人乳腺癌细胞;MCF7贴壁培养

北京索莱宝科技有限公司

人乳腺癌细胞；MCF7贴壁培养

细胞名称：人乳腺癌细胞；MCF7

形态特性：上皮细胞

生长特性：贴壁生长

培养条件：高糖DMEM，10%FBS

传代方法：1:3传代

冻存条件：细胞冻存液

特征特性：MCF-7细胞保留了多个分化了的乳腺上皮的特性，包括：能通过胞质雌激素受体加工雌二醇并能形成圆形复合物（domes）。该细胞含有Tx-4癌基因。肿瘤坏死因子α（TNF alpha）可以抑制MCF-7细胞的生长。抗雌激素处理细胞能调变IGFBP’S的分泌。

细胞处理方法：

1.细胞在培养瓶中培养至状态良好后灌满培养基运输，获得细胞后用酒精棉球擦拭瓶口消毒，然后在超

净台中操作。

2.如细胞生长至70%-80%，将瓶中的培养基移入无菌瓶中留作培养使用，保留5-8mL培养基在37℃、5%

的CO2的温箱中继续培养。细胞培养至90%-100%后，按要求消化传代。

3.弃去培养基，用无菌PBS或者其他缓冲液清洗细胞2次，加入适量胰蛋白酶消化（EDTA胰酶），待细胞

完全脱壁后加培养基吹打混匀，分瓶培养。

注意：

我们使用自产培养基及进口血清培养细胞，在您拿回细胞后，如想更换其它品牌培养基，请依照逐次替换的原则，先保留培养瓶中的培养基，多日多次代逐步更换，以减轻对细胞的刺激。

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细胞培养操作步骤

培养基的配置：基础培养基500ml+胎牛血清50ml+双抗5ml 冻存液的配置：DMS018ml+胎牛血清2ml。 依次比例酌量配置。 超净工作台常规配置 移液器1套（2.5小20 d、200 pl> 1ml）,酒精灯1盏，液器1台，斜架1台， 酒精喷壶 1 个，酒精棉球缸 1 个，污缸 1 个， 常规耗材：培养瓶（50 cm 2）,定量移液管（5ml、10ml）,枪头（1ml、200小 10 d）,培养皿，6/24/48/96孔板，医用脱脂棉球，保种管 所需试剂：gibco高糖培养基，胎牛血清，双抗，DMSO,胰酶，苯扎溴氨，75% 酒精…… 实验前准备： 所需的各项高压后的耗材放于超净工作台内，用酒精喷壶喷洒实验台面，并关闭工作台打开紫外灯照射30min 后开始实验操作。 首次传代前细胞的复苏，首先用一大烧杯盛满37C的温水放于液氮罐旁边，待 细胞株取出后留上端1/3于37C水面上尽最大速摇动管使其在2min内迅速融化。若 种管顶部含有冻存的细胞液在摇动期间用力甩动使其降于管底后再摇动。这一过程可在超净工作台外操作。 实验步骤 一、原代细胞的培养 1. 紫外消毒30min 后关闭紫外灯，开启超净台正常工作状态，用酒精消毒操作者的 双手。 2. 将所需的培养基确保瓶身干净后放于工作台面内，点燃酒精灯，将培养基瓶口用酒 精棉球擦拭后，再将瓶口对准在酒精灯上消毒2-3 次，旋开瓶盖后再次分别消毒瓶口和瓶盖，分别放于酒精灯的两侧。特别是将培养基瓶放于斜架上，瓶口对准酒精灯，且放在距离酒精灯最近的位置，瓶盖置于酒精灯的另一侧。 3. 取1 个高压后的新培养瓶，瓶口在酒精灯上消毒2-3 次，旋开后分别再次消毒瓶 口和瓶盖2-3 次分别放于酒精灯两侧，把保种管在超净台外用酒精棉球擦拭下2/3 后拿进超净台内在酒精灯上消毒保种管口2-3次放于台面左手边，取1ml 移液器快速移动在酒精灯上消毒1-2 次，然后再装上枪头吸取保种管内的细胞液，悬空移入培养瓶内。 4. 拿出1 支高压后的5ml 定量移液管，在酒精灯上灼烧尾部后装于电动移液器上， 再次放于酒精灯上灼烧整个定量移液管管身2-3 次，悬空进入培养基瓶内吸取4ml 培养基再悬空移入培养瓶内，将培养瓶瓶口和瓶盖在酒精灯上消毒2-3 次后拧紧平放，在瓶身做好实验标记。 5. 将培养基瓶口和瓶盖消毒2-3 次后拧紧，熄灭酒精灯，整理实验台面，取出实验试 剂及污缸等，关闭超净工作台。 6?将培养瓶放于28C,5%CO2的培养箱内培养，旋开瓶口少许。注意整个培养箱底托盘内一定要放高压后的水，且定期更换确保无菌。 在CO2培养箱内培养10-12h，瓶盖拧紧后拿出培养箱，置于荧光倒置显微镜下观察细胞贴壁情况，及细胞形态。最后更换培养液。 、培养液的更换

细胞培养集锦(一个培养300多种细胞人的经验总结)

细胞培养集锦(一个培养300多种细胞人的经验总结) 一、消化与吹打 版上很多朋友讨论细胞培养问题，见到很多很好的经验总结，这里说一些我个人的经验，因为一些比较特殊的原因，我自己培养接触过近300种细胞，常用于做实验的，累积有百余种，可以说遇到过许多各式各样古怪的细胞。这里挑细胞消化开始做我的第一篇专题，并不是因为细胞消化最重要，而是近期看到大家频繁讨论这个话题，我就抛砖引玉，下面几点拙见，可能与其它朋友总结的一些经验有点出入，仅供大家参考。 许多同学对细胞消化做了许多研究，得出了很多有价值的经验，也见到很多人的困惑。其实细胞培养，尤其是细胞系的培养，就消化而言，不是太难，做得多了，善于总结经验，就能把细胞越养越好。一般的程序步骤，细节操作，我这里就不讲了，只讲一些基本操作背后的知识，如果不对之处，欢迎指正，一起讨论： 1，其实绝大部分细胞消化的时候是只要用胰酶润洗一遍即可，吸去胰酶后，残留的那些无法计算体积的附着在细胞表面的微量胰酶在37度一般不到2min足够消化细胞（绝大部分1min不到）。对于这些细胞原则上不要用胰酶孵育细胞，连续这样传代，对细胞伤害很大。简单的程序是PBS润洗吸去，胰酶润洗吸去，然后37度消化。 2，什么算是消化好了呢？不是细胞全部成间隔分布很离散的单个圆形才算消化好了，一般你肉眼观察贴壁细胞层，只要能移动了，多半呈沙壮移动，其实已经可以了，很多人喜欢把细胞消化或者吹打成完全分离细胞，这是没有必要的。一般能移动了，说明细胞与培养基质材料的附着已经消失了，细胞之间的附着也已经消失了，细胞已经独立分布了（虽然没有呈现很广的离散分布）。这个时候应该停止消化，不要等到看到镜下所有细胞都分离得非常好，间隙很大，才停止。细胞就是完全成单个细胞悬液，之后在贴壁的过程中仍然会聚集，这个是贴壁培养

OPTIMEM进行贴壁细胞培养的实验方法

O P T I-M E M进行贴壁细胞培养的实验方法 日期：2012-05-17来源：互联网作者：青岚点击：194次 ?MEM细胞培养基 无血清培养基可以提供细胞贴壁需要的一些基质，本文总结了利用无血清培养基OPTI-MEM进行贴壁细胞的脂质体转染试验材料，步骤、个人经验以及问题分析。 贴壁细胞的脂质体转染 一、实验材料 1、宿主细胞CHO(贴壁细胞) 2、脂质体LIPOFECTAMINE2000(invitrogen公司) 3、6孔细胞培养版 4、无血清培养基OPTI-MEM(GIBICO) 5、转染级质粒 二、实验步骤 invitrogen的LIPOFECTAMINE2000说明书上列举了24孔、12孔、6孔......板的实验体系，因为需要转染的细胞量大，所以一直采用的是6孔版做的转染。以下是以6孔板为例说明一下我的体系和方法吧! 1、转染前一天，以合适的细胞密度接种到6孔培养板上。(我的接种密度是3~4*105/ml.)转染时，细胞要达到90~95%的融合。 2、溶液1：240ul无血清培养基+10ullipofectamine2000perwell(总体积250ul)(温育5min)

3、溶液2：Xul无血清培养基+4ug质粒perwell(总体积250ul) 4、将溶液1与溶液2混合，室温下置20min。 5、与此同时，将6孔板中的细胞用无血清培养基冲洗细胞两遍后，加入2ml 无血清培养基。 6、将溶液1与溶液2的混合液逐滴加入孔中，摇动培养板，轻轻混匀。在37℃，5%的CO2中保温5~6小时。 7、6小时后，更换含有血清的全培养基，在37℃，5%的CO2中48~72h检测转染水平。 8、如果做稳定转染，换全培养基培养后24h，即可以1：10或更高的稀释比例(根据细胞的生长情况)接种到新的培养板，加抗生素进行筛选。 三、个人经验： 我觉得贴壁细胞的脂质体转染还是很容易的，有了经验之后，现在做转染得心应手，转染前后细胞的形态几乎不发生变化，几乎没有细胞死亡。转染率很高。以下是个人经验，与大家分享。 1.细胞的状态。这点非常重要，不要急于求成，一定要让细胞处于最佳的生长状态再做。有文献说传代不要超过17代。我总是在细胞复苏后的3代左右做，那时细胞状态最好，不要用传了很多代的细胞去做，细胞的形态都会发生变化了。 2.细胞的融合度。细胞的融合度必须要达到90%才能做，细胞太少，容易死的。 3.无血清培养基OPTI-MEM(GIBICO)很好用，有条件的话，就用它代替PBS 洗细胞两遍(我曾比较过OPTI-MEM与PBS或无血清的DMEM，前者的转染效率确实高)。注意洗的时候要轻，靠边缘缓缓加入液体，然后不要吹吸细胞，而是转动培养板让液体滚动在细胞表面。如果洗的太厉害，细胞又损失一部分，加了脂质体后，细胞受影响就更大了，死亡细胞会增多。

细胞培养的过程注意事项

细胞的培养过程及注意事项 根据培养过程中是否需要分割培养物进行再培养而将细胞培养分为原代培养和传代培养。 一、原代培养 （一）过程 原代培养的基本过程包括取材、培养材料的制备、接种及培养等步骤。原代培养的方法很多，基本和最常用的是组织块培养法和分离细胞法。 1、组织块培养法 (1)基本操作过程 1）、用培养液湿润所取组织材料，并用锋利的眼科剪将附在其上的脂肪和结缔组织去除干净。再用平衡液（PBS）或Hanks液漂洗；用锋利的眼科弯剪将组织块剪成小块；再用PBS 或Hanks液漂洗多次，直至液体不浑浊、无油滴、清亮为止。 2）、用湿润的吸管吸取切碎的组织块，清清吹到培养瓶皿中，并将其按一定间距均匀放在培养瓶底壁上，量不要过多，要将组织块切面贴在培养瓶底壁上； 3）、将培养瓶翻转，使瓶底朝上，在种植了组织块一侧的对侧面加足培养液，勿使组织块与培养液接触，塞紧瓶塞； 4）、将种植了组织块的一侧朝上，静置于37℃培养箱中；待组织块贴壁1h到3h后翻瓶，使贴壁的组织块浸没与培养液中，静置； 5）、每隔2到3天更换一次培养液，或者根据培养瓶种颜色的变化确定换液时间。 2、注意事项 1）、组织块接种后的前3天，从组织块向外迁徙的细胞数很少，组织块的黏附不牢固，在观察和移动的过程中，注意不要引起液体的振荡。要避免经常翻动和振动，否则组织块不易附着于瓶壁上或附着后也会脱落飘起。 2）、加入的培养液不宜过多，避免浸泡的组织块受轻微的波动而脱落下来。 3）、用组织块培养时，要及时观察，当细胞向外迁徙出来后要注意记录并去除漂浮的组织块和残留的细胞，因为已漂浮的组织块和那些细胞碎片已经死亡，它们产生的有毒物质会影响原代细胞的生长，要及时清除。

贴壁细胞传代-消化过程图示.

贴壁细胞传代-消化过程图示 贴壁细胞细胞在培养瓶长成致密单层后，继续生长的空间不足，培养基中的营养成份也消耗较多，同时代谢废物也有较多堆积，需要分瓶培养，对细胞进行传代扩增。 对于贴壁不太紧的细胞如293，可以直接吹散后分瓶。而对于贴壁较紧的细胞如CHO，则需要以胰酶消化后再吹散分瓶，一般过程为（以下操作均按无菌操作的要求进行）： o将长成致密单层细胞的细胞瓶中原来的培养液弃去； o加入0.25％胰酶溶液，视细胞瓶的大小加入体积为0.5ml或更多，以使充分浸润； o一般消化时间约为1至3分钟，肉眼观察瓶壁半透明的细胞层，当见到出现细针孔空隙时，弃去胰酶溶液，并加入适量的细胞培养液终止消化； o视实验要求分入多瓶继续培养，一般为一传二到一传四的比例。 这里，胰酶消化的程度是一个关键：消化过度则对细胞的活性损伤较大，并有部分细胞漂浮，随弃去的胰酶流失；消化不足则细胞难于从瓶壁上吹下，反复吹打同样也会损伤细胞活性。 影响消化速度的因素较多，主要有胰酶溶液的活性（配制条件、冻存或4℃保存时间长短、是否反复冻融、化冻后存放时间及温度等）、消化时的温度（气温、细胞培养瓶及胰酶溶液的温度）以及所加胰酶溶液的多少等。以笔者的经验，以轻吹或加培养液后轻摇可下较好，但对于经验不太充分的实验者而言是较难判断掌握的。下面将细胞生长及不同消化程度的光学显微镜照片列出以供参考。 所用细胞为CHO贴壁细胞，培养基为含10％小牛血清的DMEM-F12，倒置显微镜10X40, 数码相机300万像素。

取细胞冻存管一支，于40°C水中速融；25ml细胞方瓶中加入含10%COSMIC小牛血清的DMEM-F12培养基10ml，将冻存管中细胞全部洗入瓶中，置37°C 2.5%二氧化碳孵箱中静置培养。4小时后倒去全部培养基以去除冻存液，更换10ml 培养基，同上静置培养。 经24小时培养后，生长情况为： 经48小时培养后，细胞已长成致密单层：

细胞培养的流程

细胞培养的流程，从购买试剂、分装，到无菌操作、实验、观察的过程？ 对于新手来说，细胞培养真是太难了，很多的细节你不可能一下子就考虑到、预见到，因此请教细胞培养的高手就显得非常重要且可贵了。 细胞培养包括仪器的清洗、消毒灭菌，试剂的购买、配制、分装，细胞的分离，无菌操作，培养细胞的观察，实验的设计，及结果的分析等等。但这每一个过程的含金量都很高，要求非常严格。 如果你正在培养细胞，或曾经培养过细胞，你一定有很多的经验值得大家分享，你一定有你自己的一套培养细胞的流程，从哪开始到哪结束你也一定有太多的想说。因此，你不妨说说你的细胞培养流程，以便我们广大的细胞培养新借以一鉴。 于此，我先代表广大细胞培养新手谢谢各位园丁里的奉献者！ 有空整理一下再写写。。呵呵谢了先版主建议不错，我刚开始养细胞时遇到的各种困难可以说是不计其数了，解决困难耗费了大量地时间，可惜呀！ 养细胞是一项即有难度又很讲究技术的过程，作起来不易，要真正详细的写出来示人更难！书上的规范和标准很多，但作起来每人都有自己的方法，适宜就好。 我看还没有人跟帖，我就先说一点，从最初阶段开始：（自己的做法） （一）仪器的清洗 总的分为两大类：可泡酸的和不可泡酸消毒的。酸指消毒的清洁液（由浓硫酸、重铬酸钾和蒸馏水配置的次强酸液） 可泡酸的主要是玻璃仪器培养细胞的板子，离心管等塑料器皿。消毒过程：自来水冲洗3-5遍----→超声波清洗30′----→烘干----→濅入清洁液过夜（不少于6h）----→自来水冲洗15－20遍----→蒸馏水洗3-5遍，烘干备用。 不可泡酸的主要是胶塞和盖子，虑器等，先在清水中濅泡后冲洗烘干----→2%NaOH濅泡过夜，自来水冲洗，5%HCl濅泡三○min，流水冲洗----→蒸馏水漂洗----→烘干备用。 消毒好的器具一定找个干净的柜子保存，使用前高压消毒灭菌，我科室主要使用铝制饭盒分装器具，挺方便的，用前高压。 今天暂说一点，以后有机会再续，望给师弟妹们有所借鉴。斑竹不厚道，现在知道为什么没有别的战士跟贴了么？我怎么也耗了几十分钟打的字，你就这样打击别人的信心，还有可能往后面延续么！再说，经验何止这些这点...... 您的帖子我看见了，您的抱怨我也接受！并且跟您补上一分！ 每个斑竹给分的标准有一定的差别，但是可以肯定的是：我们有自己的加分原则，大原则是不变的！比如：版内讨论得很多的东西，重复发帖一般不予以加分！ 您的这个帖子属于改范畴！ 感谢您对细胞版的支持！如果有问题可以直接pm我们！ 再次感谢！再多说点啊！ 呵呵接着说呀，很好，很有帮助，我是新手，要多向你学习顶一下。我也说说我的一些体会吧。 1、首先说清洗： 对于玻璃器皿（如移液管、盖玻片之类）可先用酸液浸泡24h以上，再用清水浸泡24h。之后用清水将移液管冲洗10遍，除去残留酸液，再用双蒸水冲洗3-5遍，彻底洗净后放入不锈钢筒中，双层牛皮纸扎口，高压灭菌20min，烘干待用。我们实验室的酸液一般是次强酸液（重铬酸钾120g 浓硫酸200 mL 蒸馏水1 000 mL）配液时要小心烫伤。装培养基的瓶子则要在每次用完培养基以后就要立即洗净，临用时再次用清水冲洗3-5遍，再用双蒸水漂洗3次，洗净后瓶口盖上锡箔纸，外包双层牛皮纸扎口后高压灭菌20min，与其配套的瓶盖则洗净后另行包好同时灭菌、烘干。培养基过滤器灭菌同瓶子，也要在用完后及时洗净、

贴壁细胞培养实验讲义

贴壁细胞培养技术课讲义 一、克隆形成及克隆形成抑制试验 克隆形成实验是测定单个细胞增殖能力的有效方法之一，其基本原理是单个细胞在体外持续增殖6代以上，其后代所组成的细胞群体，成为克隆（集落），这时的每个克隆可含50个以上的细胞，大小在0.3-1.0 mm之间。通过克隆形成实验，可对单个细胞的增殖潜力做出作定量分析，了解细胞的增殖力和对生存环境的适应性。这种方法常用于抗癌药物敏感性实验、肿瘤放射生物学实验等。 常见的有平板克隆形成实验和软琼脂克隆形成实验。 平板克隆形成实验 本法适用于贴壁生长的细胞，包括培养的肿瘤细胞和正常细胞。 1.准备所需试剂及物品： ①含10%及15 %新生牛血清的RPMI-1640培养液（15 ml/组，8组） ②PBS ③0.25%胰酶 ④5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil, 5-FU）注射液（江苏南通精华制药有限公司）， 100 μg/ mL（每1mL生理盐水含100ug药物5-FU），（EP管分装，1ml/管x 8）使用前稀释至所需浓度。 ⑤甲醇：冰醋酸（3:1） ⑥细胞染色液（吉姆萨、甲基绿、刘氏染液选一即可） ⑦12孔板（或6孔板）⑧EP管⑨滴管、小瓶等⑩相机、反光板等 ⑧实验需用的细胞株胃腺癌细胞MGC7901 2.操作： 实验为无菌操作，均需在超净工作台或安全柜中进行。因此，每次实验前需提前常规将操作台紫外杀菌，乙醇消毒（前已述，在此不多述）。 第一天： ?制备细胞悬液：取对数生长期胃腺癌细胞MGC7901，用0.25%胰酶消化并吹打成单个细胞，用含15%血清的RPMI-1640稀释，使细胞密度为3×102cell/mL，接种于12孔板，1000 μL/孔。 具体操作如下： ①胰酶消化：将培养瓶中原培养液从上面轻轻吸取弃之（可用滴管），加消化液1ml使之均匀分布作用于瓶内贴壁生长的细胞，细胞变形呈圆形颗粒附着于瓶底（镜下可见）即可弃消化液（可用滴管）（一般数十秒甚至几分钟）。

细胞培养

1．观察培养基是否正常，细胞状态如何，细胞密度如何，决定是否传代。观察时拧紧盖子。 2．加热PBS、versene、培养基，(提前做好) 瓶子不要倒着放，不要让液体接触到瓶塞。 3．打开超净台（先开风机，后开照明），用75%乙醇清洁台面，点燃酒精灯。不要把废液缸拿出去倒，如果废液太多，可以用其他容器先装废液。取小离心管一个，置于架子上。 4．取尖吸管、吸量管各一支，放置在专用的架上。放置的方式，注意吸管、吸量管前端都不要与架子接触。5．取待传代的细胞。打开versene，用酒精灯外焰烧。烧吸管时距离酒精灯心远些，不要把渣滓带进去。把试剂拿入台子的时候，尽量平稳，不要让试剂碰到瓶口。 6．用吸量管吸取旧的培养基，置离心管中，吸量管加入versene，然后将versene瓶收起来。（加versene 主要是为了将旧培养基洗去）。在离心管中间部分将液体加入。吸液体和加液体时都不要对着细胞。7．打开胰酶，然后将versene弃掉。换新管，用尖吸管吸取适量胰酶加入。加胰酶后，尽快放平，使细胞消化时间一致。 8．将细胞放入37度孵箱。放孵箱2min, 收胰酶，打开PBS. 之后拿出来镜下随时观察。使用二次消化法，去除容器中残余的细胞。别忘了用旧培养基中和。 9．取细胞，镜下观察消化情况。消化程度合适之后（细胞变圆，但不漂起），用尖吸管弃去胰酶，取离心管中的培养基加入细胞，吹打，至所有细胞从培养皿底部脱落下来。用PBS洗细胞，versene对细胞有毒性，且不能被血清中和。然后吸取至离心管中，800 rpm离心5分钟。 10．吸量管吸取适量培养基加入新的培养皿中。 11．细胞离心毕，用吸新培养基的管弃去上清，先把泡沫吸走。换吸量管吸取培养皿中培养基适量，加入离心管，小体积混匀，将细胞重悬，尖吸管吹匀。 12．擦计数板，用枪吸10ul的液体，计数。不要把枪伸到离心管内。 13．吸量管吸取细胞悬液，加入新的培养皿中。镜下观察，摇匀，放入37度孵育。收超净台。 293T细胞 培养条件： 37℃，5% CO2，PH值~，无菌恒温培养。 细胞相关操作： 细胞复苏 1. 37°C水浴预热培养基（DMEM+10% FBS）； 2. 从液氮中取出细胞迅速放入37°C水浴快速解冻（解冻后不要继续暖细胞）； 3. 在超净台中加入5ml培养基重悬细胞，1000rpm离心5min； 4. 弃上清，加入5ml培养基重悬细胞后转入T25培养瓶中，轻轻晃匀； 5. 置于37°C，5% CO2培养箱中培养(培养瓶盖没有透气孔的话,瓶盖不要拧太紧)； 6.第二天，用新鲜的培养基给细胞换液后继续培养。 细胞传代 1. 当细胞融合度达到90%以上时，给细胞传代；

贴壁细胞培养完整版

贴壁细胞培养 HEN system office room 【HEN16H-HENS2AHENS8Q8-HENH1688】

贴壁细胞培养 一、克隆形成抑制试验 原理：克隆形成实验是测定单个细胞增殖能力的有效方法之一，其基本原理是单个细胞在体外持续增殖6代以上，其后代所组成的细胞群体，成为克隆（集落），这时的每个克隆可含50个以上的细胞，大小在-1.0 mm之间。通过克隆形成实验，可对单个细胞的增殖潜力做出作定量分析，了解细胞的增殖力和对生存环境的适应性。这种方法常用于抗癌药物敏感性实验、肿瘤放射生物学实验等。常见的有平板克隆形成实验和软琼脂克隆形成实验。本法适用于贴壁生长的细胞，包括培养的肿瘤细胞和正常细胞。 材料与方法 （一）用品： 含15%新生牛血清的RPMI-1640培养液、含10%新生牛血清的RPMI-1640、培养液PBS、%胰酶、细胞染色液（刘氏染液）、相机、12孔板、EP管。5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil, 5-FU）注射液（江苏南通精华制药有限公司），用无菌生理盐水配制成100 μg/ mL溶液，使用前稀释至所需浓度。 （二）操作： ①. 制备细胞悬液：取对数生长期结肠癌SW620细胞，用%胰酶消化并吹打成单个细胞，含10%血清的RPMI-1640培养液倍比稀释到所需的体积，使细胞密度为 3×102个/mL，接种于12孔板，1000 μL/孔。 PBS过一遍，加1ml消化液，弃消化液，10%培养液2ml冲洗细胞，再用枪吸出至另一小瓶，3ml 10%培养液，混合（摇15次，吹15次），取100μl到EP管混合，取10μl细胞计数 倍比稀释（吸出1ml，加2ml培养液。Mix。） 吸出1ml，弃剩余液体，将1ml液体倒回小瓶，加2ml培养液。 重复。 直到需要的细胞数。12600个细胞/3ml，或8400个细胞/2ml。 种板：12孔板，加培液，加1ml细胞，不用摇。 ②. 待细胞贴壁后加入药物，终体积为2000 μL，设6组0，，，，， ，饱和湿度条件培养箱内孵育μg/ml药物组，每组2复孔，转染后置37℃，5％CO 2 7天。 计数： 满体积2000ul 其中药物浓度100ug/ml 100ul NS: 0 100 N=2 μg/ml *2000ul =100ug/ml * X X = + NS N=2

贴壁细胞培养步骤及注意事项

贴壁细胞培养步骤 一、复苏 1.把冻存管从液氮中取出来，立即投入37℃水浴锅中，轻微摇动。液体都融化 后（大概1-1.5分钟），拿出来喷点酒精放到超净工作台里。 2.把上述细胞悬液吸到装有10ml培养基的15ml的离心管中（用培养基把冻存 管洗一遍，把粘在壁上的细胞都洗下来），1000转离心5分钟。 3.把上清液倒掉，加1ml培养基把细胞悬浮起来。吸到装有10ml培养基的10cm 培养皿中前后左右轻轻摇动，使培养皿中的细胞均匀分布。 4.标好细胞种类和日期、培养人名字等，放到CO2培养箱中培养，细胞贴壁后 换培养基。 5.3天换一次培养基（具体看细胞生长状态及培养液情况）。 二、传代 1.培养皿中的细胞覆盖率达到80%-90%时要传代。 2.把原有培养基吸掉。 3.加入2毫升PBs洗两遍，最后吸净培养皿中的PBS 4.加适当的胰蛋白酶（能覆盖细胞就行），消化（消化时长看情况而定）。 5.当看到细胞开始脱离培养皿时倒掉酶液，加入2毫升左右含血清的培养基终 止消化。 6.用移液枪吹打细胞，把细胞都悬浮起来。 7.把细胞吸到15ml的离心管中，1000转离心5分钟。 8.倒掉上清液，加1-2ml培养基，把细胞都吹起来。 9.根据细胞种类把细胞传到几个培养皿中。一般，癌细胞分5个，正常细胞传 3个，继续培养。 10.若是只培养一皿，只需吹散后倒剩1/4左右，重新加入培养液继续培养。 三、冻存 1.把原有培养基吸掉。 2.加入2毫升PBs洗两遍，最后吸净培养皿中的PBS 3.加适当的胰蛋白酶（能覆盖细胞就行），消化（消化时长看情况而定）。 4.去掉酶液，加入2毫升左右含血清的培养基终止消化。 5.吹落后把细胞吸到15ml的离心管中，1000转离心5分钟。 6.加入1毫升冻存液悬浮细胞，装到灭菌的冻存管中，静止几分钟，写明细胞 种类，冻存日期。 7.4℃30min，-80℃过夜，然后放到液氮灌中保存。

贴壁细胞培养

贴壁细胞培养 Document number：PBGCG-0857-BTDO-0089-PTT1998

贴壁细胞培养 一、克隆形成抑制试验 原理：克隆形成实验是测定单个细胞增殖能力的有效方法之一，其基本原理是单个细胞在体外持续增殖6代以上，其后代所组成的细胞群体，成为克隆（集落），这时的每个克隆可含50个以上的细胞，大小在-1.0 mm之间。通过克隆形成实验，可对单个细胞的增殖潜力做出作定量分析，了解细胞的增殖力和对生存环境的适应性。这种方法常用于抗癌药物敏感性实验、肿瘤放射生物学实验等。常见的有平板克隆形成实验和软琼脂克隆形成实验。本法适用于贴壁生长的细胞，包括培养的肿瘤细胞和正常细胞。 材料与方法 （一）用品： 含15%新生牛血清的RPMI-1640培养液、含10%新生牛血清的RPMI- 1640、培养液PBS、%胰酶、细胞染色液（刘氏染液）、相机、12孔 板、EP管。5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil, 5-FU）注射液（江苏南通精华制药有限公司），用无菌生理盐水配制成100 μg/ mL溶液，使用前稀释至所需浓度。 （二）操作： ①.制备细胞悬液：取对数生长期结肠癌SW620细胞，用%胰酶消化并吹打成单个细胞，含10%血清的RPMI-1640培养液倍比稀释到所需的体积，使细胞密度为3×102个/mL，接种于12孔板，1000 μL/孔。 PBS过一遍，加1ml消化液，弃消化液，10%培养液2ml冲洗细胞，再用枪吸出至另一小瓶，3ml 10%培养液，混合（摇15次，吹15次），取100μl到EP 管混合，取10μl细胞计数 倍比稀释（吸出1ml，加2ml培养液。Mix。） 吸出1ml，弃剩余液体，将1ml液体倒回小瓶，加2ml培养液。 重复。 直到需要的细胞数。12600个细胞/3ml，或8400个细胞/2ml。 种板：12孔板，加培液，加1ml细胞，不用摇。 ②.待细胞贴壁后加入药物，终体积为2000 μL，设6组0，，，，， μg/ml药物组，每组2复孔，转染后置37℃，5％CO2，饱和湿度条件培养箱内孵育7天。 计数：

OPTI MEM进行贴壁细胞培养的实验方法

OPTI-MEM进行贴壁细胞培养的实验方法 日期：2012-05-17来源：互联网作者：青岚点击：194次 相关专题 ?MEM细胞培养基 无血清培养基可以提供细胞贴壁需要的一些基质，本文总结了利用无血清培养基OPTI-MEM进行贴壁细胞的脂质体转染试验材料，步骤、个人经验以及问题分析。 贴壁细胞的脂质体转染 一、实验材料 1、宿主细胞CHO(贴壁细胞) 2、脂质体LIPOFECTAMINE2000(invitrogen公司) 3、6孔细胞培养版 4、无血清培养基OPTI-MEM(GIBICO) 5、转染级质粒 二、实验步骤 invitrogen的LIPOFECTAMINE2000说明书上列举了24孔、12孔、6孔......板的实验体系，因为需要转染的细胞量大，所

以一直采用的是6孔版做的转染。以下是以6孔板为例说明一下我的体系和方法吧! 1、转染前一天，以合适的细胞密度接种到6孔培养板上。(我的接种密度是3~4*105/ml.)转染时，细胞要达到90~95%的融合。 2、溶液1：240ul无血清培养基 +10ullipofectamine2000perwell(总体积250ul)(温育5min) 3、溶液2：Xul无血清培养基+4ug质粒perwell(总体积 250ul) 4、将溶液1与溶液2混合，室温下置20min。 5、与此同时，将6孔板中的细胞用无血清培养基冲洗细胞两遍后，加入2ml无血清培养基。 6、将溶液1与溶液2的混合液逐滴加入孔中，摇动培养板，轻轻混匀。在37℃，5%的CO2中保温5~6小时。 7、6小时后，更换含有血清的全培养基，在37℃，5%的CO2中48~72h检测转染水平。 8、如果做稳定转染，换全培养基培养后24h，即可以1：10或更高的稀释比例(根据细胞的生长情况)接种到新的培养板，加抗生素进行筛选。

细胞培养的过程及注意事项

细胞培养的过程及 注意事项

36细胞培养的过程及注意事项 细胞的培养过程及注意事项；根据培养过程中是否需要分割培养物进行再培养而将细；一、原代培养；（一）过程；原代培养的基本过程包括取材、培养材料的制备、接种；1、组织块培养法；(1)基本操作过程；1）、用培养液湿润所取组织材料，并用锋利的眼科剪；2）、用湿润的吸管吸取切碎的组织块，清清吹到培养；3）、将培养瓶翻转，使瓶底朝上，在种植了组织块一；4）、将种植了组织块 细胞的培养过程及注意事项 根据培养过程中是否需要分割培养物进行再培养而将细胞培养分为原代培养和传代培养。 一、原代培养 （一）过程 原代培养的基本过程包括取材、培养材料的制备、接种及培养等步骤。原代培养的方法很多，基本和最常见的是组织块培养法和分离细胞法。 1、组织块培养法

(1)基本操作过程 1）、用培养液湿润所取组织材料，并用锋利的眼科剪将附在其上的脂肪和结缔组织去除干净。再用平衡液（PBS）或Hanks液漂洗；用锋利的眼科弯剪将组织块剪成小块；再用PBS或Hanks 液漂洗多次，直至液体不浑浊、无油滴、清亮为止。 2）、用湿润的吸管吸取切碎的组织块，清清吹到培养瓶皿中，并将其按一定间距均匀放在培养瓶底壁上，量不要过多，要将组织块切面贴在培养瓶底壁上； 3）、将培养瓶翻转，使瓶底朝上，在种植了组织块一侧的对侧面加足培养液，勿使组织块与培养液接触，塞紧瓶塞； 4）、将种植了组织块的一侧朝上，静置于37℃培养箱中；待组织块贴壁1h到3h后翻瓶，使贴壁的组织块浸没与培养液中，静置； 5）、每隔2到3天更换一次培养液，或者根据培养瓶种颜色的变化确定换液时间。 2、注意事项 1）、组织块接种后的前3天，从组织块向外迁徙的细胞数很少，组织块的黏附不牢固，在观察和移动的过程中，注意不要引

细胞培养的操作步骤

细胞培养的操作步骤 一、原代培养及其操作步骤 原代分离细胞培养是指从供体内取出组织后，经机械以及消化分离成单个细胞或单一型细胞群，使之在体外模拟人体生理环境，在无菌、适当温度和一定的营养条件下，生存、生长和繁殖。原代培养细胞常有不同的细胞成分，生长缓慢，但是更能代表所来源的组织细胞类型和表达组织的特异性特征。利用原代细胞培养做各种实验，如药物测试、细胞分化及病毒学方面的试验效果很好。其操作步骤如下。 1.剪切组织先将所取得的组织，用D-Hanks或Hanks液清洗，以去除表面血污，并用手术镊去除黏附的结缔组织等非培养所需组织。再次清洗后，用手术刀将组织切成若干小块，移入青霉素小瓶或小烧杯中，加入适量缓冲液，用弯头眼科剪，反复剪切组织，直到组织成糊状，约1mm3大小。静置片刻后，用吸管吸去上层液体，加入适当的缓冲液再清洗一次。 2.消化分离消化分离的目的是将细小的组织块消化分离成细胞团或分散的单个细胞，以利于进一步的培养，常用的消化酶有胰蛋白酶和胶原酶。 3.培养细胞悬液用计数板进行细胞计数。用培养液将细胞数调整为（2～5）×105 cells／ml，或实验所需密度，分装于培养瓶中，使细胞悬液的量以覆盖后略高于培养瓶底部为宜。置CO2培养箱内，5％CO2，37℃静置培养。一般3～5d，原代培养细胞可以黏附于瓶壁，并伸展开始生长，可补加原培养液量1／2的新培养液，继续培养2～3d后换液，一般7～14d可以长满瓶壁，进行传代。 4.注意事项 （1）无菌操作：细菌或霉菌污染是培养失败的常见原因，必须加强各个环节的无菌操作观念，以预防为主，一旦污染，一般很难消除。 （2）培养液：所用的培养液必须满足细胞生存和生长的必要条件。由于细胞来源的动物种类、组织类型不同，对培养液的要求有一定的差异，必要时可用预实验的方法选择适当的培养液。 （3）小牛血清：小牛血清对于维持培养细胞的生存和促进细胞增殖起着关键性作用。可选择多种不同批号的小牛血清进行小样分析。一旦确定某一厂家的某一批号小牛血清后，就保持应用至实验完成。 （4）胶原酶溶液：必须新鲜配制，贮存时间过长(即使是-20℃低温保存)，也将影响消化效力，导致消化时间过长，细胞损伤增加。

贴壁细胞培养

***细胞培养：指从体内组织取出细胞在体外模拟体内环境下，使其生长繁殖，并维持其结构和功能的一种培养技术。细胞培养基本条件 1、合适的细胞培养基 合成培养基的主要成分有：氨基酸、碳水化合物、无机盐、维生素及其它辅助物质。氨基酸是组成蛋白质的基本单位。不同种类的细胞对氨基酸的要求各异，但有几种氨基酸细胞自身不能合成，必须依靠培养液提供，这几种氨基酸称为必需氨基酸。其中谷氨酰胺是细胞合成核酸和蛋白质必需的氨基酸，在缺少谷氨酰胺时，细胞生长不良而死亡。因此，各种培养液中都有较大量的谷氨酰胺。但是，由于谷氨酰胺在溶液中很不稳定，应置于-20℃冰箱中保存，在使用前加入培养液内。已含谷氨酰胺的培养液在4℃冰箱中储存2 周以上时，还应重新加入原来量的谷氨酰胺。 碳水化合物是细胞生长主要能量来源，其中有的是合成蛋白质和核酸的成分。主要有葡萄糖、核糖、脱氧核糖、丙酮酸钠和醋酸等。 无机盐，培养液中无机盐的主要功能是帮助细胞维持渗透压平衡。此外，通过提供钠，钾和钙离子，帮助细胞调节细胞膜功能。培养液的渗透压是一个非常重要的因素, 细胞通常可耐受260mOsm/kg ?320 mOsm/kg。标准培养液的渗透压在此范围内波动。特别注意：向培养液中加入其它物质有可能会明显改变培养液的渗透压，特别是溶于强酸或强碱中的物质。向培养液中添加HEPES 时需按以下方法调节钠离子浓度。 缓冲系统 大多数细胞所需pH 在7.2 - 7.4。但是，细胞培养最适pH 值随培养的细胞种类不同而不同。成纤维细胞喜欢较高pH (7.4 - 7.7), 而传代转化细胞系则需要偏酸pH (7.0 - 7.4)。由于多数培养液靠碳酸氢钠（NaHCO3）与CO2 体系进行缓冲，因此，气相中的CO2浓度应与培养液中碳酸氢钠浓度相平衡。细胞培养瓶盖不应拧得太紧，以保证气体交换。pH调整液:常用的有HEPES液和NaHCO3溶液。 1）NaHCO3溶液：NaHCO3是培养基中必须添加的成分，一般情况下按说明书的要求准确添加，以保证培养基在5%CO2的环境下pH达到设计标准。如果气相或培养箱空气中CO2 浓度设定在5％，培养液中NaHCO3 的加入量为1.97g/L；如果CO2浓度维持在10％，培养液中NaHCO3的加入量为3.95g/L。如果是封闭式培养，即不与5%CO2的环境发生交换达到平衡，所使用的培养基就不能按照说明书所要求加入NaHCO3。此时常用5.6%或7.4%的NaHCO3溶液调节培养基，使之达到所要求的pH环境。 2）HEPES溶液：分子量238.31，是一种弱酸，一种非离子缓冲液，中文名字是羟乙基哌秦乙硫磺酸，对细胞无毒性，在高浓度时对一些细胞可能有毒。主要作用是防止培养基pH迅速变动。在开放式培养条件下，观察细胞时培养基脱离了5%CO2的环境，CO2气体迅速逸出，pH迅速升高，若加了HEPES，此时可以维持pH7.0左右。一般在进行克隆化培养时要添加HEPES。 在pH 7.2 - 7.4 范围内具有较好的缓冲能力。HEPES 缓冲液可与低水平的碳酸钠（0.34g/L）共用，以抵消因额外加入HEPES 引起的渗透压增加。在这种培养条件下，细胞培养瓶的盖子应拧紧，以防止培养液中所需的少量碳酸盐散入空气中。大多数培养液中含有酚红作为pH 指示剂，酸性培养液呈橙黄色，碱性培养液呈深红色。 HEPES 使用终浓度一般为10-50mM, 但通常配成1M 储存液：用200ml 双蒸水溶解47.6克HEPES，用1N NaOH 调节pH 至7.5-8.0;然后过滤除菌，分装小瓶，室温或4℃保存。 维生素，在细胞培养中，尽管血清是维生素重要来源，但是许多培养基中添加了各种维生素以适合更多的细胞系生长。 在一些较为复杂的培养液中还包括其它一些成分。如在杂交瘤技术中常用的DMEM 培养液，使用时还需要补加丙酮酸钠和2-巯基乙醇（2-Mercaptoethanol，2-Me）。2-Me 对细胞生长有很重要的作用。有人认为它相当于胎牛血清，有直接刺激细胞增殖作用。2-Me的活性部分是硫氢基，其中一个重要作用是使血清中含硫的化合物还原成谷胱甘肽，能诱导细胞的增殖，为非特异性的激活作用。同时避免过氧化物对培养细胞的损害。另一个重要作用是促进分裂原的反应和DNA 合成，增加植物凝集素(PHA)对淋巴细胞的转化作用，已广泛应用于杂交瘤技术，另外，也开始用于一些难以培养的细胞。2-Me 是一种小分子还原剂，极易氧化。分子量为78.13，纯的2-Me 是一种无色有刺激味的液体，比重为1.110-1.120(Do20)，常用终浓度为5×10-5M。常配制成0.1M 的储存液，用时每升培养液加0.5ml。

T细胞培养

293T 细胞培养 1.培养基: DMEM =丙酮酸钠++10%血清++青链霉素 2.复苏： 37 度融化后，擦干冻存管酒精擦，细胞加入15ml 离心管，加5ml 培养基，500g 离心5min，弃上清，加1ml 培养基重悬后加入到培养瓶中，5~6ml 左右，记得晃匀。3. 传代: 吸出旧培基，加5mlPBS 洗一遍，用移液管加1ml 胰酶，洗一遍吸出，37 度放1min 左右计时，看到大片大片脱落了即加入新培基吹打，吹洗充分后，吸1ml加到事先加好10ml 新培育基的新瓶里。 293T 细胞是用5 型腺病毒75 株系转化，含有Ad5 E1 区的人胚肾亚三倍体细胞系，是一种E1 区缺陷互补细胞系。293T 细胞是贴壁依赖型呈上皮样细胞，表现出典型的腺病毒转化细胞的表型，细胞允许Ad5 和其他血清型腺病毒在其上增殖。 哺乳细胞的大规模培养方式有三种：贴壁培养、微载体培养、无血清悬浮培养。 这三种方式均可用于293T 细胞的大规模培养。293T 细胞在无Ca2+或含Ca2+培养基中可同样生长，也可生长在血清浓度降低的培养基中。 单层培养细胞在5-10％FBS-DMEM 中能生长很好。一般来讲，1:10 传代后，一周可以长满。 严禁过度生长，这点很重要。因为会导致细胞密度加大和堆积，影响病毒斑的形成和转染，传代时也不易打散。 悬浮的293T 细胞很容易大规模培养，但不容易长期保持稳定。293T 细胞在传代120 次以后，其表型可能改变，生长状况不再完全是单层的了，偶尔会形成局部的细胞成团聚集，应立即抛弃，重新引入新传代的细胞。

293 细胞培养特性： 1、细胞明显适应酸性环境,pH 值在6.9～7.1 时,可顺利贴壁生长, 换液293T 时动作要轻。一般用高糖的DMEM 培养基。 2、传代：倒去废液，PBS 洗一次（轻），用0.02%EDTA 与0.25%Trypsin 消化，生长良好细胞，培养瓶中轻摇,使之流遍所有细胞表面,即将其吸除或弃去消化30s，然后吸去，再让剩下的EDTA/Trypsin 作用30s,镜下观察细胞脱落,就可加DMEM 终止消化，反复吹打至细胞全成单个悬浮细胞即可。12 小时-24 小时90%以上细胞贴壁。293 细胞传代时机为达80-90%汇合，传代比例为1：3。 3、293 细胞在低代时容易贴壁，生长良好，在传到几十代以后，易聚集成团，且贴壁不牢，用PBS 冲洗时即可能脱落，即使消化后也不容易吹打成单细胞悬液，最好购入时先大量冻存。 4、复苏293 细胞的另一生长特性是贴壁所需时间长且贴壁不牢。细胞冷冻后复苏时,都有不同程度的肿胀,若以50ml 培养瓶待细胞长满瓶底的70%～80%时消化冻存, 复苏时将其全部接种至2 个50ml 瓶中时较为合适。刚复苏的293 贴壁很慢，复苏接种后24 小时内,应尽量减少观察细胞次数或不作观察,以免因晃动而影响细胞贴壁。复苏后48 小时左右观察贴壁情况并进行首次更换培养基比较合适,如果用一次性塑料培养瓶可增加细胞贴壁牢度。换液前宜将培养基预热。 5、转染：体外应用293 细胞进行细胞转染时，如果是采用磷酸钙转染，一定要注意293 细胞不要全部长满细胞培养盘，长满细胞时加入磷酸钙就会使293 细胞大片的脱落，最好是当293 生长到1/2 或2/3 时进行磷酸钙转染，可以避免细胞的大量脱落。 其它的经验：1、用大瓶培养较小瓶要好，可能是更有利于293 均匀的分布，利于营养的摄取

贴壁细胞培养

贴壁细胞培养 Prepared on 22 November 2020

贴壁细胞培养 一、克隆形成抑制试验 原理：克隆形成实验是测定单个细胞增殖能力的有效方法之一，其基本原理是单个细胞在体外持续增殖6代以上，其后代所组成的细胞群体，成为克隆（集落），这时的每个克隆可含50个以上的细胞，大小在-1.0 mm之间。通过克隆形成实验，可对单个细胞的增殖潜力做出作定量分析，了解细胞的增殖力和对生存环境的适应性。这种方法常用于抗癌药物敏感性实验、肿瘤放射生物学实验等。常见的有平板克隆形成实验和软琼脂克隆形成实验。本法适用于贴壁生长的细胞，包括培养的肿瘤细胞和正常细胞。 材料与方法 （一）用品： 含15%新生牛血清的RPMI-1640培养液、含10%新生牛血清的RPMI- 1640、培养液PBS、%胰酶、细胞染色液（刘氏染液）、相机、12孔 板、EP管。5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil, 5-FU）注射液（江苏南通精华制药有限公司），用无菌生理盐水配制成100 μg/ mL溶液，使用前稀释至所需浓度。 （二）操作： ①.制备细胞悬液：取对数生长期结肠癌SW620细胞，用%胰酶消化并吹打成单个细胞，含10%血清的RPMI-1640培养液倍比稀释到所需的体积，使细胞密度为3×102个/mL，接种于12孔板，1000 μL/孔。 PBS过一遍，加1ml消化液，弃消化液，10%培养液2ml冲洗细胞，再用枪吸出至另一小瓶，3ml 10%培养液，混合（摇15次，吹15次），取100μl到EP 管混合，取10μl细胞计数 倍比稀释（吸出1ml，加2ml培养液。Mix。） 吸出1ml，弃剩余液体，将1ml液体倒回小瓶，加2ml培养液。 重复。 直到需要的细胞数。12600个细胞/3ml，或8400个细胞/2ml。 种板：12孔板，加培液，加1ml细胞，不用摇。 ②.待细胞贴壁后加入药物，终体积为2000 μL，设6组0，，，，， μg/ml药物组，每组2复孔，转染后置37℃，5％CO2，饱和湿度条件培养箱内孵育7天。 计数：

细胞培养与病毒培养实验步骤

实验二传代细胞培养与病毒在传代细胞中的培养 一、实验目的 了解倒置显微镜的构造与使用，了解不同传代细胞的形态及接毒后的病变特征，掌握细胞的传代培养方法、病毒接种方法及收毒方法。 二、常用细胞的种类 BHK-21：仓鼠肾传代细胞 PK-15：猪肾传代细胞 IBRS-2：猪肾传代细胞 Hela：人的子宫瘤细胞 Vero：非洲绿猴肾细胞 Marc-145：来源于Vero细胞 TK-143：人的胸苷激酶阴性细胞 Sf9：昆虫细胞 三、材料 1、100ml细胞瓶、吸管、吸球、96孔细胞培养板、加样器、枪头 2、BHK-21（baby hamster kidney）细胞 3、0.25%胰酶 4、生长液：含10%犊牛血清、200U/ml青、链霉素的DMEM 维持液：含2-5%犊牛血清、200U/ml青、链霉素的DMEM 5、伪狂犬病病毒液（PRV） 四、传代细胞培养的条件要求

1）细胞密度：2-3×105个/ml 2）pH范围最适pH7.0-7.4，耐受pH6.6-7.8 3）培养温度 哺乳动物细胞一般为37℃ 昆虫细胞28-30℃ 五、常用细胞分散剂与作用原理 1、胰酶使精氨酸或赖氨酸的羧基和其他氨基酸的氨基之间的多肽链发生水解，导致细胞间质水 解而使细胞或组织块消化为分散的单个细胞。 2、乙二胺四乙酸二钠（EDTA）：与二价钙、镁离子结合，从而使细胞分散。 3、灰色链丝菌酶：由灰色链丝菌提取的一种酶制剂，是蛋白酶、氨肽酶和羧肽酶的混合物。 六、营养液 1、人工综合营养液 氨基酸、糖类、无机盐类、维生素、辅酶、嘌呤、嘧啶、辅助生长因子。 2、血清 1）血清的种类 胎牛血清、新生犊牛血清、成年牛血清、马血清、鸡血清、兔血清、羊血清、人血清，其中以新生犊牛血清使用最为广泛。 2）血清的处理 无菌采集，过滤除菌。用前56℃灭活30min。 3）血清的作用 A、能提供细胞生存、生长和增生所必须的生长调节因子。 B、能补充基础培养液中没有或量不足的营养成分。 C、含有一些可供贴壁依赖型细胞在培养器皿表面贴附和铺展的生长基质成分。