DNA测序技术发展简史
DNA测序技术发展简史
摘要：本文回顾了1965年一来DNA测序技术的发展，重点介绍了双脱氧链终止测序法及Maxam-Gillbert DNA化学降解法的出现，以及其他的一些相关技术的发展，以简练清晰的脉络梳理了DNA测序技术的发展史。
关键词：DNA测序；双脱氧链终止测序法；Maxam-Gillbert DNA化学降解法
l953年，Watson和Crick提出DNA双螺旋结构模型以后，人们就开始探索研究DNA 一级结构的方法。1965年，美国Cornell大学以Rober Holley为首的科学家小组，第一次完成了长度为75个核苦酸的酵母丙氨酸tRNA的全序列测定并将结果发表在Science杂志上。其办法是利用各种RNA酶把tRNA降解成寡核苷酸，经分离纯化之后，再分别测定这些寡核苷酸短片段的核苷酸顺序掀开了DNA测序技术研究的序幕[1]。但那时由于没有找到分别降解四种脱氧核糖核酸的专一酶，只能通过测定RNA 的序列来推测DNA的序列，即先将RNA用酸水解或外切酶降解，再经双向电泳同系层析将其分开（小片段重叠法）。
1971年，华裔分子生物学家吴瑞博士（Dr．Ray Wu）在1968年独创性地设计了一种崭新的引物-延伸测序策略，发展出了测定DNA核苷酸序列的第一个方法，提高了DNA序列分析的速度，并于1971年首次成功地测定了λ噬菌体两个粘性末端的完整序列[2]。
l977年，英国剑桥大学分子生物学实验室的Fred Sanger领导的研究小组在吴瑞博士的基础上分别在Nature和PNAS发表文章，提出DNA聚合酶的双脱氧链终止原理测定核苷酸序列的方法，Sanger作为世界上第一个解决DNA测序的科学家，再一次荣获诺贝尔奖（1980年）[3]。DNA双脱氧链终止测序法，也称酶法或末端终止法，是利用2’,3’-双脱氧三磷酸核苷(2’,3’-ddNTP或简称ddNTP)来终止DNA的复制反应。ddNTP可以在DNA聚合酶作用下通过其5’-磷酸基团掺入到正在增长的DNA链中，但由于ddNTP在脱氧核糖的3’位置缺少一个羟基，它们不能同后续的dNTP形成磷酸二酯键（由M．R．Atkinson等人于1969年发现），从而中断延伸反应。该法将待测DNA样品分成四组，在每组DNA合成反应混合物的四种普通dNTP中加入少量的一种ddNTP，这样一来，链延伸将与偶然发生但却十分特异的链终止展开竞争，最终得到反应一系列的核苷酸链，其长度取决于从用以起始DNA合成的引物末端到出现过早链终止的位置之间的距离，由于这四组独立的酶反应中分别采用四种不同的ddNTP，将产生四组分别终止于模板链的每一个A、G、C或T的位置上的寡核苷酸，使用变性测序凝胶电泳分析这四组反应的产物，即可从放射自显影片上直接读出DNA的序列[4]。
而美国哈佛的Alan Maxam和Walter Gilbert领导的研究小组也几乎同时发明出DNA序列测定方法——Maxam-Gillbert DNA化学降解法测序，其基本原理是用特异的化学试剂修饰DNA分子中的不同碱基，然后用哌啶切断反应碱基的多核苷酸链。该法设计四组特异的反应：①G反应，用硫酸二甲酯使鸟嘌呤上的N7甲基化，加热引起甲基化鸟嘌呤脱落，导致多核苷酸链可在该处断裂；②G+A反应，用甲酸使A和G嘌呤环上的N原子质子化，从而使其糖苷键变得不稳定，再用哌啶使键断裂；③T+C反应，用肼使T和C的嘧啶环断裂，再用哌啶除去碱基；④C反应，在有盐存在时，只有C与肼反应，并被哌啶除去。这样一来，同一个末端标记的DNA片段在四组互相独立的化学反应中分别得到部分降解，每一组反应特异地针对某一种或某一类碱基，生成四组放射性标记的分子，从共同起点（放射性标记末端）延续到发生化学降解的位点，每组混合物中均含有长短不一的DNA分子，其长度取决于该组反应所针对的碱基在原DNA全片段上的位置。最后，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离此后组产物，再从放射自显影片上即可读出序列[5]。
早期，用引物合成进行DNA序列测都需要将高分子量的DNA分子通过核酸内切限制酶消化降解成一组具一定长度的限制片段后再用琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝狡作电泳分离纯化，并从中抽取出DNA片段以供进一步的序列分析使用。为将这些降解的DNA片段，按其原来的顺序“拼排”起来，至少还需要用一种（有时往往是数种）其它的核酸内切限制酶对同种大分子量的DNA作酶切消化并进行电泳纯化和序列分析。这无疑既花费大量时间又需要大量金钱（商品提供的核酸内切限制酶的价格十分昂贵），同时为保证能够获得所有的限制片段，必需制备足够数量的DNA，该过程要用不同浓度的凝胶进行电泳并纯化又加剧了DNA的丢失和损伤的可能。后来采用DNA分子克隆的方法解决了该问题，将不同限制酶消化切割的DNA限制片段随机地克隆到一种M13mp系列载体分子上以获得理想的单链DNA模板。1891年，J．messing等人该进了其中所使用的寡核苷酸引物，降低了DNA 限制片段与M13mp系列载体分子其他位点的同源性，使采用蓝白斑筛选法对转化菌落的筛选更有效。
1858年，E．Y．Chen和P．H．seebury在DNA双脱氧链终止测序法的基础上发展出Sanger双脱氧链终止-pUC体系DNA序列分析法，首次在体外将待测的DNA片段与pBR332质粒载体或pUC系列的质粒载体分子重组后转化给大肠杆菌JM83菌株，将所得的转化反应物涂布在补加有X-gal及IPTG化学试剂的选择性培养基平板上，采用蓝白斑筛选法选出转化菌落，制备得到含有DNA克隆片段的双链质粒DNA，使用碱变性后可直接作为模板进行序列分析，而无须克隆到M13mp载体分子上，大大地缩短了模板DNA的获得时间[6]。
随着计算机软件技术（特别是计算机图象识别技术）、仪器制造和分子生物学研究的迅速发展，使用了荧光分子标记代替传统的32P或35S同位素标记，测序由手动向自动发展。1986年，W．anoorge等人在前人工作的基础上，设计出以DNA链末端合成终止法原理的DNA自动荧光测序仪[7]，逐渐成为DNA序列分析的主流，它所采用的自动荧光DNA测序技术是对Sanger双脱氧链终止法测序的改进：用四种不同颜色的荧光染料标记四种双脱氧核苷酸，同时进行四种链终止反应，反应产物在变性电泳凝胶的同一个泳道上进行分离。对凝胶的结果进行分析时，带有不同染料标记的每一种产物将被激发而发出不同波长的光。发射光经衍射光栅分解后，用电荷偶联仪(a charge coupled device，CCD)检测，然后通过电脑解译[8]。
20世纪90年代后期，以MD公司的Mega BACE和PE公司的ABI 3700为代表的毛细管电泳仪问世，这些集束化的毛细管电泳代替凝胶电泳后，极大地提高了序列测定的产出率，一天可完成6-8轮序列测定，每轮可测定96-384个样品，自动化的程度也得到了提高[9]。为提高分析效率，1992年美国的Mathies等人首先提出了阵列毛细管电泳的新方法，采用激光聚焦荧光扫描装置，25只毛细管并列电泳，每只毛细管在1.5小时内可读出350bp，DNA 序列分析效率可达600bp/h。后来，日本的Kambara（1994年）、美国的Yeung又分别对此进一步完善[10]。
现今，高通量的新一代DNA测序技术进一步发展出来，通过将片断化的基因组DNA 两侧连上接头并运用不同的步骤来产生几百万个空间固定的PCR克隆阵列（每个克隆由单个文库片段的多个拷贝组成），从而能够大规模地平行进行引物杂交、酶延伸反应及荧光标记的成像检测，再经过计算机分析由DNA序列延伸和成像的持续反复确定的测序阅读片段的相邻性就可获得完整DNA序列信息。目前，市场上新一代测序仪的测序原理主要有四种：使用合成法测序的454（焦磷酸测序）和Solexa，使用连接法测序SOLID和Polonator。
参考书目：
[1]《基因工程原理第二版（上册）》，吴乃虎，64页。
[2]《生物技术原理与实验》，徐小静，张少斌，王俊丽主编，59页。
[3]《高等学校教材生物工程概论》，陶兴无主编，60页。
[4]《生物技术原理与实验》，徐小静，张少斌，王俊丽主编，60页。
[5]《生物技术原理与实验》，徐小静，张少斌，王俊丽主编，64-65页。
[6]《基因工程原理第二版（上册）》，吴乃虎主编，69页。
[7]《基因克隆技术在制药中的应用》，陈汝德编，126页。
[8]《生物技术原理与实验》，徐小静，张少斌，王俊丽主编，65页
[9]《医学分子生物学》，张钦宪何丽娅李平法主编，257页。
[10]《医学分子生物学》，张钦宪何丽娅李平法主编，259页。