秦川牛的双肌臀基因敲除

姓名：朱秀生

学号：1418302029

专业：动物遗传育种与繁殖

苏太猪功能基因及其设计实验应用于经济性状的研究

摘要：苏太猪是我国本地培育的一个优良品种，它具有产仔多、生长速度快、瘦肉率高、耐粗饲、肉质鲜美等优点。本文主要简单介绍下苏太猪的经济性状和基因的关系然后用一定的分析方法对这些基因的位点进行检测，为今后的苏太猪育种提供一定的根据。

关键词：苏太猪；PCR-RFLP；屠体和肉质性状；候选基因

1.苏太猪简介

随着生活水平的提高，人们对猪肉品质的要求越来越高，肉色、PH值、系水力、肌肉脂肪和适口性等都是影响猪肉品质的重要指标，并且早在1999年就被美国国家猪肉生产委员会认定为“有重要经济价值的肉品性状”[1]。随着生物技术的发展尤其是分子生物学技术的快速发展，使得人们可以在DNA水平上操控这些性状的基因，进而采取标记选择辅助的方法达到是肉质和肉量同步提高的目的。苏太猪是江苏省苏州市太湖猪育种中心培育而成。1991，培育中心以太湖猪为母本，杜洛克猪为父本进行杂交，得到含有50%太湖猪血统和50%杜洛克猪血统的杂交猪。采用群体继代选育法，横交固定，1年1个世代。个世代。至1995年达4个世代，作为一个新品系(D7)通过农业部验收。1999年3月通过国家畜禽品种资源委员会猪品种专业委员会审定为新品种，并改名为苏太猪。“九五”期间被农业部列为重大科技成果推广项目，2000年度被国家列为“农业科技跨越计划”的28个推广项目之一[2]。苏太猪既保持了太湖猪繁殖力强、肉质鲜美等特点，又具备了瘦肉率高、生长速度快等瘦肉型猪的明显特征。外部特征为耳中等大，垂向下方，头面有清晰皱纹，嘴中等长而直，部分猪允许有玉鼻，全身被毛黑色偏直。

2.猪肉质，生长相关基因研究进展

人类基因组计划和分子生物学技术的发展，推动了猪基因图谱的研究进展，使猪的QTL定位研究取得长足的进步，从而为利用分子标记进行数量性状位点的鉴别和定位奠定了坚实的基础。目前，对影响猪的数量性状的QTL的研究己成为国际上的研究重点，并已取得了一定的成效。对QTLs的分析，有很多种方法，比如分离分析法，基因组扫描法和侯选基因法，其中利用侯选基因法进行猪肉质等相关基因的研究取得了很大的进步。下面就简单阐述下猪生长、肉质相关基因的研究进展。

2.1 与生长性状有关的基因：IGF1和IGF2

在神经内分泌轴上，生长激素GH主要是通过工GFs系统而发挥其促生长功能。下面就简单介绍下IGF1和IGF2的功能。

2.1.1 .1 IGF1的作用

GH作为神经内分泌生长轴的主体激素，它的作用主要是通过工GF1介导的。GH的分泌和血液中IGF1的浓度的密切相关，也即IGFI成为GH分泌的特异性指示信号，但工GFl的表达量也依赖于GHoIGFI主要与其本身受体即工GF1R 结合而发挥其生物学功能。IGFl主要在肝脏中合成，并释放入血液中，通过血循环到达肾，在肾中降解。其它器官如肾、骨等处也可合成IGFI，通过局部的

旁分泌和自分泌促进靶细胞的分化与增重。IGF1的作用机制尚不清楚。一般认为肤类激素是通过细胞膜受体而发挥其生物学作用的，但IGF1在胞膜上，而且在细胞内的滑面型内质网和高尔基体等结构中也发现有其特异性的结合位点[3。

IGFl又叫生长介素(SWC)，是由70个氨基酸组成的具有内分泌、自分泌及旁分泌特性的单链碱性多肤，分子量为7648. 7Da。pIGFl基因由6个外显子和5个内含子组成，全长80kb。Winter. A. K. 等于1994年通过连锁分析将猪的IGFI 基因定位于第5号染色体的q23-24，并得到了一个线性连锁图谱:Sw1071-IFNG-S0015-MHC-IGFl-Sw995-Sw967【4】。

猪pIGFI生物学功能主要包括介导生长激素的促生长作用，促使体脂的合成，乳腺的发育，卵巢的发育，以及促进某些性腺分泌性激素等作用。pIGFI与猪的胚胎以及出生后的生长有着密切关系。IGF1在仔猪初生时含量最高，出生后第1周开始下降，瘦肉型猪血浆中IGF1含量高于脂肪型，断奶前高于断奶后。对猪的试验结果表明，血浆中IGF1水平与体重及增重呈正相关，在这方面已经阐述得比较清楚。IGF1在不同的猪品种中其浓度也有所差异，生长速率快的猪其血浆中的IGFl浓度也高于生长速率慢的猪。IGF1对猪肌肉的生长也有一定的促进作用，主要是因为GH/IGF1轴作用的主要靶组织是肌肉。给猪注射人或牛的IGF1会使猪的肌肉生长加快，且肌肉中总蛋白和总的IGFI-mRNA丰度上升。Gerrard等发现，随着猪日龄的增加，肌肉中IGF1的表达量也增加到出生后的最高水平，但IGF2基因在肌肉中的表达量却下降(P<0. 05)【5】。

2.1.1.2 IGF1基因的多态性检测

由于胰岛素样生长因子-1是猪肌肉生长的主效因子，且是生长的候选基因，因此有必要对它进行深入的研究。Casas-Carrill【5】等对6头公猪与18头无相关母猪杂交的群体，分析了与GH和IGFI位点连锁的染色体区域对生长与胭体性状的影响。发现在一个公猪家系中IGF1基因型与断奶后日增重存在连锁(LOD 值为2. 3)，断奶后日增重的假定QTL所在区间要大于IGF1至Sw1071的范围。因此需要建立几个较大的参考群来进行研究，以确定是否为生长的主要候选基因，还是一种遗传标记。方美英等【6】对我国6个地方猪种的基因频率进行了研究，结果表明香猪除与桃源猪基因频率差异不显著之外，与其它4个猪种(民猪、桃源猪、内江猪、姜曲海猪)之间基因频率差异极显著((P<0. 0l)，而其它4个猪种之间差异均不显著。王文君等用PCR-RFLP法对南昌白猪(92头)和大约克夏猪(170头)的工GF1基因的多态性进行了研究并分析了不同基因型对个体初生重、2月龄重、4月龄重、6月龄重、料重比、背膘厚和瘦肉率等生产性能的影响。结果表明，在南昌白猪中，AA(等位基因A为151+28bp, B为116十35+28bp)型猪比AB型仔猪初生重高，差异显著((P<0. 05);在大约克夏猪中，BB型猪比AB型猪的6月龄体重大，差异显著((P<0. 05) , AA型猪比AB型和BB型猪瘦肉率低，差异极差著((P<0. 01)。周杰等【7】对二花脸猪和大白猪脂肪组织中基因表达量的研究结果表明猪脂肪组织中GHR, IGFI和IGF2R的基因表达有特定的发育模式。IGF1基因表达量的品种差异可能正是两品种猪脂肪沉积规律不同的主要原因之一。李加琪等【8】对216头F2代个体的长白X蓝塘猪资源群应用PCR-RFLP方法检测了工GF1基因的多态性，结果表明IGF1基因不同基因型对断奶后日增重、骨率、月同体瘦肉量和皮脂率等4个性状有显著的遗传影响。2.1.2.1 IGF2基因的作用

胰岛素样生长因子2是胰岛素一胰岛素样生长因子一释放生长因子家族的成员之一，与有促进有丝分裂活性作用的胰岛素在结构上具有高度同源性。其生

物活性受IGF1受体、IGF2受体、胰岛素受体、6个IGF结合蛋白(IGF binding proteins, IGFBPI-IGFBP6)以及其它激素和营养的调控。IGF2是生长激素发挥作用的中间信使，即生长激素首先作用于IGF2，再由IGF2作用于靶器官，进而发挥促进生长发育的作用。

2.1.2.2 IGF2基因的结构特点、定位

Nezer【9】最早把IGF2基因定位到乓SC2p上。Andersson L等第一次利用大白猪和欧洲野公猪以及大白猪和皮特兰猪杂交建立的参考家系，收集所有F2代个体表型性状资料，表型性状包括生长性状、月同体性状和肌肉品质等，通过250个遗传标记的基因组扫描，鉴定了几个重要经济性状的QTL。其中，影响肌肉含量和脂肪沉积的QTL定位在猪2号染色体短臂末端((SS.C2p)。Andersson 等分析欧洲野猪与大约克杂交后代的资料，将一个对骨骼肌和心肌重量有中等效应的QTL定位于2号染色体，与IGF2基因共线性。de Koning等同样观察到了影响肌肉含量和脂肪沉积的印迹QTL存在于SSC2P。Amarger V等研究认为猪IGF2基因全长约23. 8kb，包含共4个启动子、10个外显子，同时含有5，端和3，端非翻译序列。IGF2存在着具有时空特异性表达的启动子。

2.1.2.3 IGF2基因的多态性研究

IGF2是常染色体上的母源印迹基因，由于在肌纤维形成中起重要作用，所以IGF2被认为是影响瘦肉率和脂肪沉积的主要候选基因。Jeon在研究欧洲野公猪X大白猪参考家系的实验中发现猪工GF2微卫星位点Swc9具有高度多态性。通过连锁分析确定了IGF2内含子2中有一个单核营酸多态(G-A转换)，但这一转换所引起的NciI限制性酶切位点改变的作用未被确证;并且发现猪IGF2基因的编码区域的多态性不能解释观察到的QTL效应。目前己发现IGF2基因8个内含子中有3个(第2, 3, 8内含子)与基因表达调控有关。近年来发现该基因内含子突变与肌肉、脂肪的沉积密切相关。刘桂兰等采用PCR-RFLP技术，分析了工GF2基因第8内含子部分片段在猪资源家系群体中的NciI酶切片段多态性分布，发现IGF2基因该片段的两个Ncil酶切位点在资源家系中均具有多态性。IGF2基因B位点酶切未突变个体均比酶切突变的个体背膘薄18. 28%(P<0. O1)，肥肉率低22. 43% (P<0. O1)，瘦肉率高8.71(P<0. 0l )，位点A具有相同的影响趋势。

3.分子育种方法选育苏太猪

3.1 分子标记育种方法简介

传统的数量遗传学育种方法，虽给家畜育种带来巨大发展，但存在周期长、选择，效应小且不稳定的缺点，这些缺点延缓了家畜改良的速度。而基于分子遗传学和分子数量遗传学的分子育种技术的兴起有可能克服这些缺点而给家畜育种工作带来一场革命，大大加快育种进度。传统的数量遗传学育种技术是根据个体及其亲属的表型值通过选择进行的，它只能有效地利用具有加性效应的基因座位，对具有互作和上位效应的一些基因座位则无能为力，而分子标记技术则可以利用一切有利的基因座位来改良动物的生产性状，同时能作到真正的基因型选择，大大提高了选择的准确性和育种效率。

分子标记育种即通过DNA标记技术对某些重要生产性状直接进行选择改良。DNA标记技术分为三大类:一是以分子杂交为基础的DNA标记技术，包括基因组DNA限制性酶切、电泳分离、Southern转移与异性探针杂交检测基因组的RFLPs。另一类是以PCR为基础的DNA标记技术，包括RFLP, RAPD, AFLP, DNA 扩增指纹(DNA)、SSCP，SSR，SNP、引物判别PCR (AP-PCR)等。第三类是卫星DNA、小卫星DNA、微卫星DNA分析。

3..2 分子标记辅助选择

标记辅助选择是将现代分子生物技术与常规育种方法相结合，借助分子标记选择某一位点来改变该位点的基因频率的过程，也称分子辅助选择。

3.3 PCR-RFLPs原理及在猪育种中的应用

限制性片段长度多态性(Restriction fragment length polymorpHisms, RFLPs)标记是20世纪70年代中期发展起来的一种分子标记，属于第一代分子标记，并最早应用于人类基因组的研究。和其他分子生物学技术手段相结合，RFLP在动物的遗传育种上的应用日益广泛。

3.3.1 RFLPs的原理

生物基因组中，DNA分子的碱基序列(除突变外)是稳定遗传的，在个体一生中和上下代传递过程中保持不变。DNA限制性酶可以识别并切割DNA特定碱基序列，并生成一定长度的DNA片段。因此，对某一个体或者基因型而言，由限制性内切酶切割而成的限制性DNA片段的长度也是固定不变的。突变型由于任何一个碱基的替代、DNA序列的插入或者缺失都影响包含该序列的DNA限制性酶切片段的长度。但在不同的个体或者群体间，酶切片段的长度却是呈现不同的多态性。这种多态性即称为DNA限制性片段长度多态性(RFLP)o RFLP的这种多态性可以通过电泳和分子杂交技术而实现。

RFLP一般有两类，一类是碱基替换(也称点多态性)，另一类是结构变异型;前者由于识别位点上发生了单个碱基替换，使原有酶切位点丧失或者获得新的位点；而后者是由于DNA序列内部发生较大片段的缺失、重复或者插入以及酶切位点的相对位移引起酶切片段大小发生了变化，通过对这些变化的检测，即可以比较不同品种或个体DNA水平的差异，为群体物种的进化以及系统发育提供信息。目前RFLP研究方法可归纳为两类:标准RFLP分析法和PCR-RFLP分析法。

3.3.2 RFLPs方法在猪育种中的应用

现在己利用分子标记定位基因座位，证实了应激综合症座位是位于第6号染色体的兰尼定受体基因突变造成。兰尼定受体结构与功能的改变，导致猪应激时骨骼肌钙离子非常释放而引起应激综合症发生，再用PCR-RFLP法扩增特定片段，进行电泳，根据酶切片段长度多态性来判断应激敏感猪与正常猪。李宁等对雌激素受体基因和促卵泡素p亚基基因在二花脸猪杂交群中检测表明:利用ESR 和FSH }受体进行标记辅助选择有可能提高产仔数，培育仔数多、生长快、背膘薄的新母系，从而大大地提高养猪的经济效益。

随着分子生物学、动物遗传标记技术等的发展，RFLP标记在理论上或者实际应用中显示了一定的局限性，但作为一种遗传标记，RFLP依然提供着有价值的信息资料，如与其它高新技术相结合，方能取长补短，提高RFLP的适用性，在动物遗传育种各个领域的研究会发挥更大的作用。

参考文献

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基因敲除技术研究新进展2011

基因敲除技术研究新进展 黄薇,严放北京大学医学部心血管研究所 gene knockout）技术是20世纪80年代发展起来的一门新技术。应用DNA同源重组技术将灭活的基因导入小鼠胚em cells，ES cells）以取代目的基因，再筛选出已靶向灭活的细胞，微注射入小鼠囊胚。该细胞参与胚胎发育形成可得到纯合基因敲除小鼠。基因敲除小鼠模型的建立使许多与人类疾病相关的新基因的功能得到阐明，使现代生物学进展。基于基因敲除技术对医学生物学研究做出的重大贡献，在该领域取得重大进展的三位科学家，70岁的美国人chi）、82岁的美国人奥利弗?史密西斯（Oliver Smithies）和66岁的英国人马丁?埃文斯（Martin Evans）分享了2 80年代末期的基因敲除技术为第一代技术，属完全性基因敲除，不具备时间和区域特异性。关于第二代区域和组织于1993年。Tsien等[1]于1996年在《Cell》首先报道了第一个脑区特异性的基因敲除动物，被誉为条件性基因敲除oxP系统为基础，Cre在哪种组织细胞中表达，基因敲除就发生在哪种组织细胞中。 imizu等[2]于《Science》报道了以时间可调性和区域特异性为标志的第三代基因敲除技术，其同样以Cre/LoxP系统re的表达。该技术使目的基因的敲除在时间上可人为控制，避免了死胎或动物出生后不久即死亡等现象的出现。 实验室Cui[3]等又报道了第四代基因工程技术，即可诱导的区域性蛋白质敲除技术，用这一技术构建的模式动物可在定蛋白质的功能，从根本上改变了前三代基因敲除技术对蛋白质代谢速度的内在依赖性，达到空前的时间精度，成组研究最先进的工具之一。 以来上述基因敲除技术只能在小鼠上完成，因为只有小鼠的ES细胞能在体外培养中无限增殖并同时保持多分化潜能以及猴等大动物模型在疾病研究中更接近于人类，大动物更有益于某些繁琐的手术操作，同时血浆及组织样本量较大家介绍近两年来基因敲除技术在大动物模型上的突破及进展。 一、大鼠ES细胞基因打靶技术 ，大鼠的生理和药理特性与人类更相近，是研究人类疾病的一种重要动物模型，在心血管疾病和糖尿病等领域的作S细胞在体外难以长期维持自我更新，用传统培养方法无法获得具有生殖传代能力的大鼠ES细胞[5]。因此在过去二物模型远不及小鼠发展迅速。2010年Tong等[6]于《Nature》报道了p53基因敲除大鼠，这在基因敲除技术上又是

基因敲除技术

第23卷武 夷 科 学V o.l23 2007年12月WUY I SCIENCE J OURNA L D ec.2007 文章编号:1001 4276 (2007)01 0187 04 几种常用的基因敲除技术 李今煜,陈健铭,彭振坤 (福建农林大学生命科学学院,福建福州350002) 摘要: 摘要:随着功能基因组学研究的深入发展,基因敲除技术逐渐成为基因功能研究的重要手段,本文就常用的三种基因敲除技术,即同源重组、插入突变、RNA干扰各自的原理、适用的范围和优缺点作简要介绍。关键词: 基因敲除;同源重组;插入突变;RNA干扰 中图分类号: Q343.1 文献标识码: A 随着越来越多生物的全基因组被测序,功能基因组学成为时下研究的热点。研究基因功能的方法主要有两种思路,一是通过增强其表达,取得表达产物进行研究,二是减弱或者终止其表达,观察整体功能的变化,进而推测相应的基因功能。前者因为不能反映基因产物的真实表达情况,而逐渐被抛弃。后者将基因与生物的整体功能联系起来考察,并能为基因的功能提供直接证据,因而其技术不断得到发展和完善,其中最常用的就是基因敲除(gene knockou t)技术。 基因敲除技术除最早的同源重组技术外,新的原理和技术也逐渐被应用,比较成功的有基因的插入突变和RNA,i它们同样可以达到基因敲除的目的。下面就这几种基因敲除技术简要进行介绍。 1 利用同源重组进行基因敲除 基因敲除是在同源重组技术及胚胎干细胞(e mbryon i c ste m cel,l ES细胞)技术的基础上逐步完善发展起来,主要是利用DNA转化技术,将含有目的基因和靶基因同源片段的重组载体导入靶细胞,通过载体与靶细胞染色体上同源序列间的重组,将外源基因整合入内源基因组内,使外源基因得以表达。通过研究靶细胞或者个体在目的基因插入前后遗传特性的改变,达到研究基因功能的目的[1]。 基因敲除技术已从最初简单的完全敲除发展到条件敲除阶段,现正朝着特定组织基因敲除、特定时间基因敲除的可调控敲除方向发展。完全基因敲除是通过同源重组直接将靶基因在细胞或者动物个体中的活性完全消除;而条件基因敲除则是将某个基因的修饰限制于特定类型的细胞或个体发育特定的阶段,即通过位点特异的重组系统实现特定基因敲除[2],现阶段以噬菌体的C re/Loxp系统和酿酒质粒的FLP/FRT系统应用得最为广泛[3]。 虽然基因敲除技术的广泛使用使其成为研究基因功能重要的技术手段,但目前仍然存在 收稿日期:2007-09-26 基金项目:福建省自然科学基金计划资助项目(项目编号:2006J0052)。 作者简介:李金煜(1976-),女,硕士,研究方向:主要从事生物化学与分子生物学领域的研究。

crispr-cas9基因敲除

CRISPR/Cas9 是细菌和古细菌在长期演化过程中形成的一种适应性免疫防御，可用来对抗入侵的病毒及外源DNA。CRISPR/Cas9 系统通过将入侵噬菌体和质粒DNA 的片段整合到CRISPR 中，并利用相应的CRISPR RNAs（crRNAs）来指导同源序列的降解，从而提供免疫性。 原理 此系统的工作原理是crRNA（CRISPR-derived RNA ）通过碱基配对与tracrRNA （trans-activating RNA ）结合形成tracrRNA/crRNA 复合物，此复合物引导核酸酶Cas9 蛋白在与crRNA 配对的序列靶位点剪切双链DNA。而通过人工设计这两种RNA，可以改造形成具有引导作用的sgRNA （singleguide RNA ），足以引导Cas9 对DNA 的定点切割。 作为一种RNA 导向的dsDNA 结合蛋白，Cas9 效应物核酸酶是已知的第一个统一因子（unifying factor），能够共定位RNA、DNA 和蛋白，从而拥有巨大的改造潜力。将蛋白与无核酸酶的Cas9（Cas9 nuclease-null）融合，并表达适当的sgRNA ，可靶定任何dsDNA 序列，而sgRNA 的末端可连接到目标DNA，不影响Cas9 的结合。因此，Cas9 能在任何dsDNA 序列处带来任何融合蛋白及RNA，这为生物体的研究和改造带来巨大潜力。 应用 基因敲除动物模型一直以来是在活体动物上开展基因功能研究、寻找合适药物作用靶标的重要工具。但是传统的基因敲除方法需要通过复杂的打靶载体构建、ES细胞筛选、嵌合体小鼠选育等一系列步骤，不仅流程繁琐、对技术的要求很高，而且费用大，耗时较长，成功率受到多方面因素的限制。即使对于技术比较成熟的实验室，利用传统技术构建基因敲除大、小鼠一般也需要一年以上。 2013 年1 月份，美国两个实验室在《Science》杂志发表了基于CRISPR-Cas9 技术在细胞系中进行基因敲除的新方法，该技术与以往的技术不同，是利用靶点特异性的RNA 将Cas9 核酸酶带到基因组上的具体靶点，从而对特定基因位点进行切割导致突变。该技术迅速被运用到基因敲除小鼠和大鼠动物模型的构建之中。通过一系列研究，首先证明了通过RNA 注射的方式将CRISPR-Cas 系统导入小鼠受精卵比DNA 注射能更有效的在胚胎中产生定点突变。在此基础上，又发现了该方法没有小鼠遗传品系的限制，能够对大片段的基因组DNA 进行删除，也可以通过同时注射针对不同基因的RNA 序列达到在同一只小鼠或大鼠中产生多个基因突变的效果。此外，还证明了利用CRISPR-Cas 技术构建的基因敲除大鼠模型与传统方法构建的同一基因（肥胖相关G 蛋白偶联受体Mc4R）突变大鼠相比具有一致的表型。该方法构建的基因突变动物具有显著高于传统方法的生殖系转移能力，是一种可靠、高效、快速的构建敲除动物模型的新方法。 CRISPR-Cas 技术是继锌指核酸酶（ZFN）、ES 细胞打靶和TALEN 等技术后可用于定点构建基因敲除大、小鼠动物的第四种方法，且有效率高、速度快、生殖系转移能力强及简单经济的特点，在动物模型构建的应用前景将非常广阔。 技术优缺点 CRISPR （Clustered Regularly Interspersed Short Palindromic Repeats）是细菌用来抵御病毒侵袭/躲避哺乳动物免疫反应的基因系统。科学家们利用RNA引导Cas9核酸酶可在多种细胞（包括iPS）的特定的基因组位点上进行切割，修饰。Rudolf Jaenisch 研究组将Cas9与Te1和Tet2特异的sgRNA共注射到小鼠的受精卵中，成功得到双基因敲除的纯合子小鼠，效率高达80%。他们将Cas9/sgRNA 与带突变序列的引物共注射，能准确在小鼠两个基因引入所要的点突变。在ES细胞中他们更是成功的一次敲除了五个基因。与ZFN/TALEN相比，CRISPR/Cas更易于操作，效率更高，更容易得到纯合子突变体，而且可以在不同的位点同时引入多个突变。但该系统是否有脱靶效应尚需进一步的研究。 传统的转基因和基因打靶技术，由于技术稳定成熟，可以对小鼠和大鼠的基因组序列进行各种修饰，仍将是模式动物的构建的主要技术。核酸酶ZFN/TALEN 尤其是CRISPR/Cas技术如果能解决脱靶效应的话，有可能会广泛应用于小鼠，大鼠及其他模式动物的制备和研究中，成为传统的转基因和基因打靶技术的重要补充。

CRISPR cas9基因敲除原理及其应用

CRISPR/Cas9基因敲除原理及其应用 CRISPR(clustered,regularly interspaced,short palindromic repeats)是一种来自细菌降解入侵的病毒DNA或其他外源DNA的免疫机制。在细菌及古细菌中，CRISPR系统共分成3类，其中Ⅰ类和Ⅲ类需要多种CRISPR相关蛋白（Cas蛋白）共同发挥作用，而Ⅱ类系统只需要一种Cas蛋白即可，这为其能够广泛应用提供了便利条件[1]。 目前，来自Streptococcus pyogenes的CRISPR-Cas9系统应用最为广泛。Cas9蛋白（含有两个核酸酶结构域，可以分别切割DNA两条单链。Cas9首先与crRNA及tracrRNA结合成复合物，然后通过PAM序列结合并侵入DNA，形成RNA-DNA复合结构，进而对目的DNA双链进行切割，使DNA双链断裂。 由于PAM序列结构简单（5’-NGG-3’），几乎可以在所有的基因中找到大量靶点，因此得到广泛的应用。CRISPR-Cas9系统已经成功应用于植物、细菌、酵母、鱼类及哺乳动物细胞，是目前最高效的基因组编辑系统[1]。 通过基因工程手段对crRNA和tracrRNA进行改造，将其连接在一起得到sgRNA（single guide RNA）。融合的RNA具有与野生型RNA类似的活力，但因为结构得到了简化更方便研究者使用。通过将表达sgRNA的原件与表达Cas9的原件相连接，得到可以同时表达两者的质粒，将其转染细胞，便能够对目的基因进行操作[2,3]。

目前常用的CAS9研究方法是通过普通质粒,质粒构建流程如下：Cas9质粒构建 设计2条单链oligo序列； 退火形成双链DNA pGK1.1 将双链DNA连接到载体 中 转化G10competent cell 筛选阳性克隆；测序验证 序列；质粒大提；电转染 靶细胞 在细胞内crRNA识别靶 位点，Cas9对靶位点进行 随机剪切 Cruiser TM酶切细胞池，计 算突变率；Cruiser TM酶切 初筛阳性克隆；将阳性克 隆测序验证；做敲除序列 比对分析。

基因敲除技术研究进展

兰州交通大学化学与生物工程学院综合能力训练Ⅰ——文献综述 题目：基因敲除技术研究进展 作者：王振宇 学号：201207744 指导教师：谢放 完成日期：2014-7-16

基因敲除技术研究进展 摘要基因敲除是自20世纪80年代末以来发展起来的一种新型分子生物学技术，是通过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失的技术。在总结已有研究成果的基础上，本文对基因敲除技术的概况、原理方法应用以及近年来基因敲除技术的研究进展作一个简单的综述。 关键词基因敲除 RNA i生物模型基因置换基因打靶同源重组1. 基因敲除技术简介 基因敲除(Gene knockout)是指一种遗传工程技术，针对某个序列已知但功能未知的序列，改变生物的遗传基因，令特定的基因功能丧失作用，从而使部分功能被屏障，并可进一步对生物体造成影响，进而推测出该基因的生物学功能。 它克服了随机整合的盲目性和偶然性，是一种理想的修饰、改造生物遗传物质的方法。基因敲除借助分子生物学、细胞生物学和动物胚胎学的方法,通过胚胎干细胞这一特殊的中间环节将小鼠的正常功能基因的编码区破坏,使特定基因失活,以研究该基因的功能；或者通过外源基因来替换宿主基因组中相应部分,以便测定它们是否具有相同的功能，或将正常基因引入宿主基因组中置换突变基因以达到靶向基因治疗的目的。基因敲除是揭示基因功能最直接的手段之一。通常意义上的基因敲除主要是应用DNA同源重组原理，用设计的同源片段替代靶基因片段(即基因打靶),从而达到基因敲除的目的。随着基因敲除技术的发展,除了基因打靶技术外,近年来新的原理和技术也逐渐被应用,比较成功的有RNA干扰技术,同样也可以达到基因敲除的目的。简单的说基因敲除是指将目标基因从基因组中删除。基因敲除技术主要应用于动物模型的建立，而最成熟的实验动物是小鼠，对于大型哺乳动物的基因敲除模型还处于探索阶段。这项技术的诞生可以说是分子生物学技术上继转基因技术后的又一革命。尤其是条件性、诱导性基因打靶系统的建立，使得对基因靶位时间和空间上的操作更加明确、效果更加精确、

基因敲除具体步骤

The following protocols take MLCK (myosin light chain kinase) as an example. General steps: 1.BAC extraction (It is necessary for us to identify the BAC by PCR) 2.Transform BAC to EL350 ( Cm+) 3.Retrieving (Cm+ Amp+) 4. Targeting 1st lox P (Amp+ Amp+ and K+) 5. Transform MLCK 1st lox P to EL350 to get purify MLCK 1st lox P ( Amp+ and K+) 6. MLCK 1st lox P pop out (Amp+ and K+ AmP+) 7. Transform MLCK 1st lox P pop out to EL250 (Amp+) 8. Targeting 2nd lox P (Amp+ Amp+ and K+) 9. Transform MLCK 2nd lox P to DH-5α or XL1-Blue ( Amp+ and K+) 10. Linearization 1. BAC extraction Solution I: Tris.Cl 0.025 M EDTA 0.01M Glucose 0.05M pH 8.0 Solution II: SDS 1 % NaOH 0.2M fresh prepared (1Volume 2% SDS + 1Volume 0.4M NaOH) Solution III: (120 ml 5 M KAc + 23 ml HAc + 57 ml H2O) / 200 ml

基因敲除小鼠的制作方法

.. 一、常规基因敲除鼠（Conventional Knockout） 常规基因敲除是通过基因打靶，把需要敲除的基因的几个重要的外显子或者功能区域用Neo Cassette 替换掉。这样的小鼠其全身所有的组织和细胞中都不表达该基因产物。此类基因敲除鼠一般用于研究某个基因在对小鼠全身生理病理的影响，而且这个基因没有胚胎致死性。 二、条件性基因敲除小鼠（Conditional Knockout） 条件性基因敲除小鼠是通过基因打靶，把两个loxP 位点放到目的基因一个或几个重要的外显子的两边。该小鼠和表达Cre酶小鼠杂交之前，其目的基因表达完全正常。当和组织特异性表达Cre酶的小鼠进行杂交后，可以在特定的组织或细胞中敲除该基因，而该基因在其他组织或细胞表达正常。 条件性基因敲除鼠适用范围为：（1）该基因有胚胎致死性；（2）用于研究该基因在特定的组织或细胞中的生理病理功能。 三、基因敲入小鼠（Knockin） 基因敲入小鼠是通过基因打靶，把目的基因序列敲入到小鼠的相应基因位点，使用小鼠的表达调控元件指导目的基因表达。 此类基因敲入鼠一般用于药物的筛选，信号通路的研究等。 获得嵌合体及之后品系纯化详细流程： 基因敲除其他方法： 一、ZFN技术制作基因敲除鼠 ZFN能够识别并结合指定的基因序列位点，并高效精确地切断。随后细胞利用天然的DNA 修复过程来实现DNA的插入、删除和修改，这样研究人员就能够随心所欲地进行基因组编辑。这在过去是无法想象的，传统的基因敲除技术依赖细胞内自然发生的同源重组，其效率只有百万分之一，而ZFN的基因敲除效率能达到10%。利用这些技术进行小鼠基因的定点敲除和敲入，可以把时间从一年缩短到几个月。 这项技术中设计特异性的ZFN是最关键的环节，目前研究者采用计算生物学方法设计高特异性的ZFN，但ZFN的脱靶（off target），也就是把不该切的地方切了的问题仍是一个挑战。也正因为这个原因，利用ZFN技术进行小鼠的基因修饰还无法完全取代传统技术。 二、TALEN技术制作基因敲除鼠 TALEN 技术是一种崭新的分子生物学工具。科学家发现，来自一种植物细菌的TAL蛋白的核酸结合域的氨基酸序列与其靶位点的核酸序列有恒定的对应关系。利用TAL的序列模块，可组装成特异结合任意DNA序列的模块化蛋白，从而达到靶向操作内源性基因的目的，它克服了ZFN方法不能识别任意目标基因序列，以及识别序列经常受上下游序列影响等问题，而具有ZFN相等或更好的灵活性，使基因操作变得更加简单方便。然而同样因为脱靶的问题，利用TALEN技术进行小鼠的基因修饰仍然无法取代传统技术。 ;.

基因敲除技术的原理、方法和应用

基因敲除技术的原理、方法和应用 2010-01-24 17:03:43 来源：易生物实验浏览次数：6302 网友评论 0 条 1．基因敲除概述 2．实现基因敲除的多种原理和方法： 2.1.利用基因同源重组进行基因敲除 2.2利用随机插入突变进行基因敲 除。 2.3.RNAi引起的基因敲除。 3．基因敲除技术的应用及前景 4．基因敲除技术的缺陷 关键词：基因敲除 1．基因敲除概述： 基因敲除是自80年代末以来发展起来的一种新型分子生物学技术，是通过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失的技术。通常意义上的基因敲除主要是应用DNA同源重组原理，用设计的同源片段替代靶基因片段，从而达到基因敲除的目的。随着基因敲除技术的发展，除了同源重组外，新的原理和技术也逐渐被应用，比较成功的有基因的插入突变和iRNA，它们同样可以达到基因敲除的目的。 2．实现基因敲除的多种原理和方法： 2．1．利用基因同源重组进行基因敲除 基因敲除是80年代后半期应用DNA同源重组原理发展起来的。80年代初，胚胎干细胞（ES细胞）分离和体外培养的成功奠定了基因敲除的技术基础。1985 年，首次证实的哺乳动物细胞中同源重组的存在奠定了基因敲除的理论基础。到1987年，Thompsson首次建立了完整的ES细胞基因敲除的小鼠模型 [1]。直到现在，运用基因同源重组进行基因敲除依然是构建基因敲除动物模型中最普遍的使用方法。 2.1.1利用同源重组构建基因敲除动物模型的基本步骤(图1)： a．基因载体的构建：把目的基因和与细胞内靶基因特异片段同源的DNA 分子都重组到带有标记基因(如neo 基因，TK 基因等)的载体上，成为重组载体。基因敲除是为了使某一基因失去其生理功能，所以一般设计为替换型载体。

基因敲除技术现状及应用

医学分子生物学杂志,2007,4(1):862 90　J Med Mol B i ol,2007,4(1):86290 通讯作者:汤华(电话:022*********,E 2mail:htang2002@yahoo 1 co m ) Corres ponding author:T ANG Hua (Tel:86222223542603, E 2mail: htang2002@yahoo 1co m ) 基因敲除技术现状及应用 万海英　综述 汤华　审阅 天津医科大学天津市生命科学中心实验室　天津市,300070 【摘要】　功能基因组学的研究进展使基因敲除技术显得尤为重要。基因敲除技术从载体构建到细胞的筛选到动物模型的建立各方面都得到了发展。其中C re 2LoxP 系统可以有效的控制打靶的发育阶段和组织类型,实现特定基因在特定时间和(或)空间的功能研究;转座子系统易于操作,所需时间短,具有高通量的特点,可以携带多种抗性标记,方便了同时进行多基因功能研究;基因捕获技术提供了获得基因敲除小鼠的高效方法,方便了进行小鼠基因组文库的研究。此外,进退策略、双置换法、标记和交换法、重组酶介导的盒子交换法也从不同方向发展了基因敲除技术。 【关键词】　基因敲除;C re 2LoxP 系统;转座子;基因捕获【中图分类号】　R34918 St a tus Quo and Appli ca ti on of Gene Knockout WAN Haiying,T ANG Hua Tianjin M edical U niversity,Tianjin L ife Science Center ,Tianjin,300070,China 【Abstract 】　Gene knockout is i m portant f or functi onal genom ics 1Great p r ogress has been made in the vect or constructi on of gene knockout,screening of ai m ed cells and ani m al models and the devel op 2ments in these fields hel p t o s olve the p r oble m s in the study of genom ic functi ons 1Cre 2LoxP syste m can effectively contr ol the devel opment stage and hist ol ogy of gene knockout,thereby making it possi 2ble t o study gene functi on in a given ti m e and /or s pace 1Trans pos on syste m is easy t o mani pulate,quick and can achieve high thr oughput,carry multi p le resistance marker gene,which makes si m ulta 2neous study of multi p le genes possible 1Gene trapp ing p r ovides a highly efficient method of obtain knockout m ice and can facilitate the research of m ice geno m ic library 1I n additi on,the techniques such as “hit and run ”,“double rep lace ment ”,“tag and exchange ”and “recombinase 2mediated cas 2sette exchange ”all contribute t o the devel opment of gene knockout technol ogy 1【Key words 】　gene knockout,Cre 2LoxP syste m,trans pos on;gene trapp ing 基因敲除又称为基因打靶,是指从分子水平上将一个基因去除或替代,然后从整体观察实验动物,推测相应基因功能的实验方法。基因敲除技术是功能基因组学研究的重要研究工具。 基因敲除技术是在20世纪80年代后半期应用DNA 同源重组原理发展起来的。胚胎干细胞(e m 2bry onic ste m cell ,ES 细胞)分离和体外培养的成功及哺乳动物细胞中同源重组的存在奠定了基因敲除 的技术基础和理论基础[1] 。基因敲除主要包括下列技术:①构建重组载体;②重组DNA 转入受体细 胞核内;③筛选目的细胞;④转基因动物。 基因敲除传统的重组载体主要有插入性载体系统和替换性载体系统。插入性载体系统构建载体时主要包括要插入的基因片段(目的基因)、同源序列片段、标志基因片段等成分,替换性载体系统主要包括同源序列片段、替换基因的启动子、报道基因等成分。基于正负双向筛选(positive and negative selecti on,P NS )策略的传统方法的基因敲除需要满足:对基因组提取处理用于构建载体;需要位于打靶区两翼的具有特异性和足够长度的同源片段,并便于用其作为探针用Southern 印迹证实;neo 基因(新霉素磷酸转移酶基因)的整合;同源重组区域外侧tk 基因(胸苷激酶基因)在随机重组时的活性;打靶结构外特异的基因探针;合适的酶切位点,

基因敲除技术样本

基因敲除技术 点击次数: 2605 发布日期: -5-25 来源: 本站仅供参考, 谢 绝转载, 否则责任自负 1．概述: 基因敲除是自80年代末以来发展起来的一种新型分子生物学技术, 是经过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失的技术。一般意义上的基因敲除主要是应用DNA同源重组原理, 用设计的同源片段替代靶基因片段, 从而达到基因敲除的 目的。随着基因敲除技术的发展, 除了同源重组外, 新的原理和技术也逐渐被应用, 比较成功的有基因的插入突变和iRNA, 它们同样能够达到基因敲除的目的。2．实现基因敲除的多种原理和方法: 2．1．利用基因同源重组进行基因敲除 基因敲除是80年代后半期应用DNA同源重组原理发展起来的。80年代初, 胚胎干细胞( ES细胞) 分离和体外培养的成功奠定了基因敲除的技术基础。1985年, 首次证实的哺乳动物细胞中同源重组的存在奠定了基因敲除的理论基础。到 1987年, Thompsson首次建立了完整的ES细胞基因敲除的小鼠模型[1]。直到现在, 运用基因同源重组进行基因敲除依然是构建基因敲除动物模型中最普遍的 使用方法。 2.1.1利用同源重组构建基因敲除动物模型的基本步骤(图1):

图1.基因同源重组法敲除靶基因的基本步骤 a．基因载体的构建: 把目的基因和与细胞内靶基因特异片段同源的DNA 分子 都重组到带有标记基因(如neo 基因, TK 基因等)的载体上, 成为重组载体。基因敲除是为了使某一基因失去其生理功能, 因此一般设计为替换型载体。 b．ES 细胞的获得: 现在基因敲除一般采用是胚胎干细胞, 最常见的是鼠, 而兔, 猪, 鸡等的胚胎干细胞也有使用。常见的鼠的种系是１２９及其杂合体, 因为这类小鼠具有自发突变形成畸胎瘤和畸胎肉瘤的倾向, 是基因敲除的理想实验动物。而其它遗传背景的胚胎干细胞系也逐渐被发展应用。[2, 3] ｃ．同源重组: 将重组载体经过一定的方式(电穿孔法或显微注射)导入同源的胚胎干细胞(ES cell)中, 使外源DNA与胚胎干细胞基因组中相应部分发生同源重组, 将重组载体中的DNA序列整合到内源基因组中, 从而得以表示。一般地, 显微注射命中率较高, 但技术难度较大, 电穿孔命中率比显微注射低, 但便于使用。[4,5] ｄ．选择筛选已击中的细胞: 由于基因转移的同源重组自然发生率极低, 动物的重组概率为10－2～10-5, 植物的概率为10－4～10－5。因此如何从众多细胞中筛出真正发生了同源重组的胚胎干细胞非常重要。当前常见的方法是正负筛选法( PNS法) , 标记基因的特异位点表示法以及PCR法。其中应用最多的是PNS法。[6]

微生物基因敲除技术分析

微生物基因敲除技术分析 牟福朋 20071401105 山东大学生命科学学院 摘要：基因敲除技术是上个世纪80年代出现的新型分子生物学实验技术。到现在经过近30年的发展，已经出现了很多前沿技术。微生物由于它本身特有的性质一直成为基因敲除的热点。本文主要考察基因敲除技术的现状及其发展方向，并对基因敲除的应用提出自己的观点。关键词：基因敲除微生物前沿进展 一常规基因敲除 1 常规基因敲除的步骤 基因敲除的一般流程见图1。用引物扩增目的基因之后，使用内切酶切开基因，连入有相同粘性末端的抗生素基因如四环素抗性基因或者报告基因例如lacZ等；将载体转化入目的菌内，通过筛选，筛选出含有标记基因的菌株，然后要通过PCR等进行复证。 使用双标记法可以判断发生交换的次数。如果只发生第一次重组，则两个标记都会被插入宿主DNA中；而若发生了两次重组，则阴性标记会被丢失，细菌要么是野生型的，要么能检测到阳性标记。 图1 常规基因敲除的主要流程和机理 2 常规基因敲除的成功率分析 首先，DNA的同源重组频率不是很高。况且，此处要求发生两次同源重组，这使得重组概率大大下降。加长两端的同源序列有助于重组，但这样一来内切酶效率就得不到保证。这一问题解决的方法，主要是进行大量的培养，实验中，往往可以得到较多的敲除子。 第二，图中可以看出，在第一次重组和第二次重组之间，由于敲出基因载体的整个插入，基因仍然有一部分是完好的（载体的一段和宿主的另一端融合而成）。解决这一问题的方法已如前述：即引入两个标记。 3 常规基因敲除的主要缺点 ①速度慢，效率低。基因敲除需要一般的基因工程方法来进行转化和表达，周期较长，在这个过程中载体是关键；

基因敲除小鼠技术

转基因、基因敲入/敲除动物技术已经成为现代生命科学基础研究和药物研发领域不可或缺的重要技术，该技术从上世纪七八十年代诞生以来，已有近四十年的历史，经典技术如DNA原核显微注射、胚胎干细胞显微注射技术一直以来经久不衰，并逐渐从基 础研究实验室转向商业模式，成为一项高度标准化的新兴产业 一、技术介绍与研究进展 转基因、基因敲入/敲除动物技术已经成为现代生命科学基础研究和药物研发领域不可或缺的重要技术，该技术从上世纪七八十年代诞生 以来，至今已有近四十年的历史，经典技术如DNA原核显微注射、胚胎干细胞显微注射技术一直以来经久不衰，在小鼠模型构建方面日趋完善，并且如同剪切酶和抗体等 常规分子生物学试剂的制备技术一样，逐渐从基础研究实验室转向商业模式，成为一项高度标准化的新兴产业，催生了数以百计的创新药物和数以千计的优秀文章。尽管 如此，传统技术仍然存在一些难以克服的缺陷，如步骤繁琐、周期漫长、成功率低、费用高昂等，而ZFN和TALEN等新技术的出现，或有可能将这一局面彻底改变。 二、同源重组技术原理 基因敲除鼠技术是上世纪80年代中后期基于DNA同源重组的原理发展起来的，Capecchi和Smithies在1987年根据同源重组（homologous recombination）的原理，首次实现了ES的外源基因的定点整合（targeted integration），这一技术称为"基 因打靶"（gene targeting）或"基因敲除"（gene knockout），利用这种ES的显微注射就可以制作出基因敲出小鼠（KO Mice: knockout mice）;由于这一工作，Capecchi 和Smithies于2007年与Evans分享了诺贝尔医学奖。 同源重组（homologous recombination）定义：是指发生在姐妹染色单体（sister chromatin) 之间或同一染色体上含有同源序列的DNA分子之间或分子之内的重新组合。在基因敲除小鼠制作过程中，需要针对目的基因两端特异性片段设计带有相同片段的

CRISPRCas基因敲除原理及其应用

C R I S P R C a s基因敲除原 理及其应用 The Standardization Office was revised on the afternoon of December 13, 2020

CRISPR/Cas9基因敲除原理及其应用 CRISPR(clustered,regularlyinterspaced,shortpalindromicrepeats)是一种来自细菌降解 入侵的病毒DNA或其他外源DNA的免疫机制。在细菌及古细菌中，CRISPR 系统共分成3类，其中Ⅰ类和Ⅲ类需要多种CRISPR相关蛋白（Cas蛋白）共同发挥作用，而Ⅱ类系统只需要一种Cas蛋白即可，这为其能够广泛应用提供了便利条件[1]。 目前，来自Streptococcuspyogenes的CRISPR-Cas9系统应用最为广泛。Cas9蛋白（含有两个核酸酶结构域，可以分别切割DNA两条单链。Cas9首先与crRNA及tracrRNA结合成复合物，然后通过PAM序列结合并侵入DNA，形成RNA-DNA复合结构，进而对目的DNA双链进行切割，使DNA双链断裂。 由于PAM序列结构简单（5’-NGG-3’），几乎可以在所有的基因中找到大量靶点，因此得到广泛的应用。CRISPR-Cas9系统已经成功应用于植物、细菌、酵母、鱼类及哺乳动物细胞，是目前最高效的基因组编辑系统[1]。 通过基因工程手段对crRNA和tracrRNA进行改造，将其连接在一起得到sgRNA（singleguideRNA）。融合的RNA具有与野生型RNA类似的活力，但因为结构得到了简化更方便研究者使用。通过将表达sgRNA的原件与表达Cas9的原件相连接，得到可以同时表达两者的质粒，将其转染细胞，便能够对目的基因进行操作[2,3]。 目前常用的CAS9研究方法是通过普通质粒,质粒构建流程如下： Cas9质粒构建 设计2条单链oligo序列；退火形成双链DNA

基因敲除技术的发现及应用

个人自主学习研究报告 本次研讨方向：掌握基因概念的本质与演变过程 本人承担的具体学习研讨主题：80年代基因敲除技术的突破 基因敲除是自20世纪80年代末以来发展起来的一种新型分子生物学技术，是通过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失的技术。此技术是由马里奥·卡佩奇、马丁·埃文斯与奥利弗·史密斯所开发，最初是以基因敲除小鼠（knockout mouse，昵称：KO mouse）完成实验，三人并因此获得2007诺贝尔医学奖。 1. 基因敲除技术简介 基因敲除(Gene knockout)是指一种遗传工程技术，针对某个序列已知但功能未知的序列，改变生物的遗传基因，令特定的基因功能丧失作用，从而使部分功能被屏障，并可进一步对生物体造成影响，进而推测出该基因的生物学功能。 它克服了随机整合的盲目性和偶然性，是一种理想的修饰、改造生物遗传物质的方法。基因敲除借助分子生物学、细胞生物学和动物胚胎学的方法,通过胚胎干细胞这一特殊的中间环节将小鼠的正常功能基因的编码区破坏，使特定基因失活，以研究该基因的功能；或者通过外源基因来替换宿主基因组中相应部分，以便测定它们是否具有相同的功能，或将正常基因引入宿主基因组中置换突变基因以达到靶向基因治疗的目的。基因敲除是揭示基因功能最直接的手段之一。 2. 80年代实现基因敲除的原理和方法： 通常意义上的基因敲除主要是应用DNA同源重组原理，用设计的同源片段替代靶基因片段，从而达到基因敲除的目的。随着基因敲除技术的发展，基因敲除技术有很多，如同源重组法、插入突变法、RNAI法。然而，在80年代，基因敲除是应用DNA同源重组原理发展起来的。该方法通过同源重组将外源基因定点整合入靶细胞基因组某一确定的位点，以达到定点修饰改造染色体上某一基因的目的，克服了随机整合的盲目性和偶然性，是一种理想的修饰、改造生物遗传物质的方法。80年代初，胚胎干细胞（ES细胞）分离和体外培养的成功奠定了基因敲除的技术基础。1985年，首次证实的哺乳动物细胞中同源重组的存在奠定了基因敲除的理论基础。到1987年，Thompsson首次建立了完整的ES细胞基因敲除的小鼠模型。直到现在，运用基因同源重组进行基因敲除依然是构建基因敲除动物模型中最普遍的使用方法。 3. 基因敲除技术的前景 基因敲除技术现在以广泛的应用于各个领域并取得了快速的发展，应用此技术可以建立生物模型、培育新的生物品种、还可以用于疾病的分子机理研究和疾病的基因治疗等。80年代，基因工程技术是该世纪分子生物学史上的一个重大突破，而基因敲除技术则是另一重大飞跃。它为定向改造生物，培育新型生物提供了重要的技术支持。

基因敲除技术

基因敲除技术 1．概述： 基因敲除是自80年代末以来发展起来的一种新型分子生物学技术，是通过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失的技术。通常意义上的基因敲除主要是应用DNA同源重组原理，用设计的同源片段替代靶基因片段，从而达到基因敲除的目的。随着基因敲除技术的发展，除了同源重组外，新的原理和技术也逐渐被应用，比较成功的有基因的插入突变和iRNA，它们同样可以达到基因敲除的目的。 2．实现基因敲除的多种原理和方法： 2．1． 利用基因同源重组进行基因敲除 基因敲除是80年代后半期应用DNA同源重组原理发展起来的。80年代初，胚胎干细胞（ES细胞）分离和体外培养的成功奠定了基因敲除的技术基础。1985年，首次证实的哺乳动物细胞中同源重组的存在奠定了基因敲除的理论基础。到1987年，Thompsson首次建立了完整的ES细胞基因敲除的小鼠模型[1]。直到现在，运用基因同源重组进行基因敲除依然是构建基因敲除动物模型中最普遍的使用方法。 2.1.1利用同源重组构建基因敲除动物模型的基本步骤(图1)： a． 基因载体的构建：把目的基因和与细胞内靶基因特异片段同源的DNA 分子都重组到带有标记基因(如neo 基因，TK 基因等)的载体上，成为重组载体。基因敲除是为了使某一基因失去其生理功能，所以一般设计为替换型载体。 b．ES 细胞的获得：现在基因敲除一般采用是胚胎干细胞，最常用的是鼠，而兔，猪，鸡等的胚胎干细胞也有使用。常用的鼠的种系是１２９及其杂合体，因为这类小鼠具有自发突变形成畸胎瘤和畸胎肉瘤的倾向，是基因敲除的理想实验动物。而其他遗传背景的胚胎干细胞系也逐渐被发展应用。[2，3] ｃ．同源重组：将重组载体通过一定的方式(电穿孔法或显微注射)导入同源的胚胎干细胞(ES cell)中，使外源DNA与胚胎干细胞基因组中相应部分发生同源重

基因敲除三大技术对比

基因敲除三大技术对比 技术名称优势局限性可提供服务类型 基于胚胎干细胞的同源重组技术成熟、可靠、精细是目前 为止唯一一个可以满足所 有要求的打靶技术 1）需要ES细胞，目前只有 小鼠有高效的ES细胞，其它 模式动物的ESC还不能实现 大规模应用。 2）周期长、工作量大、费用 相对比较高 1）全基因敲除模式小鼠 2）条件性基因敲除模式小鼠 3）先全敲除再条件性敲除模 式小鼠 4）基因敲入模式小鼠 5）ROSA位点定点转基因 TALEN技术基因敲除效率高，速度快， 可实现多物种基因敲除基因敲入效率较低，多基因敲 除困难，系统构建相对复杂， 存在脱靶风险 1）全基因敲除大/小鼠 2）全基因敲除细胞系 EGE系统基因敲除/敲入效率高，速 度快，可实现多基因、多 物种基因敲除/敲入，系统 构建简单存在脱靶风险，但通过选择合 适的sgRNA可以有效降低脱 靶率，In vivo脱靶可通过传 代去除 1）全基因/条件性基因敲除大 /小鼠 2）全基因/条件性报告基因敲 除/敲入大/小鼠 3）CRISPR/Cas9粒构建 4）细胞系敲除/敲入

免疫类 B-NSG小鼠：Biocytogen-NOD-SCID-IL2rg B-NSG小鼠是NOD遗传背景，Prkdc和IL2rg双基因敲除的小鼠，是目前国际公认的免疫缺陷程度最高、最适合人源细胞或组织移植的工具小鼠。 基本特征 ?NOD（non-obese diabetes）遗传背景：自发I型糖尿病；其巨噬细胞对人源细胞吞噬作用弱；先天免疫系统，如补体系统和树突状细胞功能降低。 ?Prkdcscid ：Prkdc（protein kinase DNA-activated catalytic）基因突变，小鼠的功能性T 和B细胞缺失，淋巴细胞减少，表现为细胞免疫和体液免疫的重度联合免疫缺陷（severe combined immune deficiency, scid）。 ?Il2rgnull：Interleukin-2受体的gamma链（IL-2R γc，又称CD132）位于小鼠X染色体上，是具有重要免疫功能的细胞因子Il2、Il-4、Il-7、Il-9、Il-15和I-21的共同受体亚基，该基因敲除后的小鼠机体免疫功能严重降低，尤其是NK细胞的活性几乎丧失。 B-NSG小鼠：综合了NOD-SCID-IL2rg背景特征，具有重度免疫缺陷表型，无成熟T细胞、B 细胞和功能性NK细胞，细胞因子信号传递能力缺失等。非常适合人造血干细胞及外周血单核细胞的移植和生长。 优点 ?迄今世界上免疫缺陷程度最高的工具小鼠； ?与NOD-scid小鼠相比寿命更长，平均长达1.5年； ?对人源细胞和组织几乎没有排斥反应； ?少量细胞即可成瘤，依赖于细胞系或细胞类型； ?无B淋巴细胞泄漏。

基因敲除技术

基因敲除技术研究进展综述 摘要：基因敲除在20世纪80年代发展起来后已经应用到许多领域, 如建立人类疾病的转基因动物模型(糖尿病转基因小鼠、神经缺损疾病模型等)。这些疾病模型的建立使研究者可以在动物体内进行疾病的研究: 研究发育过程中各个基因的功能, 研究治疗人类遗传性疾病的途径。 关键字：基因敲除；Cre/LoxP系统；基因载体；生物模型 1．概述： 基因敲除又称为基因打靶, 是指从分子水平上将一个基因去除或替代, 然后从整体观察实验动物,推测相应基因功能的实验方法，是功能基因组学研究的重要研究工具。是自80年代末以来发展起来的一种新型分子生物学技术。 通常意义上的基因敲除主要是应用DNA同源重组原理，用设计的同源片段替代靶基因片段，从而达到基因敲除的目的。随着基因敲除技术的发展，除了同源重组外，新的原理和技术也逐渐被应用，比较成功的有基因的插入突变和iRNA，它们同样可以达到基因敲除的目的。 基因敲除已成为当前医学和生物学研究的最热点与最前沿, 并已对生物学和医学的许多研究领域产生深刻的影响, 成为革命性的研究工具, 具有极其重要的理论意义和实践意义。 基于基因敲除技术对医学生物学研究做出的重大贡献，在该领域取得重大进展的三位科学家，70岁的美国人马里奥?卡佩奇（Mario Capecchi）、82岁的美国人奥利弗?史密西斯（Oliver Smithies）和66岁的英国人马丁?埃文斯（Martin Evans）分享了2007年诺贝尔生理学或医学奖。 2.基因敲出技术发展历史 80年代末期的基因敲除技术为第一代技术，属完全性基因敲除，不具备时间和区域特异性。关于第二代区域和组织特异性基因敲除技术的研究始于1993年。Tsien等于1996年在《Cell》首先报道了第一个脑区特异性的基因敲除动物，被誉为条件性基因敲除研究的里程碑。该技术以Cre/LoxP系统为基础，Cre在哪种组织细胞中表达，基因敲除就发生在哪种组织细胞中。 2000年Shimizu等[于《Science》报道了以时间可调性和区域特异性为标志的