第一章1-6噬菌体载体2

3、λ噬菌体载体的优缺点：?优点：包装的λ噬菌体感染大肠杆菌要比

质粒转化细菌的效率高。

?缺点：λ噬菌体载体的克隆操作要比质粒载体复杂。

?用途：λ噬菌体载体比质粒载体能插入的DNA长得多，常用于构建cDNA文库或基因组文库。

第一章

分子克隆的工具酶和载体?第八节噬菌体载体

?一、λ噬菌体

?（一）λ噬菌体

?（二）λ噬菌体载体的改造

?（三）λ噬菌体载体举例

（三）λ噬菌体载体举例?Lambda gt10

?Lambda gt11

?EMBL3和EMBL4Lambda gt10

概述：

?Lambda gt10是一种插入载体。

?在噬菌体阻遏基因cI 内有单一的EcoRⅠ克隆位点。用于插入小的cDNA片段(约6kb)，构建cDNA文库或基因文库。

?该载体克隆效率很高。

?在构建cDNA文库时，利用Oligo(dT)或随机引物合成的cDNA经过EcoRⅠadaptors或Linkers修饰后，就可以和λgt10连接起来。?克隆到λgt10的噬菌体，可用核酸探针进行筛选。

Lambda gt10map

宿主：

?建议用C600 and C600hf1作受体菌。

筛选：

?如果有外源DNA插入，cI基因失活，该噬

菌体进入裂解生长途径，在培养皿形成噬

菌斑。反之，若无插入，cI基因表达，噬

菌体进入溶原生长途径，不形成噬菌斑。

?核酸探针杂交。

Insertional cloning

?Insertional cloning into the cI gene of the

lambda -gt10 cDNA cloning vector (DNA inserts of ~1-5 kb) can be selected in hfl (high

frequency of lysogeny ) mutant strains of E. coli. In hflA strains of E. coli, expression of the lambda cII gene is elevated, resulting in transcriptional induction of the lambda cI repressor gene which promotes lysogeny . Disruption of the lambda cI coding

sequence by DNA insertion into the unique EcoRI site of the lambda gt10 cDNA cloning

vector, blocks the lysogenic pathway leading to cell lysis and plaque formation.

Lambda gt11

?λgt 载体系列：是插入型载体。插入了大肠

杆菌β-半乳糖苷酶基因片段，可以表达外源cDNA 而形成β-半乳糖苷酶融合蛋白。?λgt18/19 、λgt20/21和λgt 22/23 是λgt 11的衍生载体。?重组体筛选：

?未重组的噬菌体载体转入lac -宿主后，在X-gal 平板上形成淡蓝色噬斑；而外源DNA 片段插入载体后，重组噬菌体形成无色噬斑，很容易辩别。

?常常用免疫学方法对噬班或菌落进行筛选。

Lambda gt10 map

Lambda gt11 map

Lambda gt11

概述：

?Lambda gt11是一个克隆和表达载体。

?用于小的插入（7.2 kb ）片断构建cDNA 文库或基因文库。

?在其β-半乳糖苷酶翻译终止位点上游的LacZ 基因内，有单一的EcoR Ⅰ位点。

?如果外源DNA 的阅读框与lacZ 吻合，即可表达融合蛋白。

?在构建cDNA 文库时，利用Oligo (dT)或随机引物合成的cDNA 经过EcoR ⅠAdaptors 或Linkers 修饰后，可以和λgt11连接起来。

宿主：

?建议用Y1089(r-) and Y1090(r-)作受体菌。筛选：

?利用特异的抗体进行筛选。

EMBL3和EMBL4

?EMBL3/4是由λ1059衍生的λ置换型载体。?是常用的基因组克隆载体，克隆的DNA 片

段大小为9-23kb 。

?多克隆位点分别位于一个14 kb 填充片段的两侧。

?两载体均在填充片段内含有red 及gam 基因，可由Spi 表现型筛选重组子。

?除多克隆位点的顺序相反外，EMBL3和EMBL4的其余特征相同。

red及gam基因

?red及gam基因：编码一种与重组有关的（核酸外

切酶和一种抑制E coli recBCD核酸酶活性）蛋白。?二者抑制噬菌体使之无法在一些宿主菌（噬菌体

P2的溶源菌株）中生长，

?噬菌体P2的溶源菌株：如基因组内含有一个拷贝

P2基因组的菌株。

?spi-筛选：当填充片段被外源片段取代时，重组菌株成为red-及gam-，噬菌体能在P2的溶源菌株中生长。这一现象称为spi-筛选（对P2介入敏感）。?spi-筛选不利于亲代载体，可降低非重组子的数目。

Replacement of lambda DNA ?Replacement of lambda DNA containing the red and gam genes in the lambda EMBL3 genomic DNA cloning vector with BamHI compatible DNA inserts of ~10-20 kb, permits lytic growth of recombinant phage in E. coli strains containing the P2 bacteriophage lysogen.

EMBL3和EMBL4

?特征：

1. 9-23kb的置换容量。

2. 未切的DNA，消化和去磷酸的DNA臂都是有效的。

3. 要提供宿主菌株。

?宿主：

建议用NM538、

NM539作受体菌。

LambdaGem-11

?是EMBL3的衍生载体，有反向的T7及SP6两个启动子，可以合成RNA探针。

?在多克隆位点区域有特意设计的覆盖的XhoI及BamHI位点，它们分别离T7及SP6启动子为6及11个核苷酸。

?在T7及SP6两个启动子的两侧有非对称的SfiI位点。?Bacterial strains KW251 and LE392 are included with LambdaGEM?-11 Arms.

LE392, NM538 and NM539 are included with uncut vector DNA.

提供（cDNA文库表达）载体的公司?Stratagene

?Novagen

?Invitrogen：Topo Gateway?

?BD Biosciences Clontech

Lambda ZAP?II Vector

?载体插入pSK质粒序列，能进行蓝白斑筛

选。

?能产生单链环状DNA。

?用于序列测定或定点突变。

Charon4A、Charon21A、Charon32～35和Chaoon40载体?Charon载体：是为克隆DNA大片段而设计的置换型载体。

?Charon32～35和Charon40载体与以前构建的

Charon4A和Charon21A载体相比较，可接受的

DNA片段更大，可利用的限制酶切位点更多。?Charon40：

?外源DNA长9～24kb；

?填充片段两侧各有一个方向相反的多克隆位点；

?由许多头尾相接的小DNA片段构成的多填充片段、很容易除

去，这是其得天独厚的优点。因为用单一限制酶(NaeI)可将该

片段酶消化成碎片，用聚乙二醇分级沉淀法轻而易举地除尽。

Charon4A

?构建真核生物基因组文库的置换型载体。?填充片段7kb。载体选择的因素：

?限制性内切酶的使用；

?插入外源DNA片段的大小；

?载体是否将被用于在E coli中表达所克隆的基因；

?是否将以质粒或噬菌粒的形式从噬菌体中回收外源DNA；

?携带的外源DNA是否将被装配成一个所克隆DNA的大的重叠的叠连群（overlaping

contig）。

（四）、文库的构建

1、cDNA 文库的构建

?Preparation of a

bacteriophage l cDNA library.

2、基因文库的构建

Construction of a genomic library of human DNA in a bacteriophage l vector .

?Cloning in phage λ. A

nonessential central region of the phage chromosome is

discarded and the ends

ligated to random 15-kb fragments of donor DNA. A linear multimer (concatenate) forms, which is then stuffed into phage heads one monomer at a time by

using an in vitro packaging system.

In vitro lambda phage packaging

噬菌斑评价The plaque formation assay

二、柯斯质粒载体（cosmid）

背景

?对于λ噬菌体基因组而言，只要含有cos 位点，即可与外壳蛋白包装成λ噬菌体颗粒；这样我们可以除去λ噬菌体中的左右臂和中段，仅留下两端包装所必需的cos序列，使其与适当长度的外源DNA序列重组，经包装、感染后，即可进行基因克隆。Cosmid：

?定义：即粘粒载体。是

即粘粒载体。是一种人工构建的含有λ噬菌体的cos序列和质粒复制子的特殊类型的质粒载体。

?柯斯质粒能被包装到λ噬菌体颗粒中，通过感染大肠杆菌而获得扩增；它携带入宿主细菌的DNA片段（超过45kb）要比质粒载体携带的要大。

1、cos质粒构建

?将左右臂和中段都去除，仅留下λDNA两端包装噬菌体所必需的cos 序列，再加上质粒的复制序列、标记基因、多克隆位点等，就可构成cos质粒或称为粘粒的载体。?粘粒可插入30～45 kb长的外源DNA，然后用λ噬菌体外壳蛋白包装成噬菌体，感染大肠杆菌后，粘粒的DNA能以质粒的形式在细菌中繁殖而被克隆。

?λ噬菌体最多只能携带23kb的外源DNA，所以粘粒主要用于DNA文库的构建，以获得基因组大片段的DNA克隆。

cosmid构建?cosmid=cos site-carrying plas mid 由λ噬菌体的cos粘性末端+质粒人工构建而成。

?Cosmid：包括质粒的一个复制起点、抗药性标记、一个或多个限制酶单一位点、λ噬菌体的cos粘性末端。

Cosmid基因的克隆Cosmid的改良和选择：

?1)将两个cos位点组合到同一个粘粒载体中，两个位点的存在

将大大简化在载体中的定向克隆。

?2)构建与常用质粒载体无同源性的粘粒载体。当同一个具备

重组能力的细胞中同时带有两类载体时，它们相互之间就不

可能发生重组。

?3)粘粒载体带有噬菌体编码的依赖于DNA的RNA聚合酶的启

动子，可在体外合成插入片段任意一端的特异性RNA探针。

?4)载体中加入选择性标记，以简化鉴定经重组粘粒转染的真

核细胞的步骤。

?5)载体中加入真核基因复制起点以使转染的粘粒能够在哺乳

动物细胞中自主复制。

?6) 载体中加些原核标记。以促进转染到哺乳动物细胞内的粘

粒序列在细菌中获救。

?7)用噬菌体复制起点代替质粒复制起点。噬茵体复制起点可

缓解由携带ColEI起点的重组粘粒所造成的生长速度不同的

问题。

2、柯斯质粒载体的优点：

①具有λ噬菌体的特点：

?a.具有噬菌体的高效感染力。

?在克隆了外源片段后可在体外被包装成噬菌体颗粒，高效地感

染对λ噬菌体敏感的大肠杆菌细胞。

?b. 在进入宿主细胞后无法进入溶菌周期，不形成子代噬菌体仅以质粒形式存在。

?c.重组DNA注入宿主细胞后，两个cos位点连接形成环状DNA 分子，即能重新环化。

?进入寄主的柯斯质粒DNA分子，按照λ噬菌体DNA的方式环

化，但无法按λ噬菌体的方式生活，更无法形成子代噬菌体

颗粒。②具有质粒特点

?a.如同质粒一样进行复制

? b.携带有抗生素抗性基因

有抗生素抗性基因和克隆位点，并具氯霉素扩增效应。

③与同源序列的质粒进行同源重组

④具有高容量的克隆能力：

?具有克隆大片段外源DNA（约30～45kb ）的能力，这是其最大的优点。

?克隆能力取决于能包装到λ噬菌体头部的

DNA大小和载体本身的大小。

?噬菌体最多能容纳52kb的DNA，最小能包装

的DNA为38kb，载体本身一般只有5－7kb，

所以其克隆高限45kb，克隆低限30kb，远

远超过质粒载体及λ噬菌体载体的克隆能

力。

?柯斯质粒：用于克隆大片段的DNA分子，对于研究高等生物的基因组十分重要。举例：pWE15

?可以在Ecoli和哺乳类动物细胞内增殖。?携带有能在哺乳动物中表达的Tn5新霉素抗性基因（neo r）

?SV40复制起点

?含有可增强克隆化基因表达的序列?MCS含有T3和T7启动子，可以有选择性地转录出某一条链的RNA。同时含有切点罕见的NotI 位点

?外源基因的克隆位点BamH1

SuperCos1

Applications

?Cloning capacity of 30-42 kb ?For generating cosmid libraries ?Ideal for high-resolution restriction mapping and rapid chromosomal

walking

克隆程序：?General procedure

for cloning DNA fragments

in cosmid vectors.

用柯斯质粒克隆大片段DNA 原理示意图

三、单链噬菌体载体

1、E coli丝状噬菌体的分子生物学

包括M13, fd和f1，亲缘关系很接近。

?其基因组的组织形式相同。ssDNA

?病毒颗粒的大小与形状相近。丝状

?基因组DNA同源程度高。核苷酸序列同源性达到98％以上。M13、f1和fd噬菌体中的互补现象十分活跃，相互之间容易发生重组。

M13噬菌体颗粒?M13 particle:

基因组特征：

?含有一个6407 nt的单链环状DNA(ss

DNA )，

?90％的基因组编码蛋白，共编码10个基因。?多数均仅以数个核苷酸相隔。仅有的两个较长的基因间隔区（intergenic region，IG）位于基因Ⅷ与Ⅲ和Ⅱ与Ⅳ基因之间。

?这些基因间隔区内含有调节基因表达和病毒DNA合成的元件。复制起点和装配起始信号均位于基因间隔区。

M13 genome ?Genome Replication:

?Infecting (+)strand DNA is converted in

d/s 'RF' form by host cell enzymes, which together with g2p build up a pool of RF DNA in the cell.Virus proteins are synthesized from this pool of DNA.?Later in the infection, the concentration of g5p in the cell builds up. This protein binds to newly formed (+)strands, causing a switch from RF to (+)strand replication (coated with g5p).

DNA复制和侵染

?丝状噬菌体经F鞭毛（pilus）感染E coli，但不裂解宿主细胞，而且还可以从宿主中释放（分泌）出来。

?DNA的复制过程须经过dsDNA

（RFDNA，复制型）阶段，然后以dsDNA 为模板合成ssDNA 。可为序列测定合成

ssDNA。

?M13研究最透彻，已经改造成为克隆和序列分析载体。M13基因组的特征：

?M13是大肠杆菌丝状噬菌体。

?基因组为环状ssDNA，大小为6407bp，编码11个蛋白。

?在M13基因组中，除2个基因间隔区(Ⅱ和Ⅳ、Ⅷ和Ⅲ)外，其他均为复制和组装所必需的基因。?Ⅱ和Ⅳ的IG区是508bp非编码区。含有包装及DNA在病毒颗粒中的定向进行调控的顺式作用信号、正链与负链DNA合成的起始位点与终止位点，以及不依赖于ρ因子的转录终止信号。

?外源DNA插入IG区不影响M13活动。所以对野生型M13的改造主要在IG区中进行。?野生型M13不适于作为克隆载体，人们对野生型M13进行改造，构建了一系列M13克隆载体。如将MCS克隆在此部位，可作为克隆载体；同时，可将IG克隆到质粒上，形成噬菌粒，合成单链DNA。3、M13基因产物的功能

分3类：

?复制蛋白

ⅡⅤⅩ

?形态蛋白

ⅠⅣⅪ

?结构蛋白

ⅢⅥⅦⅧⅨ

复制蛋白

?Ⅱ：在RFDNA(+)的IG特定位点切割，开始滚环复制+DNA，还可切割单链产生单个分子，用于包装。

?Ⅴ：+链DNA结合蛋白，在细菌膜包装位点与DNA分子脱离。

?Ⅹ：不清楚。形态蛋白

?Ⅰ：穿过细菌内膜，与装配起始有关。?Ⅳ：感染细菌时大量合成。

?Ⅺ：与穿膜和噬菌体装配位点的形成有关。

结构蛋白

?Ⅲ：少数衣壳蛋白。3～4拷贝附着在噬菌体颗粒的基顶。感染时先进入，颗粒分泌时最后离开。?Ⅵ：少数衣壳蛋白。位于噬菌体颗粒的基顶，与Ⅲ协同作用。

?Ⅶ：衣壳蛋白。与IG内的装配信号作用。5分子位于噬菌体颗粒的尾部。

?Ⅷ：主要的衣壳蛋白，2700个/颗粒。结合在细菌质膜的内膜上，以回环结构转位贯穿膜，具有穿膜潜能。

?Ⅸ：少数衣壳蛋白。5分子位于噬菌体颗粒的尾部，装配从那里开始，与Ⅶ相同，是与IG内的装配信号作用的膜蛋白。4、生活史：

?通过性毛感染雄性（F+或Hfr）大肠杆菌，或通过转染进入雌性大肠杆菌细胞；?进入细胞后，转变成复制型(RF) dsDNA，然后以滚环方式复制出ssDNA。?每当复制出单位长度正链，即被切出和环化，并被立即组装成子代噬菌体和以出芽方式（即宿主细胞不被裂解）被释放至胞外。

M13 life cycle

?性菌毛与Ⅲ作用，衣壳脱去，病毒DNA侵入细菌。?+DNA转变成双链环状DNA，RFDNA。Ecoli pol 合成-DNA。然后进行数轮θ复制。

?滚环复制：

–Ⅱ在RFDNA(+)链的特定位置切割，产生切口，然后

Ecoli polI以-链DNA为模板，在+链DNA的3’OH端延

伸，合成+链DNA。复制叉移动到终点时，Ⅱ切割产

生一个单位长度的噬菌体基因组DNA，然后环化，再

转化为RFDNA。作为下一轮复制+DNA和转录的模板。?当RFDNA达到100～200拷贝，SSB（Ⅴ）抑制

Ⅱ的翻译，并与新合成的+DNA 结合，阻止转化为RFDNA，也不再合成病毒DNA。

?包装：形态发生和分泌以协同方式进行。?包装

–Ⅴ与+DNA形成致密的棒状结构，结合在细胞

膜的特定位置。

–包装信号（IG内）从复合物的一端突出，并与

膜结合衣壳蛋白Ⅸ和Ⅶ作用，形成起始形态。

同时，Ⅴ逐步被移去，而衣壳蛋白逐步添加。

–初生的噬菌体颗粒穿过感染细胞膜，构建完成

病毒丝状颗粒。

丝状噬菌体单链DNA载体的优越性：?ssDNA的复制是以双链环状DNA

（RFDNA）为中间媒介的。RFDNA同质粒一样，可在体外进行纯化和操作。?无论是RFDNA 还是ssDNA，都能感染大肠杆菌。

?单链噬菌体颗粒的大小，受其DNA多寡的制约。所以不存在包装限制的问题。?可产生大量纯化的含外源DNA片段插入的ssDNA分子。

?应用单链噬菌体，可容易地测定外源

DNA片段的插入方向（测序）。5、M13改造

(1)插入β-半乳糖苷酶选择标记

?在M13噬菌体的IG区中插入β-半乳糖苷酶N 端一小段编码序列及其调控序列，该序列编码β-半乳糖苷酶的α肽。

?大肠杆菌lac Z突变株ΔMl5：缺失突变，缺失了β-

半乳糖苷酶N端的11~41氨基酸的---Ml5多肽，而它

能编码β-半乳糖苷酶的C端。

?改造的M13和大肠杆菌lac Z突变株ΔMl5组成克隆体

系，两者混合融为一体，才能产生有活性的β-半乳

糖苷酶，实现基因内互补。

(2)插入一小段多克隆位点区

?在α肽的编码区内插入一小段含限制酶单一位点的DNA片段，当外源DNA插入到这段，则会破坏α肽的互补作用，不产生β-半乳糖苷酶。这时若将M13(含外源DNA)和宿主细胞涂布在含有IPTG 和X-gal培养基的平板上，则形成无色噬菌斑。

M13mp18/19克隆和载体

?Figure 6.17. M13 Phage DNA, a Cloning and Sequencing Vector.

?M13 phage DNA is very useful in sequencing DNA fragments by the dideoxy method. A double-stranded DNA fragment is inserted into M13 RF DNA. Synthesis of new strand is primed by an oligonucleotide that is complementary to a sequence near the inserted DNA.

6、M13克隆载体

?是对野生型M13进行改造建成的，载体

长为7250 bp。

?M13载体克隆DNA的能力较小，一般只

适于克隆300~400bp的外源DNA片段。?突出优点：特别适合用于制备克隆基因

的单链DNA。

?用途：主要用于制备测序用的单链DNA

模板、特异的单链DNA探针，定位诱变

等。也可用于噬菌体展示(phage display)。M13mp18/19

? a gene for the lac repressor (lac I) protein to allow regulation of the lac promoter

?the operator-proximal region of the lac Z gene (to allow for α-complementation in a host with operator-proximal deletion of the lac Z gene). ? a lac promoter upstream of the lac Z gene ? a polylinker(multiple cloning site) region inserted several codons into the lac Z gene

mcs ?18/19单链DNA的产生

?Producing single-stranded recombinant DNA using M13 and phagemid vectors.

?(A) M13 vectors. M13 vectors are replicative(RF) forms of M13 derivatives containing a nonfunctional component of the lac Z b-

galactosidase system which can be complemented in function by the

presence of a complementary lac Z component in the E. coli JM series. The double-stranded M13 recombinant DNA enters the normal cycle of DNA

replication to generate numerous copies of the genome, prior to a switch to production of single-stranded DNA (+ strand only). Mature recombinant

phage exit from the cell without lysis.

?(B) Phagemid vectors. The pBluescript series of plasmid vectors contain two origins of replication: a normal one from Col E1 and a second from

phage f1 which, in the presence of a filamentous phage genome, w ill

specify production of single-stranded DNA. Superinfection of transformed cells with M13 phage results in two types of phage-like particles released

from the cells: the original superinfecting phage and the plasmid

recombinants within a phage protein coat. Sequencing primers spe cific for the phagemid vector are used to obtain unambiguous sequences.

Abbreviation:MCS,multiple cloning site.

Abbreviation: MCS, multiple cloning site.

7、噬菌质粒载体：简称噬菌粒(phagemid或phasmid)

1.组成：噬菌粒是由丝状噬菌体和质粒载体

DNA融合而成。包括：

?a. 质粒ColE1的ori

?b. 抗生素抗性标记

?c. M13或f1噬菌体复制起点

?d. 整合而成pUC119/118

?是将野生型M13的基因间隔区插入质粒载体pUC19/l8构建而成的。

用途：

?克隆外源基因。

?利用lac promoter进行基因表达。

?从噬菌体颗粒中分离单链DNA，以作为测定外源DNA序列、进行寡核苷酸引导的诱变，以及合成链特异性探针的模板。

?使用M13primers进行DNA测序。

pBluescript II KS

2. 噬菌粒优点：

?①载体本身分子小，约为3000bp ，便于分离和操作；

?②克隆外源DNA 的容量较M13噬菌体载体大，可克隆10kb 外源DNA 片段，而M13噬菌体载体可克隆300~400bp 外源DNA 片段；?③噬菌粒在寄主细胞内以质粒形式存在，复制产生双链DNA 。

?当用辅助噬菌体M13感染宿主细胞后，噬菌质粒的复制就转变成如同M13噬菌体一样的滚环复制，产生单链DNA 。

?

可用于制备单链或双链DNA ，克隆和表达外源基因。

f1噬菌体文库筛选

?Phage display.

?Phage display is a form of expression cloning which involves cloning

cDNA into phage vectors and expressing foreign proteins on the phage surface. The figure illustrates one popular approach whereby the DNA is cloned into gene III of the filamentous phage f1(or M13, etc.), a gene which encodes a minor phage coat protein. The

cloning site is usually designed by site-specific mutagenesis to occur at a position corresponding to the extreme N-terminal sequence of the gene III protein. Following transfection of E. coli,phage

assembly, extrusion from the cells and phage harvesting (see Figure 4.17for the general scheme of cloning using filamentous phage vectors), a phage library is produced.

?

Recombinants with inserts which do not produce a frameshift in the reading frame may often be expressed to give a fusion protein in which the N-terminal component consists of a foreign protein sequence. An antibody which specifically recognizes one of the foreign protein sequences can then be used to bind specifically to the phage which displays the sequence, leading to its purification . Such affinity purification permits identification of cDNA sequences encoding an uncharacterized protein of interest 。

六、真核生物的克隆载体

?以上主要讨论了原核生物的克隆载体。但

是关于真核生物基因调控以及真核基因产物转录及翻译后的加工等问题，原核生物载体所无法解决问题。

?为了适应真核生物基因工程的需要，现已构建了一系列真核生物载体，主要有以下几大类：

1．酵母质粒载体

?酵母质粒载体都是利用酵母的2μm质粒和其染色体组分与细菌质粒pBR322构建而成的，能分别在细菌和酵母菌中进行复制，所以又称为穿梭载体。

?主要有以下三种：

?(1)附加体质粒(episomal plasmid)

?(2)复制质粒(replicating plasmid)

?(3)整合质粒(integrating plasmid)(1)附加体质粒(episomal plasmid)?载体含有来自细菌质粒pBR322的复制起点，并携带作为大肠杆菌选择标记的氨苄青霉素抗性基因(Amp r)。此外，还有来自酵母2μm质粒的复制起点以及一个作为酵母选择标记的URA3基因(尿嘧啶核苷酸合成酶基因3)。

?质粒特点：既可在大肠杆菌中也可在酵母细胞中复制，当重组质粒导入酵母细胞中可进行自主复制，且具有较高拷贝数。

(2)复制质粒(replicating plasmid)?含有来自细菌质粒pBR322的复制起点和作为大肠杆菌选择标记的氨苄青霉素抗性基因(Amp r)和四环素抗性基因(Tet r)。还有来自酵母染色体的自主复制序列(ARS)，以及作为酵母选择标记的URA3基因和TRP1基因(色氨酸合成酶基因1)。

?能在大肠杆菌或酵母细胞中复制，重组质粒导入酵母细胞中可获得中等拷贝数的质粒。(3)整合质粒(integrating plasmid)?含有来自大肠杆菌质粒pBR322的复制起点和作为大肠杆菌选择标记的氨苄青霉素抗性基因(Amp r)和四环素抗性基因(Tet r)。以及来自酵母的URA3基因，它既可以作为酵母细胞的选择标记，也可与酵母染色体DNA进行同源重组。

?可在大肠杆菌中复制，但不能在酵母细胞中进行自主复制。一旦导入酵母细胞，可整合到酵母染色体上，成为染色体DNA的一个片段。

2．真核生物病毒载体

?来自猴肾病毒SV40（Simian Virus 40）、逆转录病毒和昆虫杆状病毒等。

?使目的基因或序列在动物细胞中表达或试验其功能、或作基因治疗等。(1)哺乳动物病毒载体

?病毒载体具有许多优点：

?动物病毒能够识别宿主细胞，某些动

物病毒载体能高效整合到宿主基因组

中，以及高拷贝和强启动子等，有利

于真核外源基因的克隆与表达。

?目前利用许多哺乳动物病毒如SV40，

腺病毒、牛痘病毒、逆转录病毒等改

造后的衍生物作为基因载体。

?动物病毒载体构建时，一般都把细菌质粒复制起始序列放置其中。使载体及其携带的外来序列能方便地在细菌中繁殖和克隆，然后再引入真核细胞。

?原因：动物细胞的培养和操作较复杂、花费也较多。(2)昆虫病毒载体

?昆虫中的杆状病毒的衍生物作为载体，具有许多优点：

?主要为高克隆容量，克隆外源DNA片

段大小可高达100kb；

?其次具有高表达效率，外源DNA的表

达量达到细胞蛋白质总量的25％左

右，甚至更多；

?此外，它具有安全性，仅感染无脊椎

动物，并不引起人和哺乳动物疾病。

(3)植物病毒载体

?一些RNA病毒和DNA病毒已被改造为植物基因工程载体。

?目前植物基因工程操作较多使用双链DNA 病毒载体，如花椰菜花叶病毒载体。七、人工染色体

1、酵母人工染色体

(yeast artificial chromosome，YAC)：

?是一类目前能克隆容纳最大的人工构建的载体。它是由默里(Murray)于1983年首次构建成功的。伯克(Burke)等于1987年用以构建成YAC克隆库。

酵母染色体的控制系统：

主要包括三部分：

?①着丝粒(centromere，CEN) ：作用是使染色体的附着粒与有丝分裂的纺锤丝相连，保证染色体在细胞分裂过程中正确分配到子代细胞；

?②端粒(telotmere，TEL)：位于染色体两个末端，它的功能是保护染色体两端，保证染色体的正常复制，防止染色体DNA复制过程中两端序列的丢失；

?⑤酵母自主复制序列(autonomously replicating sequence，ARS) ：其功能与酵母细胞DNA复制有关。

酵母人工染色体(YAC)?TEL：代表端粒；

?ARS：代表自主复制序列；

?CEN：代表着丝粒；

?URA3：代表尿嘧啶核苷酸合成酶基因3；?Not：代表限制酶位点

YAC 特点：

?YAC 克隆外源DNA 能力非常大，一个YAC

可插入长达100万碱基以上DNA 片段。因此YAC 既保证所插入外源基因结构的完整性，又大大减少基因库所要求克隆的数目。

?目前YAC 已成为构建高等真核生物基因库的重要载体，并在人类基因组的研究中起着重要作用。

pYAC2结构与功能图

YAC 的构建示意图

细菌人工染色体(BAC ，bacterial artificial chromosome)

?BAC 是一种以F 因子为基础构建的大片段

DNA 克隆载体，其克隆容量可达300Kb ，为环状分子，在E.coli 中非常稳定，易于分离纯化。

?BAC 更便于基因工程操作，在人类基因组研究中正被广泛应用。

BAC 载体

BAC

?Linearized and dephosphorylated Bacterial Artificial

Chromosome (BAC) Vectors

?pIndigoBAC-5 is the first commercially available cloning-

ready Bacterial Artificial Chromosome (BAC) vector for

preparation of primary BAC libraries (Figure 1).

?The vector is derived from pBeloBAC11 and pIndigoBAC1

and will accommodate and stably maintain DNA inserts of

>100 Kb.

?pIndigoBAC-5 has been linearized at its unique Bam H I or

Hind III site and dephosphorylated-ready for cloning your

Bam H I-or Hind III-cut genomic DNA.

?The linearized and dephosphorylated vectors are highly

purified and tested to be free of contaminating E. coli

chromosomal DNA and to ensure the completeness of

dephosphorylation. Several protocols for constructing BAC

genomic libraries have been published 1-2. The complete

sequence and restriction map of pIndigoBAC-5 is available

at https://www.wendangku.net/doc/1b4894815.html,.

植物表达载体

End PAC载体

抗体筛选质粒表达文库?Figure 4.18. Antibody screening of a cDNA expression library.

?To permit expression in a bacterial host, the vector requires su itable expression sequences flanking the cDNA insert, including a strong, usually inducible, bacterial or phage promoter (P) plus a riboso me-binding site (RBS) upstream of the multiple cloning site (MCS). In addition, downstream transcriptional terminator sites (TER) are

required to prevent readthrough from disrupting plasmid replication.

cDNA cloning using such vectors results in a library of bacterial

clones containing recombinant molecules (R1, R2, R3, R4 in figur e) able to express the insert to give a protein (prot1, prot2, etc.).

Individual bacterial colonies can be separated by plating out an d the colonies transferred to colony filters (see Figure 5.18). The bacterial cells are lysed in situ by treatment with lysozyme and washed to remove cell debris. Exposure to a suitable antibody can result i n

specific antibody binding to a colony expressing the protein of

interest, and detection of bound antibody. The identified colony

containing the cDNA of interest is grown in culture to enable

isolation of the desired cDNA clone.

基因克隆载体上的各种常用蛋白标签

基因克隆载体上的各种常用蛋白标签 蛋白标签(proteintag)是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和纯化等。随着技术的不断发展，研究人员相继开发出了具有各种不同功能的蛋白标签。目前，这些蛋白标签已在基础研究和商业化产品生产等方面得到了广泛的应用。 美国GeneCopoeia(复能基因)为客户提供50多种蛋白标签，可以满足客户的不同需求，包括各种最新型的标签，如：SNAP-Tag?、Halo Tag?、AviTag?、Sumo等;也提供齐全的各种常用标签，如eGFP、His、Flag等等标签。 以下是部分蛋白标签的特性介绍，更加详细的介绍可在查询产品的结果列表里面看到各种推荐的蛋白标签和载体。 TrxHIS His6是指六个组氨酸残基组成的融合标签，可插入在目的蛋白的C末端或N末端。当某一个标签的使用，一是能构成表位利于纯化和检测;二是构成独特的结构特征(结合配体)利于纯化。组氨酸残基侧链与固态的镍有强烈的吸引力，可用于固定化金属螯合层析(IMAC)，对重组蛋白进行分离纯化。使用His-tag有下面优点： 标签的量小，只有~0.84KD，而GST和蛋白A分别为~26KD和~30KD，一般不影响目标蛋白的功能; His标签融合蛋白可以在非离子型表面活性剂存在的条件下或变性条件下纯化，前者在纯化疏水性强的蛋白得到应用，后者在纯化包涵体蛋白时特别有用，用高浓度的变性剂溶解后通过金属螯和去除杂蛋白，使复性不受其它蛋白的干扰，或进行金属螯和亲和层析复性; His标签融合蛋白也被用于蛋白质-蛋白质、蛋白质-DNA相互作用研究; His标签免疫原性相对较低，可将纯化的蛋白直接注射动物进行免疫并制备抗体。 可应用于多种表达系统，纯化的条件温和; 可以和其它的亲和标签一起构建双亲和标签。 Flag标签蛋白 Flag标签蛋白为编码8个氨基酸的亲水性多肽(DYKDDDDK)，同时载体中构建的Kozak序列使得带有FLAG的融合蛋白在真核表达系统中表达效率更高。FLAG作为标签蛋白，其融合表达目的蛋白后具有以下优点： FLAG作为融合表达标签，其通常不会与目的蛋白相互作用并且通常不会影响目的蛋白的功能、性质，这样就有利用研究人员对融合蛋白进行下游研究。 融合FLAG的目的蛋白，可以直接通过FLAG进行亲和层析，此层析为非变性纯化，可以纯化有活性的融合蛋白，并且纯化效率高。 FLAG作为标签蛋白，其可以被抗FLAG的抗体识别，这样就方便通过Western Blot、ELISA等方法对含有FLAG的融合蛋白进行检测、鉴定。

第一章1-6噬菌体载体2

3、λ噬菌体载体的优缺点：?优点：包装的λ噬菌体感染大肠杆菌要比 质粒转化细菌的效率高。 ?缺点：λ噬菌体载体的克隆操作要比质粒载体复杂。 ?用途：λ噬菌体载体比质粒载体能插入的DNA长得多，常用于构建cDNA文库或基因组文库。 第一章 分子克隆的工具酶和载体?第八节噬菌体载体 ?一、λ噬菌体 ?（一）λ噬菌体 ?（二）λ噬菌体载体的改造 ?（三）λ噬菌体载体举例 （三）λ噬菌体载体举例?Lambda gt10 ?Lambda gt11 ?EMBL3和EMBL4Lambda gt10 概述： ?Lambda gt10是一种插入载体。 ?在噬菌体阻遏基因cI 内有单一的EcoRⅠ克隆位点。用于插入小的cDNA片段(约6kb)，构建cDNA文库或基因文库。 ?该载体克隆效率很高。 ?在构建cDNA文库时，利用Oligo(dT)或随机引物合成的cDNA经过EcoRⅠadaptors或Linkers修饰后，就可以和λgt10连接起来。?克隆到λgt10的噬菌体，可用核酸探针进行筛选。 Lambda gt10map 宿主： ?建议用C600 and C600hf1作受体菌。 筛选： ?如果有外源DNA插入，cI基因失活，该噬 菌体进入裂解生长途径，在培养皿形成噬 菌斑。反之，若无插入，cI基因表达，噬 菌体进入溶原生长途径，不形成噬菌斑。 ?核酸探针杂交。

Insertional cloning ?Insertional cloning into the cI gene of the lambda -gt10 cDNA cloning vector (DNA inserts of ~1-5 kb) can be selected in hfl (high frequency of lysogeny ) mutant strains of E. coli. In hflA strains of E. coli, expression of the lambda cII gene is elevated, resulting in transcriptional induction of the lambda cI repressor gene which promotes lysogeny . Disruption of the lambda cI coding sequence by DNA insertion into the unique EcoRI site of the lambda gt10 cDNA cloning vector, blocks the lysogenic pathway leading to cell lysis and plaque formation. Lambda gt11 ?λgt 载体系列：是插入型载体。插入了大肠 杆菌β-半乳糖苷酶基因片段，可以表达外源cDNA 而形成β-半乳糖苷酶融合蛋白。?λgt18/19 、λgt20/21和λgt 22/23 是λgt 11的衍生载体。?重组体筛选： ?未重组的噬菌体载体转入lac -宿主后，在X-gal 平板上形成淡蓝色噬斑；而外源DNA 片段插入载体后，重组噬菌体形成无色噬斑，很容易辩别。 ?常常用免疫学方法对噬班或菌落进行筛选。 Lambda gt10 map Lambda gt11 map Lambda gt11 概述： ?Lambda gt11是一个克隆和表达载体。 ?用于小的插入（7.2 kb ）片断构建cDNA 文库或基因文库。 ?在其β-半乳糖苷酶翻译终止位点上游的LacZ 基因内，有单一的EcoR Ⅰ位点。 ?如果外源DNA 的阅读框与lacZ 吻合，即可表达融合蛋白。 ?在构建cDNA 文库时，利用Oligo (dT)或随机引物合成的cDNA 经过EcoR ⅠAdaptors 或Linkers 修饰后，可以和λgt11连接起来。 宿主： ?建议用Y1089(r-) and Y1090(r-)作受体菌。筛选： ?利用特异的抗体进行筛选。 EMBL3和EMBL4 ?EMBL3/4是由λ1059衍生的λ置换型载体。?是常用的基因组克隆载体，克隆的DNA 片 段大小为9-23kb 。 ?多克隆位点分别位于一个14 kb 填充片段的两侧。 ?两载体均在填充片段内含有red 及gam 基因，可由Spi 表现型筛选重组子。 ?除多克隆位点的顺序相反外，EMBL3和EMBL4的其余特征相同。

第八讲单链噬菌体载体及噬菌粒载体

第八讲单链噬菌体载体及噬菌粒载体 吴乃虎 中国科学院遗传与发育生物学研究所

第八讲单链噬菌体载体及噬菌粒载体 一、单链噬菌体的一般生物学 1．单链噬菌体的优越性 2．M13噬菌体的生物学特性 二、M13克隆体系 1．M13克隆体系 2．M13克隆体系-半乳糖苷酶的显色反应原理 3．M13载体系列的发展 4．M13载体系列的优点 三、噬菌体展示载体 1．噬菌体展示载体的构建原理 2．噬菌体展示载体 3．噬菌体表面展示文库 4．应用噬菌体展示载体分离有关蛋白质的实例 四、噬菌粒载体

1．M13噬菌体载体克隆的若干难点2．噬菌粒 3．若干常用的噬菌粒载体4．pBluescript噬菌粒载体5．pUC118和pUC119噬菌粒载体

第八讲单链噬菌体载体 一、单链噬菌体一般生物学 大肠杆菌丝状单链DNA噬菌体有M13噬菌体、f1噬菌体及fd 噬菌体，它们均含有分子量约为6400个核苷酸的单链闭环DNA分子。 1．单链DNA phage的优越性 A．具有双链的复制型DNA(RF DNA)，可如质粒质粒一样进行遗传操作；RF DNA：Replication Form DNA。 B．RF DNA和ssDNA均可感染感受态的寄主细胞——形成phaque或colony。 C．不受包装的限制。因为单链DNA phage的大小是受其DNA 多寡制约的。 D．可容易地测出外源DNA的插入取向。 E．可产生大量的含有外源DNA的单链DNA分子，这种单链DNA分子有如下用途(作为模板)： *1用作双脱氧链终止法进行DNA测序

*2制备单链的放射性标记的杂交用DNA探针 *3利用寡核苷酸进行定点突变 2．M13 phage的生物学特性 A．M13 phage同f1 phage亲缘关系十分密切，例如： ①基因组组织形式相同； ②病毒颗粒大小、形状相近； ③DNA同源性高达98%以上。 B．在M13 phage颗粒中只有(+)链DNA，感染具F性须的大肠杆菌菌株，因此M13噬菌体是雄性E.coli特有的；M13噬菌体的(+)链DNA，又称为感染性单链DNA。 C．复制型双链DNA(RF DNA=Replication Form DNA) 感染过程：当感染的M13 phage颗粒穿过性须时，其外层主要 衣壳蛋白质脱落，M13 DNA及附着其上的Gene Ⅲ 蛋白进E.coli细胞内， ↓ 感染性单链DNA(正链DNA)在细菌胞内酶的作用 下转变为双链DNA，称复制型DNA。通过结构 进行几轮复制。

克隆载体与表达载体教程文件

克隆载体：大多是高拷贝的载体，一般是原核细菌，将需要克隆的基因与克隆载体的质粒相连接，再导入原核细菌内，质粒会在原核细菌内大量复制，形成大量的基因克隆，被克隆的基因不一定会表达，但一定被大量复制。克隆载体只是为了保存基因片段，这样细胞内不会有很多表达的蛋白质而影响别的工作。 克隆载体(Cloning vector )：携带插入外源片段的质粒或噬菌体，从而产生更多物质或蛋白质产物。(这是为“携带”感兴趣的外源DNA、实现外源DNA的无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA 分子。) 其中，为使插入的外源DNA序列可转录、进而翻译成多肽链而设计的克隆载体又称表达载体。 是否含有表达系统元件，即启动子--核糖体结合位点--克隆位点--转录终止信号，这是用来区别克隆载体和表达载体的标志。 表达载体：有的是高拷贝的，有的是低拷贝的，各有各的用处，是一些用于工程生产的细菌，被导入的目标基因会在此类细菌中得到表达，生产出我们需要的产物，导入的基因是由克隆载体产出的。表达载体具有较高的蛋白质表达效率，一般因为具有强的启动子。 表达载体（Expression vectors）就是在克隆载体基本骨架的基础上增加表达元件（如启动子、RBS、终止子等），是目的基因能够表达的载体。如表达载体pKK223-3是一个具有典型表达结构的大肠杆菌表达载体。其基本骨架为来自pBR322和pUC的质粒复制起点和氨苄青霉素抗性基因。在表达元件中，有一个杂合tac强启动子和终止子，在启动子下游有RBS位点（如果利用这个位点，要求与ATG之间间隔5-13bp），其后的多克隆位点可装载要表达的目标基因。 （RBS位点：1974年Shine和Dalgarno首先发现，原核生物，在mRNA上有核糖体的结合位点，它们是起始密码子AUG和一段位于AUG上游3～10 bp处的由3—9bp组成的序列。这段序列富含嘌呤核苷酸，刚好与16S rRNA 3，末端的富含嘧啶的序列互补，是核糖体RNA的识别与结合位点。根据发现者的名字，命名为Shine-Dalgarno序列，简称S-D序列。 由于它正好与30S小亚基中的16s rRNA3’端一部分序列互补，因此S-D序列也叫做核糖体结合序列。 真核生物存在于真核生物mRNA的一段序列，其在翻译的起始中有重要作用。加Kozark sequence(GCCACC), Kozak sequence是用来增强真核基因的翻译效率的。是最优化的ATG环境，避免ribosome出现leaky scan） 克隆载体目的在于复制足够多的目标质粒，所以常带有较强的自我复制元件，如复制起始位点等，往往在菌体内存在多拷贝，所以抽质粒会抽出一大堆。但不具备表达元件。而表达质粒有复杂的构成，为的是控制目标蛋白的表达，如各种启动子（T7），调节子（LacZ）等，而且以pET为代表的表达载体在菌体内都是低拷贝的，防止渗漏表达。 克隆载体只是把你要的基因片段拿到就可以了，不管读码框什么的，但是表达载体是不但要你的目的基因连在上面，而且要表达蛋白，所以就要求你的读码框不能乱了，否则就不能得到你想到的表达产物。 1.载体即要把一个有用的基因（目的基因——研究或应用基因）通过基因工程手段送到生物细胞（受体细胞），需要运载工具（交通工具）携带外源基因进入受体细胞，这种运载工具就叫做载体（vector）。 2. 载体的分类 按功能分成：（1）克隆载体: 都有一个松弛的复制子，能带动外源基因，在宿主细胞中复制扩增。它是用来克隆和扩增DNA片段（基因）的载体。（2）表达载体:具有克隆载体的基本元件（ori,Ampr,Mcs等）还具有转录/翻译所必需的DNA顺序的载体。 按进入受体细胞类型分：（1）原核载体（2）真核载体（3）穿梭载体（sbuttle vector）指在两种宿主生物体内复制的载体分子，因而可以运载目的基因（穿梭往返两种生物之间）. 克隆载体顾名思义就是质粒拷贝数比较高,在做上游克隆时比较方便, 其重点在于质粒的复制.

噬菌体载体7页word

第三章噬菌体载体 一、填空题 1．噬菌体之所以被选为基因工程载体，主要有两方面的原因：一是—-----------—；二是----------——。 2．第一个报道的全测序的单链DNA噬菌体是ФX174，DNA长5386个碱基对，共一个基因，为一环状DNA分子，基因组的最大特点是—----------—。 3．λ噬菌体的基因组DNA为———————kb，有——多个基因。在体内，它有两种复制方式，扩增时(早期复制)按—-----—复制，成熟包装(晚期复制)则是按—--------—复制。它有一个复制起点，进行—-------—向复制。λ噬菌体的DNA既可以以线性存在又可以环状形式存在，并且能够自然成环。其原因主要是在λ噬菌体线性DNA分子的两端各有一个——个碱基组成的天然黏性末端。这种黏性末端可以自然成环。成环后的黏性末端部位就叫做——————位点。 4．根据噬菌体的包装能力，将野生型λ噬菌体的基因组DNA改造成插入型载体，该载体的最小分子大小约为————kb，插入的外源片段最大不超过——————kb。 5．野生型的M13不适合用作基因工程载体，主要原因是————和--------------—。 6．黏粒(cosmid)是质粒—噬菌体杂合载体，它的复制子来自——、C OS位点序列来自—--------—，最大的克隆片段达到—----------—kb。

7．有两类改造型的λ噬菌体载体，即插入型和取代型。从酶切点看，插入型为——个，取代型为——个。 8．野生型的λ噬菌体DNA不宜作为基因工程载体，原因是：(1)---------------——(2)——————————(3)—---------------------—。 9． M13单链噬菌体的复制分为三个阶段：(1)————————(2)—-------------—， (3)———————————。 10．噬菌粒是由质粒和噬菌体DNA共同构成的，其中来自质粒的主要结构是—-----—，而来自噬菌体的主要结构是—-------------------—。 11．M13单链噬菌体基因2和基因4之间的IG区有三个最重要的功能，即(1)—————(2)—------------—(3)—-------------—。 12．野生型的M13有10个基因，分为三个功能集团，其中与复制有关的两个基因是： ——------------------和——-----------------。 13．以丸噬菌体载体和黏粒载体构建文库时，起始DNA的长度是不同的，前者为—----— kb，后者为————kb。 14．λ噬菌体载体由于受到包装的限制，插入外源DNA片段后，总的长度应在噬菌体基因组的—---------------—的范围内。 二、判断题

参考文献类型及其标识

3 参考文献类型及其标识 (1) 根据GB3469规定，以单字母方式标识以下各种参考文献类型： 对于其他未说明的文献类型，建议采用单字母“Z”。 (3) 对于数据库(database)、计算机程序(computer program)及电子公告(electronic bulletin board)等电子文献类型的参考文献，建议以下列双字母 对于非纸张型载体的电子文献，当被引用为参考文献时需在参考文献类型标识中同时标明其载体类型。本规范建议采用双字母表示电子文献载体类型：磁带(magnetic tape)——MT，磁盘(disk)——DK，光盘(CD-ROM)——CD，联机网络(online)——OL，并以下列格式表示包括了文献载体类型的参考文献类型标识： [文献类型标识/载体类型标识] 如：[DB/OL]——联机网上数据库(database online) [DB/MT]——磁带数据库(database on magnetic tape) [M/CD]——光盘图书(monograph on CD-ROM) [CP/DK]——磁盘软件(computer program on disk) [J/OL]——网上期刊(serial online) [EB/OL]——网上电子公告(electronic bulletin board online) 以纸张为载体的传统文献在引作参考文献时不必注明其载体类型。 4 文后参考文献表编排格式 参考文献按在正文中出现的先后次序列表于文后；表上以“参考文献：”(左顶格)或“[参考文献]”(居中)作为标识；参考文献的序号左顶格，并用数字加方括号表示，如[1]、[2]、…，以与正文中的指示序号格式一致。参照ISO690及ISO690-2，每一参考文献条目的最后均以“.”结束。各类参考文献条目的编排格式及示例如下： a.专著、论文集、学位论文、报告 [序号]主要责任者.文献题名[文献类型标识].出版地：出版者，出版年.起止页码(任选). [1] 刘国钧，陈绍业，王凤翥.图书馆目录[M].北京：高等教育出版社，1957.15-18. [2] 辛希孟.信息技术与信息服务国际研讨会论文集：A集[C].北京：中国社会科学出版社，1994. [3] 张筑生.微分半动力系统的不变集[D].北京：北京大学数学系数学研究所，1983. [4] 冯西桥.核反应堆压力管道与压力容器的LBB分析[R].北京：清华大学核能技术设计研究院，1997. b.期刊文章 [序号]主要责任者.文献题名[J].刊名，年，卷(期)：起止页码.

《文献类型与文献载体代码》

根据GB3469-83《文献类型与文献载体代码》规定，以单字母标识： M——专著（含古籍中的史、志论著） C——论文集 N——报纸文章 J——期刊文章 D——学位论文 R——研究报告 S——标准 P——专利 A——专著、论文集中的析出文献 Z——其他未说明的文献类型 电子文献类型以双字母作为标识： DB——数据库 CP——计算机程序 EB——电子公告 非纸张型载体电子文献，在参考文献标识中同时标明其载体类型： DB/OL——联机网上的数据库 DB/MT——磁带数据库 M/CD——光盘图书 CP/DK——磁盘软件 J/OL——网上期刊 EB/OL——网上电子公告 一、参考文献著录格式 1 、期刊作者．题名〔J〕．刊名，出版年，卷(期)∶起止页码 2、专著作者．书名〔M〕．版本(第一版不著录)．出版地∶出版者，出版年∶起止页码 3、论文集作者．题名〔C〕．编者．论文集名，出版地∶出版者，出版年∶起止页码 4 、学位论文作者．题名〔D〕．保存地点．保存单位．年份 5 、专利文献题名〔P〕．国别．专利文献种类．专利号．出版日期 6、标准编号．标准名称〔S〕 7、报纸作者．题名〔N〕．报纸名．出版日期(版次) 8 、报告作者．题名〔R〕．保存地点．年份 9 、电子文献作者．题名〔电子文献及载体类型标识〕．文献出处，日期 二、文献类型及其标识 1、根据GB3469 规定，各类常用文献标识如下： ①期刊〔J〕 ②专著〔M〕 ③论文集〔C〕 ④学位论文〔D〕 ⑤专利〔P〕 ⑥标准〔S〕 ⑦报纸〔N〕 ⑧技术报告〔R〕 2、电子文献载体类型用双字母标识，具体如下： ①磁带〔MT〕

②磁盘〔DK〕 ③光盘〔CD〕 ④联机网络〔OL〕 3、电子文献载体类型的参考文献类型标识方法为：〔文献类型标识/载体类型标识〕。例如： ①联机网上数据库〔DB/OL〕 ②磁带数据库〔DB/MT〕 ③光盘图书〔M/CD〕 ④磁盘软件〔CP/DK〕 ⑤网上期刊〔J/OL〕 ⑥网上电子公告〔EB/OL〕 三、举例 1、期刊论文 〔1〕周庆荣，张泽廷，朱美文，等．固体溶质在含夹带剂超临界流体中的溶解度〔J〕．化工学报，1995(3)：317—323 〔2〕Dobbs J M, Wong J M. Modification of supercritical fluid phasebehavior using polor coselvent〔J〕. Ind Eng Chem Res, 1987,26:56 〔3〕刘仲能，金文清.合成医药中间体4-甲基咪唑的研究〔J〕.精细化工，2002(2)：103-105 〔4〕Mesquita A C, Mori M N, Vieira J M, et al ．Vinyl acetate polymerization by ionizing radiation 〔J〕．Radiation Physics and Chemistry,2002, 63:465 2、专著 〔1〕蒋挺大．亮聚糖〔M〕．北京：化学工业出版社，2001．127 〔2〕Kortun G．Reflectance Spectroscopy〔M〕．New York: Spring-Verlag,1969 3、论文集 〔1〕郭宏，王熊，刘宗林．膜分离技术在大豆分离蛋白生产中综合利用的研究〔C〕．//余立新．第三届全国膜和膜过程学术报告会议论文集．北京：高教出版社，1999．421-425 〔2〕Eiben A E, vander Hauw J K．Solving 3-SAT with adaptive genetic algorithms 〔C〕．//Proc 4th IEEE Conf Evolutionary Computation．Piscataway: IEEE Press, 1997．81-86 4、学位论文 〔1〕陈金梅．氟石膏生产早强快硬水泥的试验研究（D）．西安：西安建筑科学大学，2000 〔 2 〕Chrisstoffels L A J ．Carrier-facilitated transport as a mechanistic tool in supramolecular chemistry〔D〕．The Netherland：Twente University．1988 5、专利文献 〔1〕Hasegawa, Toshiyuki, Yoshida,et al．Paper Coating composition〔P〕．EP 0634524．1995-01-18 〔 2 〕仲前昌夫，佐藤寿昭．感光性树脂〔P 〕．日本，特开平09-26667．1997-01-28 〔3〕Yamaguchi K, Hayashi A．Plant growth promotor and productionthereof 〔P〕．Jpn, Jp1290606．1999-11-22 〔4〕厦门大学．二烷氨基乙醇羧酸酯的制备方法〔P〕．中国发明专利，CN1073429．1993-06-23 6、技术标准文献 〔1〕ISO 1210-1982，塑料——小试样接触火焰法测定塑料燃烧性〔S〕 〔2〕GB 2410-80，透明塑料透光率及雾度实验方法〔S〕 7、报纸 〔1〕陈志平．减灾设计研究新动态〔N〕．科技日报，1997-12-12(5) 8、报告 〔1〕中国机械工程学会．密相气力输送技术〔R〕．北京：1996

λ噬菌体载体

λ噬菌体载体 λ噬菌体，一种大肠杆菌双链RNA噬菌体。 是一种中等大小的温和噬菌体。迄今已经定位的λ噬菌体的基因至少有61个，其中有一半左右参与了噬菌体生命周期的活动，我们称这类基因为λ噬菌体的必要基因；另一部分基因，当它们被外源基因取代之后，并不影响噬菌体的生命功能，我们称这类基因为λ噬菌体的非必要的基因。 一．λ噬菌体的分子生物学概述 （1）λ噬菌体基因组的结构 在λ噬菌体线性双链 DNA分子的两端，各有一条由12个核劳酸组成的彼此完全互补的5′单链突出序列，即通常所说的粘性末端。注入到感染寄主细胞内的λ噬菌体的线性DNA分子，会迅速地通过粘性末端之间的互补作用，形成环形双链DNA分子。随后在DNA连接酶的作用下，将相邻的5′-P和3′-OH基团封闭起来，并进一步超盘旋化。这种由粘性末端结合形成的双链区段称为cos 位点（略语cos，系英语cohesive-end site的缩写，即粘性末端位点之意）（如图）。 在环化的状态下，λ噬菌体DNA分子的长度为48 502碱基对。

（2）λ噬菌体DNA的复制 在λ噬菌体感染的早期，环形的λ DNA分子按θ形式从双向进行复制。到了感染的晚期，控制滚环复制机理的开关被启动了，合成出了由一系列线性排列的人基因组oxA组成的长多连体分子。 （3）λ噬菌体DNA的整合与删除 λ噬菌体基因组的整合作用，是通过它的附着位点att，同大肠杆菌染色体DNA的局部同源位点之间的重组反应实现的。整合作用需要int基因的表达，它是一种可逆的过程。的复制子，这种过程叫做原噬菌体的删除作用。λ噬菌体的删除，需要噬菌体xis基因和bio基因的协同作用才能实现。 （4）λ噬菌体DNA的转录与转译 在溶菌周期，λ噬菌体DN A的转录是在三个时期，即早期、中期和晚期发生的。大体的情况是，早期基因转录确立起溶菌周期；中期基因转录的结果导致DNA进行复制和重组；晚期基因的转录最终使DNA被包装为成熟的噬菌体颗粒。 二．λ噬菌体载体的构建及其主要类型 （1）构建λ噬菌体载体的基本原理 构建λ噬菌体载体的基本原理是多余限制位点的删除。 按照这一基本原理构建的λ噬菌体的派生载体，可以归纳成两种不同的类型： 一种是插入型载体（insertion vectors），只具有一个可供外源DNA插入的克隆位点(如图)。 另一种是替换型载体（rePlacement vectors），具有成对的克隆位点，在这两个位点之间的人 DNA区段可以被外源插入的 DNA片段所取代。

文献的载体形式

第二講文獻的載體與形式 甲骨 甲骨指龜甲和獸骨，乃商代占卜是用的工具，上有刻辭，以作貞卜的紀錄。 甲骨文的發現和拓印乃二十世紀初年的事，之後著名學者如羅振玉、王國維等識讀了不少文字，大大推進了古文字、歷史等方面的研究。 甲骨與王國維。 金文 金文主要指銘刻在青銅器上的文字，屬商周時期的器物。 殷周金文與甲骨文有同有異，內容多是當時戰爭、盟約、條例、賞賜等政治活動的紀錄。 西周時的金文已有較長篇的記事文，如毛公鼎就是著名的例子。 簡牘 竹簡和木牘是較早的書寫材料，對後世的書籍形式有深遠的影響。 簡牘可以數量較有彈性，可以記錄不同類型的資料，包括律令、史事、思想等。 上世紀陸續有許多簡牘出土，加深了我們對古代的歷史和文化的認識。 中研院《漢代簡牘數位典藏》。 帛書 帛書指書寫在絲綢繒帛上的文字帛書，最遲在公元前六、七世紀已出現。 帛書較竹牘簡便，易於攜帶，後世紙張出現後，縑帛仍是重要的書寫工作。 竹牘與簡帛在上個世紀有許多重大發現，吸引許多學者參與，堪稱顯學。 簡帛研究網

紙卷 紙是四大發明之一，相傳為東漢蔡倫所造，但其實西漢時已有類似的纖維紙。 紙是優良的文字傳播工具，結果很快普及，並且傳至國外，包括朝鮮、越南以至印度。 現存出土文物證實，西漢時已有古紙。 關於紙的考古發現，當以敦煌紙卷最為重要。這批文獻約三萬餘卷，內容廣泛。 文獻的數碼化 中央研究院「瀚典」 https://www.wendangku.net/doc/1b4894815.html,.tw/index.html? 臺灣故宮「寒泉」 http://210.69.170.100/s25/index.htm 香港中文大學「漢達文庫」 https://www.wendangku.net/doc/1b4894815.html,/ 四庫全書電子版 https://www.wendangku.net/doc/1b4894815.html,.hk/resources/e-resources/skqs.html 流通的方式 背誦 阮元《文言說》 古人無筆硯紙墨之便，往往鑄金刻石，始傳久遠；其著之簡策者，亦有漆書刀削之勞，非如今人下筆千言，言事甚易也。許氏說文“直言曰言，論難曰語”。左傳曰“言之無文，行之不遠”。此何也？古人以簡策傳事者少，以口舌傳事者多，以目治事者少，以口耳治事者多。故同為一言，轉相告語，必有愆誤，是必寡其詞，協其

第四节 单链丝状噬菌体载体

第四节单链丝状噬菌体载体 一、M13 噬菌体的生物学 1．M13 噬菌体的组成和结构 M13 噬菌体颗粒是丝状的，只感染雄性大肠杆菌。感染宿主后不裂解宿主细胞，而是从感染的细胞中分泌出噬菌体颗粒，宿主细胞仍能继续生长和分裂。 M13 噬菌体的基因组为单链 DNA ，由 6407 的碱基组成（GenBank 注册号为 V00604）。基因组 90% 以上的序列可编码蛋白质，共有 11 个编码基因，基因之间的间隔区多为几个碱基。较大的间隔位于基因Ⅷ 和基因Ⅲ 以及基因Ⅱ 和基因Ⅳ 之间，其间有调节基因表达和 DNA 合成的元件。 M13 噬菌体基因组可编码 3 类蛋白质，包括复制蛋白（基因Ⅱ，Ⅴ 和Ⅹ），形态发生蛋白（基因Ⅰ，Ⅳ 和Ⅺ），结构蛋白（基因Ⅲ 、Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ 和Ⅸ）。所有结构蛋白在形态发生之前都插入在宿主细胞的质膜中。基因组 DNA 为正链，按基因Ⅱ 至基因Ⅳ 方向合成，与噬菌体的 mRNA 序列同义。图 3-20 是 M13 噬菌体的遗传图谱。 M13 噬菌体颗粒为丝状长管状结构，长 880nm ，直径 6-7nm 。噬菌体颗粒的核心由 2700 个基因Ⅷ 编码的结构蛋白呈管状排列而成（图 5-32），成熟的基因Ⅷ 的产物为由 50 个氨基酸残基组成的α螺旋蛋白。顶端由 5 个基因Ⅶ 和 5 个基因Ⅸ 产物组成，作用于间隔区中的包装信号。 5 个基因Ⅲ 蛋白和5 个基因Ⅵ 蛋白位于丝杆的末端，参与对性纤毛的吸咐。图 3-21 是 M13 噬菌体结构模型。 2．M13 噬菌体的增殖 吸附是噬菌体感染的第一步， M13 噬菌体只感染具有性纤毛的菌株，携带 F 质粒的菌株可产生性纤毛。在吸附过程中，噬菌体的基因Ⅲ 蛋白与性纤毛发生作用。随后丝状噬菌体穿入到性纤毛，基因Ⅲ 蛋白与宿主的 TolQ 、TolR 和 TolA 蛋白发生作用，去除外壳蛋白，致使病毒 DNA 及附着于其上的基因Ⅲ 蛋白进入宿主菌体内。

文献类型及载体类型标志

文献类型及载体类型标志 对于其他未说明的文献类型，采用单字母“Z”。 对于数据库、计算机程序及电子公告等电子文献类型的参考文献， 1.电子文献的载体类型及其标志 对于非纸张型载体的电子文献，当被引用为参考文献时需在参考文献类型标志中同时标明其载体类型。一般用双字母表示电子文献载体类型：磁带——MT，磁盘——DK，光盘——CD，联机网络——OL，并以[文献类型标志/载体类型标志]表示包括了文献载体类型的参考文献类型标志。 如：[M/CD]——光盘图书(monograph on CD-ROM)； [DB/MT]——磁带数据库(database on magnetic tape)； [CP/DK]——磁盘软件(computer program on disk)； [J/OL]——网上期刊(serial online)； [DB/OL]——网上数据库(database online)； [EB/OL]——网上电子公告(electronic bulletin board online)。 2.中文文献 a. 普通图书(包括教材等)、会议论文集、资料汇编、学位论文、报告(包括科研报告、技术报告、调查报告、考察报告等)、参考工具书(包括手册、百科全书、字典、图集等) [1]邹申，杨任明.简明英语测试教程[M].北京:高等教育出版社,2002. [2][美]登哈特J V,登哈特R B.新公共服务:服务,而不是掌舵[M].丁煌，译.北京:中国人民大学出版社,2004：7. [3]朱一玄.聊斋志异资料汇编[G].郑州:中州古籍出版社,1985:177-178.

[4]张筑生.微分半动力系统的不变集[D].北京:北京大学数学系数学研究所,19 83:26. [5]冯西桥.核反应堆压力管道与压力容器的LBB分析[R].北京:清华大学核能技术设计研究院,1997:89. [6]张永录.唐代长安词典[K].西安:陕西人民出版社,1980:55. 3. 期刊文章 文献题名[J] [2]金显贺,王昌长,王忠东,等.一种用于在线检测局部放电的数字滤波技术[J].清华大学学报:自然科学版,1993,33(4):62－67. 4.报纸文章 文献题名[N]. 报纸名，出版日期(版次). [1]谢希德.创造学习的新思路[N].人民日报,1998-12-25(10). 5.标准(包括国际标准、国家标准、规范、法规等) 标准名称[S]. 出版地(任选):出版者(任选),出版年(任选). [1] GB/T 7714-2005,文后参考文献著录规则[S]. [2]JT/T 623-2005,集装箱吊具[S].北京:人民交通出版社出版,2005. 6. 析出文献 [文献类型标志] // [1]钟文发.非线性规划在可燃毒物配置中的应用[C]//赵玮.运筹学的理论与应用—中国运筹学会第五届大会论文集.西安：西安电子科技大学出版社,1996:468－471. [2]王家益.1995年湖南省交通肇事逃逸案件[G]//公安部交管局.49～99五十年交通事故统计资料汇编.北京:群众出版社,2000. [3]林穗芳.美国出版业概况[M]//陆本瑞.世界出版概观.北京中国书籍出版社，1991:1-23. [4]钟文发.非线性规划在可燃毒物配置中的应用[C]//赵玮.运筹学的理论与应用中国运筹学会第五届大会论文集.西安:西安电子科技大学出版社，1996 ：4 68-471. 7.电子文献 [文献类型标志/载体类型标志].(更新日期)[引用日期]. 电子文献网址. [1]萧钰.出版业信息化迈入快车道[EB/OL].(2001-12-19)[2002-04-15]. https://www.wendangku.net/doc/1b4894815.html,/news/20011219/200112190019.html. 注：如为网上图书、杂志等，如有印刷载体，则最好按印刷版本格式著录。如只是在网上发行，则需要在文献题名后著录相应项目，如期刊年限期数等。

文献学文献的载体

第二讲文献的载体、形成、流布、收藏与散佚 一、文献的载体 （一）甲骨xx竹木帛羊皮纸xx纸 （二）纸质文献与装潢形制（书册制度） 卷子经折装蝴蝶装包背装线装 册页制度 是指书籍的一种装帧形式。它出现于唐朝末年，因为雕版印刷使书纸变成一页的单页，然后再将每一页装订成册，人们把书籍的这种形式称为册页制度。 卷子（流行于六朝到唐五代时期） 经折装（约出现于唐后期，多用于佛经装潢） 蝴蝶装（约始于唐末，盛行于宋代，沿用至明清） 其装订方法是将每页从中缝把有文字的两个半页对折，背面空白处在外，然后把这样对折的一叠散页用一张纸从前包到后面，并将各页折口处牢牢地粘连在这张纸上，以免脱落，这样就形成了蝴蝶装的书。其所以得名，是因为书册打开后左右对称，犹如蝴蝶展开双翅，因而称为蝴蝶装”，或蝶装”。蝴蝶装 用以包裹书册前后、形成封面和封底的纸，叫做书衣”令称书皮”。）书衣往往 内用软纸，外加一层硬纸，有时还用绫锦为表，很像现在的精装书。 书衣封面左边有时贴上张狭长的签条，叫书签”，上写书名、册次，有时加上卷次。书册的上端称书头”或书首”，下端叫书根”，右边粘连的一边叫书背”或书脊”，左边翻阅的一边叫书口”。由于蝴蝶装的书衣都很坚硬结实，所以书上架的方法与今天的书籍相似，是立放在书架上。只不过今天的书籍插立时是书背向外，书头在上，书根向下压在板上，而蝴蝶装的书则是书背向上，书根向外，书口向下压在板上。蝴蝶装书籍继承了折叠形制书籍翻阅方便的优点，装订在册后又不易断裂、散乱，所以很快成为书籍的主要形制。

但有一个缺点，即由于每页有字的一面对折在内，空白的背面在外，打开书，往往尽碰上空白的背面；而且读完一页，必须连翻两页，才能继续读下去，很不方便，于是人们又发明了包背装。 包背装 一般认为起源于元代，一直沿用到明代中叶。包背装书页的背面同背面对折在内，有文字的一面露在外（与后来的线装书各页相同），再用一张书衣，把折叠好的一叠散页从前到后包裹起来，就形成了包背装”（裹背装”）。与蝴蝶装 相比，包背装的书籍版心转到了书口一侧，一页书版面之外的两个余边粘在书背上，这样，展读时就不会遇到空白，可以逐页读去而不间断。 包背装在发展中经过一些改进。如书籍的书口正是书页的版心，上刻篇名、书名、卷次、页码等，查阅方便。但如果仍然采用蝴蝶装的插架办法，书口向下压在书架上，经常磨损势必导致书页从中缝处断裂为两半。这样，不仅版心上的书名、篇名等不可辨识，翻阅和展读时又会像蝴蝶装那样屡遇空白。因此，人们便改用平放上架的方法，把许多书平叠放置。 既然是平放，书衣也就不必用硬质的材料了，这样就出现了软书衣。而书根上的书名、篇名之类，也就由上下直写改为横写，如同后来的线装书一样。包背装的书籍，要想把每页的两边牢牢地粘在书背上，比起蝴蝶装更为费事。而需要粘连的两个外边，版框外又总有较宽的余纸，因此有人便采用新方法，在余纸上打小孔，一般打二至三个孔，再用纸捻穿进小孔，把一册书订牢。这打孔穿订的一边叫做书脑”，外边再用整张的书衣包裹起来，外表依然和起初的包背装一样。这种经过改进的包背装，就已经为后来的线装打开了通路。 线装 大约起于明代中叶，沿用至今。它是在经过改进的包背装基础上发展起来的。包背装在书背处容易破损，此时仅靠二三个纸捻，不能把书脑部分压平，书脑的上下两角纸张容易卷起，影响外观和阅读。于是又有人作了改进： 在打孔订好纸捻后，另外打孔用线穿订，这就是线装”。线装书不像蝴蝶装、包背装那样用整张的书衣裹背，而是改用两张半页大小的软纸，分置书册 前后，作为封面和封底，与书册一起装订。线装的打孔穿线有一定规格，一般使用

参考文献类型及文献类型电子文献载体类型及其标志代码

参考文献类型及文献类型\电子文献载体类型及其标志代码 参考文献类型及文献类型，根据GB3469-83《文献类型与文献载体代码》规定，以单字母方式标识：专著(M)；论文集（C）；报纸文章（N）；期刊文章（J）学位论文（D）；报告（R）；标准（S）专利（P） a. 专著、论文集、学位论文、报告：[序号]主要责任者．文献题名[文献类型标识]．出版地：出版者，出版年． [1] 周振甫．周易译注[M]．北京:中华书局．1985． [2] 陈送．五四前后东西方文化问题论战文选[C]．北京:中国社会科学出版社，1985． [3] 陈桐生．中国史官文化与《史记》[D]．西安:陕西师范大学文学研究所，1992年． [4] 白永秀，刘敢，任保平．西安金融、人才、技术三大要素市场培育与发展研究[R]．西安:陕西师范大学西北经济研究中心，1998． b．期刊文章：[序号]主要责任者．文献题名[J]．刊名，年，卷(期)． [5] 何龄修．读顾城《南明史》[J]．中国史研究，1998(3)． c．论文集中的析出文献：[序号]析出文献主要责任者．析出文献题名[A]．原文献主要责任者(任选)．原文献题名[C]．出版地：出版者，出版年． [6] 瞿秋白．现代文明的问题与社会主义[A]．罗荣渠．从西化到现代化[C]．北京：北京大学出版社，1990． d．报纸文章：[序号]主要责任者．文献题名[N]．报纸名，出版日期(版次)． [7] 谢希德．创造学习的新思路[N]．人民日报，1998-12-25(10)． e．国际、国家标准：[序号]标准编号，标准名称[S]． [8] GB／T16159-1996，汉语拼音正词法基本规则[S]． f．专利：[序号]专利所有者．专利题名[P]．专利国别：专利号，出版日期． [9] 姜锡洲．一种温热外敷药制备方案[P]．中国专利：881056073，1989-07-26． g．电子文献：[序号]主要责任者．电子文献题名[电子文献及载体类型标识]．电子文献的出处或可获得地址，发表或更新日期／引用日期(任选)． [10] 王明亮．关于中国学术期刊标准化数据库系统工程的进展[EB／01]．http：//www．Cajcd．edu．cn／pub／wm1．txt／980810-2．htmI，1998-08-16／1998-10-04． [11] 万锦坤．中国大学学报论文文摘(1983一1993)．英文版[DB／CD]．北京：中国大百科全书出版社，1996．

文献类型与文献载体代码(完整版)

参考文献的类型 根据GB3469-83《文献类型与文献载体代码》规定，以单字母标识：M——专著（含古籍中的史、志论著） C——论文集 N——报纸文章 J——期刊文章 D——学位论文 R——研究报告 S——标准 P——专利 A——专著、论文集中的析出文献 Z——其他未说明的文献类型 电子文献类型以双字母作为标识： DB——数据库 CP——计算机程序 EB——电子公告 非纸张型载体电子文献，在参考文献标识中同时标明其载体类型： DB/OL——联机网上的数据库 DB/MT——磁带数据库 M/CD——光盘图书 CP/DK——磁盘软件 J/OL——网上期刊 EB/OL——网上电子公告 一、参考文献著录格式 1 、期刊作者．题名〔J〕．刊名，出版年，卷(期)∶起止页码 2、专著作者．书名〔M〕．版本(第一版不著录)．出版地∶出版者，出版年∶起止页码 3、论文集作者．题名〔C〕．编者．论文集名，出版地∶出版者，出版年∶起止页码 4 、学位论文作者．题名〔D〕．保存地点．保存单位．年份 5 、专利文献题名〔P〕．国别．专利文献种类．专利号．出版日期 6、标准编号．标准名称〔S〕 7、报纸作者．题名〔N〕．报纸名．出版日期(版次) 8 、报告作者．题名〔R〕．保存地点．年份 9 、电子文献作者．题名〔电子文献及载体类型标识〕．文献出处，日期 二、文献类型及其标识 1、根据GB3469 规定，各类常用文献标识如下： ①期刊〔J〕 ②专著〔M〕 ③论文集〔C〕 ④学位论文〔D〕

⑤专利〔P〕 ⑥标准〔S〕 ⑦报纸〔N〕 ⑧技术报告〔R〕 2、电子文献载体类型用双字母标识，具体如下： ①磁带〔MT〕 ②磁盘〔DK〕 ③光盘〔CD〕 ④联机网络〔OL〕 3、电子文献载体类型的参考文献类型标识方法为：〔文献类型标识/载体类型标识〕。例如： ①联机网上数据库〔DB/OL〕 ②磁带数据库〔DB/MT〕 ③光盘图书〔M/CD〕 ④磁盘软件〔CP/DK〕 ⑤网上期刊〔J/OL〕 ⑥网上电子公告〔EB/OL〕 三、举例 1、期刊论文 〔1〕周庆荣，张泽廷，朱美文，等．固体溶质在含夹带剂超临界流体中的溶解度〔J〕．化工学报，1995(3)：317—323 〔2〕Dobbs J M, Wong J M. Modification of supercritical fluid phasebehavior using polor coselvent〔J〕. Ind Eng Chem Res, 1987,26:56 〔3〕刘仲能，金文清.合成医药中间体4-甲基咪唑的研究〔J〕.精细化工，2002(2)：103-105 〔4〕Mesquita A C, Mori M N, Vieira J M, et al ．Vinyl acetate polymerization by ionizing radiation〔J〕．Radiation Physics and Chemistry,2002, 63:465 2、专著 〔1〕蒋挺大．亮聚糖〔M〕．北京：化学工业出版社，2001．127 〔2〕Kortun G．Reflectance Spectroscopy〔M〕．New York: Spring-Verlag,1969 3、论文集 〔1〕郭宏，王熊，刘宗林．膜分离技术在大豆分离蛋白生产中综合利用的研究〔C〕．//余立新．第三届全国膜和膜过程学术报告会议论文集．北京：高教出版社，1999．421-425 〔2〕Eiben A E, vander Hauw J K．Solving 3-SAT with adaptive genetic algorithms 〔C〕．//Proc 4th IEEE Conf Evolutionary Computation．Piscataway: IEEE Press, 1997．81-86 4、学位论文 〔1〕陈金梅．氟石膏生产早强快硬水泥的试验研究（D）．西安：西安建筑科学大学，2000