34分别以处理的上清液、未处理的菌体及未处理的菌体对DPPH的消除率最高，最高消除率分别为82. 8%、92. 6%及70. 4%。
在抗脂质过氧化性方面，以5%亚油酸为脂质，测定各样品对亚油酸的抑制率。菌株1、菌株5、菌株34都以处理的菌体对亚油酸的抑制率最高，且抑制率分别为5. 6%、10. 1%及7. 0%。
在5% DTNB体系中，菌株1、菌株5、菌株34的无细胞提取物内TTG含量分别为5. 0×10-6mol/L，6. 6×10-6mol/L及3. 4×10-6mol/L。
采用SOD试剂盒、GSH-PX试剂盒分别测定样品内的SOD、GSH-PX含量。菌株1、菌株5、菌株34都以上清液内SOD含量最高，最高含量分别为3. 05U、3. 65 U及3. 28 U；菌株1、菌株5、菌株34分别以菌体、菌体及上清液内GSH-PX 含量最高，且最高含量分别为194. 52U、124. 68U及49. 71U。
菌株1、菌株5、菌株34在含100μg/mL胆固醇与0. 3%牛胆汁的改良MRS 培养基中，对胆固醇的去除率分别为41. 67%、17. 67%及2. 65%。
在模拟耐酸环境中，菌株5强于其他两株菌，在pH值为2的MRS培养基中，5h后菌株5的菌落数为9×108CFU/mL；在模拟耐胆盐环境中，菌株34强于其他两株菌，在0. 4%胆盐的实验组，5h后菌株34的菌落为6. 5×108CFU/mL。这两数值均高于菌株发挥有益作用的临界值（1. 0×106CFU/mL）。
关键词：乳酸菌，抗氧化性，耐受性，胆盐，酸
Lactic acid bacteria(LAB) can produce superoxide dismutase, glutathione peroxidase, catalase and NADH in the fermentation process, which makes LAB had ability of fighting against cancer and enhancing immunity. Probiotics containing LAB have a wide range of applications in breeding, dairy and pharmaceutical industries.
The anti-oxidation properties of samples treated by ultrasonic cells broken extract apparatus and untreated samples was studied. Firstly, the scavenging ratio of each samples to ·OH was mensurated by using the method of deoxyriboset. The fermentated broth after being disposed of strain 1 had the highest scavenging ratio to ·OH which was 83.4%, while the others had none.
Secondly, the scavenging ratio of each samples to O2·was measured by using the method of pyrogallol oxidation·. In the system of 2.5 mmol/L pyrogallol, broken cell treated by ultrasonic cells broken extract apparatus of strain 1, fermentation broth after being treated of strain 5, and unbroken cell of strain 34 had the highest scavenging ratio to O2·, which were 96.5%, 86.3% and 88.8%, respectively.
In the system of 0. 12 mmol/L DPPH，the highest scavenging ratio to DPPH of strain 1, strain 5, strain 34 were supernatant treated unbroken cell and unbroken cell, respectively, the highest scavenging ratios are 82.8%, 92.6% and 70.4%, respectively.
In the respect of anti-lipid peroxidizing property, the lipid was 5% linolic acid, then detect the scavenging ratio to linolic acid. The highest scavenging ratio to linolic acid of strain 1, strain 5, strain 34 were all broken cell treated by ultrasonic cells broken extract apparatus, and the scavenging ratio were 5.6%, 10.1% and 7.0, respectively.
In the system of 5 % DTNB, the contents of TTG in cell-free extracts of strain 1, strain 5, strain 34 were 5.0×10-6 mol/L, 6.6×10-6 mol/L and 3.4×10-6 mol/L, respectively.
The contents of SOD, GSH-PX in samples were detected by elisa. The highest contents of SOD of strain 1, strain 5, strain 34 were all in supernatant, the contents were 3.05 U, 3.65 U and 3.28 U, respectively; the highest contents of GSH-PX of strain 1, strain 5, strain 34 were cell, cell and supernatant, respectively, the contents were 194.52 U, 124.68 U and 49.71 U, respectively.
In the modified MRS of 100 μg/mL Cholesterol and 0.3% Oxgall, the removal ratio to Cholesterol of strain 1, strain 5, strain 34 were 41.67%, 17.67% and 2.65%, respectively.
In the simulational environment of the tolerance to acid, strain 5 was stronger than the other two strains. In the pH 2 MRS broth, the colonies of strains 5 was 9×108 CFU/mL after 5h; in the simulational environment of the tolerance to bile salts, strain 34 was stronger than the other two strains.The colonies of strains 34 was
6.5×108 CFU/mL in the group of 0.4%, Both colonies were higher than the critical value (1.0 × 106 CFU/mL)which was the bottom colonies of LAB in the intestine.
Key words:Lactic acid bacteria; anti-oxidant properties; tolerance; bile salts; acid
术语与缩略词
术语与缩略词
英文全称中文全称
g gram 克
g/mL gram/milliliter 克每毫升
min minute 分钟
μl microlitre 微升
ml milliliter 毫升
r. p. m revolutions per minute 转/分钟
BSA bovine serum albumin 牛血清白蛋白
EDTA ethylene cliamine tetraacetic acid 乙二胺四乙酸
Tris Tri(hydroxymethyl)
aminomethane 三羟甲基氨基甲烷PBS phosphate buffered saline 磷酸盐缓冲液
Delnsity 光密度OD Optical
acid 硫代巴比妥酸TBA Thiobarbituric
hydroxyanisole 丁基羟基甲苯BHT Butylated
1-dipheny-2-picrylhydrazyl radica 1, 1-二苯基苦基苯肼DPPH 1,
acid 三氯乙酸TCA Trichloroacetic
dismutase 超氧化物歧化酶SOD Superoxide
GSH-Px Glutathione peroxidase 谷胱甘肽过氧化物酶
5-二硫代二(2-硝基苯甲酸)
5, DTNB Dithio-bis-nitrobenzoic
acid
TTG Total sulfhydryl compounds 总巯基化合物
独创性声明
本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得安徽农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。
研究生签名：时间：2011 年 6 月 8 日
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研究生签名：时间： 2011 年 6 月8日
第一导师签名：时间： 2011 年 6 月8日
文献综述
1 益生菌
1. 1 益生菌的定义
益生菌（Probiotics），一词来源于拉丁文，意为“有利于生命”，由Lilly和Stillwell于1965年在Science发表研究论文时提出[1]。1989年，Fuller将Probiotics重新定义为“一种活的微生物制剂，它能通过改善宿主动物肠道菌群的组成从而有利于动物健康”，这一定义强调益生菌必须是由活细胞组成[2]。根据联合国粮农组织（FAO）、世界卫生组织（WHO），联合专家组在2001年给出了定义：益生菌是指适量服用后，有益于其宿主健康的活的微生物。概括地讲，益生菌的作用在于促进有益菌、抑制致病菌的生长，维持肠道菌群的平衡，有益人体健康[1]。
1. 2 益生菌的种类
最初的益生菌主要指：嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌和双歧杆菌等主要应用于乳制品中的微生物[3]。后来对益生菌的菌种范围又有一定的划分[4]，益生菌现分为3类[2, 3]：第一类为乳酸菌，主要包括嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）、粪链球菌（Streptococcus faecalis）和双歧乳杆菌[5]（Bifidobacterium lactis）等；第二类为芽孢杆菌（Bacillus），主要是短小芽孢杆菌（B. Pumilus）、枯草芽孢杆菌（B. subtilis）和蜡样芽孢杆菌（B. cereus）等；第三类为酵母菌，如酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和石油酵母（Petroleum yeast）。
1. 3 益生菌的生理功能
益生菌寄住于宿主并对其有促健康作用，益生菌发挥有益作用的重要机制之一就是其有抗氧化活性。一般意义上的益生菌除了具有乳酸菌的抗氧化活性，还有一些特殊生理功能。
1. 3. 1 益生菌的耐酸性
胃液的pH最低可达1. 5，在进食后pH可上升至6或更高，但一般维持在2. 5-3. 5之间[6-7]，通常食物在胃内停留时间为2-4h。胃液有强酸性，可激活胃蛋白酶原，杀死随食物进入胃内的一些细菌。益生菌是重要的健康促进因子，能帮助肠道抵御疾病以维持肠道正常功能，所以说益生菌发挥其生理功能的基础是必须能耐受胃液的强酸和消化道的高胆盐环境，并具有良好的粘附性及定植抗性。
李善仁等[8]通过实验得出，芽胞杆菌CS16在pH2、pH3、pH4的盐酸液中培养4h，其存活率维持在10%-30%之间，活菌数保持在107CFU /mL；同样条件下芽孢杆菌CS21和CS27的存活率在30%-50%之间且菌株CS27的活菌数在24h内与4h时比变化不大，在pH4中还略增加，这表明CS27能适应胃液环境。Lim等[9]从韩国常用食物中筛选出几株耐酸的益生菌：DC55、 DC136、 DC222、 KC21、KC24、 KC34、 KC43、 KC117、 MJ54、MJ301、SP33andSP170，其中植物乳杆菌KC21的耐酸性较强。在pH2. 5的条件下，几乎能维持酸值不变，从8. 04
到7. 95。这些菌最有可能在胃与肠道中定植，其实用价值较高。杜丹等[10]采用人工胃液，检测菌株L. acidophilus1. 1878和L. rhamnosus1. 120对上消化道环境的耐受性，两株可耐受pH>3. 0的人工胃液。在pH为3. 0时，L. acidophilus1. 1878的活菌数基本保持不变，L. rhamnosus1. 120在60min时活菌数开始降低，至180min时，活菌数降低至原来的90. 3％；在pH 4. 0时，两株菌在3 h内均保持较稳定的存活率。
1. 3. 2 益生菌的耐胆盐性
益生菌能否发挥益生作用，很大程度上取决于菌株是否能顺利通过胃的酸性环境以及耐受十二指肠的高胆盐环境，并以活菌的状态到达小肠，从而发挥微生态的调整功能。肠道pH一般维持在8. 0左右，食物在小肠中停留时间为1-4h，因此，可通过检测菌株在含有胆盐的环境中的存活能力和在不同浓度胆盐中的生长情况来选择胆盐耐受性较好的菌株。一般对于作用于人体的益生菌的胆盐耐受实验，推荐胆盐浓度为0. 15％-0. 3％[10]。黄春振等[11]从一些实验中得出，耐酸性与耐胆盐较强的菌株其降胆固醇能力较高，这些菌种有很广的应用前景。
靳志强等[12-14]从Kefir中筛选出植物乳杆菌H13，在接种量设定为3×l07cfu /mL时，菌株H13在0. 3％胆盐环境下活菌数有所下降，但3h后活菌数仍在106cfu/mL以上，高于活菌发挥功能特性的菌数临界值。菌株H13对不同胆盐的耐受性没有显著差异。由此表明，所筛选菌株具有一定的抗胆汁盐能力，可顺利通过小肠到达大肠，发挥益生作用。刘长建等[15]在类植物乳杆菌Ⅱ32的耐胆盐实验中得出，乳酸菌Ⅱ32在含不同浓度胆盐的培养基中均能生长。不同浓度胆盐对菌株生长量达到OD值0. 6的时间延迟都在0. 5h以内，这说明菌株对胆盐有耐受性。杨桂梅等[16]从猪肠道分离到2株益生性屎肠球菌E1、E7，对革兰氏阴、阳性菌均有明显的抑制作用，并具有稳定的生长特性。胆盐浓度为0. 4%时，E1、E7仍有一定的耐受能力，随胆盐浓度升高至0. 6%时，活菌数由108. 2CFU/mL降到102. 5CFU/mL，能提供足够进一步繁殖的活菌数, 这为菌株过胃后在肠道中存活奠定了基础。
2微生态制剂
早在十几年前，人们已认识到抗生素已不再适合做饲料添加剂。没有耐药性、无药物残留、没有毒性作用等优点的微生态制剂逐渐代替了抗生素，是目前最具潜力的绿色饲料添加剂[17]。微生态制剂自1970年左右被使用，其作用效果很好，所以微生态制剂被人们广泛接受[18]。
2. 1 微生态制剂的定义
微生态制剂也称益生素，最早是由Parker于1974年提出来的[1, 4, 19]，是指在微生态理论指导下，采用有益的微生物，经培养、发酵、干燥等特殊工艺制成的对人和动物有益的生物制剂或活菌制剂。它是用于调节动物机体微生态平衡的具有
直接通过增强动物对肠内有害微生物的抑制作用或通过增强非特异性免疫功能来预防疾病，从而促进动物生长或提高饲料转化率的一类药物或饲料添加剂[20, 21]。
2. 2 微生态制剂的种类
微生态制剂一般分为三类[22-24]：第一类定义为益生素，益生素是一种含有大量有益菌及其代谢产物和生长促进因子的物质，能维持肠道内菌物平衡、改善机体健康水平的活菌制剂。益生素可分为单一菌种制剂和复合菌种制剂。益生素菌种主要有3类:芽孢杆菌类，主要包括枯草芽孢杆菌、芽孢杆菌和短小芽孢杆菌；乳酸菌类，主要包括双歧乳杆菌、嗜酸乳杆菌和粪链球菌；酵母菌，主要包括石油酵母和酿酒酵母。多数研究表明，益生素具有调节畜禽肠道菌群平衡，增强畜禽免疫力，提高畜禽生产性能等有益作用[25-28]。
第二类为益生元[29]，益生元是一类不被宿主直接吸收，但能选择地促进其体内一种或多种有益菌的生长、代谢与繁殖，从而增进机体健康的物质。这类制剂的主要特点是使肠道有益菌形成优势菌群从而达到维持机体健康的作用。
第三类为合生元[30]，合生元是指生理性细菌(即益生剂)加促进物质(即益生元)的合剂。在合生元中，益生剂与益生元的相加不是简单的混合，可见合生元中添加的益生元必须能促进制剂中生理性细菌的增殖，还可促进肠道中的生理性细菌定植和增殖，当然这种作用具有种的特异性。
2. 3微生态制剂的作用机理
目前，有关微生态制剂作用的机理的报道还是很少，主要为“微生态平衡理论”，主要为[29-31]：
①调整微生态平衡 微生态制剂可以补充有益菌群的数量，抑制病原微生物的生长和繁殖，使动物体内的微生物菌群处于平衡状态，保持动物机体处于健康状态。
②夺氧理论 微生态制剂中的有益耗氧微生物在体内定植，可降低局部氧气的浓度，促进厌氧微生物的生长，从而使失调的微生态恢复平衡，达到抗病的目的。
③生物拮抗理论 微生态制剂中的活菌大多为机体正常菌群中的一员，具有定植性、排它性、繁殖性，进入机体后能对致病菌群产生拮抗作用。
④增强机体免疫理论 微生态制剂可以增强吞噬细菌的吞噬能力，刺激免疫系统的防御能力，减少肠内有毒物质的产生，从而保证了微生态系统中能量流、物质流和基因流的正常运转。
⑤营养物质合成理论 微生态制剂在肠道内定位繁殖，可产生多种有利于动物机体生长的B族维生素、氨基酸，多种活性较强的淀粉酶、蛋白酶类、生长刺激因子，从而提高饲料转化率，促进动物生长。
2. 4 微生态制剂的应用
微生态制剂广泛应用于一下几个方面：
①养猪业 防治仔猪腹泻的微生态制剂添加到哺乳母猪饲料中可以提高哺乳仔猪日增重、减少红白痢的发生、提高仔猪免疫力[32-34]。汪彬等[35]通过对仔猪饲喂不同的微生态制剂得出，实验组的仔猪体重与采食量明显提高，从而提高饲料利用率，仔猪腹泻率也明显降低。
②养鸡业 JIN等[36]在肉鸡饲料中添加0. 05%或0. 1%乳酸菌，结果显著提高2l-42日龄肉鸡体重和饲料转化率(p＜0. 05), R．Kalavathy等[37]在肉鸡日粮中添加乳酸菌培养物也得出同样结论。微生态制剂用于蛋鸡还可以增强免疫力、减少蛋用雏鸡下痢等疾病的发病率。用于肉鸡养殖中可以显著提高肉生产性能，并可对肠道微生态平衡进行调节，降低肉鸡腹水症、脂肪肝的发病率[38]。
③养牛业 养牛业主要利用微生态制剂的上述特点[39-40]，适量的微生态制剂被加入日粮中，可以优化瘤胃内的微生态系统，提高牛对营养物质的吸收效率，提高产奶量。同时微生态制剂还可以防治奶牛乳房炎、子宫内膜炎。
另外，微生态制剂也被用于医药方面[41-45]，其应用领域越来越广。
3乳酸菌
3. 1 乳酸菌的定义概述
乳酸菌是一类能发酵碳水化合物产生乳酸的细菌的总称[46]，这是一种习惯叫法。其细菌形态有杆状、球状之分。它们的形态、生理学特征和代谢性能不完全相同。革兰氏染色为阳性。按培养条件分有好氧、厌氧和兼性厌氧之种类。早在5000年前人类就已经在使用乳酸菌了，人们在认识乳酸菌之前就已利用它们来加工和保存食品。乳酸菌不仅可以延长食品的保藏时间，而且有其特定的生理活性和保健功能[47]。乳酸菌主要有以下几类：乳球菌属(Lactococcus)、链球菌属(Streptococcus)、片球菌属(Pediococcus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)、芽胞乳杆菌属(Sporolactobacillus)、明串珠菌属(Leuconostoc)[48]。乳酸菌不仅可维持肠道内正常的微生态平衡，还有以下生理功能[49-50]：改善制品的风味，提高制品营养价值；抗肿瘤作用；降低体内胆固醇含量；延缓衰老；降血糖抗高血压等作用。
这些对人和动物有直接或潜在的营养价值和保健作用的细菌被人们称为益生菌。作为益生菌的细菌应具备下列条件：无毒性和无致病作用；对宿主有益；能在消化道内存活；能适应体内胃酸和胆盐环境；能在消化道表面定殖；在加工和贮存过程中能保持活性[1]。
乳酸菌种类多，分部广泛，是生物圈的重要组成部分，具有特殊的生理活性与营养价值，在工、农、医、食品和饲料方面有着广泛的应用[51]。
3. 2乳酸菌的抗氧化活性
体内过量的自由基可引发疾病和提前衰老[52]，国内外一些研究结果显示，乳酸菌菌体及其代谢产物具有较强的抗氧化活性[53]。它的抗氧化活性主要是指对超
氧阴离子自由基(O2-. )、羟自由基（OH. ）和1, 1-二苯基-2-苦味肼基自由基（DPPH）的清除作用及抗脂质过氧化性。
3. 2. 1乳酸菌对超氧阴离子自由基(O2-. )的清除
乳酸菌的菌体、由菌体破碎离心得到的无细胞提取物、胞外分泌物对O2-. 都有一定的清除能力[54-56]。
据文献报道[54-55]，目前从食品中分离筛选出的乳酸菌菌悬液对O2-. 的清除率能够达到0. 1%-98. 46%。吴祖芳等[54]分离的戊糖乳杆菌(L. pentosus)H15和植物乳杆菌(L. plantarum)H17，浓度为109CFU/mL的菌悬液对O2-. 的清除率分别为73. 09%和49. 04%；王曦等[11]筛选的乳酸菌La4和La5，浓度为1010 CFU/mL 的菌悬液对O2-. 的清除率可以高达91. 02%和98. 46%。
不仅乳酸菌菌悬液对O2-. 有清除作用，将乳酸菌细胞破碎后得到的无细胞提取物对O2-. 也有一定的消除能力[55-57]。邵伟等[56]发现酸豆奶中的乳酸菌的无细胞提取物对O2-. 的消除率可达35%-38%，且消除能力随菌种不同而有差异。张书文等[57]从乳制品中筛选出的乳酸杆菌SY13和LJJ的无细胞提取物对O2-. 的清除率分别为32%和30%，对照组菌为伊利集团的乳酸菌LGG，且LGG的无细胞提取物对O2-. 的清除率为33%。
除此之外，乳酸菌的胞外分泌物对O2-. 也有清除能力。王曦等[55]在对一些乳酸菌胞外分泌物进行研究时，发现乳酸菌La29的浓度为1010 CFU/mL的胞外分泌物对O2-. 的清除率可高达98. 97%，这说明了乳酸菌的胞外分泌物与菌体、无细胞分泌物相比，胞外分泌物对O2-. 的清除能力较强。
由此可见，清除O2-. 的活性物质存在于乳酸菌菌体内和代谢产物中，并且主要存在于乳酸菌的胞外分泌物中[55]，消除率因菌种和活性物质的浓度大小而不同。
3. 2. 2 乳酸菌对羟自由基（OH. ）的清除
在生物体所产生的自由基中，OH. 对DNA、蛋白质和脂类等重要生物大分子有着较强的结合能力，能够破坏生物体细胞成分，从而影响细胞的正常功能[58]。因此，只有清除生物体内多余的OH. 才能够保持机体的正常活动。
张书文等[59]通过对乳酸菌的无细胞提取物消除OH. 的能力实验和模拟结肠环境探索菌体对OH. 的消除能力实验研究发现，无细胞提取物及菌体对OH. 都有很高的消除能力。嗜酸乳杆菌E在菌液浓度为1010 CFU/mL时，其无细胞提取物对OH. 的消除能力与33. 1mmol/L尿酸对OH. 的清除能力相当。Lin等[52]得出，乳酸菌L3和L4在浓度为1010 CFU/mL时，其无细胞提取物对OH. 的清除率分别为83. 5%和45. 7%。
胡晓丽等[60]通过乳酸菌在模拟正常结肠实验中对OH. 的消除能力得出，乳酸菌Lp、LGG和Lsp清除OH. 的能力依次降低，且Lp、LGG的清除能力显著高于Lsp(P<0. 05)，乳酸菌Lp、LGG对OH. 的清除率最高分别为55%和50%，
而此状态下Lsp对OH. 的清除率最高只为5%。但在模拟高铁结肠实验中发现，菌株LGG、Lp和Lsp的清除能力依次降低，乳酸菌LGG、Lp对OH. 的清除率最高分别为32%和28%，而此状态下Lsp对OH. 的清除率最高只为17%。由此可见，在正常结肠和高铁结肠环境的体外模拟实验中，不同乳酸菌对OH. 的清除能力不同，且同一乳酸菌在不同环境中的清除能力也不同。
3. 2. 3 乳酸菌的抗脂质过氧化性
乳酸菌对亚油酸等一些低分子量的脂肪类物质有一定的过氧化性，并且乳酸菌的抗脂质过氧化性能够清除多余的自由基及阻止自由基的生成。
白明等[61]从乳制品中分离出益生菌，其的抗氧化活性实验结果显示，乳杆菌、双歧杆菌、嗜热链球菌和乳酸乳球菌在浓度为109 CFU/mL时，无细胞提取物对5%亚油酸乳化液的过氧化抑制率为1. 3%-68. 4%。菌株B. longum ATCC 15708和L. acidophilus ATCC 4356在浓度为109 CFU/mL时，无细胞提取物对5%亚油酸乳化液过氧化抑制率分别为48%和45. 3%[62-63]，而浓度为109 CFU/mL的B. longum ATCC 15708、L. acidophilus ATCC 4356菌体对5%亚油酸乳化液过氧化抑制率分别只有33. 2%和28. 1%。此外，菌株L. plantarum KCTC 3099对亚油酸的过氧化抑制率可达48. 5%[64]。
3. 3 乳酸菌的降胆固醇能力
体内高水平的血清胆固醇是引发冠心病的主要因素之一。一些相关研究表明，乳酸菌有着一定的降胆固醇作用[65-67]。
L. plantarum LS12，LS31，Lp501和Lp529可通过对胆固醇的吸收而达到较强的降解胆固醇能力[68]，降解能力最高可达20. 76 μg/mL。B. breve ATCC 15700在含有牛磺胆酸钠的培养基中培养时[69]，对胆固醇的吸收率可高达51%。
肖琳琳等[70]对动物的一些研究也证实了乳酸菌有着降胆固醇的能力。用干酪乳杆菌（L. casei）KM-16菌体灌胃高脂血症模型小鼠，对照组（高脂饲料组）小鼠则灌胃生理盐水，灌胃7d后，实验组小鼠的血清总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)浓度与对照组比较均有着显著的下降(P<0. 05)。灌胃14d后，实验组小鼠的血清TG、TC浓度明显低于对照组(P<0. 01)。在液体培养基中，KM-16对胆固醇的降解率高达51. 8%。MIN等[68]用德氏保加利亚乳杆菌亚种(L. delbrueckiip subsp. bulgaricus) 2038培养物的冻干粉饲喂小鼠，结果表明，实验组中的小鼠的胆固醇含量明显低于对照组中小鼠的胆固醇含量。
ASHAR等[71]发现，志愿者食用含有嗜酸乳杆菌的发酵牛奶后，其体内的血清胆固醇含量可低于2. 0g/L，血清胆固醇含量下降率达到21%。由此可见，一些乳酸菌具有较强的降胆固醇能力，能够降低人体血清胆固醇的含量，减少疾病发生，在医药方面有着广泛的应用前景。
3. 4 乳酸菌的应用
乳酸菌产品已有百余年历史，传统的乳酸菌产品主要是酸奶、奶酪，而且
70%的益生菌被应用于乳制品的生产中。益生菌可参与发酵或直接被添加到产品中，人们所食用的乳制品都是由乳酸菌发酵而制成的，而在一些种植业与养殖业中，益生菌是以活菌的形式被直接应用的。此外乳酸菌还被应用于医药领域。3. 4. 1 乳酸菌与乳制品
乳制品是目前应用非常成功的一类乳酸菌食品。2010年前9个月，全国乳制品产量持续增长，同比增长10. 0%[72]。2009年全球乳产量估计为6. 95亿t，比2008年增长0. 8％，增加620万t。近年来，中国的液体乳制品消费呈快速增长趋势，其中奶牛乳制品的增长占全球乳制品产量的84%，乳粉是整个乳制品市场增幅最为强劲的产品[73]。
将益生菌代田乳酸菌（L. casei shirota）和动物双歧杆菌（B. animalis）添加到蔓越莓汁酸奶甜点中，贮藏21d后，两株菌的终浓度分别为 1. 99×106 CFU/g和2. 05×107 CFU/g，均高于活菌发挥特性的菌数临界值（106 CFU/g）[74]。董成等[75]以从内蒙古发酵酸马奶中分离出的乳酸菌Lb. casei Zhang为发酵剂，通过添加不同比例的发酵剂制成新鲜干酪，实验结果显示，新鲜干酪在4℃冷藏28d 后，其中的Lb. casei Zhang仍具有较高的活力，存活率最高可达99. 12％。
3. 4. 2 乳酸菌与饲料添加剂
微生态制剂是运用有益的微生物，经培养、发酵、干燥等特殊工艺制成的对人和动物有益的生物制剂。它被广泛用于调节动物机体微生态平衡，增强动物的非特异性免疫功能，从而能促进动物生长或提高饲料利用率[76-77]。
乳酸菌微生态制剂能促进仔猪生长和降低发病率[78]；降低蛋用雏鸡下痢等疾病的发病率、增强蛋鸡免疫力、显著提高肉鸡产蛋率，降低肉鸡腹水症和脂肪肝的发病率，并可调节鸡肠道微生态平衡[36]。李春丽等[78]通过对母猪及所产仔猪喂养含0. 25%微生态制剂的饲料的实验研究发现，微生态制剂可使仔猪发病率降低36. 04%、平均日增重提高13. 02%。JIN等[36, 78]在肉鸡饲料中按0. 05%或0. 1%比例直接添加活乳酸菌，此种饲喂方法可使2l-42日龄肉鸡的体重和饲料转化率显著提高(P<0. 05)，在肉鸡日粮中添加乳酸菌培养物也得出同样结论[37]。
含有活乳酸菌的饲料添加剂主要被应用于养殖业中，长期使用此种饲料不仅能明显提高利润，还能改善饲养环境，减少舍内苍蝇，基本消除了粪便的恶臭，有效增强动物的免疫功能，减少疾病的发生，降低饲养成本[79]。
3. 4. 3 乳酸菌与其他产品
乳酸菌产品在临床上被广泛用于治疗腹泻、消化性溃疡、细菌性阴道炎以及便秘等疾病，且对肝、肾功能无不良影响，它是一类安全、有效的微生物制剂[41]。患者食用一定量安全的益生菌产品一段时间后，其口腔中的微生物种类与数量都有一定的改变[42]。Parent等对32例细菌性阴道病（BV）的患者给予能产生H2O2的乳杆菌制剂治疗，每天l-2次，阴道用药，连用1-2周和4周后的治愈率分别为77％和88％[43]。
乳酸菌已被应用于生产医用制剂，且获国内药品批准文号，口服制剂可用于治疗肠道菌群失调引起的疾病。丽珠肠乐、金双歧、妈咪爱散剂、定菌生等含有益生菌的药品已被安全用于临床治疗[44]。医用益生菌产品正在被不断研发，产品种类在不断扩大。
4 乳酸菌的发展前景
随着人们生活水平的提高，乳酸菌及其饮品在许多国家已相当普及，但目前我国人均消费量与美国、巴西等国的水平仍有较大的差距。一些发达国家的乳酸菌奶类产品已占到乳品市场的80. 0%，世界乳酸菌奶饮品平均市场占有率已达30. 0%，且在我国乳制品的消费人群主要为城乡居民。据估算，到2035年，中国奶业的规模将超过美国，成为全球最大的乳制品市场。所以中国的乳制品市场有很大的发展空间，可以从以下几方面考虑使乳酸菌得到更广泛的应用。
4. 1 菌种变异
优良高效的乳酸菌菌种是提高乳制品质量的重要保障。人们发现的微生物物种已有10万多种，但开发利用的微生物物种仅占已发现微生物物种的1%左右，所以，有应用价值的微生物物种数有待进一步扩大[80]。一方面可以扩展野生型乳酸菌的筛选范围，海洋中物种丰富，其中存在着大量的优良野生型乳酸菌。另一方面可以利用人工诱变或基因工程等手段筛选出优良的乳酸菌菌种，丰富乳酸菌菌种[81]。
4. 2 产品类型
微生态制剂已被广泛应用于生产中，不同动物适用使用不同类型的菌种，且微生态制剂在动物的不同生长发育阶段使用效果不一样。市场上已出现专用于猪的福来宝微生态制剂、用于水产的益康素微生态制剂。动物专用型微生态制剂可以有效提高制剂的利用率，节省饲养成本。含用动物体内的优势菌种的微生态制剂必能促进相应动物的生长发育。
复合型菌制剂是含有两种或多种菌种的微生态制剂，菌种间可以通过协同作用发挥有益功能。目前，复合型菌制剂还没有被广泛应用于生产[82-84]。研究不同益生菌的最佳混合培养条件，然后参照此依据制成的复合型菌制剂应为微生态制剂的新亮点。
综上，一些发酵产品备受人们喜爱，基于乳酸菌及其独特的生理特性，无论在食品工业，还是在饲料生产和临床上都有着极大的应用前景。
1 引言
乳酸菌种类多，资源丰富，在自然界分部广泛，并在食品、饲料、医药与农业得到很应用。其产品已有百余年历史，传统的乳酸菌产品主要是酸奶、奶酪，且70%的益生菌被应用于乳制品的生产中。乳酸菌可参与发酵或直接被添加到产品中，人们所食用的乳制品大部分是由乳酸菌发酵而制成的，并且在一些种植业与养殖业中，益生菌是以活菌的形式被直接应用。
乳酸菌主要有以下几类：乳球菌属(Lactococcus)、链球菌属(Streptococcus)、片球菌属(Pediococcus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)、芽胞乳杆菌属(Sporolactobacillus)、明串珠菌属(Leuconostoc)。乳酸菌不仅可维持肠道内正常的微生态平衡，还有以下生理功能：改善制品的风味，提高制品营养价值；抗肿瘤作用；降低体内胆固醇含量；延缓衰老；降血糖抗高血压等作用。
董成等[75]以乳酸菌Lb. casei Zhang为发酵剂，通过添加不同比例的发酵剂制成新鲜干酪，实验结果显示，新鲜干酪在4℃冷藏28d后，其中的Lb. casei Zhang 仍具有较高的活力，存活率最高可达99. 12％。Parent细菌性阴道病（BV）的患者给予能产生H2O2的乳杆菌制剂治疗，每天l-2次，阴道用药，连用1-2周和4周后的治愈率分别为77％和88％[43]。
微生态制剂也称益生素，是指在微生态理论指导下，采用有益的微生物，经培养、发酵、干燥等特殊工艺制成的对人和动物有益的生物制剂或活菌制剂。它可以用于调节动物机体微生态平衡，且具有直接通过增强动物对肠内有害微生物的抑制作用或通过增强非特异性免疫功能来预防疾病，从而促进动物生长或提高饲料转化率。李春丽等[78]通过对仔猪喂养含微生态制剂的饲料的实验研究，发现微生态制剂可使仔猪发病率降低36. 04%、平均日增重提高13. 02%。
微生态制剂也被用于作物种植方面，其应用领域越来越广。不同的乳酸菌其发酵产物有所差异，在不同的应用领域选用具有相应特性的乳酸菌能使其效果更好，资源充分利用。
本文主要从两方面研究三株乳酸菌的特性：（1）采用不同的方法对乳酸菌的发酵液、发酵液离心后的上清液、菌体细胞对不同物质（·OH、O2·、DPPH、脂质）的抗氧化性做了定性测定，且对其内TTG、SOD、GSH-PX含量做了测量；（2）对乳酸菌的耐酸性、耐胆盐性做了比较性实验，在模拟肠道环境中存活的菌落数，这是乳酸菌被应用于肠道的首要必须条件。
2 材料与方法
2. 1材料
2. 1. 1 菌株
乳酸乳球菌亚种（Lactococcus lactis subsp. lactis）lactc 1、戊糖乳杆菌（Lactobacillus pentosus）lactc 5、植物乳杆菌（Lactobacillus pentosus）lactc 34：实验室保藏菌株，都来自植物性材料。
2. 1. 2 培养基
MRS液体培养基[85]（g/L）：蛋白胨10. 0g，牛肉膏10. 0g，酵母粉5. 0g，磷酸氢二钾2. 0g，柠檬酸二铵2. 0g，乙酸钠5. 0g，葡萄糖20. 0g，Tween-80 5. 0mL，硫酸镁0. 58g，硫酸锰0. 25g，pH7. 0，115℃，灭菌30min。
改良MRS液体培养基[86]：MRS液体加入0. 3%硫代乙醇酸钠和100μg/mL 可溶性胆固醇。
MRS固体培养基：配方同上，按2. 0%加入琼脂。
牛肉膏蛋白胨液体培养基[85]（g/L）：牛肉膏3. 0g，蛋白胨10. 0g，NaCl 5. 0g，pH 7. 0-7. 2，120℃，灭菌20min。
牛肉膏蛋白胨固体培养基：配方同上，按2. 0%加入琼脂。
2. 1. 3 仪器设备
表2-1实验主要仪器及生产厂家
Tab2-1 Instruments used in the studies and their producters
仪器名称公司或厂家
DHG-9247 A型电热恒温干燥箱上海精宏实验设备有限公司
TGL-18R高速冷冻离心机赛特湘仪离心机仪器有限公司
电热恒温培养箱湖北省黄石市医疗器械厂
PHS-3C离子酸度计（上海康仪仪器有限公司
IMS系列全自动制冰碎冰机江苏格林电器有限公司
JY92-Ⅱ超声波细胞破碎仪(宁波新芝科器研究所
WH-3微型旋涡混合仪上海泸西分析仪器厂
TU-1800SPC紫外可见分光光度计北京普析通用仪器有限责任公司
PB203-N 电子天平——
2. 1. 4 试剂
表2-2. 实验主要试剂及生产厂家
Tab. 2-2 Reagents used in the studies and their producters
试剂名称生产厂家
邻苯三酚BIO BASIC INC
1，10-菲咯啉BIO BASIC INC
2-硫代巴比妥酸(TBA) BIO BASIC INC
三氯乙酸(TCA) BIO BASIC ING
2-脱氧-D-核糖BIO BASIC ING
胆固醇生物工程上海有限公司
亚油酸生物工程上海有限公司
牛磺胆酸钠生物工程上海有限公司
二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH) Sigma，购自生物工程上海有限公司
2，6－二叔丁基对甲酚(BHT)Sigma，购自生物工程上海有限公司
抗坏血酸上海联试化工试剂有限公司
乙二胺四乙酸(EDTA) 合肥博美生物科技有限责任公司
超氧化物歧化酶(SOD)分型测试盒南京建成科技有限公司
谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)测试盒南京建成科技有限公司
总胆固醇测试盒南京建成科技有限公司
2. 1. 5 主要试剂的配制
0. 5 % 1，10- 菲咯啉：用电子天平准确称取0. 05 g 1，10- 菲咯啉于容量瓶中，用二级水定容至10. 0 mL。
2. 5 mmol/ L FeSO4：用电子天平准确称取0. 095g FeSO4于容量瓶中，用二级水定容至250 mL。
20 mmol/ L H2O2：用量程为0. 1-1. 0 mL的移液枪准确量取0. 5mL 30% H2O2于容量瓶中，用二级水定容至250mL。
4% TCA：用电子天平准确称取0. 4g TCA于容量瓶中，用二级水定容至10. 0mL。
0. 8 % TBA：用电子天平准确称取0. 08 % TBA于烧杯中，沸水溶解，再移入容量瓶中，用二级水定容至10. 0mL。
1mmol/ L EDTA：用电子天平准确称取0. 04 g EDTA于容量瓶中，用二级水定容至10. 0mL。
10mmol/ L FeCl3: 用电子天平准确称取0. 016g FeCl3于容量瓶中，用二级水定容至10. 0mL。
5%DTNB：用电子天平准确称取0. 5g DTNB于容量瓶中，用二级水定容至10. 0mL。
10mmol/ L 2-脱氧-D-核糖：用电子天平准确称取0. 013g 2-脱氧-D-核糖于容量瓶中，用二级水定容至10. 0mL。
1mmol/ L抗坏血酸：用电子天平准确称取0. 02g抗坏血酸于容量瓶中, 用二级水定容至100. 0mL。
0. 12mmol/ L DPPH：用电子天平准确称取0. 045g DPPH于容量瓶中，先用甲醇溶解再用50%乙醇定容至100. 0mL。
5%亚油酸乳化液：称取聚已烯醇(聚合度1750) 2. 0g加入二级水中加热搅拌至全部溶解，配制成2%的溶液，再与亚油酸以20:1混合，高速搅拌30分钟，中间间停10分钟，静置乳化24小时，室温保存。
溶液A：用电子天平分别准确称取0. 5g 硫酸铜（CuSO4·2H2O），1. 0g 柠檬酸（Na3C6H5O7·2H2O），用二级水定容至100. 0mL，避光保存，待用。
溶液B：用电子天平分别准确称取20. 0g Na2CO3，4. 0g NaOH，用二级水定容至1000. 0mL。
溶液C：溶液A与溶液B按体积以1:50混合，摇匀，避光保存，待用。
溶液D：Folin-酚试剂与水按体积以1:1混合，摇匀，待用。
2. 2 实验方法
2. 2. 1 菌株的活化及种子液的制备
分别将保藏于4℃条件的菌种Lactc 518、Lactc 5、Lactc 34接种在MRS 固体培养基上，37℃，培养24h ，待用。分别挑1-2环活化的Lactc518、Lactc5、Lactc34接种于8mL MRS 液体培养基中，37℃，静置培养12h ，即为种子液，待用。
2. 2. 2 无细胞提取物的制备
将Lactc 518、Lactc 5、Lactc 34种子液按2%的比例，接种在MRS 液体中，37℃静置培养24h ，在8000r/min ，10min ，4℃条件下将发酵液离心，收集菌体，用0. 02mol/L ，pH7. 0 PBS 洗涤菌体3次, 菌体重悬于PBS 中，制成含1010CFU/mL 的菌悬液， A 600为0. 002。将菌悬液置于冰浴中，在功率为400W 条件下超声破碎细胞, 工作10s ，间歇10s ，全程时间10min 。然后在10000r/min ，10min ，4℃条件下将破碎后的液体离心，收集上清液，上清液即为无细胞提取物
[87, 17]
。
2. 2. 3 清除羟自由基(·OH)能力的测定
在5mL 的离心管中分别加入0. 1mL 的样品，0. 02mol/L ，pH7. 0 PBS 0. 4mL ， 1mmol/L EDTA 0. 1mL ，10mmol/L H 2O 2 0. 1mL ，2mmol/L 抗坏血酸0. 1mL ，60mmol/L 2-脱氧-D-核糖0. 1mL ，1mmol/L FeCl 3 0. 1mL ，该体系在37 ℃恒温水浴中反应1. 0h ，然后加入20%（m/v ）TCA 1. 0mL ，1. 0% TBA 1. 0mL ，混匀，100 ℃水浴15min ，冷却，在365nm 处测吸光值（如浑浊需离心），以PBS 为空白对照，每组设3个重复[87, 88]。
计算公式如下：
·OH 清除率(%)=1-
AO
AC
AS ?×100%
式中：A0：试剂空白反应组的吸光值，不加样品；
AS ：含样品和脱氧核糖反应组的吸光值； AC ：样品空白反应组的吸光值，不加脱氧核糖。
2. 2. 4 消除超氧自由基（O 2·)能力的测定
在10mL 的离心管中加入0. 05mol/L ，pH7. 0 Tris-HCl 4. 5mL ，置25℃水浴中加热20min ，然后加入待测样品0. 1mL ，2. 5mmol/L 邻苯三酚0. 4mL ，混合后25℃水浴中反应4min ，立即加入8mol /L HCl 2滴终止反应，在306nm 处测定吸光值。以二级水为空白对照，每组设3个重复[89]。
计算公式如下：
清除率(%)=1-
2
1A A A ?×100%
式中：A0：加邻苯三酚，但不加样品反应组的吸光值；
A1：加邻苯三酚和样品反应组的吸光值； A2：加样品但不加邻苯三酚反应组的吸光值。
2. 2. 5 消除自由基DPPH 能力的测定
在5mL 的离心管中加入0. 12mmol/L DPPH 1. 9mL ，样品0. 1mL ，室温静置
20min ，在526nm 处测定吸光值。以50%乙醇为空白对照，每组设3个重复[90]。
计算公式如下：
清除率(%)=1-
A B
A ?×100% 式中：A0：未加样的DPPH(1. 9mL DPPH+0. 1mL50%乙醇)的吸光度；
A ：样品与DPPH 反应后（1. 9mL DPPH+0. 1mL 样品）的吸光度；
B ：样品空白(1. 9mL50%乙醇+0. 1mL 样品)的吸光度。
2. 2. 6 抗亚油酸氧化抑制的测定
在10mL 的离心管中加入0. 02mol/L ，pH7. 0 PBS 0. 5mL ，5%亚油酸乳化液
1mL, 0. 01% FeSO 4 0. 2mL ，0. 01%H 2O 2 0. 2mL ，混匀后加入样品0. 5mL ，37℃水浴12h 。水浴反应之后加入4% TCA 0. 2mL 和0. 8% TBA 2mL ，上述体系在100℃水浴下反应30min ，冷却后加入三氯甲烷2mL ，抽提，取上层液在530nm 下测吸光值，以PBS 作空白对照，每组设3个重复[17, 91]。
计算公式如下：
亚油酸氧化抑制率（%）=1-0
1
A A ×100% 式中：A0：空白组的吸光度；
A1：实验组的吸光度。
2. 2. 7 TTG 含量的测定
在2. 5mL 的0. 02mol/L ，pH7. 0 PBS 中加入5%的DTNB 0. 05mL ，无细胞提取物0. 25mL ，
该体系在37 ℃条件下水浴15min ，412nm 处测反应液的吸光值，以PBS 作空白对照，每组设3个重复[17]。
计算公式如下：
TTG 含量 C =
ε
412
A ×D
式中：C ，基浓度；ε，DTNB 复合物的消光系数，值为14150/ cm ；D ，稀释因子，为11. 2。
2. 2. 8 蛋白浓度测定-Lowry 法 2. 2. 8. 1 蛋白质标准曲线的绘制
以牛血清白蛋白(BSA)为标准样品，配制成不同浓度：0. 1mg/mL，0. 2
mg/mL，0. 3 mg/mL，0. 4 mg/mL，0. 5 mg/mL，0. 6 mg/mL，在750nm处测反应
液的吸光值，以双蒸水空白对照，每组设3个重复。以BSA浓度为横坐标，相
应的吸光值为纵坐标绘制标准曲线[92]。
2. 2. 8. 2 Lowry法测蛋白浓度
用双蒸水稀释样品至0. 5mL，加入2. 5mL的溶液C，混匀，室温下放置5-10 分
钟，再加入0. 25mL的溶液D，混匀，室温下放置20-30分钟，750nm处测反应液
的吸光值，以双蒸水为空白对照，每组设3个重复。根据上述标准曲线中就可以
得出样品中相应的蛋白浓度。
2. 2. 9 超氧化物歧化酶(SOD)活力的测定
以SOD测试盒说明为参照，具体操作如下，并采用Lowry法测定蛋白质浓度。
2. 2. 9. 1 试剂的组成及其配制
试剂1：10mL。其应用液的配制：每瓶加二级水至100 mL, 4℃保存备用。
试剂2：10mL，4℃-10℃保存备用。
试剂3：10mL，4℃-10℃保存备用。
试剂4：350μL，4℃保存不可冷冻。4号液体10mL，4℃保存。用时前者与后
者按1:14稀释，现用现配制。4℃保存，不可置于较低温度。
试剂5：粉末试剂，用70℃-80℃二级水溶解至75mL后，备用。溶解后必须
用二级水调至75mL，配好的试剂4℃避光保存。
试剂6：粉末试剂，用二级水溶解至75mL备用，4℃避光保存。
显色剂的配制：按试剂五：试剂六：冰乙酸=3：3：2的体积比配显色剂，4℃
避光保存。
2. 2. 9. 2 操作方法
实验体系如下：
表2-3 总SOD（T-SOD）活力的测定
Table 2-3 Determine the activity of total superoxide dismutase
试剂测定管对照管
试剂1（mL） 1. 0 1. 0
样品（mL）a* - 二级水（mL）- a* 试剂2（mL）0. 1 0. 1
试剂3（mL）0. 1 0. 1
试剂4（mL）0. 1 0. 1
用旋涡混匀器充分混匀，置37℃恒温水浴40分钟
显色剂（mL） 2 2 混匀，室温放置10分钟，于波长550nm处测吸光值，二级水调零，比色
革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌
细菌的分类 把众多的细菌分为两大类，革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。大多数化脓性球菌都属于革兰氏氏阳性菌，它们能产生外毒素使人致病，而大多数肠道菌多属于革兰氏阴性菌，它们产生内毒素，靠内毒素使人致病。 常见的革兰氏阳性菌有：葡萄球菌、链球菌、李式杆菌属、丹毒丝菌属、肾杆菌属、芽孢杆菌属、梭菌属、分歧杆菌属、放线菌属、奴卡菌属、棒状杆菌属、红球菌属、丹毒杆菌、气肿疽杆菌、结核杆菌、肺炎双球菌、炭疽杆菌、白喉杆菌、破伤风杆菌等； 常见的革兰氏阴性菌有:伤寒杆菌、大肠杆菌、变形杆菌、痢疾杆菌、肺炎杆菌、布式杆菌、流感副流感杆菌、卡他杆菌、不动杆菌属、耶尔森菌属、嗜肺军团菌、绿脓杆菌、（副）百日咳杆菌、志贺菌属、巴斯德菌属、霍乱弧菌、副溶血性杆菌及脑膜炎双球菌等。 G+ 球菌：金黄色葡萄球菌（葡萄球菌属）、乙型溶血性链球（链球菌属）、 肺炎链球菌（链球菌属） G—球菌：淋球菌、脑膜炎双球菌（奈瑟菌属） G+ 杆菌：白喉杆菌（棒状杆菌属）、结核杆菌（分歧杆菌属）抗酸菌 麻风杆菌（分歧杆菌属）抗酸菌 G—杆菌：大肠杆菌（埃希菌属）、伤寒杆菌、副伤寒杆菌、志贺痢疾杆菌、 福式痢疾杆菌、宋内痢疾杆菌（志贺菌属）、百日咳杆菌（包特菌属）、 肠炎杆菌（沙门菌属）、绿脓杆菌（假单胞菌属）、 在治疗上，大多数革兰氏阳性菌都对青霉素敏感；而革兰氏阴性菌则对青霉素不敏感，而对链霉素、氯霉素等敏感。所以首先区分病原菌是革兰氏阳性菌还是阴性菌，在选择抗生素方面意义重大。 附：革兰氏阳性细菌和阴性细菌感染可选药物清单 一、革兰氏阳性细菌 1.主要抗革兰氏阳性菌的抗生素与抗菌药 青霉素类：青霉素G，青霉素V 耐青霉素酶的青霉素：唑西林，邻氯西林，二氯西林，氟氯西林，甲氧西林，萘夫西林等内酰胺酶抑制剂合剂：阿莫西林／克拉维酸，氨苄西林／舒巴坦，氨苄西林／舒巴坦等 大环内酯类：一代：红霉素，柱晶白霉素，乙酰螺旋霉素，麦迪霉素 二代：罗红霉素，克拉霉素，阿奇霉素，地红霉素 林可霉素类：林可霉素，克林霉素 链阳霉素类：奎奴普丁／达福普汀 糖肽类：万古霉素，去甲基万古霉素，替考拉宁 嗯唑烷酮类：利奈唑酮 其他：利福平，夫西地酸，杆菌肽 2.具有良好抗革兰氏阳性菌作用的广谱抗生素与抗菌药 广谱青霉素：氨苄西林，阿莫西林 头孢菌素：第一、二、四代头孢菌素 碳青霉烯：亚胺培南，培尼培南，美洛培南 青霉烯：法罗培南 氨基糖苷：庆大霉素，阿米卡星，阿贝卡星 四环素类：多西环素，米诺环素 其他类抗生素：氯霉素，甲砜霉素，磷霉素
微生物的鉴定中常用地生理生化试验
一、实验目的 1.证明不同微生物对各种有极大分子物质的水解能力不同，从而说明不同微生物有着不同的酶系统。 2.掌握微生物大分子物质水解实验的原理和方法。 3.了解糖发酵的原理和在肠细菌鉴定中重要作用。 4.掌握通过糖发酵鉴别不同微生物的方法。 5.了解IMViC的原理。 二、实验原理 由于各种微生物具有不同的酶系统，所以他们能利用的底物不同，或虽利用相同的底物但产生的代谢产物却不同，因此可以利用各种生理生化反应来鉴别不同的细菌，尤其是在肠杆菌科细菌的鉴定中，生理生化试验占有重要的地位。具体的原理如下： 1.淀粉水解试验：在淀粉固体培养基上接种两种细菌（枯草杆菌，大肠杆菌），培养两天以后，再往培养基中加碘液染色，若该细菌能分泌胞外淀粉酶，则能利用其周围的淀粉，淡然在染色后，其菌落周围不呈蓝色，而是无色透明圈。 2.糖发酵试验：不同的细菌分解糖的能力不同，有些细菌能利用糖发酵产酸和产气，有些则不能。酸在加入溴甲酚指示剂后会使溶液呈黄色，且德汉氏小管中会收集到一部分气体。若细菌不能使糖产酸产气，则最后溶液为指示剂的紫色，且德汉氏小管中无气体。 3.IMVC实验主要用于快速鉴别大肠杆菌和产气肠杆菌。 （1）吲哚试验：在蛋白胨培养基中，若细菌能产生色氨酸酶，则可将蛋白胨中的色氨酸分解为丙酮酸和吲哚，吲哚与对二甲基苯甲醛反应生成玫瑰色的玫瑰吲哚。本次不做该试验。
（2）甲基红试验（MR）：某些细菌在糖代谢过程中分解葡萄糖生成丙酮酸，后者进而被分解产生甲酸，乙酸和乳酸等多种有机酸，是培养液PH值降至4.2以下，加入甲基红后溶液呈红色。 三、实验材料 1.菌种 大肠杆菌（Escherichia coli），金黄色葡萄球(Staphyloccocus aureus Rosenbach)，铜绿假单胞菌（P.Aeruginosa），枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis Cohn）， 产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)，普通变形杆菌（Proteus.vulgaris)。 2.培养基 固体油脂培养基，固体淀粉培养基，葡萄糖发酵培养基（5支，附德汉式小管），乳糖发酵培养基（5支，附德汉式小管），蛋白胨水培养基。 3.溶液和试剂 革兰氏染色用卢戈氏碘液，甲基红指示剂，乙醚和吲哚试剂，无菌水。 4.仪器和其他用品 平板，试管，接种环，试管架，电子天平，称量纸，玻璃棒，三角瓶，烧杯，药匙，标签纸，酒精灯，滴管。 四、实验步骤 1.淀粉水解实验 （1）培养基制备 将固体淀粉培养基熔化后冷却至50℃左右，无菌操作制成平板。
2020版药典微生物限度计数—耐胆盐革兰阴性菌
2020版药典微生物限度计数—耐胆盐革兰阴性菌 2020版本药典 (1) 菌种及菌液制备 1) 菌液制备 将铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、沙门菌分别接种在胰酪大豆胨琼脂培养基上，35℃条件下培养24小时，将新鲜培养物用pH7.0的0.9%无菌氯化钠溶液制成适宜浓度的菌悬液。 (2) 控制菌检查方法适用性试验 控制菌检査用培养基的适用性检查项目包括促生长能力、抑制能力及指示特性的检查，各培养基的检查项目及所用的菌株见表1。 表1 控制菌检査用培养基的促生长能力、抑制能力和指示特性 耐胆盐革兰阴性菌检查方法适用性试验 1、肠道菌增菌液体培养基促生长能力检查：分别接种不大于 l00cfu的大肠埃希菌和铜绿假单胞菌于被检培养基以及对照培养基中，
在35℃条件下培养24小时。 2、肠道菌增菌液体培养基抑制能力检查：分别接种不大于 l00cfu的金黄色葡萄球菌于被检培养基和对照培养基中，在35℃条件下培养48小时。 3、紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基促生长能力检查：分别接种不大 于l00cfu的大肠埃希菌和铜绿假单胞菌于被检培养基以及对照培养基中，在35℃条件下培养18小时。 4、紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基指示能性检查：分别接种不大于 l00cfu的大肠埃希菌和铜绿假单胞菌于被检培养基以及对照培养基中，在35℃条件下培养18小时。 5、紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基抑制能力检查：分别接种不大于 l00cfu的金黄色葡萄球菌于被检培养基和对照培养基中，在35℃条件下培养24小时。 (3) 耐胆盐革兰氏阴性菌检査 1) 供试液制备和预培养 供试品的控制菌检查按经方法适用性试验确认的方法进行。取供试品，用胰酪大豆胨液体培养基作为稀释剂制成1:10供试液，混匀，在25℃条件下培养，培养时间使供试品中的细菌充分恢复但不增殖(2小时)。 2) 定性试验 取相当于10ml供试品的上述预培养物接种至适宜体积90ml肠道菌增菌液体培养基中，35℃培养24小时后，划线接种于紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基平板上，35℃培养24小时。如果平板上无菌落生长，判供试品未检出耐胆盐革兰阴性菌。 3) 定量试验
抗冷水稻的生理生化特性
?综述? 抗冷水稻的生理生化特性 周介雄1 蒋向辉2 余显权2 (1.贵州省种子总站 贵阳 550001;2.贵州大学农学院水稻研究所 贵阳花溪 550025) 摘要:根据杂交水稻抗冷性育种的需要,本文主要从细胞结构、细 胞内主要物质、酶的适应性变化、激素的调节、Ca 2+ 的调控等方面,综述了抗冷水稻和冷敏感水稻在耐冷特性方面的差异: 低温下耐冷性强的品种能保持较好的细胞膜完整性,保持更高的CA T 、SOD 和POD 等保护酶活性和更低的MDA 含量,并诱导产生更多的脯氨酸,同时ABA 水平增高。从多方面揭示了抗冷水稻的抗冷原因,并初步提出了今后抗冷水稻品种选育的努力方向。 关键词 抗冷水稻 生理生化特性 细胞膜 保护酶系统 激素 水稻作为重要的粮食作物,持续的高产、优质、抗逆一直是科学工作者的理想与追求。目前水稻从南纬34°的南美洲大西洋沿岸至北纬53°27′的黑龙江漠河、从平原到海拔2700m 范围内广泛栽培,而水稻生长所需的适宜温度为15～18℃至30～ 33℃[5] ,因此低温冷害发生比较普遍。我国每年因低温冷害使稻谷减产30～50亿kg [18]。尤其是贵州省从1999年以来,在中低海拔地区几乎年年都遭受低温危害,造成水稻不同程度的减产,个别地方甚至颗粒无收,特别是2002年全省遭受严重的低温阴雨危害,致使全省水稻减产21%,全省粮食减产6%。因此,培育抗冷性水稻品种应用于生产,保持水稻持续高产稳产,是当今贵州省水稻育种和水稻生产迫切需要解决的问题。 低温冷害是指零度以上低温对植物造成的伤害或死亡的现象[2]。水稻的冷害一般分为障害型和延迟型。障害型冷害中危害最大的是孕穗期的冷害引起的不结实,其次是开花期的低温引起的不结实。延迟型冷害,大致可区别为:因抽穗前各时期生育延迟而造成抽穗延迟,以致结实不良;以及成熟期本身的低温引起的不结实。延迟型换而言之,也可说是成熟不良型[1]。 低温对植物的危害是一个复杂的生理过程,而植物抵抗低温胁迫的能力又是一个多系统的综合生理反应,它受物种本身的遗传基因控制,也受环境的制约[15]。当水稻受到冷胁迫后,会表现一系列的不良症状,本文就水稻受低温胁迫后所表现的生理障碍和生理生化变化综述前人的研究结果,为选育和鉴定抗冷性水稻品种提供参考。 1 水稻在低温胁迫下的不良症状 水稻从种子发芽到成熟的整个生长发育期间都有可能遭受 低温冷害:(1)苗期:水稻苗期受低温冷害,主要导致出芽不良,分蘖少,苗弱,易感立枯病,从而影响后期丰产群体的建立,严重的还会发生烂秧死苗。(2)大田生长期:在这一时期低温对水稻的影响,主要表现在对叶片和根系的生长方面。遇低温时叶片极度凋萎至枯死,其原因是根系损伤无法恢复吸水能力。主要导致成活不良,分蘖少,幼穗形成晚等。(3)孕穗期:水稻属高温短日植物,需高温诱导才能由营养生长转入生殖生长期。此时遭受低 温,导致出穗延迟,且器官发生各种异常,尤其穗长变短,原因是枝梗及颖花的分化受到抑制并退化,颖花产生畸变。进而在低温下使性器官畸变,如雌雄蕊、鳞片等小穗器官的数目增加、生殖器官缺损等。(4)抽穗开花期:这个时期低温冷害主要导致抽穗延迟。水稻的雌雄性器官对温度反应敏感,且一般又以为雄性器官比雌性器官更敏感。同时,水稻开花期遇到低温,不仅影响正常开花受精,而且也能使初生胚受精后的合子早期停止发育而成秕粒,产量降低。(5)成熟期:主要导致成熟不良,子粒不饱满,米质差等。灌浆初期遇低温危害时米粒发育停止,米粒长度减少,甚至形成死米。灌浆中期遇低温危害时会产生乳白米和曝腰米。在同一穗内,下部的谷粒较上部的、出穗迟的谷粒较出穗早的、第二次枝梗上的谷粒较第一次枝梗上的灌浆能力弱,低温对它们的影响亦大。因此在所有的颖花中如果弱势颖花比例高的品种则易受到冷害。和抽穗开花期一样,灌浆期的稻株遇到低温时叶绿素会受到破坏,叶片变黄,叶片发黄时由基部老叶→顶部新叶、由叶尖→叶基顺次进行[7]。因此,叶片光合强度也受低温抑制而显著降低。 2 抗冷水稻的生理生化特性 抗冷水稻与冷敏感水稻相比具有对低温冷害的忍受和适应的优良特性,即水稻的抗冷性[2]。当它遭遇冷害时,细胞的结构和细胞内各物质将发生一系列形态及生理生化方面的适应性变化,以维持其稳定地生长。2.1 细胞结构的特性2.1.1 细胞膜 细胞膜的流动性和稳定性是细胞乃至整个植物体赖以生存的基础,它不仅调控一切营养物质的进出,而且是细胞反应外界不利因子的最先的重要屏障[3]。1973年,Lyons 根据细胞膜结构功能与抗冷性的关系,提出著名的“膜脂相变冷害”假说。认为温带植物遭受零上低温时,只要降到一定的温度,生物膜首先发生膜脂的物相变化,这时膜脂从液晶相变为凝胶相,膜脂的脂肪酸链由无序排列变为有序,膜的外形和厚度也发生变化,可能使膜发生收缩,出现孔道或龟裂,因而膜的透性增大,膜内可溶性物质、电解质大量向膜外渗漏,破坏了细胞内外的离子平衡,同时膜上结合酶的活力降低,酶促反应失调,表现出呼吸作用下降,能量供应减少,植物体内积累了有毒物质[4]。 膜脂相变转换温度与膜脂脂肪酸的不饱和程度密切相关。一般抗冷水稻膜脂脂肪酸的不饱和度较高,膜脂相变温度相应较低,使膜在低温下保持流动性和柔韧性,以利低温下正常功能的执行和避免膜脂固化造成膜伤害。苏维埃等用差示扫描量热计法(DSC )和荧光偏振法,杨福愉等用顺磁共振法,都证明水稻的抗冷品种膜脂流动性大[16];王洪春等[14]对206个水稻品种种子干胚膜脂脂肪酸组成所做的分析指出:抗冷品种含有较多的亚油酸(18∶2)和较少的油酸(18∶1)。致使其脂肪酸的不饱和指数高
控制菌检查方法验证操作规程
GMP管理文件 一、目的：为使控制菌检查的操作规范化、制度化，故建立此规程 二、适用范围：控制菌检查必须按本规程执行。 三、责任者：微生物限度检查化验员，质量检测中心主任。 四、正文： 1、控制菌检查方法适应性试验 1、1 供试液的制备 取样品10g，用胰酪大豆胨液体培养基（TSB），作为稀释液制成1：10供试液，混匀，在20～25℃培养 ,培养时间应使供试品中的细菌充分恢复但不增殖（约2小时）。 试验菌 大肠埃希菌和铜绿假单胞菌 适用性试验 取相当于1mL供试品的上述预培养物及不大于100cfu的大肠埃希菌和铜绿假单胞菌分别接种至适宜体积肠道菌增菌液体培养基中，30～35℃培养24小时后，划线接种于紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基平板上，30～35℃培养18小时。应能分别检出所加大肠埃希菌和铜绿假单胞菌相应的反应特征. 结果判断 上述试验若检出试验菌，按此供试液制备法和控制菌检查方法进行供试品检查；若未检出试验菌，应消除供试品的抑菌活性，并重新进行 方法适用性试验。
耐胆盐革兰氏阴性菌的检查 供试液的制备和预培养：取样品10g，用胰酪大豆胨肉汤琼培养基（TSB），作为稀释液制成1：10供试液，混匀，在20～25℃培养 ,培养时间应使供试品中的细菌充分恢复但不增殖（约2小时） 定性试验： 除另有规定外，取相当于1g或ml供试品的预培养物接种至适应体积（经方法适用性试验确定）肠道增菌液培养基中，30～35℃培养24～48小时后，划线接种于紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基的平板上，30～35℃培养18～24小时。 判断结果：如果平板上无菌生长，判供试品未检出耐胆盐革兰氏阴性菌。 定量检查： 选择和分离培养：取相当于、和（或、、）供试品的预培养物或其稀释剂分别接种至适应体积（经方法适用性试验确定）肠道增菌液体培养基中，30～35℃培养24～48小时后，上述每一培养物分别划线接种于紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基的平板上，30～35℃培养18～24小时。 判断结果：若紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基平板上有菌落生长，则对应培养管为阳性，否则为阴性。
乳酸菌的生理生化特性
1.形态和培养特征观察 采用牛肉膏蛋白胨培养基,将已纯化后的甘油菌种活化后于37℃下培养20～24h ,并进行革兰氏染色及菌体形态和菌落特征的观察。染色方法参照微生物鉴定实验指导 2.生长条件试验 (1)耐盐性试验(NaCl 浓度:0. 85 、1. 20 和1. 71) (mol/ L) ; (2)耐酸碱试验(p H :4. 3 、5. 7 、6. 8 、8. 4 、8. 6 和8. 7) ; (3)温度梯度试验(温度: 10℃、30℃、40℃、50℃、55℃、60℃和65℃) 。 分别将参试菌接种于以上处理的液体培养基中培养48 h ,记录生长状况。 3.生理生化试验 ⑴过氧化氢酶测定 将实验菌接种于PGY培养基斜面上,37℃培养20h—24h,取一环接种的培养物,涂于干净的载玻片上,然后在其上滴加3%－—15%的过氧化氢,有气泡则为阳性反应,无气泡为阴性反应。 ⑵葡萄糖产酸产气实验 在PY基础培养基内加入30g葡萄糖和5%吐温-80,1.6g/100mL的溴甲酚紫1.4mL作指示剂, 在培养基内放置一小倒管,分装试管置37℃培养24h, 经培养后,指示剂变黄表示产酸,倒管内出现气泡,表示产气。 ⑶淀粉水解实验 接种新鲜的菌种于含有0.5g可溶性淀粉的PY基础培养基中,取少许培养液于比色盘内,同时取未接种的培养液作对照,分别在其中加入卢哥氏碘液.不显色表示淀粉水解,显蓝黑色或蓝紫色时,表示淀粉未水解或水解不完全。 ⑷明胶液化实验 将实验菌接种于明胶基础培养基中,置37℃培养,以一支未接种的试管作为对照。将接种的和未接种的对照管置于冰箱或冷水中,等待对照管凝固后记录实验结果,反复观察对比多次。如对照管凝固时,接种管液化为阳性反应,凝固为阴性反应 ⑸甲基红（M.R）试验 接种实验细菌于PYG培养基，于37℃培养2天后，于培养物中加入几滴甲基红酒精溶液，如呈红色，表示阳性。 ⑹乙酰甲基甲醇V-P实验 接种新鲜的实验菌种于培养基中, 37℃培养2天后,取培养液1mL在其中 加入1ml 10％的NaOH，混匀，再加入3－4滴2%氯化铁溶液。数小时后，培养基表面的下层出现红色者，为阳性 ⑺柠檬酸盐 取幼龄菌种接种于柠檬酸盐斜面培养基上，适温培养3－7天，培养基呈碱性（蓝色）者为阳性反应，不变者则为阴性 ⑻酪素水解试验 牛奶平板的制备：取5g脱脂奶粉加入50mL蒸馏水中（或用50mL脱脂牛奶），另称1.5g琼脂溶于50mL蒸馏水中，将两液分开灭菌。待冷至45－50℃时，将两液混匀倒平板，即成牛奶平板。将平板倒置过夜，使表面水分干燥，然后将菌种点接在平板上，每皿可点接3－5株菌。适温培养1、3、5天，记录菌落周围和下面酪素是否已被分解而呈透明。配制该培养基时，切勿将牛奶和琼脂混合灭菌，以防牛奶凝固 ⑼厌氧生长测定 将菌种接入营养肉汤平板后,用密封带包好放入CO2培养箱37℃培养2天后,观察生长情况,生长则为阳性(10)厌氧硝酸盐产气 接种封油：以斜面菌种用接种环接种后，用凡士林油（凡士林和液体石蜡为1:1）封管，封油的高度约1厘米。必须同时接种不含有硝酸钾的肉汁胨培养液作对照。 观察结果：培养2－7d，观察在含有硝酸钾的培养基中有否生长和产生气泡。如有气泡产生，表示反硝化作用产生氮气，为阳性反应。但如不含硝酸钾的对照培养基也可产生气泡，则只能按可疑或阴性处理。 (11)石蕊牛奶的反应
重金属对植物生理生化的影响
重金属对植物生理生化特性的影响（综述） 摘要 随着工农业的迅速发展，环境污染日益严重，特别是重金属在环境中的释放严重污染了土壤、水体和大气，并且可通过食物链进人生物体，危害人类健康，因此，重金属污染已成为世界性的重大环境问题。重金属的来源有多种途径，除采矿区的尾矿、矿渣、冶炼、有毒气体的排放之外，还有城市垃圾、金属电镀、汽车尾气排放、工业企业向环境排放的“三废”、化工产品在农业中的不合理使用、农田的污水灌溉等等，这些途径都将导致环境的重金属污染。通常植物在受到重金属污染时都会出现生长迟缓、植株矮小、根系伸长受抑制直至停止、叶片褪绿、出现褐斑等症状，严重时甚至导致作物产量降低和植物死亡[1，2]。多年来，人们就重金属对植物的毒害作用做了大量的研究工作，特别是近年来有关重金属对植物毒害的分子机理也有较多报道，本文就重金属对植物生理生化的影响的研究现状作一综述。 关键字：重金属，植物，生理生化。 1.影响植物根系对土壤营养元素的吸收 重金属污染能影响植物根系对土壤中营养元素的吸收，其主要原因是影响了土壤微生物的活性，影响了酶活性。重金属与某些元素之间有拮抗作用，也可能会影响植物对某些元素的吸收。沈阳农业大学张宁、唐咏[3]的研究表明，Cr能明显降低水生植物凤眼莲的根系活力，影响植株生长。 2.引起植物细胞超微结构的改变 当植物受到重金属毒害未出现可见症状之前，实际上在细胞内部已有
亚细胞结构的变化，从而导致这些细胞器参与的生理生化功能抑制或丧失。据彭鸣、王焕校等人[2]的研究表明，当重金属污染较轻时，细胞核、线粒体、叶绿体等细胞器没有明显变化，这时植株外部形态也不会表现出很明显的受害症状。而污染严重时，细胞核、线粒体、叶绿体等细胞器的结构均被破坏，此时植株外部形态会表现出叶片褪绿、萎蔫，根生长受抑制，乃至植株死亡。 3.影响细胞膜透性 重金属能影响植物细胞膜透性。王正秋[4]等对Pb2+，Cr3+，Zn2+对芦苇幼苗质膜的影响进行了研究，结果表明Pb2+，Cr3+，Zn2+对芦苇幼苗根系和叶片的电解质渗漏影响显著，且随处理浓度的增加和处理时间的延长而加剧，其中Cr3+和Zn2+的作用更明显。张宁、唐咏[3]的研究表明，Cr3+污染可增加凤眼莲膜脂过氧化，并使其细胞膜透性增加，且伤害程度与Cr3+浓度呈正相关，而且膜脂过氧化的发生要早于膜透性的改变。目前，细胞膜透性被广泛地用作评定植物对重金属反应的方法之一。 4.影响植物光合作用和呼吸作用 对于重金属对植物光合作用的影响研究比较广泛，结果表明，对光合作用的影响是植物受害的主要原因。许多研究[3]说明，重金属Cr3+可使高等植物的叶绿素含量明显降低，原因是重金属离子直接干扰了叶绿素的生物合成。在大麦幼苗中，Cr3+通过影响原叶绿素酸酯还原酶的活性抑制叶绿素的合成。据王泽港[5]等报道，重金属离子对叶绿素的影响不是由于取代叶绿素卟啉环中的Mg，而是通过影响叶绿素合成酶以及抑制一些参与光合作用的酶的活性等其他途径而产生的。张宁、唐咏[3]就Cr3+对凤眼莲光合作用的影响进行了研究，结果表明，较低浓度Cr3+时(Cr≤0．025mmol/L)，凤眼莲叶绿素含量有所增加，而较高浓度Cr3+时
细菌鉴定中常见的生理生化反应
实验五细菌鉴定中常见的生理生化反应 16111202班史政伟1120122681 一、实验目的 1)了解细菌生理生化反应原理，掌握细菌鉴定中常见的生理生化反应方法。 2)了解不同细菌对不同含碳、含氮化合物的分解利用情况。 3)了解细菌在不同培养基的不同生长现象及其代谢产物在鉴别细菌中的意义。 二、实验原理 各种细菌所具有的酶系统不尽相同，对营养基质的分解能力也不一样，因而代谢产物存在差别。以此用生理生化试验的方法检测细菌对各种基质的代谢作用及其代谢产物，从而鉴别细菌的种属，称之为细菌的生理生化反应。 1.糖（醇）类发酵试验 不同的细菌含有发酵不同的糖（醇）的酶，因而发酵糖（醇）的能力各不相同，产生的代谢产物也不同：有的产酸产气，有的产酸不产气。指示剂溴甲酚紫，pH5.2黄色—pH6.8紫色，当发酵产酸时，培养基将由紫变黄。产气可由杜氏小管中有无气泡来证明。 2.甲基红试验（M.R试验） 甲基红试验，pH4.4红色～pH6.2黄色，是用来检测由葡萄糖产生的有机酸，如甲酸、乙酸、乳酸等。有些细菌分解糖类产生丙酮酸，丙酮酸进一步反应形成甲酸、乙酸、乳酸等，使培养基的pH降低到4.2以下。有些细菌在培养的早期产生有机酸，但在后期将有有机酸转化为非酸性末端产物，如乙醇、丙酮酸等，使pH升至大约6。 3.Voges-Proskauer试验（伏-普试验，V.P. 试验） 伏-普试验是用来测定某些细菌利用葡萄糖产生非酸性或中性末端产物的能力。某些细菌分解葡萄糖成丙酮酸，再将丙酮酸缩合脱羧成乙酰甲基甲醇。乙酰甲基甲醇在碱性条件下，被氧化为二乙酰，二乙酰与培养基中所含的胍基作用，生成红色化合物为V.P.反应阳性。 4.靛基质试验 某些细菌，如大肠杆菌，能产生色氨酸酶，分解蛋白胨中的色氨酸，产生靛基质，靛基质与对二甲基氨基苯甲酸结合，形成玫瑰色靛基质。 5.硫化氢试验 某些细菌能分解含硫的氨基酸，产生硫化氢，硫化氢与培养基中的铁盐反应，形成黑色的硫化铁沉淀，为硫化氢试验阳性。 6.明胶液化实验 明胶在25度以下可维持凝胶状态，以固体状态存在，而在25度以上时明胶就会液化。有些微生物可产生一种成为明胶酶的胞外酶，水解这种蛋白质，而使明胶液化，甚至在4 度仍能保持液化状态。 7.柠檬酸盐利用试验 有的细菌如产气杆菌，能利用柠檬酸钠为碳源，因此能在柠檬酸盐培养基上生长，并分解柠檬酸盐后产生碳酸盐，使培养基变为碱性。此时培养基中的溴麝香草酚蓝指示剂 pH6.0(黄)～7.6(蓝)，由绿色变为深蓝色。 8.淀粉水解实验 细菌水解淀粉的过程可以通过底物的变化来证明，即用碘测定不再产生蓝色。 三、实验仪器、材料和用具 实验仪器：32度恒温培养箱、4度冰箱； 微生物材料：大肠杆菌、变形杆菌、枯草杆菌、产气杆菌、待鉴定的未知菌的平板单菌落；
耐胆酸革兰阴性菌检查法
耐胆酸革兰阴性菌、大肠埃希菌和沙门菌检查法 1．所用方法：平皿法 1.1.培养基制备： 1.1.1.肠道菌增菌液体培养基制备： 1.1.1.1.取脱水肠道菌增菌液体培养基加水配制后，按验证过的高压灭菌程序灭菌备用。 1.1. 2.紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基制备： 1.1. 2.1.取脱水紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基加水配制后，按验证过的高压灭菌程序灭菌备用。 1.1.3.胰酪大豆胨液体培养基制备： 1.1.3.1. 取脱水胰酪大豆胨液体培养基加水配制后，按验证过的高压灭菌程序灭菌备用。 1.2.供试品检查： 1.2.1.阳性对照试验： 各取不大于100cfu的大肠埃希菌和铜绿假单胞菌接入肠道菌增菌液体培养基和紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基中，在规定的温度和最短的时间下培养，应检出相应的控制菌。 1.2.2.阴性对照试验： 1.2.2.1以稀释剂代替供试液照相应控制菌检查法检查，阴性对照试验应无菌生长。如果阴性对照有菌生长，应进行偏差调查。 1.2.3.供试液制备和预培养: 1.3.3.1.取供试品，用胰酪大豆胨液体培养基作为稀释剂照“非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法”制成1 : 10供试液，混匀，在20?25°C培养，培养时间应使供试品中的细菌充分恢复但不增殖(约2小时)。 1.2.4.定性试验： 1.2.4.1.除另有规定外，取相当于l g 或lm l供试品的上述预培养物接种至适宜体积(经方法适用性试验确定）肠道菌增菌液体培养基中，30?35°C培养24?48小时后，划线接种于紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基平板上，30?35°C培养18?24小时。如果平板上无菌落生长，判供试品未检出耐胆盐革兰阴性菌。 1.2.5.定量试验： 1.2.5.1选择和分离培养取相当于0.1g 、O.Olg和O.OOlg(或0. 1ml、0. 01ml和0. OOlml) 供试品的预培养物或其稀释液分别接种至适宜体积(经方法适用性试验确定）肠道菌增菌液体培养基中，30?3 5C培养24?4 8小时。上述每一培养
细菌常用生理生化鉴定
细菌鉴定中常用的生理生化反应 录入时间:2009-8-13 15:12:12 来源：中国生命科技论坛 1、实验原理 （1）细菌生化试验 各种细菌所具有的酶系统不尽相同，对营养基质的分解能力也不一样，因而代谢产物或多或少地各有区别，可供鉴别细菌之用。用生化试验的方法检测细菌对各种基质的代谢作用及其代谢产物，从而鉴别细菌的种属，称之为细菌的生化反应。 （2）糖（醇）类发酵试验 不同的细菌含有发酵不同糖（醇）的酶，因而发酵糖（醇）的能力各不相同。其产生的代谢产物亦不相同，如有的产酸产气，有的产酸不产气。酸的产生可利用指示剂来判定。在配制培养基时预先加入溟甲酚紫［P HS . 2 （黄色）一6 . 8 （紫色）] ，当发酵产酸时，可使培养基由紫色变为黄色。气体产生可由发酵管中倒置的杜氏小管中有无气泡来证明。 （3）甲基红（Methylred ）试验（该试验简称MR 试验） 很多细菌，如大肠杆菌等分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸再被分解，产生甲酸、乙酸、乳酸等，使培养基的pH 降低到4 . 2 以下，这时若加甲基红指示剂呈现红色。因甲基红指示剂变色范围是pH4 . 4 （红色）一pH6 . 2 （黄色）。若某些细菌如产气杆菌，分解葡萄糖产生丙酮酸，但很快将丙酮酸脱梭，转化成醇等物，则培养基的pH 仍在6 . 2 以上，故此时加入甲基红指示剂，呈现黄色。 （4）大分子物质代谢实验． 靛基质（口引睬）试验 某些细菌，如大肠杆菌，能分解蛋白质中的色氨酸，产生靛基质（叫睬），靛基质与对二甲基氨基苯甲醛结合，形成玫瑰色靛基质（红色化合物）。 硫化氢试验 某些细菌能分解含硫的氨基酸（肌氨酸、半肌氨酸等），产生硫化氢，硫化氢与培养基中的铅盐或铁盐，形成黑色沉淀硫化铅或硫化铁。为硫化氢试验阳性，可借以鉴别细菌。 明胶液化实验 某些细菌具有胶原酶，使明胶被分解，失去凝固能力，呈现液体状态，是为阳性。淀粉水解试验（在紫外诱变中做，本实验不做） 细菌对大分子的淀粉不能直接利用，须靠产生的胞外酶（淀粉酶）将淀粉水解为小分子糊精或进一步水解为葡萄糖（或麦芽糖），再被细菌吸收利用，细菌水解淀粉的过程可通过底物的变化来证明，即用碘测定不再产生蓝色。 （5）有机酸盐及氨盐利用试验 柠檬酸盐利用试验 柠檬酸盐培养基系一综合性培养基，其中柠檬酸钠为碳的唯一来源。而磷酸二氢按是氮的唯一来源。有的细菌如产气杆菌，能利用柠檬酸钠为碳源，因此能在柠檬酸盐培养基上生长，并分解柠檬酸盐后产生碳酸盐，使培养基变为碱性。此时培养基中的溟廖香草酚蓝指示剂由绿色变为深蓝色。不能利用柠檬酸盐为碳源的细菌，在该培养基上不生长，培养基不变色。 2、实验仪器，材料和用具 （1）实验仪器 37OC 恒温培养箱、20OC 恒温培养箱（室温代替）。 （2）微生物材料 大肠杆菌、变形杆菌、枯草杆菌、产气杆菌这四种菌种的斜面各1 支。 （3）试剂
乳酸菌1
乳酸菌的耐酸机制 摘要:对乳酸菌耐酸机理进行了初步介绍, 主要从以下几个方面进行 了阐述, 包括质子泵机制、蛋白质及RNA修复、细胞膜及代谢方式的改变和碱生成等, 以期为人们了解乳酸菌耐酸的生理生化机制提供借鉴, 为研究者对乳酸菌耐酸性研究提供理论指导。 关键词:乳酸菌; 耐酸性; 机理 Review on the Mechanism of Acid Tolerance of Lactic Acid Bacteria Abstract:This review provided the possible acid tolerance mechanism of Lactic acid bacteria, including proton pump, repair of protein and RNA, cell membrane and metabolic ways change, production of alkali and so on. The purpose of this article was to make comprehensive understandings of the mechanism for acid tolerance of Lactic acid bacteria and provide a theoretical basis for the research work related to Lactic acid bacteria. Key words:Lactic acid bacteria; acid tolerance; mechanism 引言 乳酸菌是一类能利用可发酵糖产生大量乳酸的细菌的通称。它们在自然界分布广泛，可栖居于人和动物的肠道及其他器官中。在土壤、植物根际和许多的人类食品、动物饲料，还有自然界的湖泊和污泥以及一些临床样品中都发现有乳酸菌的存在。很久以前人们就利用乳酸菌来发酵动物（乳、肉、鱼等）和植物制品（蔬菜、葡萄酒、橄榄等）生产各种各样的产品。随着食品发酵工业的不断发展壮大，乳酸菌的经济效益不断在增长，因为虽然它们在发酵食品中的含量非常少，但是对食品的感官品质和质量却有决定作用。因此，发酵剂菌株的质量功能特性和生长特性对于产品的成功发酵是非常必要的。 乳酸菌不但包括在食品发酵中使用的一般认为安全的微生物，而且还包括胃肠道中普遍存在的共生体和具有潜在益生作用的益生菌。对这些微生物来说，食品和胃肠道中的酸性环境对它们的生存是一个很大的挑战。例如，益生菌的最佳
生理生化实验
(第10章肠杆菌科 一、教学大纲要求 （1）肠杆菌科分类 （2）肠杆菌科细菌共同特性 （3）肠杆菌科各菌属特性 （4）肠杆菌科细菌临床意义 （5）肠杆菌科各菌属鉴别 （6）肠杆菌科实验室检查 二、教材内容精要 （一）肠杆菌科概述 1．分类 肠杆菌科是一大类生物学性状相似的革兰阴性杆菌。与临床医学密切相关的肠杆菌科细菌主要有14个菌属：埃希菌属、志贺菌属、爱德华菌属、沙门菌属、枸橼酸菌属、克雷伯菌属、肠杆菌属、哈夫尼亚菌属、多源菌属、沙雷菌属、变形杆菌属、摩根菌属、普罗威登斯菌属、耶尔森菌属。 2．肠杆菌科共同特性 （1）生物学特性：革兰阴性杆菌，无芽胞，有菌毛，多数有周身鞭毛。需氧或兼性厌氧，营养要求不高，生化反应活跃，氧化酶－，发酵葡萄糖产酸、产气或不产气，触酶＋，能还原硝酸盐为亚硝酸盐。 （2）抗原构造：肠杆菌科抗原构成主要有菌体抗原（O抗原）、鞭毛抗原（H抗原）、表面抗原、菌毛抗原等。O抗原与H抗原为肠杆菌科血清学分群与分型的依据，但是O抗原与相应抗体之间的反应可被表面抗原和菌毛抗原阻断。 （3）毒力因子：主要有菌毛或菌毛样结构、荚膜或微荚膜、外膜蛋白、内毒素及外毒素等。3．临床意义 肠杆菌科细菌多为肠道正常菌群，除沙门菌属、志贺菌属、埃希菌属部分菌种、耶尔森菌属有致病作用外，其余均为条件致病菌，可导致医院感染。 4．鉴定与鉴别 （1）科间鉴别：氧化酶阴性基本可将肠杆菌科与弧菌科、非发酵菌、巴斯德菌科区别开来。后3类菌均为阳性(表10-1)。 表10-1 肠杆菌科与其它革兰阴性杆菌区别 试验肠杆菌科弧菌科发酵菌巴斯德菌科 葡萄糖氧化、发酵发酵发酵氧化或不分解发酵氧化酶－＋＋* ＋ 形态杆状弧状、杆状杆状球杆状 鞭毛周鞭毛或无单鞭毛单、丛、周鞭毛或无无鞭毛注：*不动杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌除外 （2）分类鉴别：用苯丙氨酸脱氨酶试验和葡萄糖酸盐试验可将肠杆菌科分为三大类(表10-2)。 表10-2 肠杆菌科初步分类
革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的区别()
革兰氏阳性细菌与阴性细菌的比较 把细菌采用龙胆紫染色，涂碘加强染色。然后用酒精脱色，革兰氏阳性菌不会被脱色呈现紫色，革兰氏阴性菌会被脱色呈现红色。在治疗上，大多数革兰氏阳性菌都对青霉素敏感；而革兰氏阴性菌则对 1.阳性的肽聚糖厚，阴性的肽聚糖薄，如下图： 2.阳性菌有磷壁酸，阴性菌没有。磷壁酸如下图： 3.阳性菌无外膜，阴性菌有外膜，其图如下： 1884年革兰氏染色法被发明，用于细菌的形态观察和分类，根据革兰氏染色反应的基本特征，细菌可以主要分为两大类：G阳性（G+）和G阴性（G-）。前者经过染色后细菌细胞仍然保留初染结晶紫的蓝紫色，后者经过染色后细菌细胞则先脱去了初染结晶紫的颜色，带上了复杂蕃红或沙黄的红色。本文将从细胞形态和结构，生理特性以及在生产生活中不同的运用这三个方面，来对革兰氏阳性细菌与阴性细菌进行进一步比较。 一、细胞形态和结构 细胞的基本结构包括细胞壁和原生质体两部分。原生质体位于细胞壁内，包括细胞膜（细胞质膜）、细胞质、核质和内含物。另外细胞还含有有些特殊结构，主要有荚膜、芽孢、鞭毛和菌毛等4种。由于革兰氏阳性细菌与阴性细菌在结构上的差别主要在于细胞壁，故本文就细胞壁与非细胞壁结构两部分来进行集中比较。
1.细胞壁 革兰氏染色的机理主要是抓住了革兰氏阳性细菌与阴性细菌在细胞壁的结构与组成上的不同，具体比较见下表： 带负电的部分原因就是因为磷酸壁带负电。同时，磷酸壁赋予了革兰氏阳性细菌以特异的表面抗原（殷士学.环境微生物学.北京:殷机械工业出版社.2008年.P9） 总的说来，细胞壁结构的差异导致了染料吸收的差异，也导致了很多生理特性的不同。 2.非细胞壁结构 在非细胞壁结构中，革兰氏阳性细菌和阴性细菌主要的区别在于是否有芽孢和鞭毛与性菌毛的不同上。 芽孢是某些细菌菌体发育过程中的一个阶段，在一定的环境条件下由于细胞质和核质的浓缩凝集形成的一种特殊结构。革兰氏阴性细菌中没有会形成芽孢的菌种，而部分革兰氏阳性细菌可以。 另外，在鞭毛和性菌毛方面两者也有不同。鞭毛和性菌毛都是附属物。某些细菌表面伸出的细长、波曲的附属物称为鞭毛。（顾夏生,胡洪营,文湘华,王慧等.水处理生物学.北京:中国建筑工业出版 社.2010年.P16）革兰氏阳性细菌的鞭毛上基本着生两个环，革兰氏阴性细菌则基本着生四个环。（赵开弘.环境微生物学.武汉:华中科技大学.2009年.P30）性菌毛只见于革兰氏阴性菌，参与细胞间称作接合作用的交配过程。 二、生理特性 以下是关于革兰氏阳性细菌和阴性细菌在生理特性方面的比较。两者的不同从本质上来说，还是主要是由细胞结构的不同所决定的。
关于乳酸菌的文献
论文相似性检测报告 论文相似性检测报告（详细版） 报告编号：ed77aded-ecfd-49f9-97a7-a1ce0125cb50 原文字数：8,812 检测日期：2013年05月30日 检测范围：中国学术期刊数据库（CSPD）、中国学位论文全文数据库（CDDB）、中国学术会议论文数据库（CCPD）、中国学术网页数据库（CSWD） 检测结果： 一、总体结论 总相似比：53.33% (参考文献相似比：0.00%，排除参考文献相似比：53.33%) 二、相似片段分布 注：绿色区域为参考文献相似部分，红色区域为其它论文相似部分。 三、相似论文作者（举例9个） 点击查看全部举例相似论文作者 四、典型相似论文（举例78篇） 序号相似比相似论文标题参考文献论文类型作者来源发表时间115.56%CLA功能性玉米秸秆青贮生产及其对草鱼生产性能的影响学位论文马海桥安徽农业大学2009 214.44%乳酸菌的生理功能及在畜牧业中的应用期刊论文国春艳 等饲料工业2006 313.33%益生菌在慢性重型肝炎患者的应用效果观察期刊论文翁田波 等中国社区医师（医学专业）2012 411.11%天然乳酸菌的作用及在畜禽饲料中应用的效果期刊论文陈广香 等养殖技术顾问2011
论文相似性检测报告 点击查看全部举例相似论文 五、相似论文片段（共10个） 序号相似比相似论文标题参考文献论文类型作者来源发表时间511.11%瑞士乳杆菌发酵乳蛋白肽与抗ACE功能的研究 学位论文霍建新天津科技大学2007610.00%产CLA乳酸菌培养物对肉仔鸡生长性能及其小肠发育与菌群的影响学位论文陈佳安徽农业大学200878.89%瑞士乳杆菌发酵剂制备及其发酵产物生物活性的评价学位论文孙囝天津科技大学200888.89%乳酸菌的研究及其应用 期刊论文赵红霞 等江西饲料20039 7.78%高产类胡萝卜素的红酵母与乳酸菌素在“无抗”肉鸡生产上的应用及 其互作效应学位论文 张景琰 中国农业大学 2006 107.78%乳酸菌及其在畜牧生产中的应用期刊论文杨建军 等畜禽业200211 6.67%浅述乳酸菌发酵在乳品加工中的应用 期刊论文李晓红 等广西轻工业200812 6.67%一株降胆固醇乳酸菌的筛选及其生物学特性的初步研究学位论文金鑫内蒙古农业大学200813 6.67%L.casei Zhang抗感染及免疫协同作用的研究学位论文张七斤内蒙古农业大学200614 6.67%磁弹性无线微生物传感器研究 学位论文戈树田湖南大学200915 5.56%新城疫病毒F基因乳酸菌表达载体的构建与表达 学位论文 宁军 吉林农业大学 2008
遮阴对3种地被植物幼苗生长及生理生化特性的影响
遮阴对3种地被植物幼苗生长及生理生化特性的影响 本文以蓝刺头(Echinops sphaerocephalus L.)、二月兰(Orychophragmus violaceus L.)、紫花地丁(Viola philippica Car.)3种地被植物为研究对象,进行了耐阴性研究。通过5种不同梯度的遮阴处理(分别为0%遮阴度、30%遮阴度、50%遮阴度、70%遮阴度以及90%遮阴度),从3种地被植物幼苗生长指标、生理指标和光合指标这3个方面进行耐阴性的鉴定,通过隶属函数分析对3种地被植物的耐阴能力进行综合评价,并从中筛选出植物耐阴性鉴定的有效指标,使以后的耐阴评价工作更加快捷、方便。 试验结果如下:(1)遮阴对生长指标的影响:叶长、叶宽、株高和叶面积在5种不同的遮阴梯度处理下,叶长、叶宽、株高和叶面积总体上表现为随着遮阴度的增加而逐渐增加。(2)遮阴对生理生化指标的影响:叶绿素a+b含量、相对质膜透性都随着遮阴度的增加和遮阴时间的增加呈现出上升的趋势;过氧化物酶则表现为呈现“V”字型趋势,遮阴对可溶性蛋白和丙二醛含量的影响变化趋势不明显,说明遮阴对二者影响较小。 (3)遮阴对光合日变化的影响:净光合速率、气孔导度、胞间CO2浓度和蒸腾速率均为单峰型变化曲线,在13:00时为峰值的最高点或者最低点。这与植物的耐阴性密切相关。 (4)确定了3种地被植物的可生长光照范围:二月兰比紫花地丁的可生长光照范围大,紫花地丁比蓝刺头的可生长光照范围大。二月兰在全光照到90%遮阴度下都能正常生长,最适光照为70%遮荫度;紫花地丁在全光照到70%遮阴度下能够正常生长,70%遮荫度为最适光照。 蓝刺头在50%遮阴度下生长最佳,在遮荫度0%、30%和70%下正常生长。(5)
细菌生理生化实验
细菌生理生化试验—小木虫 微生物生理生化反应是指用化学反应来测定微生物的代谢产物，生理生化反应常用来鉴别一些在形态和其它方面不易区分的微生物。因此微生物生理生化反应是微生物分类鉴定中的重要依据之一,微生物鉴定中常用的生理生化反应如下所示： (一) 糖、醇发酵试验 原理： 不同微生物分解利用糖类的能力有很大差异，或能利用或不能利用，能利用者，或产气或不产气。可用指示剂及发酵管检验。有些细菌分解某些糖（醇、苷）产酸（符号：+）、产气（符号：○），培养基由紫（蓝）变黄（指示剂溴甲酚紫或溴百里酚蓝由紫或蓝遇酸变黄的结果），并有气泡；有些产酸，仅培养基变黄；有些不分解糖类（符号：－），培养基仍为紫（蓝）色。 培养基配制： 一般细菌常用休和李夫森二氏培养基： 蛋白胨：2g ，K2HPO4 :0.2g ，NaCl:5g ，糖（醇、糖苷）：1% ，水洗琼脂：5～6g，蒸馏水：1000mL，PH:6.8～7.0，溴百里酚蓝：1%水溶液3mL(先用少量的95%乙醇溶解后，再加水配成1%水溶液)。先调PH后再加指示剂。 芽孢杆菌培养基配制： (NH4)2HPO4:1g ，MgSO4:0.2g ，KCl:0.2g ，酵母膏：0.2g ，糖（醇、糖苷）：1%水洗琼脂：5～6g ，蒸馏水：1000mL ，溴甲酚紫：0.4%乙醇液2mL，PH:6.8～7.0。先调PH后再加指示剂。 将以上培养基分装试管，培养基高度约为4～5cm ，115℃灭菌20min。 测定的糖（醇、糖苷）类可以包括：葡萄糖、蔗糖、甘露糖、乳糖（1.5%）、半乳糖（1.5%）、D-山梨醇、果糖、阿拉伯糖、麦芽糖、纤维二糖、木糖、水杨苷等。 注意：以上亦可用液体培养基。 接种和观察结果： 用18～24h的幼龄菌种，用穿刺针接种于培养基中，适温培养1d，3d，5d后观察，颜色变黄为阳性，不变为阴性；有气泡产生为产气。 结果记录： 产酸：+，产气：○，不产酸长气：- 。 (二) 淀粉水解试验 原理： 某些细菌可以产生分解淀粉的酶，把淀粉水解为麦芽糖或葡萄糖。淀粉水解后，遇碘不再变蓝色。 培养基配制： 牛肉膏5g；NaCl:5g；可溶性淀粉5g；琼脂:20g；蒸馏水1000mL。PH:7.2 121℃灭菌20min。 试验方法： 以18~24h的纯培养物，点接于淀粉琼脂平板（一个平板可分区接种）或直接移种于淀粉肉汤中，于36±1℃培养24～48h，或于20℃培养5天。然后将碘试剂直接滴浸于培养表面，若为液体培养物，则加数滴碘试剂于试管中。立即检视结果，阳性反应（淀粉被分解）为琼脂培养基呈深蓝色、菌落或培养物周围出现无色透明圈、或肉汤颜色无变化。阴性反应则无透明圈或肉汤呈深蓝色。 淀粉水解系逐步进行的过程，因而试验结果与菌种产生淀粉酶的能力、培养时间，培养