人外周血单核细胞分离技术

人外周血单核细胞分离

1.抗凝血的预离心分别取正常人新鲜抗凝全血

A: 20 mL于50 mL离心管中，以2 000 r /min 离心20 min，吸弃上层血浆，获得下层沉淀细胞约10?12.5 mL 。

2.沉淀细胞的稀释与离心分离在所获取沉淀

A中的细胞中加入Hank s液（不含Ca2+、Mg 2+, pH 7.2 ?7.6）体积比仍未1:1 , 混匀，制成细胞悬液。

B:无菌抗凝血与Hank s液或PBS以1:1体积在试管中混匀。

另取一离心管，加入LTS1077淋巴细胞分层液，然后用毛细吸管距分层液上1cm处

将细胞悬液小心而缓慢地加于其上面，使稀释血液重叠于分层液上。此时稀释后的细胞悬液

分离液淋巴细胞体积为：1:1。与用水平离心机以2000 r /min 离心20min，离心结束后，取出离心管，可见管中液体已经分层。

管内可见分为4层：最上层是血浆，含部分血小板：第二层为薄薄的白膜层，主要台

单个核细胞，还混杂有少量血小板；第三层为分离液层；第四层为粒细胞及红细胞，红细胞

沉于管底，而粒细胞则紧贴在压积红细胞上呈一层很薄的白膜

3.单个核细胞的提取、洗涤与悬浮、贴壁

吸去最上层的血浆，收集血浆层和淋巴细胞分离液交界面的单个核细胞，尽量全部吸出PBMC。加3~4倍以上体积Hanks或PBS液于所得的单个核细胞中，用毛细吸管轻轻吹判均匀，避免产小气泡，液柱高度不超过离心管的 2 / 3。混匀后离心1500r/mi n 离心

10min，低速离心有利于去除细胞悬液中留存的血小板，去上清液。

注意：还可以先用吸管把雾状层上面的液体吸走，注意不要碰到雾状层，然后在把要的部分慢慢吸出来。第二种方法，比较简单一些。

再用同样洗涤液洗涤细胞2次，1500r/min 离心10min，洗去残留的淋巴细胞分离液。再以RPMI-1640 培养基离心洗涤1次，吸尽上清，以充分去除血小板等杂质。按每毫升血液标本加0.2

mL含20%小牛血清的Hank s液（或含10%胎牛血清及25 mmol /L

hepas的RPMI-1640 液3?4 mL）重新混悬细胞37 C、5% C02孵育箱中培养2?3 h

后去除上清，得到贴壁的单核细胞。于各培瓶中分别加入含10%胎牛血清的RPMI-1640

液3?4 mL ,按需调定细胞密度，于37 C、5% C02孵育箱中培养备用。

4.单核细胞的纯度与细胞活力的鉴定

取一定体积的细胞悬液送做流式细胞CD14、CD56等检查，以测定所得细胞的纯度。

取1滴细胞悬液置于血细胞计数板内计数。以台盼蓝拒染法检测细胞活力。取1滴细胞悬液加1滴2%台盼蓝染液混匀，加盖片，显微镜高倍镜检，活细胞不着色，折光强；死细胞被染成蓝色，体积略膨大。

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