Nebular abundances of southern symbiotic stars

a r X i v :a s t r o -p h /0502308v 1 16 F e

b 2005

Astronomy &Astrophysics manuscript no.luna February 2,2008

(DOI:will be inserted by hand later)

Nebular abundances of southern symbiotic stars ?

G.J.M.Luna 1and R.D.D.Costa 1

Instituto de Astronomia,Geo?sica e Ci?e ncias Atmosf′e ricas (IAG),Universidade de S?a o Paulo,S?a o Paulo,Brazil e-mail:gjmluna@https://www.wendangku.net/doc/172400491.html,p.br,roberto@https://www.wendangku.net/doc/172400491.html,p.br

Abstract.We have calculated relative elemental abundances for a sample of 43symbiotic stars.Helium abundances and the

relative elemental abundances N /O,Ne /O,Ar /O were derived from new spectra collected in the optical range through low dispersion spectroscopy.The He ionic abundances were derived taking into account self-absorption e ?ects in Balmer lines.We found that the symbiotic stars in the galactic bulge have heavy element abundances showing the same wide distribution as other bulge objects.In the galactic disk,the symbiotic stars follow the abundance gradient as derived from di ?erent kinds of objects.

Key words.Stars:binaries:symbiotic-stars:abundances-Galaxy:abundances

1.Introduction

Symbiotic stars are binary systems with large periods and strong interaction.There is an agreement in the fact that they consist of (at least)three components:a giant star,a hot source like a white dwarf,a main sequence star or even a neutron star (GX1+4),and a nebula ejected by the red giant,as was shown by Nussbaumer et al.(1988).The nebula can be ionized by the UV radiation from the hot source and in some eruptive sym-biotic stars also by the region where the winds from the hot and cold sources collide (Willson et al.1984).As the emission lines are very strong,the symbiotic stars are easily observable at large distances and are useful tools to test some aspects of the chemical composition of the low and intermediate mass popu-lation of the disk and galactic bulge as well as the evolution of double stars.

Some studies on nebular abundances in symbiotic stars have been performed in the optical region (see Costa &de Freitas Pacheco 1994,Pereira et al.2002,Gutierrez Moreno &Moreno 1999)but with a small number of objects.Medina Tanco &Steiner (1995)have made spectral classi?cation of a sample of symbiotic stars toward the galactic bulge,but they did not derive chemical abundances.In the UV region,CNO abundances were derived for expressive samples of symbiotics using IUE data (e.g.Nussbaumer et al.1988,Schmid &Nussbaumer 1993).

The analysis of chemical abundances is required to investi-gate the surface enrichment of the red giant photosphere,whose stellar wind re?ects the modi?cations introduced by dredge up processes along the stellar evolution.In this case,the

investiga-

2G.J.M.Luna and R.D.D.Costa:Nebular abundances of southern symbiotic stars 3.Observations

Spectroscopic observations were performed in two runs at the National Laboratory for Astrophysics(Bras′o polis,MG,Brazil) from07-16/Jun/2002,and from23-26/Jun/2003,using a Boller &Chivens Cassegrain spectrograph attached to the1.60m tele-scope with a dispersion of4.4?/pixel.Some observations were made at ESO using the1.52m telescope in La Silla,Chile(from 08-13/Oct/2002)with a Boller&Chivens Cassegrain spectro-graph with a dispersion of2.2?/pixel.Spectra cover the range 3800-7400?.The log of the observations can be seen in the Table1.Each object was observed at least twice in the cor-responding observational run,one of them with a short expo-sure time to get the?uxes of Hα,Hβ,Hγand Hδto derive the reddening correction,and the other with a longer exposure time,saturating the Balmer lines and getting the weaker line ?uxes.All the observations were performed in weather con-ditions compatible with?ux calibration,and with an average seeing of2arcsecs for LNA and1arcsec for ESO.Flux calibra-tion for each object was secured through observations of stan-dard stars on each night.Reduction was performed using the IRAF1package and followed the standard procedures,consist-ing in bias image subtraction,?at-?elding,wavelength and?ux calibration.Figure2displays sample spectra for two objects, including the main diagnostic lines.Emission line?uxes were calculated by adopting gaussian pro?les;a gaussian deblend-ing routine was also used when necessary.Table2,available electronically at the CDS,contains extinction-corrected?uxes in the Hβ=100scale for the objects of our sample.See section 7.1for a discussion on the accuracy of the results.

4.Reddening correction

In the low density limit,Balmer ratios can be used to derive interstellar extinction by comparing line ratios predicted by the recombination theory with the observed values,as described by Osterbrock(1989).It was already noticed that in symbiotic stars the Balmer ratios are far from the expected values result-ing from interstellar extinction only Costa&de Freitas Pacheco (1994).These deviations from Case-B can be

attributed

to self-

absorption e?ects,as described by Netzer(1975)for AGNs. Considering that symbiotic nebulae are very dense,optical depth e?ects should be present,therefore we adopted the Netzer(1975)and Almog&Netzer(1989)results for deriva-

tion of the reddening correction and HeI abundances.

Reddening correction was derived according to the proce-dure described by Guti′e rrez-Moreno&Moreno(1996).This method determines simultaneously reddening and optical depth in Hαusing the Balmer decrement values computed by Netzer (1975)for di?erent electron densities and di?erent optical depths at Lyα(τα),under conditions of self-absorption.When using this procedure,we have adopted the interestellar absorp-tion curve from Cardelli et al.(1989),and used Netzer’s(1975) Balmer decrement values for log N e=8.

λ4363

(1) R([NII])=

λ6584+λ6548

λ6730

(3)

In view of the high density of symbiotic nebulae is di?cult to use the R(SII)to estimate the electron density,as this relation produce unique results for N e≤105(Osterbrock1989).We es-timated a lower limit for the density from the R([OIII])and R([NII])ratios assuming T e≈12000K,which is an acceptable value for symbiotics(Nussbaumer et al.1988),and adopted two di?erent density zones,namely N e[OIII]and N e[NII];for

G.J.M.Luna and R.D.D.Costa:Nebular abundances of southern symbiotic stars3 Table1.Log of the Observations

Source Date Observatory Source Date Observatory

Table2.Reddening corrected line?uxes(Hβ=100)

Source H3835[NeIII]λ3869[NeIII]λ3968HδHγ[OIII]λ4363HeIIλ4686[ArIII]λ4711+Hβ..

[NeIV]λ4714 CL Sco8.46534.5729.1929.0649.0040.0614.56 2.585100.0..

FN Sgr 5.0927.05717.5627.7446.089.46694.539.759100.0..

H2-38...78.1735.1026.8347.25113.278.45 3.484100.0..

Hen2-171 2.57149.8431.0922.6745.0044.5785.27 6.072100.0..

RT Ser......12.6720.8944.257.750118.8 1.416100.0..

V2416Sgr... 1.4230.00518.1938.11 4.30880.06...100.0..

V343Ser......0.02320.7239.03 2.83849.37 5.384100.0..

V4018Sgr14.55 3.30119.3725.4544.77 6.52649.24 3.362100.0..

AE Ara9.03015.7924.0732.4343.6115.3614.83 2.243100.0..

H2-5.........20.4541.1724.08101.7...100.0..

AS210 5.38112.5118.6124.3544.5316.7867.09 1.126100.0..

Ap1-8......7.15518.9941.77 1.69277.99...100.0..

......................

4G.J.M.Luna and R.D.D.Costa:Nebular abundances of southern symbiotic

stars

Fig.1.H α/H βvs.H β/H γand H α/H βvs.H β/H δfor the objects of our sample.The ?gure has the same format as used by Netzer (1975),the curves are parametrized in τH αvalues.We have used only τα=106which correspond to optically thicker nebulae.For values of ταand τH αsee Netzer’s (1975)Table 1.

suggesting at least two regions with distinct densities are also seen in Coud′e spectra of HM Sge (Stau ?er 1984).We consider that in the R([NII])region the main ionic species are N +,O +,S +,while in the R([OIII])region species of higher excitation like O +2,S +2,Ne +2,Ar +2,Ar +3are dominant.Only in AS 210,RR Tel,PN H 1-36,PN H 2-38and Hen 2-171both density regions were used.For these objects R([NII])lead to density values (in cm ?3)of respectively :2.6*105,3.38*105,1.03*105,3.38*105,1.*105.The derived values for N e are listed in Table 3.

6.Helium abundance

Helium abundance is a key parameter to characterize chemical evolution either of stars and galaxies.As discussed by Clegg (1987),line formation in HeI is complex in view of the metasta-bility of the lowest triplet level,which can cause some lines to become optically thick.In particular,the collisional enhance-ment of HeI lines from the metastable 23S level is an impor-tant issue that cannot be ruled out,as indicated by Kingdon &Ferland (1995).This is a specially controversial subject in symbiotic stars in view of their high nebular densities.

Usually helium abundance is expressed relative to hydro-gen.As discussed in section 4,in high density nebulae self-

absorption e ?ects are present in the Balmer series.In order to minimize these e ?ects on the helium abundance,Schmid &Schild (1990)used the ratio between HeII and higher excita-tion Balmer lines when deriving the ?nal helium abundance.Here we adopted a similar procedure,taking H γas our ref-erence line.It was chosen as a compromise solution between lower lines,more a ?ected by self absorption e ?ects,and higher,weaker,lines.The optical depth in this line can be scaled to the value of τH α.Using the optical depth in H α,τH α,which is de-rived from our reddening calculation,the optical depth in H γ,τH γis 0.07*τH α.In the cases that τH γ≤0.5we would expect that self-absorption e ?ects are negligible and no large errors are being committed.

The HeI abundances were computed considering the pos-sibility of large collisional excitation and self absorption ef-fects,following the procedure described in details by Costa &de Freitas Pacheco (1994).In the present work we derived the abundance from lines λ5876and λ7065,weighted by their in-tensities.Line λ6678was not used to compute HeI abundance because we have detected that in many objects it is placed over the wings of H α,resulting in overestimated ?uxes.Line λ7065was also used to estimate the optical depth in λ3889(τ(λ3889))since this optical depth is required to derive emissivities calcu-lated by Almog &Netzer (1989)for HeI lines.The concentra-

G.J.M.Luna and R.D.D.Costa:Nebular abundances of southern symbiotic stars5

Fig.2.Diagnostic lines in the spectra of Hen2-171(lower)and CL Sco(upper).

6G.J.M.Luna and R.D.D.Costa:Nebular abundances of southern symbiotic stars

Fig.3.Behavior of R([OIII])and R([NII])relations for Hen 2-171.The solid lines represent an uncertainty of 2σwith respect to the calculated value

tion of He +can consequently be obtained from the relation (de Freitas Pacheco &Costa,1992):n (He +)

E λ(τ)

I λ

O

≈

N +

O ≈

Ne +2O

≈

Ar +2+Ar +3

G.J.M.Luna and R.D.D.Costa:Nebular abundances of southern symbiotic stars7 Table3.N e(cm?3),E(B-V)andτHαderived for our sample

Source E(B-V)τHαN e[OIII]Other E(B-V)Source E(B-V)τHαN e[OIII]Other E(B-V)

a Pereira(1995)

b using Hα&Hγ

c Schmid&Nussbaumer(1993)

d Pereira et al.(1998)

e Michalitsianos et al.(1982)

f Mikolajewska et al.(1997)

g N e assumed minimum value

h Pereira et al.2002

i Simon(2003)

j Munari&Buson(1994)

k without diagnostic lines,N e=108

l Nussbaumer et al.(1988)

m Guti′e rrez-Moreno et al.(1992)

n Munari&Buson(1993)

7.1.Precision of the abundance determination Abundance determination involves many sources of errors like accuracy of the?uxes,limited precision in data reduction,un-certainties in reddening and the derived physical parameters, as well as in the adopted methodology to derive abundances. We tested the sensitivity of the abundances to the line?uxes for each object by calculating mean and standard deviation for all the?ux measurements of each spectral line for each object. The results can be seen in?g.4,where?F represents the stan-dard deviation for each line.The points that form a straight line correspond to those lines for which we have only one mea-surement;for them we adopt an error of30%for the lines weaker than(1/3)Hβand10%for the stronger lines(respect to Hβ=100).The?ux dispersions result in abundance disper-sions that have a mean value of0.2dex for stronger lines like [OIII],and0.4dex for weaker lines like[ArIV],[NeIII],etc. These uncertainties are typical in this type of calculations(e.g. Escudero&Costa2001).

We also tested the dependence of the derived abundances on E(B-V),the most uncertain parameter along the whole pro-cess.As described in section4,we calculate E(B-V)using the method described by Gutierrez Moreno&Moreno1996.Just to check the dependence of the derived relative abundances to the reddening,we consirered an uncertainty of50%in E(B-V)and rederived the electron densities and abundances,which resulted in upper and lower limits of precision for our results.

8G.J.M.Luna and R.D.D.Costa:Nebular abundances of southern symbiotic stars

Table 4.He abundances

Source

He I

He II

He

Source

He I

He II

He

Fig.4.Flux mean values vs.standard deviation (?F)from all the lines for each object of the sample

These limits are displayed in ?gure 5as a mean error bar for the results.It can be seen that even such a large error in reddening does not a ?ect our main conclusions.

8.Results and discussion

Our sample contains 54objects for which ionic abundances have been derived.For many of them,these are the ?rst abun-

dances published.These abundances are similar to those ob-tained for nebulae that present similar spectroscopic behavior as planetary nebulae.

To perform the chemical diagnostics we have chosen emis-sion lines from elements with similar ionization potentials,in order to minimize the e ?ects of density gradients.We have obtained abundances ratios from collisionally excited lines,namely N /O,Ne /O and Ar /O.

We present the ionic concentrations for O,N,Ar,S,He and Ne.The relative elemental abundances show the composition of the interstellar medium in the time of progenitor formation,and the N and He abundances re?ect the evolutionary state of the stars,showing that this class of objects have experienced dredge up episodes,may be up to the second one.Also the He and N abundances are comparable with progenitors between 0.6to 1.5M ⊙.

Fig.5shows the relation between N /O and He /H;as nitro-gen and helium are nucleosynthesis products and related to the mass spectrum of the progenitors,they are expected to be cor-related;and this diagram is important to the diagnostic of abun-dances.The ?gure combines data from symbiotics with other from planetary nebulae (Escudero &Costa 2001,Escudero et al.2004,Exter et al.2004).It can be seen that the objects in this ?gure are distributed in two groups:a larger,upper group for which the planetary nebulae sample de?ne a reasonably well de?ned correlation between log(He /H)and log(N /O),in the sense that helium-rich objects are usually nitrogen-rich.The symbiotics ?t into this distribution,in spite of their dispersion.This correlation re?ects the mass spectrum of the progenitors.It can also be seen a small group of PNe with low log(N /O)and log(He /H)varying from -1.1to -0.7.The same pattern ap-pears in the results of Cuisinier et al.(1996)for galactic PNe and can be related to objects at high Z above the galactic plane.

G.J.M.Luna and R.D.D.Costa:Nebular abundances of southern symbiotic stars9 Table7.Mean Ne/O ratios for di?erent samples

Sample Ne/O Source

However,the uncertainties in distances,both for symbiotics and PNe,make this point still an open question.

The same?gure also includes a model from Marigo (2001),with mixing-length parameter=1.68and initial metal-licity Z=0.019and Y=0.273,computed to0.1026≥He≥0.1387and-0.9≥log(N/O)≥-0.001.Clearly,the dispersion of the data is high,but the model trend agrees with the mean values and tendencies for most of the PNe sample.For some symbiotic stars,however,this agreement cannot be seen,may be due to the uncertanties in the method used to derive He abun-dances and/or to the Marigo’s model,that was produced for isolated stars,and some discrepacies are expected with respect to binary objects like symbiotics.

Nebular abundances of symbiotics should re?ect the abun-dances of the intermediate mass stars from which they origi-nate,irrespective of their position in the galaxy.To verify this behavior we compare the mean values of the Ne/O ratio for our sample of symbiotics to other samples of disk and bulge PNe.Beingα-elements,the Ne/O ratio do not re?ect the chem-ical evolution of the interstellar medium and should remain the same along the galactic bulge and disk.The mean values and dispersions are listed in table7.

The mean values show that symbiotic stars have a similar Ne/O ratio to the bulge PNe from Escudero et al.(2004)or disk PNe form Maciel&K¨o ppen(1994).On the other hand, the mean Ne/O for the Exter et al.(2004)sample,which com-bines bulge and disk objects,is higher than the value from our sample.Within the dispersion,this is another indication that our sample contains both bulge and disk objects.

As an additional test,we included in our analysis some symbiotics that are outside of our de?nition of bulge.The mean and standard deviation of Ne/O including these objects is0.147±0.027.Since we have only a few objects outside the bulge, the derived mean values are essentially the same.

As a following project we intend to observe the full sam-ple of southern symbiotic stars to increase the statistics about physical parameters and abundances for this class of objects in di?erent locations in the Galaxy.

Acknowledgements.This work was supported by CNPq and FAPESP.

G.J.M.Luna acknowledges CNPq for his graduate fellowship(Process 141805/2003-0).We acknowledge the comments and suggestions of the referee,which helped us to improve the?nal quality of this work. References

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245Fig.5.Log(N/O)vs.Log(He/H)for our sample(?lled circles), planetary nebulae from Escudero&Costa(2001)(triangles) and Escudero et al.(2004)(squares),Exter et al.(2004)(stars); solid line represents a model from Marigo(2001)with solar metallicity and mixing-length parameterα=1.68(see Marigo 2001for details)

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12G.J.M.Luna and R.D.D.Costa:Nebular abundances of southern symbiotic stars Table6.Relative elemental abundances

Source N/O Ne/O Ar/O Source N/O Ne/O Ar/O Schmid,H.M.&Nussbaumer,H.,1993,A&A,268,159

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Stau?er,J.R.,1984,ApJ,280,695

Willson,L.A.,Wallerstein,G.,Brugel,E.W.,Stencel,R.E.,1984,

A&A,133,154

第八章分子生物学常用技术的原理及其应用及人类基因组学

第八章分子生物学常用技术的原理及其应用及人类基因组学 测试题 一、名词解释 1．分子杂交 2．Southernblotting 3．Northernblotting 4．Westernblotting 5．dotblotting 6．DNA芯片技术 7．PCR 8．功能性克隆 9．转基因技术 二、填空题 1．Southernblotting用于研究、Northernblotting用于研究，Westernblotting用于研究。 2．PCR的基本反应步骤包括、和三步。 3.在PCR反应体系中，除了DNA模板外，还需加入、、和。 4．Sange法测序的基本步骤包括、、和。 5．目前克隆致病相关基因的主要策略有、、。 6．血友病第Ⅷ因子基因的首次克隆成功所采用的克隆策略是，而DMD致病基因的克隆所采用的克隆策略是。 三、选择题 A型题 1.经电泳分离后将RNA转移到硝酸纤维素(NC)膜上的技术是： A．SouthernblottingB．Northernblotting

C．WesternblottingD．dotblotting E．insituhybridization 2.不经电泳分离直接将样品点在NC膜上的技术是 A．SouthernblottingB．Northernblotting C．WesternblottingD．Dotblotting E．insituhybridization 3.经电泳分离后将蛋白质转移到NC膜上的技术是 A．SouthernblottingB.Northernblotting C．WesternblottingD．dotblotting E．insituhybridization 4.经电泳后将DNA转移至NC膜上的技术是A．SouthernblottingB．Northernblotting C．WesternblottingD．Easternblotting E．insituhybridization 5.PCR的特点不包括 A．时间短，只需数小时B．扩增产物量大 C.只需微量模板D．用途非常广泛 E.底物必须标记 6．用于PCR的DNA聚合酶必须 A．耐热B．耐高压C.耐酸D．耐碱E.耐低温7．PCR反应过程中，模板DNA变性所需温度一般是A．95?CB．85?CC．75?CD．65?CE．55?C 8．PCR反应过程中，退火温度一般是 A．72?CB．85?CC．75?CD．65?CE．55?C 9.PCR反应过程中，引物延伸所需温度一般是A．95?CB.82?CC．72?CD．62?CE．55?C

Southern&northern&western杂交原理

Southern杂交 Southern印迹杂交是进行基因组DNA特定序列定位的通用方法。一般利用琼脂糖凝胶电泳分离经限制性内切酶消化的DNA片段，将胶上的DNA变性并在原位将单链DNA片段转移至尼龙膜或其他固相支持物上，经干烤或者紫外线照射固定，再与相对应结构的标记探针进行杂交，用放射自显影或酶反应显色，从而检测特定DNA分子的含量 基本原理是：具有一定同源性的两条核酸单链在一定的条件下，可按碱基互补的原则形成双链，此杂交过程是高度特异的。由于核酸分子的高度特异性及检测方法的灵敏性，综合凝胶电泳和核酸内切限制酶分析的结果，便可绘制出DNA分子的限制图谱。 Southern印迹杂交技术包括两个主要过程：一是将待测定核酸分子通过一定的方法转移并结合到一定的固相支持物（硝酸纤维素膜或尼龙膜）上，即印迹（blotting）；二是固定于膜上的核酸同位素标记的探针在一定的温度和离子强度下退火，即分子杂交过程。该技术是1975年英国爱丁堡大学的E.M.Southern首创的，Southern印迹杂交故因此而得名。 Northern 印记杂交 Northern blot 是一种通过检测RNA的表达水平来检测基因表达的方法，通过northern blot 的方法可以检测到细胞在生长发育特定阶段或者胁迫或病理环境下特定基因表达情况。 原理：在变性条件下将待检的RNA样品进行琼脂糖凝胶电泳，继而按照同Southern Blot相同的原理进行转膜和用探针进行杂交检测。 Western杂交 原理：是将蛋白质电泳、印迹、免疫测定融为一体的特异性蛋白质的检测方法。其原理是：生物中含有一定量的目的蛋白。先从生物细胞中提取总蛋白或目的蛋白，将蛋白质样品溶解于含有去污剂和还原剂的溶液中，经SDS-PAGE电泳将蛋白质按分子量大小分离，再把分离的各蛋白质条带原位转移到固相膜（硝酸纤维素膜或尼龙膜）上，接着将膜浸泡在高浓度的蛋白质溶液中温育，以封闭其非特异性位点。然后加入特异抗性体（一抗），膜上的目的蛋白（抗原）与一抗结合后，再加入能与一抗专一性结合的带标记的二抗（通常一抗用兔来源的抗体时，二抗常用羊抗兔免疫球蛋白抗体），最后通过二抗上带标记化合物（一般为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶）的特异性反应进行检测。根据检测结果，从而可得知被检生物（植物）细胞内目的蛋白的表达与否、表达量及分子量等情况。

DNA实验技术：原位杂交实验要求及步骤

原位杂交组织（或细胞）化学（In situ Hybridization Histochemistry，ISHH）简称原位杂交（In Situ Hybridization），属于固相分子杂交的范畴，它是用标记的DNA或RNA为探针，在原位检测组织细胞内特定核酸序列的方法。根据所用探针和靶核酸的不同，原位杂交可分为DNA-DNA杂交，DNA-RNA杂交和RNA-RNA 杂交三类。 根据探针的标记物是否直接被检测，原位杂交又可分为直接法和间接法两类。直接法主要用放射性同位素、荧光及某些酶标记的探针与靶核酸进行杂交，杂交后分别通过放射自显影、荧光显微镜术或成色酶促反应直接显示。间接法一般用半抗原标记探针，最后通过免疫组织化学法对半抗原定位，间接地显示探针与靶核酸形成的杂交体。 原位杂交最初是以同位素标记探针进行的。尽管同位素标记（如35S，3H，32P等）仍然广泛使用，但非同位素标记探针的迅速发展（尤其是生物素标记探针和地高辛标记探针），更引起科技工作者的极大兴趣。 一、基本要求 1. 组织取材：组织取材应尽可能新鲜。由于组织RNA降解较快，所以新鲜组织和培养细胞最好在30 min 内固定。 2. 固定目的是： （1）保持细胞结构； （2）最大限度地保持细胞内DNA或RNA的水平； （3）使探针易于进入细胞或组织。 最常用的固定剂是多聚甲醛，与其它醛类固定剂（如戊二醛）不同，多聚甲醛不会与蛋白质产生广泛的交叉连接，因而不会影响探针穿透入细胞或组织。 3. 增强组织的通透性和核酸探针的穿透性： （1）稀酸处理和酸酐处理：为防止探针与组织中碱性蛋白之间的静电结合，以降低背景，杂交前标本可用0.25%乙酸酐处理10 min，经乙酸酐处理后，组织蛋白中的碱性基团通过乙酰化而被阻断。组织和细胞标本亦可用0.2 M HCl处理10 min，稀酸能使碱性蛋白变性，结合蛋白酶消化，容易将碱性蛋白移除。 （2）去污剂处理：去污剂处理的目的是增加组织的通透性，利于杂交探针进入组织细胞，最常应用的去污剂是Triton X-100。注意：过度的去污剂处理不仅影响组织的形态结构，而且还会引起靶核酸的丢失。

一代、二代、三代测序技术

一代、二代、三代测序技术 (2014-01-22 10:42:13) 转载 第一代测序技术-Sanger链终止法 一代测序技术是20世纪70年代中期由Fred Sanger及其同事首先发明。其基本原理是，聚丙烯酰胺凝胶电泳能够把长度只差一个核苷酸的单链DNA分子区分开来。一代测序实验的起始材料是均一的单链DNA分子。第一步是短寡聚核苷酸在每个分子的相同位置上退火，然后该寡聚核苷酸就充当引物来合成与模板互补的新的DNA链。用双脱氧核苷酸作为链终止试剂（双脱氧核苷酸在脱氧核糖上没有聚合酶延伸链所需要的3－OH基团，所以可被用作链终止试剂）通过聚合酶的引物延伸产生一系列大小不同的分子后再进行分离的方法。测序引物与单链DNA模板分子结合后，DNA聚合酶用dNTP延伸引物。延伸反应分四组进行，每一组分别用四种ddNTP（双脱氧核苷酸）中的一种来进行终止，再用PAGE分析四组样品。从得到的PAGE胶上可以读出我们需要的序列。 第二代测序技术-大规模平行测序 大规模平行测序平台（massively parallel DNA sequencing platform）的出现不仅令DNA测序费用降到了以前的百分之一，还让基因组测序这项以前专属于大型测序中心的“特权”能够被众多研究人员分享。新一代DNA测序技术有助于人们以更低廉的价格，更全面、更深入地分析基因组、转录组及蛋白质之间交互作用组的各项数据。市面上出现了很多新一代测序仪产品，例如美国Roche Applied Science公司的454基因组测序仪、美国Illumina公司和英国Solexa technology公司合作开发的Illumina测序仪、美国Applied Biosystems公司的SOLiD测序仪。Illumina/Solexa Genome Analyzer测序的基本原理是边合成边测序。在Sanger等测序方法的基础上，通过技术创新，用不同颜色的荧光标记四种不同的dNTP，当DNA聚合酶合成互补链时，每添加一种dNTP就会释放出不同的荧光，根据捕捉的荧光信号并经过特定的计算机软件处理，从而获得待测DNA的序列信息。以Illumina测序仪说明二代测序的一般流程，（1）文库制备，将DNA用雾化或超声波随机片段化成几百碱基或更短的小片段。用聚合酶和外切核酸酶把DNA片段切成平末端，紧接着磷酸化并增加一个核苷酸黏性末端。然后将Illumina测序接头与片段连接。（2）簇的创建，将模板分子加入芯片用于产生克隆簇和测序循环。芯片有8个纵向泳道的硅基片。每个泳道内芯片表面有无数的被固定的单链接头。上述步骤得到的带接头的DNA 片段变性成单链后与测序通道上的接头引物结合形成桥状结构，以供后续的预扩增使用。通过不断循环获得上百万条成簇分布的双链待测片段。（3）测序，分三步：DNA聚合酶结合荧光可逆终止子，荧光标记簇成像，在下一个循环开

southern

Southern印迹杂交

Southern印迹杂交是进行基因组DNA特定序列定位的通用方法。一般利用琼脂糖凝胶电泳分离经限制性内切酶消化的DNA片段，将胶上的DNA变性并在原位将单链DNA片段转移至尼龙膜或其他固相支持物上，经干烤或者紫外线照射固定，再与相对应结构的标记探针进行杂交，用放射自显影或酶反应显色，从而检测特定DNA分子的含量

实验原理 核酸分子杂交技术是分子生物学领域中最常用的具体方法之一。其基本原理是：具有一定同源性的两条核酸单链在一定的条件下，可按碱基互补的原则形成双链，此杂交过程是高度特异的。由于核酸分子的高度特异性及检测方法的灵敏性，综合凝胶电泳和核酸内切限制酶分析的结果，便可绘制出DNA分子的限制图谱。但为了进一步构建出DNA分子的遗传图，或进行目的基因序列的测定以满足基因克隆的特殊要求，还必须掌握DNA分子中基因编码区的大小和位置。有关这类数据资料可应用Southern印迹杂交技术获得。

Southern印迹杂交技术包括两个主要过程：一是 将待测定核酸分子通过一定的方法转移并结合到一定 的固相支持物（硝酸纤维素膜或尼龙膜）上，即印迹（blotting）;二是固定于膜上的核酸同位素标记的探针 在一定的温度和离子强度下退火，即分子杂交过程。 该技术是1975年英国爱丁堡大学的E.M.Southern首创的，Southern印迹杂交故因此而得名。 早期的Southern印迹是将凝胶中的DNA变性后， 经毛细管的虹吸作用，转移到硝酸纤维膜上。近年来 印迹方法和固定支持滤膜都有了很大的改进，印迹方 法如电转法、真空转移法；滤膜则发展了尼龙膜、化 学活化膜（如APT、ABM纤维素膜）等。利用Southern 印迹法可进行克隆基因的酶切、图谱分析、基因组中 某一基因的定性及定量分析、基因突变分析及限制性 片断长度多态性分析（RFLP）等。

原位杂交原理及具体操作

原位杂交原理及具体操作

原位杂交实验原理与方法 一、目的 本实验的目的是学会原位杂交的使用方法。了解各种原位杂交的基本原理和优缺点。 二、原理 原位杂交组化（简称原位杂交，in situ hybridization histochemistry；ISHH）属于分子杂交的一种，是一种应用标记探针与组织细胞中的待测核酸杂交，再应用标记物相关的检测系统，在核酸原有的位置将其显示出来的一种检测技术。原位杂交的本质就是在一定的温度和离子浓度下，使具有特异序列的单链探针通过碱基互补规则与组织细胞内待测的核酸复性结合而使得组织细胞中的特异性核酸得到定位，并通过探针上所标记的检测系统将其在核酸的原有位置上显示出来。 当然杂交分子的形成并不要求两条单链的碱基顺序完全互补，所以不同来源的核酸单链只要彼此之间有一定程度的互补顺序（即某种程度的同源性）就可以形成杂交双链。 探针的种类按所带标记物可分为同位素标记探针和非同位素标记探针两大类。目前，大多数放

射性标记法是通过酶促反应将标记的基因掺入DNA中，常用的同位素标记物有3H、35S、125I 和32P。同位素标记物虽然有灵敏性高，背底较为清晰等优点，但是由于放射性同位素对人和环境均会造成伤害，近来有被非同位素取代的趋势。非同位素标记物中目前最常用的有生物素、地高辛和荧光素三种。 探针的种类按核酸性质不同又可分为DNA探针、cDNA探针、cRNA探针和合成寡核苷酸探针。cDNA 探针又可分为双链cDNA探针和单链cDNA探针。原位杂交又可分为菌落原位杂交和组织原位杂交。 菌落原位杂交（Colony in situ hybridization）菌落原位杂交是将细菌从培养平板转移到硝酸 纤维素滤膜上，然后将滤膜上的菌落裂菌以释出DNA。将NDA烘干固定于膜上与32P标记的探针杂交，放射自显影检测菌落杂交信号，并与平板上的菌落对位。 组织原位杂交（Tissue in situ hybridization）组织原位杂交简称原位杂交，指组织或细胞的原位杂交，它与菌落的原位杂交不同。菌落原位杂交需裂解细菌释出DNA，然后进行杂交。而原位

高通量测序：第二代测序技术详细介绍

高通量测序：第二代测序技 术详细介绍 -标准化文件发布号：（9456-EUATWK-MWUB-WUNN-INNUL-DDQTY-KII

在过去几年里，新一代DNA 测序技术平台在那些大型测序实验室中迅猛发展，各种新技术犹如雨后春笋般涌现。之所以将它们称之为新一代测序技术（next-generation sequencing），是相对于传统Sanger 测序而言的。Sanger 测序法一直以来因可靠、准确，可以产生长的读长而被广泛应用，但是它的致命缺陷是相当慢。十三年，一个人类基因组，这显然不是理想的速度，我们需要更高通量的测序平台。此时，新一代测序技术应运而生，它们利用大量并行处理的能力读取多个短DNA 片段，然后拼接成一幅完整的图画。 Sanger 测序大家都比较了解，是先将基因组DNA 片断化，然后克隆到质粒载体上，再转化大肠杆菌。对于每个测序反应，挑出单克隆，并纯化质粒DNA。每个循环测序反应产生以ddNTP 终止的，荧光标记的产物梯度，在测序仪的96 或384 毛细管中进行高分辨率的电泳分离。当不同分子量的荧光标记片断通过检测器时，四通道发射光谱就构成了测序轨迹。 在新一代测序技术中，片断化的基因组DNA 两侧连上接头，随后运用不同的步骤来产生几百万个空间固定的PCR 克隆阵列（polony）。每个克隆由单个文库片段的多个拷贝组成。之后进行引物杂交和酶延伸反应。由于所有的克隆都是系在同一平面上，这些反应就能够大规模平行进行。同样地，每个延伸所掺入的荧光标记的成像检测也能同时进行，来获取测序数据。酶拷问和成像的持续反复构成了相邻的测序阅读片段。

Solexa 高通量测序原理 --采用大规模并行合成测序法(SBS, Sequencing-By-Synthesis)和可逆性末端终结技术（Reversible Terminator Chemistry） --可减少因二级结构造成的一段区域的缺失。 --具有高精确度、高通量、高灵敏度和低成本等突出优势 --可以同时完成传统基因组学研究（测序和注释）以及功能基因组学（基因表达及调控，基因功能，蛋白/核酸相互作用）研究 ----将接头连接到片段上，经 PCR 扩增后制成 Library 。 ----随后在含有接头（单链引物）的芯片（ flow cell ）上将已加入接头的 DNA 片段变成单链后通过与单链引物互补配对绑定在芯片上，另一端和附近的另外一个引物互补也被固定，形成“桥” ----经30伦扩增反应，形成单克隆DNA簇 ----边合成边测序（Sequencing By Synthesis）的原理，加入改造过的DNA 聚合酶和带有4 种荧光标记的dNTP。这些dNTP是“可逆终止子”，其3’羟基末端带有可化学切割的基团，使得每个循环只能掺入单个碱基。此时，用激光扫描反应板表面，读取每条模板序列第一轮反应所聚合上去的核苷酸种类。之后，将这些基团化学切割，恢复3'端粘性，继续聚合第二个核苷酸。如此继续下去，直到每条模板序列都完全被聚合为双链。这样，统计每轮收集到的荧光信号结果，就可以得知每个模板DNA 片段的序列。目前的配对末端读长可达到2×50 bp，更长的读长也能实现，但错误率会增高。读长会受到多个引起信号衰减的因素所影响，如荧光标记的不完全切割。 Roche 454 测序技术 “一个片段 = 一个磁珠 = 一条读长（One fragment =One bead = One read）”

Southern blot实验方法和操作步骤

Southern Blot原理及实验方法 Southern Blot原理及实验方法原理： 将待检测的DNA分子用/不用限制性内切酶消化后，通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，继而将其变性并按其在凝胶中的位置转移到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上，固定后再与同位素或其它标记物标记的DNA或RNA探针进行反应。如果待检物中含有与探针互补的序列，则二者通过碱基互补的原理进行结合，游离探针洗涤后用自显影或其它合适的技术进行检测，从而显示出待检的片段及其相对大小。 用途：检测样品中的DNA及其含量，了解基因的状态, 如是否有点突变、扩增重排等。 试剂和器材 一、试剂 变性液：1.5mol/L NaCl，0.5mol/L NaOH。 中和液：0.5mol/L Tris-HCl (pH=7.5)，1.5mol/L NaCl。 20×SSC：3mol/L NaCl，0.3mol/L 柠檬酸钠。 以上溶液均在100Kpa灭菌20分钟。 2×SSC：用无菌移液管吸取20×SSC溶液5mL，加无菌水45mL。 6×SSC：用无菌移液管吸取20×SSC溶液15mL，加无菌水75mL。 二、器材 22cm×15cm瓷盘 操作方法 1. 在琼脂糖凝胶上电泳分离DNA。取出凝胶，切去边缘多于部分，EB染色，在紫外灯下照相（放一标尺，可从像片中读出DNA迁移的距离）。 2. 将凝胶置于200mL变性液中，浸泡45分钟，并温和地不断振荡，使凝胶上的ds-DNA转变为ss-DNA，然后用重蒸水冲洗凝胶几次。 3. 用中和液浸泡凝胶并不断地振荡45分钟，将凝胶中和至中性。防止凝胶的碱性破坏硝酸纤维膜。 4. 取一个瓷盘，在底部放一块玻璃板（或一块海绵）使盛器内的20倍SSC转移滤液低于玻板表面，在玻板表面盖一张3mm的二号滤纸，滤纸两边浸没于20倍SSC溶液中，在玻璃和滤纸之间，赶掉所有的气泡。

分子杂交技术

分子杂交技术 -标准化文件发布号：（9456-EUATWK-MWUB-WUNN-INNUL-DDQTY-KII

分子杂交技术 分子杂交技术 互补的核苷酸序列通过Walson-Crick碱基配对形成稳定的杂合双链分子DNA分子的过程称为杂交。杂交过程是高度特异性的,可以根据所使用的探针已知序列进行特异性的靶序列检测。 杂交的双方是所使用探针和要检测的核酸。该检测对象可以是克隆化的基因组DNA,也可以是细胞总DNA或总RNA。根据使用的方法被检测的核酸可以是提纯的，也可以在细胞内杂交, 即细胞原位杂交。探针必须经过标记，以便示踪和检测。使用最普遍的探针标记物是同位素, 但由于同位素的安全性，近年来发展了许多非同位素标记探针的方法。 核酸分子杂交具有很高的灵敏度和高度的特异性,因而该技术在分子生物学领域中已广泛地使用于克隆基因的筛选、酶切图谱的制作、基因组中特定基因序列的定性、定量检测和疾病的诊断等方面。因而它不仅在分子生物学领域中具有广泛地应用,而且在临床诊断上的应用也日趋增多。 第一节核酸探针标记的方法 核酸探针根据核酸的性质，可分为DNA和RNA探针;根据是否使用放射性标记物的与否,可分为放射性标记探针和非放射性标记探针;根据是否存在互补链,可分为单链和双链探针;根据放射性标记物掺入情况,可分为均匀标记和末端标记探针。下面将介绍各种类型的探针及标记方法。 一、双链DNA探针及其标记方法 分子生物研究中，最常用的探针即为双链DNA探针，它广泛应用于基因的鉴定、临床诊断等方面。 双链DNA探针的合成方法主要有下列两种:切口平移法和随机引物合成法。 1. 切口平移法(nick translation) 当双链DNA分子的一条链上产生切口时,E.coli DNA聚合酶Ⅰ就可将核苷酸连接到切口的3'羟基末端。同时该酶具有从5'→3'的核酸外切酶活性,能从切口的5'端除去核苷酸。由于在切去核苷酸的同时又在切口的3'端补上核苷酸,从而使切口沿着DNA链移动,用放射性核苷酸代替原先无放射性的核苷酸，将放射性同位素掺入到合成新链中。最合适的切口平移片段一般为50-500个核苷酸。切口平移反应受几种因素的影响: (a) 产物的比活性取决于[α-32 P]dNTP的比活性和模板中核苷酸被置换的程度。(b) DNA酶Ⅰ的用量和E.coli DNA聚合酶的质量会影响产物片段的大小。(c) DNA模板中的抑制物如琼脂糖会抑制酶的活性, 故应使用仔细纯化后的DNA。 材料：待标记的DNA。 设备：高速台式离心机，恒温水浴锅等。 试剂： (1)10×切口平移缓冲液:0.5mol/L Tris·Cl (pH7.2); 0.1mol/L MgSO4 ; 10mmol/L DTT; 100μg/ml BSA。 (2)未标记的dNTP原液:除同位素标记的脱氧三磷酸核苷酸外,其余3种分别溶解于50mmol/L Tris·Cl (pH7.5)溶液中,浓度为0.3mmol/L。 (3)[α-32 P] dCTP或[α-32 P]dATP:400 Ci/mmol, 10μCi/μl。 (4) E.coli DNA聚合酶Ⅰ(4单位/μ l):溶于50μ g/ml BSA, 1mmol/L DTT, 50%甘油，50mmol/L Tris·Cl(pH7.5)中。 (5)DNA酶Ⅰ:1mg/ml。 (6)EDTA :200mmol/L (pH8.0)。 (7)10mol/L NH4Ac。 操作步骤: (1) 按下列配比混合: 未标记的dNTP 10μl 10×切口平移缓冲液5μl 待标记的DNA 1μg [α-32 P]dCTP或dATP(70μCi) 7μl E.coli DNA聚合酶 4单位 DAN酶I 1μl 加水至终体积50μl (2) 置于15℃水浴60分钟。 (3) 加入5μl EDTA终止反应。

Southern杂交实验

Southern 杂交实验 Southern 杂交的原理是将待检测的DNA分子用限制性内切酶消化，通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，继而将其变性并按照其在凝胶中的位置转移到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上，固定后再与同位素或其他标记物标记的DNA探针进行反应。如果待测物中含有与探针互补的序列，则二者通过碱基互补原理进行结合，游离的探针洗涤后用显影或其他合适的技术进行检测，从而显示出待检的片段及其相对大小。 一、溶液配制 (1)20 X SSC(1000 mL) : 组分浓度 3.0M的Nacl，0.3M的柠檬酸钠 NaCl 175.32g 柠檬酸钠88.26g NaOH调PH值到7.0，高温高压灭 (2)洗涤缓冲液Washing buffer 200ml 组分浓度：0.1M Maleic acid, 0.15M Nacl; pH 7.5(20℃); 0.3%(v/v) Tween20. Maleic acid：2.32g Nacl： 1.75g Tween20 0.6ml NaOH固体约1.7g调Ph值7.5 (3)马来酸缓冲液Maleic acid buffer 200ml 组分浓度：0.1M Maleic acid, 0.15M Nacl; pH 7.5 (20oC) Maleic acid：2.32g Nacl： 1.75g Tween20 0.6ml NaOH固体约1.7g调Ph值7.5 (4)检测缓冲液Detection buffer 100ml 组分浓度：0.1M Tris-HCl, 0.1M Nacl, pH 9.5(20oC) Tris 1.21g, NaCl 0.584g

原位杂交实验操作步骤

原位杂交实验操作步骤 一质粒制备 1质粒的转化和扩增 1.1制备XL1-Blue感受态细菌 1.取400uLXL1-Blue菌种加入到含200mlLB培养基的锥形瓶中，37℃、100rpm 培养4h，离心，倒置，以冰冷的0.1mol/LCaCl_2重悬细菌，冰浴30min，离心，弃上清，倒置，再加4ml(含15%甘油)冰冷的CaCl2重悬细菌，分装(200μ/tube)，-80℃保存。 2.转化：在冰浴中将1管XL1-Blue感受态菌解冻，将浓度为2ng/μ1的质粒DNA4μ1加入到8Oμ1感受态菌中。 3.轻轻摇匀，冰浴30min。 4.42℃热激9O秒，然后迅速冰浴2min。 5.加入LB培养液(无氨苄青霉素)0.8ml，在37℃，100转/min水浴孵育60min。 6.取200μl菌液铺于琼脂板上(涂有X-Gal(20mg/ml)-IPTG(200mg/ml)的LB-氨苄青霉素50mg/ml,1μl/ml培养基)，待菌液全部被吸收后，倒置平板于37℃培养12-16h。 1.2鉴定和挑选含重组质粒的菌落 1.用无菌牙签挑取单菌落，接种到10ml含氨苄青霉素的LB培养液的离心管中，于37℃，200转/分培养2h，取1ml之一Eppendorf离心管，加 50μl10mmol/L EDTA(pH8.0)。 2.加入50μl新配置的0.2mol/LNaOH、0.5%SDS、20%蔗糖溶液后，振荡30秒。 3.在70℃温育5min，然后冷却到室温。 4.加1.5μ14mol/LKCl和0.5μ1含0.4%溴酚兰染液，振荡3O秒后，冰浴5min。 5.12000g，4℃离以3min，以除去细菌碎片。 6.制备1%的琼脂糖凝胶(含EB0.5μg/ml)，取50μl上清液加入到样品孔中，其中一孔加入中等分子量DNAMarker。恒压50V，进行电泳。 7.当溴酚兰迁移到凝胶全长的2/3-3/4时，停止电泳，在紫外灯下检查质粒DNA 分于量的大小是否与转入质粒相符。

Southern Blot操作流程

Southern Blot 操作流程 1、哺乳动物基因组DNA 的提取（或用OMEGA 试剂盒E.Z.N.A.TM Tissue DNA Kit ） 1、 取约30mg 样品，加入600 ul SNET ，再加入12 ul （20.2mg/ml ）的蛋白酶 K ，使蛋白酶K 的终浓度为400ug/ml ； 2、 55℃振荡过夜； 3、 加入0.6 ul RNaseA ，室温下孵育10 min ，后置于65℃ 10 min ； 4、 加入300 ul Tris 饱和酚，288 ul 氯仿和12 ul 异戊醇，室温下振荡30 min ； 5、 17,000 g 离心5min ，转移上层水相（600 ul ）至一新的离心管； 6、 加入等体积（600 ul ）的异丙醇沉淀DNA ，于4℃下13,250 g 离心15 min ； 7、 小心除去异丙醇，加入1 ml 70%的乙醇。离心5 min 后除去乙醇，室温下干 燥15~20 min ； 8、 加入100 ul TE ，使核酸沉淀溶解。 一、 酶切 1、 拷贝数的计算 哺乳动物基因组全长3.0×109个碱基对，按插入基因单拷贝计算如下： () g plasmid of mass bp bp DNA of Insertion μ10100.39 = ? 2、 酶切体系 基因组DNA 10 ug 10*Buffer 10 ul 酶(10U/ul) 10 ul Total 100 ul 3、 混合后置于适宜酶切温度进行酶切反应； 4、 对酶切产物进行纯化，用30 ul TE 洗脱； 5、 制备1%浓度的琼脂糖凝胶（不加EB ）； 6、 将纯化后的酶切产物敞开盖子于70℃放置15 min ，以除尽残留乙醇和消除

Southern 印迹杂交实验报告

Southern 印迹杂交实验报告 姓名：陆叶学号：14211020062 专业：公共卫生 实验时间：12.18；12.25 带教老师：潘銮凤 【实验目的】 学习核酸杂交的基本过程和操作 【实验原理】 将待检测的DNA分子用或不用限制性内切酶消化后，通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，继而将其变性并按其在凝胶中的位置转移到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上，固定后再与同位素或其它标记物标记的DNA或RNA探针进行反应，检测靶DNA片段中是否存在与探针同源的序列。如果待检物中含有与探针互补的序列，则二者通过碱基互补的原理进行结合，游离探针洗涤后用自显影或其它合适的技术进行检测，从而显示出待检的片段及其相对大小。 用途：检测样品中的DNA及其含量，了解基因的状态, 如是否有点突变、扩增重排等。【实验步骤】 1、基因组DNA的限制性内切酶酶切 取1个1.5ml离心管按下列量依次加入基因组DNA、10X酶缓冲液，酶，做好标记。老师给的HL60基因组DNA 10μg（7.6μL）；10×Buffer E（10.4μL）；EcoR I（10 u/μL）（2μL）。总体积20μL。37℃保温1.5小时。 2、1％琼脂糖电泳 先制备凝胶，称取1.2 g Agarose放入三角烧瓶中，加入60 mL TAE溶液，微波炉中加热令其完全溶解，稍作冷却后加入GelRed核酸染液6μL（稀释10,000倍）。浇板，水平放置，待凝。胶凝后按照以下顺序加样。两组共用一块凝胶，共7个样。 ①基因组DNA10 20μl （自己的） ②基因组DNA10 μg（老师的） ③酶切样品 ④阳性对照（c-myc 4.7 kb线性片段，30pg/μl, 10μl) ⑤酶切样品 ⑥基因组DNA10 μg （老师的） ⑦基因组DNA10 20μl （自己的） 插上电源，负极在样品槽一边，DNA将向阳极跑，80V电泳2小时左右，直到溴酚蓝染料跑到接近凝胶尾部，在电泳期间做好胶变性和转移准备。 3、变性 切胶，2—6孔，宽4.5cm,长7cm(从顶部开始，可用尼龙膜保护纸作为标尺） ①将凝胶浸在5倍体积的胶变性液中, 慢慢摇动20分钟。 ②ddH2O洗2次。 ③在胶中和液中慢慢摇动15分钟。 4、转移 ①在搪瓷盘中加入300 ml 10×SSC，放上培养皿和小玻璃板。 ②将3张长滤纸浸湿，逐张放在玻璃板上，用移液管的滚动，赶走气泡。 ③切除多余凝胶，小心地将凝胶放在滤纸上（加样孔面向下），赶走滤纸与胶之间的气泡。 ④再将与胶大小相同的尼龙膜（浸湿）放在胶上，同样不能有气泡，然后放上三张浸湿的 滤纸，赶走气泡。 ⑤紧贴凝胶四周各放一张X光片。 ⑥小心蒙上一张比搪瓷盘大的保鲜膜。保鲜膜要紧贴滤纸，但不能让滤纸移动。

原位杂交操作流程

原位杂交操作流程 1、使用地高辛标记的核酸探针进行石蜡切片的RNA原位杂交第一天 1）二甲苯于37℃脱蜡2次，每次15分钟； 2）无水乙醇浸泡2次，每次3分钟； 3） 95%乙醇浸泡2次，每次3分钟； 4） PBS清洗3分钟； 5） 2%焦碳酸二乙酯室温下浸泡10分钟； 6） PBS清洗10分钟； 7）加入胃蛋白酶25ul/ml，37℃孵育15分钟； 8） PBS清洗2次，每次3分钟； 9） 0.2N的HCl孵育30分钟； 10）PBS清洗2次，每次3分钟； 11）0.25%无水乙酸和0.1M三乙醇胺孵育10分钟； 12）PBS清洗2次，每次5分钟； 13）预杂交缓冲液孵育30分钟； 14）准备核酸探针混合物：使用预杂交缓冲液稀释探针，85℃加热5分钟，置于冰块中10分钟； 15）杂交；第二天 16）将玻片置于SSC中2次，每次5分钟以去除封片； 17）PBS清洗3分钟； 18）RNA酶A溶液中（或0.1-1ng/mlPBS中），37℃孵育30分钟； 19）PBS清洗5分钟； 20）室温，2×SSC清洗10分钟； 21）37℃，1×SSC清洗10分钟； 22）37℃，0.5×SSC清洗10分钟； 23）缓冲液A孵育10分钟； 24）缓冲液A（1%正常绵羊血清和0.03%三重氢核X-100）孵育30分钟； 25）加入抗地高辛抗体（1/200的上述缓冲液，来自Boehringer Mannheim），37℃孵育3 小时； 26）缓冲液A清洗2次，每次10分钟； 27）缓冲液B清洗2次，每次5分钟； 28）制成NBT/BCIP暗处保存30-60分钟，显微镜下进行观察，如果背景尚佳，显色时间可延长到16小时；29）停止缓冲液B的反应，用水进行简单的清洗； 30）固红，脱水以及封片进行核的复染。 2、使用地高辛标记的寡核苷酸探针进行石蜡切片的原位DNA杂交第一天 1）二甲苯于37℃脱蜡2次，每次15分钟； 2）无水乙醇浸泡2次，每次5分钟； 3） 95%乙醇浸泡2次，每次5分钟； 4） PBS清洗5分钟； 5） 2%焦碳酸二乙酯室温下浸泡10分钟； 6） PBS清洗5分钟； 7）加入胃蛋白酶25ul/ml，37℃孵育10分钟； 8） PBS清洗2次，每次5分钟； 9） 0.2N的HCl孵育30分钟； 10）PBS清洗2次，每次5分钟； 11）0.25%无水乙酸和0.1M三乙醇胺孵育10分钟；

核酸的分子杂交技术及其应用

核酸的分子杂交技术及其应用 1概述 核酸的分子杂交(molecular hybridization)技术是目前生物化学和分子生物学研究中应用最广泛的技术之一，是定性或定量检测特异RNA或DNA序列片段的有力工具。它是利用核酸分子的碱基互补原则而发展起来的。在碱性环境中加热或加入变性剂等条件下，双链DNA之间的氢键被破坏(变性)，双链解开成两条单链。这时加入异源的DNA或RNA(单链)并在一定离子强度和温度下保温(复性)，若异源DNA或RNA之间的某些区域有互补的碱基序列，则在复性时可形成杂交的核酸分子。 在进行分子杂交技术时，要用一种预先分离纯化的已知RNA或DNA序列片段去检测未知的核酸样品。作为检测工具用的已知RNA或DNA序列片段称为杂交探针(probe)。它常常用放射性同位素来标记。 虽然核酸分子杂交技术的应用仅有二十多年的历史，但它在核酸的结构和功能的研究中作出了重要贡献，在基因的表达调控和物种的亲缘关系研究中也发挥重要作用。而且，随着核酸探针制备及标记技术的丰富和完善以及以不同材料为支持物的固相杂交技术的发展，使核酸分子杂交技术在分子生物学领域中的应用更加广泛。这里我们将就分子杂交技术的几个主要过程及其应用进行介绍。 2核酸探针的制备 核酸分子杂交的灵敏性主要依赖杂交探针的放射性比活度。比活度高就可提高反应的灵敏性，减少待测样品的用量。目前一般所用的是体外标记，这里介绍几种最常用的方法： 2.1DNA的切口平移 双链DNA分子的一条链有切口时，大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ可把核苷酸残基加到切口处的3’端，同时由于此酶具有5’→3’外切核酸酶活性，它还可从5’端除去核苷酸。这样5’端核苷酸的去除与3’端核苷酸的加入同时进行，导致切口沿着DNA链移动，称切口平移(nicktranslation)。常用于在双链DNA 上打开切口的酶为胰DNA酶Ⅰ。由于高放射性比活度的核苷酸置换了原有核苷酸，就有可能制备比活度大于108计数/(分.μg)的32P标记的DNA探针。 2.2单链DNA探针的制备 与传统的双链探针相比，单链探针由于不存在互补链，因此可以消除由探针的两条链重退火形成无效杂交体的可能。最常用的是以M13噬菌体载体合成单链DNA探针的方法。其主要原理是用人工合成的寡核苷酸引物(其序列与载体上固定区段的序列相互补。可从生物试剂公司直接购买)与来自重组M13噬菌体的单链DNA退火，然后以此寡核苷酸作为引物在大肠杆菌DNA聚合酶ⅠKlenow大片段催化下合成互补的放射性标记DNA。 2.3单链RNA探针的制备 首先将感兴趣的DNA序列到带有SP6噬菌体或T7及T3噬菌体的启动子的重组载体质粒中。由于这些重组质粒带有的强启动子能被噬菌体的依赖DNA的RNA聚合酶所识别。因此，当把线状质粒与适当的依赖DNA的RNA聚合酶及4种rNTP(核糖核苷三磷酸)在体外混合并温育时，就可在噬菌体启动子处开始合成RNA。 单链RNA探针除具有单链DNA探针的优点之外，还具有：①合成效果高(模板可反复被转录)；②

原位杂交的方法

原位杂交 1 探针的设计与合成 1)根据实验室已有的p8基因cDNA全长序列，用premier primer5.0设计引物p81和p82， 以卤虫cDNA为模板，PCR扩增得到346bp的产物，用Takara胶回收试剂盒回收纯化。引物编号引物序列长度 p81 TGCGGACGAAACAGGAAG 18 bp p82 GCTCAAACAGTGA TGCCAGT 20 bp 2)目的片段克隆 a. 在无菌离心管中加入连接载体的各种成分，载体与片段的摩尔比控制在1:3-1:8，根据凝胶电泳检测后的浓度及载体与片段分子大小来计算摩尔比。加入成分及比例如下： 目的PCR片段 5 μl pGM-T载体（约50ng/uL） 1 μl 10×T4 DNA Ligation Buffer 1 μl T4 DNA Ligase（3U/uL） 1 μl 无菌去离子水 3 μl 总体积10 μl b. 轻轻弹动离心管以混合内容物，短暂离心。置于PCR仪中16℃过夜连接，反应结束后将离心管置于冰上。 c. 向铺好的含有氨苄青霉素的固体平板表面加入16 μl的IPTG（50mg/ml）、40 μl的X-gal （20mg/ml），使用无菌的弯头玻璃棒将其均匀的涂开，避光置于37℃培养箱1-3小时，使溶解X-gal的二甲基甲酰挥发干净。 d. 将10 μl的连接产物加到100 μl DH5 感受态细胞中，轻弹混匀，冰浴半小时，将离心管置于42℃水浴90秒，取出管后立即置于冰浴上放置2-3分钟，其间不要摇动离心管。向离心管加入500 μl 37℃预热的LB（不含抗生素）培养基，150rpm摇床37℃振荡培养45分钟。目的是使质粒上相关的抗性标记基因表达，使菌体复苏。将菌液于4000g下离心10分钟，去掉上清，加入100 μl培养液重溶并加入到配制好的LB固体培养基上，用无菌的弯头玻璃棒轻轻将细胞均匀涂开。待平板表面干燥后，倒置平板，37℃培养12-16小时。 e. 挑取白色菌落直接进行PCR检测，筛选转化子。 f. 将转化子接种于LB液体培养基中培养24小时，吸取1mL菌液送至大连宝生物公司进行序列测序。 3)重组质粒的线性化 取6 μl以测序的重组质粒，选取NcoI内切酶37℃酶切4h。酶切反应体系为20 μl： 质粒 6 μl 10xK Buffer 2 μl NcoI酶 1 μl 0.1% BSA 2 μl 灭菌水9 μl 终体积20 μl 取酶切前后的质粒各4 μl，经1%琼脂糖电泳检测，确认酶切完全，将酶切产物用Takara胶回收试剂盒回收纯化，作为探针合成的模板。 4)探针合成 按罗氏DIG RNA Labeling Kit (SP6/T7)试剂盒使用指南，标记反义RNA探针。 使用的所有试剂和器皿均经去RNase处理，合成方法如下:先准备反应体系。冰上向RNase-Free的微离心管中顺序加入下列试剂:

SouthernBlot印记杂交常见问题解析

Southern Blot印记杂交常见问题解析 1、针对不同的实验材料，southern杂交实验难度有差异么？答：不同的实验材料，在进行试验过程中难度差异很大，例如玉米、 小麦、葡萄的Southern杂交检测难度要比普通的材料要大。 (1)、物种本身的基因组较大（例如小麦），检测操作难度大 (2)、材料本身含有高糖多酚（例如葡萄）严重影响酶切操作 (3)、物种品系复杂（例如玉米），在基因组信息研究层面还不透彻。 2、核酸质量对southern杂交实验的影响 答：核酸质量对实验的影响是直接的，既要求客户提供的总量足够——实验消耗（上样量），又要求保证质量——按要求准备材料。 上样量指的是基因组DNA酶切消化后，回收后的DNA片段的量。根据 不同物种的基因组大小不同，上样量也有所区别。基因组越大，上样 量越多。例如，拟南芥大概需要3ug ，酵母3ug，人8ug，小麦15ug。酶切消化之后不能直接上样，需要回收纯化。回收会有损失，最多能 损失一半，所以需要客户提供足够量的样品，一般要求至少20 ug的 基因组DNA。（以上上样量均为一个泳道） DNA 样品一般对 OD 值和浓度有如下要求：OD260/280=1.8～2.0， OD260/230＞2.0，浓度≥100 ng/ul 。同时，需要对 DNA 样品进行琼 脂糖凝胶电泳，电泳结果显示该 DNA 样品无蛋白质和 RNA 等物质污染，无降解弥散，条带清晰。（如图所示）

3、探针设计是怎么回事，有哪些原则？ 答：探针就是与待测目的基因序列同源的一段地高辛标记的DNA序列，可以和酶切后的基因组片段特异性的结合。探针设计有如下几个原则: (1)、长度适中。探针的片段长度一般控制在300-1000bp，探针太长时会导致非特异性结合的概率增加，探针太短时，探针结合的地高辛标 记物太少，会导致发光信号减弱。 (2)、特异性强。最佳的探针序列是仅与目的基因同源，与整个基因组 序列的同源片段低于30%。 (3)、ATGC含量均匀，无发卡结构和高度重复序列。

原位杂交实验操作步骤

原位杂交实验操作步骤 撰写人：范为民 一、实验原理 原位杂交是指借助于核酸分子杂交的方法，在显微镜水平检测和定位特异的核苷酸片段。现在原位杂交已经成为在分子水平研究肿瘤和遗传性疾病的发生，发展和调控等根本性问题的有力工具。 二、试剂盒 本实验室常用的原位杂交试剂盒是博士德公司生产的敏感加强型原位杂交检测试剂盒，此试剂盒分为两种，一种为过氧化物酶（POD）检测（MK1030型），一种为碱性磷酸酶(AP)检测系统（MK1032型），用于mRNA的杂交。过氧化物酶（POD）检测的最终信号为棕黄色，而碱性磷酸酶(AP)检测的信号为紫色，因后者信号比较突出，所以一般采用后一种检测方法。两种检测方法的实验步骤相差不多，所用洗脱缓冲液也大同小异。用于杂交的探针也可以分为两种，一种是DNA探针，即是用DNA与组织中的mRNA杂交，另一种是RNA 探针，即用RNA与组织中的mRNA杂交。DNA探针处理操作简单，但杂交信号一般不如RNA探针强烈，所以条件允许的话一般采用RNA探针。下面先介绍碱性磷酸酶(AP)检测试剂盒，采用RNA作为探针的操作步骤。 三、实验步骤 原位杂交实验主要包括三大部分，即组织冰冻切片、RNA探针标记、原位杂交三部分。 （一）组织冰冻切片 1. 实验准备 （1）原位杂交专用载玻片：用多聚赖氨酸处理后的载玻片，使切片紧密粘附在玻片上，可以用于后面的洗脱。一般一张载玻片上可以贴至多十张切片（可以是不同组织的切片），所以需要玻片的数目需要根据实验的要求而定。这种专用载玻片可以从中杉金桥公司购买，目前价格是每片2.2元，玻片有一面的一端是毛玻璃，用于标记组织名称等，切片应该贴在此面，切勿贴到反面。 （2）缓冲液配备 1.1器具准备 剪刀、镊子各三把，开壳钳一把，100ml量筒一个，磁力搅拌子一个；100ml试剂瓶一个，250ml试剂瓶三个。以上器具均洗净后置于180摄氏度以上烘烤6小时以上。铅笔、显微镜、冰、吸水纸、一次性塑料手套等。 1.2 溶液配制 0.1M PB缓冲液：Na2HPO4?12H2O 5.8021g,NaH2PO4?2 H2O 0.5928 g,加入200ml ddH2O溶解于之前准备的250ml试剂瓶中，再加入200ūl DEPC，充分摇匀后过夜，高压灭菌。以上溶液配制两份，其中一份瓶中放入磁力搅拌子。