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实时荧光定量PCR法检测非小细胞肺癌EGFR基因突变的总结分析

基因突变的检测方法

基因突变的检测方法基因突变的研已成为当今生命科学研究的热点之一，检测方法也随之迅速发展。人类细胞癌基因的突变类型已如上所述，对于基因突变的检测，1985以前，利用Southern印迹法，可以筛选出基因的缺失、插入和移码重组等突变形式。对于用该法法不能检测的突变，只能应用复杂费时的DNA序列测定分析法。多聚酶链反应（polymerase chain reaction,PCR）技术是突变研究中的最重大进展，使基因突变检测技术有了长足的发展，目前几乎所有的基因突变检测的分子诊断技术都是建立于PCR的基础之上，并且由PCR衍生出的新方法不断出现，目前已达二十余种，自动化程度也愈来愈高，分析时间大大缩短，分析结果的准确性也有很大很提高。其中包括单链构象多态性（single-strand comformational polymorphism,SSCP）和异源双链分析法（heteroduplex analysis,HA）。下面分别介绍几种PCR衍生技术及经典突变检测方法，可根据检测目的和实验室条件选择时参考。 PCR-SSCP法 PCR-SSCP法是在非这性聚丙烯酰胺凝胶上，短的单链DNA和RNA分子依其大街基序列不同而形成不同构象，一个碱基的改变将影响其构象而导致其在凝胶上的移动速度改变。其基本原理为单链DNA在中性条件下会形成二级结构，这种二级结构依赖于其碱基组成，即使一个碱基的不同，也会形成不同的二级结构而出刺同的迁移率。由于该法简单快速，因而被广泛用于未知基因突变的检测。用PCR-SSCP法检测小于200bp的PCR产物时，突变检出率可达70％-95％，片段大于400bp时，检出率仅为50％左右，该法可能会存在1％的假阳性率。应用PCR-SSCP法应注意电泳的最佳条件，一般突变类型对检测的灵敏度无大的影响，同时该法不能测定突变的准确位点，还需通过序列分析来确定。Sarkar等认为对于大于200bp的片段，用其RNA分子来做SSCP会提高其录敏度。应用PCR-SSCP检测点突变已见报道于人类大部分的肿瘤组织或细胞，如乳腺癌、食管癌、肺癌、胃癌、肝癌、胰腺癌等。检测的基因包括多种癌基因及抑癌基因，也是检测抑癌基因p53突变最常用的方法，仅检测第5-8外显子即可发现85％以上的p53基因突变。由于该法简便快速，特别适合大样本基因突变研究的筛选工作。异源双链分析法（HA） HA法直接在变性凝胶上分离杂交的突变型一野生型DNA双链。由于突变和野生型DNA形成的异源杂合双链DNA在其错配处会形成一突起，在非变性凝胶中电泳时，会产生与相应的同源双DNA不同的迁移率。该法与SSCP相似，所不同的是SSCP分离的是单链DNA，HA法分离的是双链DNA，也只适合于小片段的分析。但HA对一些不能用SSCP 检出的突变有互补作用，两者结合使用，可使突变检出率提高到近100％。

(3)理解基因突变的检测方法

第十章基因突变一、教学目的与要求：（1）了解基因突变的类型和性质、特征（2）掌握基因突变分子机理和诱变因素的作用方式（3）理解基因突变的检测方法 (4) 掌握基因突变的修复途径二、教学重点、难点、疑点： 1.突变的概念、类型和性质 2.诱发突变的分子基础 3.诱发突变与人类癌症 4.生物体基因突变的修复机制 5.果蝇基因突变的检出 6.植物基因突变的检出 7.人类基因突变的检出 [解决方法] （1）通过出示基因结构变化的示意图，加深学生对基因突变内涵的理解。（2）课堂教学中不断提出问题，让学生通过概念的运用达到巩固概念和知识迁移的目的。 2．教学难点及解决办法基因突变的原因。 [解决办法] 对人类镰刀型细胞贫血症病因结合图解进行分析，使学生真正明白基因突变的原因——DNA复制过程也可能发生差错，基因中个别碱基的变化，就会造成性状改变。 3．教学疑点及解决办法为什么说基因突变是变异的主要来源？ [解决办法]讲明基因突变与基因重组的区别，联系实际举例。三、教学方法设计：四、教具或教学手段：多媒体课件五、教学过程与板书设计：

第一节基因突变的概念和特征一、基因突变的概念及类别 1、基因突变：指在染色体上一定位点基因内部的化学变化引起的突变基因突变：指染色体上一定位点基因内部的化学变化引起的突变 2、类别隐性突变：A a 显性突变：a A 自发突变—外界环境条件的自然作用或生物体内的生理生化变化而产生的突变诱发突变—在专门诱变因素影响引起的突变，为“诱发突变” 形态突变型—可见突变：指造成外形改变的突变型至死突变型—能造成个体死亡或生命力明显下降的突变型条件突变型—在一定条件下有致死效应 3.一般特征 ①突变的频率：指生物体在每一世代中发生突变的机率，或者在一定时间内突变可能发生的次数。高等植物 10-5— 10-8 细菌和噬菌体 10-4—10-10范围大、突变频率比动植物高例如：氨基酸过程中三种疾病是由三种基因突变导致酶发生变化引起的，有一定的突变频率苯丙氨酸羟化酶缺乏导致苯丙酮尿症；尿黑尿酸氧化酶缺乏会产生尿黑酸尿症；酪氨酸酶缺乏导致白化病苯丙氨酸羟化酶苯丙酮酸苯丙氨酸酪氨酸积累尿黑尿酸氧化酶酪氨酸酶苯丙酮尿症尿黑酸黑色素

肺癌基因检测

肺癌中遗传学改变及其相应的靶向药物遗传学改变(驱动事件) 针对肺癌驱动事件的活性靶向药物 EGFR突变厄洛替尼、吉非替尼、阿法替尼 ALK重排克唑替尼表皮生长因子受体2（HER2）突变曲妥珠单抗、阿法替尼（FDA） BRAF突变Vemurafenib（维罗非尼）、Dabrafenib（达拉非尼）MET扩增克唑替尼 ROS1基因融合克唑替尼 RET基因融合Cabozantinib（卡博替尼） OS 总生存期（Overall Survival）mOS 中位（数）总生存期PFS 无进展生存期（Progression-Free Survival）mPFS 中位（数）无进展生存期ORR 客观缓解率（Objective Response Rate）指肿瘤缩小达到一定量并且保持一定时间的病人的比例，包括CR+PR的病例。OR 总缓解率（Overall Response 或者Overall Remission）经过治疗CR+PR病人总数占对于总的可评价病例数的比例。CR 完全缓解(Complete Response) PR 部分缓解(Partial Response) SD 疾病稳定（Stable Disease）PD 疾病进展（Progression Disease）DCR 疾病控制率(Disease Control Rate)=CR+PR+SD DOR 疾病缓解时间(Duration of Response）=CR/PR到PD/死亡的时间TTP 肿瘤进展时间( Time To Progress) TTF 治

疗失败时间（Time To Treatment Failure）QoL 生命质量（Quality Of Life）MTD 最大耐受剂量(Maximum Tolerated Do

基因突变的检测方法(完整资料).doc

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肺癌基因突变分子靶向治疗

NCCN 2018第2期第NSCL-H页载文如下： NCCN Guidelines Version 2.2018 Non-Small Cell Lung Cancer NSCL-H EMERGING TARGETED AGENTS FOR PATIENTS WITH GENETIC ALTERATIONS 译为中文即：基因改变患者的靶向性药物 1Ou SH, Kwak EL, Siwak-Tapp C, et al. Activity of crizotinib (PF02341066), a dual mesenchymal-epithelial transition (MET) and anaplastic lymphoma kinase (ALK) inhibitor, in a non-small cell lung cancer patient with de novo MET amplification. J Thorac Oncol 2011;6:942-946. 2Camidge RD, Ou S-HI, Shapiro G, et al. Efficacy and safety of crizotinib in patients with advanced c-MET-amplified non-small cell lung cancer. J Clin Oncol 2014;32(Suppl 5): Abstract 8001. 3Frampton GM, Ali SM, Rosenzweig M, et al. Activation of MET via diverse exon 14 splicing alterations occurs in multiple tumor types and confers clinical sensitivity to MET inhibitors. Cancer Discov 2015;5:850-859. 4Paik PK, Drilon A, Fan PD, et al. Response to MET inhibitors in patients with stage IV lung adenocarcinomas harboring MET mutations causing exon 14 skipping. Cancer Discov 2015;5:842-849.

基因突变检测多少钱检测方法是什么

基因突变检测多少钱检测方法是什么一代测序法（Sanger法）：科学家Sanger，于1977年建立，他本人也因此而获得了诺贝尔奖。该技术至今已用三十多年，现在已相当成熟完善。人类基因组计划的测序工作就是使用该项技术完成的，现在***的仪器是美国ABI公司的***3730型全自动遗传分析仪，是经过国际和国家认证的仪器，可重复性达到100%，是亲子鉴定和法医鉴定的专用仪器。该方法是目前基因检测的国际金标准。缺点是通量小，适合少量样本，可进行个性化位点检测，成本极高，比芯片或高通量检测高100倍。 Taqman法：准确性好，适合于大量样本、少量位点，价格贵，缺点是不能读出序列，不太直观。质谱法：准确性较好，缺点只能读出质量数据，不能读出序列，对于缺失和插入突变无法读出，但这种突变更加可怕，适合于大量样本、多位点（最多能检测25个位点），所以可能会出现少量假阳性和假阴性。二代基因检测芯片法：适合于超多位点，大量样品检测和科研参考，每个样本做几百个位点和做几千个位点的检测成本，相差无几，最大优点是成本低廉，一个位点的价格只相当于一代测序价格的1%，缺点是出来的大量数据，可信度不高。我们都知道“是药三分毒”，癌症患者的过度治疗会造成患者的器脏损伤，甚至化疗整个过程费钱费力却“不讨好”，所以进行在进行治疗之前先进行基因测序检测，会让靶向药物治疗事倍功半。肺癌的靶向药基因检测，现在很多公司都可以做，医院基本上也是外送公司做，看你检测几个几个基因，一般不会超过7200，一般检测就是EGFR,融合基因ALK,ROS1，C-MET，中源协和基因检测。一般的，基因检测是通过血液、其他体液、或细胞对DNA进行检测的技术。基因检测可以诊断疾病，也可以用于疾病风险的预测。疾病诊断是用基因检测技术检测引起遗传性疾病的突变基因。目前应用最广泛的基因检测是新生儿遗传性疾病的检测、遗传疾病的诊断和某些常见病的辅助诊断。目前有1000多种遗传性疾病可以通过基因检测技术做出诊断。

肺癌靶向治疗中需注意基因突变类型

肺癌靶向治疗中需注意基因突变类型肺癌在癌症的发病率和病死率中名列前茅，非小细胞肺癌（NSCLC）占肺癌患者的75％一80％。近年来，有关NSCLC的分子生物学研究发展迅速，为靶向治疗NSCLC提供了可能。表皮生长因子受体（EGFR）靶位备受国内外学者的关注。酪氨酸激酶抑制剂（tyrosine kinase inhibitors，TKI），如吉非替尼和厄洛替尼等通过结合三磷酸腺苷的酪氨酸激酶结构域破坏EGFR活性，所以EGFR-TKI已成为治疗NSCLC的常用药物，并取得了很好的疗效。但近年的研究结果表明，存在KRAS突变的患者表现出TKI原发耐药现象，所以，尽早判断肿瘤是否存在KRAS突变至关重要。在临床中，寻求一种针对KRAS 基因突变的药物非常紧迫。目前，治疗NSCLC的靶向抗肿瘤药物EGFR-TKI越来越受到研究人员的重视。EGFR-TKI 对携带EGFR突变基因的NSCLC患者具有显着疗效。研究结果显示，携带exonl8、19和21突变的患者中75％一95％的病例对EGFR-TKI敏感，但KRAS基因突变会导致TKI耐药。TRIBUTE大型随机对照研究结果显示，存在KRAS基因突变的患者生存时间明显缩短，提示KRAS基因突变是影响TKI药物疗效的不利因素。因此，确定肿瘤原发灶和转移灶中KRAS 和EGFR基因的突变位点对选择药物治疗对象至关重要。一项国内的研究检测了150例NSCLC患者肿瘤原发灶和转移灶中KRAS和EGFR基因突变情况，结果发现，原发灶和转移灶中相关基因突变位点不完全相同，KRAS和EGFR基因突变位点在原发灶和转移灶中不一致率分别为6.7％（10／150）和8.7％（13／150）。Kalikaki等发现，25例患者中原发灶和转移灶中KRAS和EGFR基因突变位点不一致率分别为24％和28％，高于本研究结果。Schmid等报道的96例患者中不一致率分别为26％和6.3％。Monaco等发现40例患者中22.5％的病例存在KRAS基因突变位点不一致。本研究结果低于国外的研究结果，推测与人种差异有关。西欧国家NSCLC患者人群中KRAS基因突变率较高，在腺癌患者中甚至达到了30％～50％，但EGFR基因的突变率低，仅为3％～8％。亚洲国家NSCLC患者则相反，EGFR突变率为30％～60％，KRAS基因的突变率为24％。转移灶中的基因突变位点与原发肿瘤中的基因突变位点不一样的现象提示，在肿瘤进展过程中仍会出现基因突变。尽管目前具体的分子机制不明确。但不可否认这对于临床治疗具有指导意义，能够部分解释有些患者转移灶对EGFR-TKI类药物具有较好的反应而原发灶无效这一现象。另一方面，当使用靶向治疗时，不应忽略原发灶和转移灶可能存在基因突变位点不一致的现象。在靶向治疗前，建议对NSCLC患者进行肿瘤组织活检，检测其原发灶和转移灶中基因突变情况，从而更好地选择适合靶向治疗的患者。综上所述，非小细胞肺癌患者原发灶和转移灶中KRAS和EGFR基因突变位点并不一致，这意味着对于已经出现转移的NSCLC患者，确定这两种基因在原发灶和转移灶中的状态对是否选择靶向治疗具有重要的参考意义。目前KRAS抑制剂的研发正加快脚步，以法尼基转移酶抑制剂为代表的创新型KRAS基因抑制剂Antroquinonol已经进入了II期临床阶段，并已经申请进入了美国FDA快速审批通道。其中，I期的临床结果已经得到了美国FDA的认可，I期临床研究中13位经过多种常规治疗方案失败的晚期非小细胞肺癌的患者，在无常规治疗方案的情况下，使用

P53基因突变检测方法

2、试剂和耗材） GIAGEN,德国QIAamp?DNA Blood Mini Kit （）Platiinim?Taq DNA Polymerase High Fidelity （Invitrogen, 11304-102 Nuclease-Free Water （Promega,P 1195） d NTP Mix （Promega,P 151B） PCR引物：北京博迈德科技有限公司合成 DL10000 DNA Marker（TAKARA,大连宝生物）DNA分子定量标准：技术Bioer 产物回收纯化试剂盒（BioSpiii Gel Extraction kit,日本PCR有限公司）公司） Axygen, 200-1000 ul 吸头（美国110.5?10 u、2?20 u k 20-200 □、管EP、仪.器3 ；Taimon1600R凝胶成像系统分析仪（上海天龙公司）Eppendorf 5417R 高速冷冻离心机（Eppendorf公司，德国）公司，美国）Allegra 6R离心机（Beckman-Coulter应涡旋混合器（北京北德科学仪器厂）MVS-1公司，德国） 1000 u 150 口1、200 ul、（Eppendorf^ 口1 移液器、10 U 1、NEWAIR 公司，美国）1【级生物安全柜NU425-400E （拓速冷冻离心机（BECKMAN COULTER 公司，美国）X-15R 公司德国）仪（Eppendorf Eppendorf Masteicycter PCR 公司，美国）（Bio-Rad电泳仪：Universal 024BR电热恒温水浴器（北京来亨科贸有限责任公司）240全自动凝胶成像系统（中国）凝胶成像分析系统：Tocan 测序仪：GenomeLab CEQ/GeXP （BECKMAN COULTER 公司，美国）20 u k 200 ul和1000 ul加样器（吉尔森公司，法国）旋涡震荡器（Scientific Industries公司，美国）二、实验方法 1、样品采集，送检和保存乙二胺四乙酸（EDTA） -3K抗凝管采集HIV和HEV合并感染者外周静脉血，于24h内测定CD4+T淋巴细胞计?数，抗凝血经常规离心分离全血中间层，分装后-80°C冻存用于P53基因变异的测定。 2、血浆样本DNA的提取取200 P1全血中间层于1.5ml无菌EP管中，加入20 口1蛋白酶K；再加入200 ul AL缓冲液，涡旋振荡15秒，56°C孵育10分钟；瞬时离心EP管，加入200 u 1 无

肺癌KRAS基因突变

非小细胞肺癌分子靶向治疗与KRAS基因突变的研究探讨非小细胞肺癌（Non-Small Cell Lung Cancer,NSCLC）的分子靶向治疗是指在肺癌分子生物学的基础上，将与肺癌发生、发展、预后等密切相关的特异分子作为靶点，利用靶分子特异抑制剂或药物进行治疗的方法，包括细胞生长因子受体抑制剂、血管生成抑制剂及信号传导抑制剂等药物，其中以表皮生长因子受体（Epidermal Growth Factor Receptor,EGFR）为靶标的酪氨酸激酶抑制剂（Tyrosine Kinase Inhibitors,TKIs）应用最为广泛，代表药物有Iressa（阿斯利康公司）和Tarceva（罗氏公司）。早期临床研究发现，TKIs药物治疗化疗失败的NSCLC患者的总有效率达10%以上，进一步的亚组分析还发现，东方人种、女性、腺癌和不吸烟是TKIs药物治疗的优势人群，有效率可升高到40%以上。随后，研究发现这些临床特征与肿瘤的生物学特征有密切关系，因此采用这些临床特征选择TKIs 治疗患者可以取得良好的治疗效果。多项研究发现EGFR突变的NSCLC患者对TKIs药物有更好的反应性，而KRAS基因突变与NSCLC患者TKIs治疗的耐药密切相关。 KRAS基因突变与NSCLC分子靶向治疗美国Memorial Sloan-Kettering癌症中心在早期做了一项探索性的转化研究，文章发表于2005年，该研究发现EGFR突变的肺癌患者对TKIs药物反应性较好。而KRAS基因是EGFR信号传导通路的下游调节因子，二者在同一个肿瘤组织中是相互排斥的，意味着KRAS和EGFR基因在肺癌的进展中可能起着同样重要作用，所以该研究还探讨了KRAS基因突变与TKIs药物治疗肺腺癌敏感性的关系。该研究收集60例肺腺癌病人，所有病人均接受了Gefitinib或Erlotinib治疗，对应的标本收集于TKIs治疗前，都进行了EGFR和KRAS基因突变检测。结果38例对TKIs不敏感的病人中有9 例肿瘤组织存在KRAS基因突变，而客观缓解的21例病人中无一例存在KRAS基因突变；敏感病人中77%存在EGFR突变，而不敏感病人中无EGFR突变。得出结论：KRAS基因突变与肺腺癌患者对Gefitinib或Erlotinib单药治疗的原发耐药密切相关。 BR21研究是一项前瞻性、全球多中心、随机、双盲、安慰剂对照的Ⅲ期临床研究，总计入组731例既往接受过1-2次化疗的晚期非小细胞肺癌患者，通过对收集的标本进行检测，结果发现存在KRAS基因突变的病人对Erlotinib治疗的有效率低，生存期也显着缩短（HR 1.63;P=0.03）。BR21的数据提示，KRAS基因突变与肺癌患者对TKIs药物的原发耐药有关，利用KRAS基因检测可以为TKIs药物治疗病人的筛选提供重要参考。 KRAS突变作为预测IV期NSCLC患者化疗联合TKIs药物治疗的疗效作用方面知之甚少。不过，从第三阶段TRIBUTE试验（化疗+安慰剂 vs 化疗+Tarceva，针对未曾治疗NSCLC 患者）的数据我们得到些启示。进行KRAS突变分析的274例肿瘤患者（总计1079例）中，55例存在KRAS突变。存在KRAS突变的肿瘤患者，用Tarceva+卡铂+紫杉醇（8%）的治疗疗效与接受化疗病人（23%）相比疗效差。这些数据表明，Tarceva治疗不但没有改善用卡铂和紫杉醇治疗的KRAS突变病人的总生存时间，还有可能降低化疗药的疗效。值得注意的是，KRAS突变对于卡铂和紫杉醇治疗的反应率没有显着性差异（26% vs 23%）。对治疗组与EGFR和KRAS突变组分别做总生存期和无进展生存期的标准曲线，结果表明，Tarceva联合化疗的KRAS突变患者，总生存期最短。较近的一项研究，应用基于PCR的基因测序法，检测166例口服EGFR-TKIs治疗晚期NSCLC患者的KRAS突变情况，结果发现KRAS突变状态与疾病进展和无进展生存期较短相关，与总生存率无关。得出结论如下：KRAS基因与NSCLC患者EGFR-TKIs治疗耐药和不良预后相关。

肺癌常见突变基因EGFR与ALK的认知

肺癌常见突变基因EGFR与ALK的认知肺癌是我国发病率最高，也是我国死亡率最高的癌症，而幸运的是在我国大约有40-50%的肺癌具有敏感基因突变，最常见的是EGFR突变及ALK融合突变（欧美10%），可以应用靶向药物治疗，EGFR/ALK靶点的突变应用靶向药物有效率高达70%，明显提高患者生存质量，提高生存期。有效率虽然很高但总有一个跨不过去的坎那就是耐药。一、EGFR（表皮生长因子受体）突变 EGFR大家已经非常熟悉了，是非小细胞肺癌最常见的致癌基因，是目前肺癌靶向药物对应的主要驱动基因，常见的突变位点发生在18、19、20和21号外显子上。最常见的有两种，一种是19号外显子的缺失（45%），另外一种是21号外显子L858R（40-45%）的突变。针对EGFR突变的肺癌患者，比如19外显子缺失和L858突变，常用的药物一代EGFR抑制剂厄洛替尼、吉非替尼、埃克替尼和二代EGFR抑制剂阿法替尼，三代奥西替尼（9291），这些药物对EGFR 突变的非小细胞肺癌患者不错的药物。但多数病人在使用第一代靶向药物1-2年时间内，就会出现耐药，肿瘤进展。其中原因有四： 1，60%的患者是由于出现继发耐药突变——T790M突变，一旦T790M突变，可以使用三代靶向药物奧希替尼（9291）； 2，20%的患者耐药是因为旁路激活，比如c-MET扩增，也就是说肿瘤细胞的增殖绕开了EGFR，走了另外一条路。如果基因检测显示MET扩增或突变，可以应用克唑替尼；

3，表型改变也是一代靶向药物产生耐药的一种情况，比如腺癌会向小细胞肺癌转化； 4，EGFR驱动基因的下游信号通路激活，也会导致的原发耐药或者获得性耐药。这种情况就要考虑化疗。奧希替尼作为一代靶向药耐药后的选择，仍然会产生耐药。比如继发C797S的共生突变，其他旁路激活等。在EGFR突变的患者中，除了常见的19/21基因突变外，还有3种罕见突变：G719X（18外显子）、S768I（20外显子）和L861Q （21外显子）。目前没有相应的靶向药物，可以选择化疗。二、ALK（间变性淋巴瘤激酶）基因融合突变 ALK融合基因突变在非小细胞肺癌患者中突变率只有3%-8%，但被称为“钻石突变”，原因是针对ALK靶点的靶向药比较多，而且有些靶向药可以逆转上个靶向药的耐药，因而患者可以获得更长的生存期。一代的ALK抑制剂克唑替尼；二代的色瑞替尼、艾乐替尼、布加替尼；三代的劳拉替尼。对于ALK阳性的非小细胞肺癌患者的首选治疗为克唑替尼，但出现脑转移的患者效果较差。如果出现耐药，后续治疗可以考虑二代ALK抑制剂艾乐替尼、色瑞替尼或布加替尼。布加替尼是一种新型的ALK和EGFR双重抑制剂，可强效抑制这两种突变。目前FDA已经获批用于治疗克唑替尼用药期间病情进展或无法耐受克唑替尼的

肿瘤基因突变检测

肿瘤基因突变检测癌症是一类难以预防的疾病，中晚期癌症治愈的可能性又很小，而早期癌症的治愈率可达65%以上，有些肿瘤可达90%以上，因此，战胜癌症的关键是早期发现癌症。由于癌症早期常无特殊症状，甚至毫无症状，故癌症的早期发现、早期诊断主要是通过定期健康体检和人群筛查完成。目前筛查癌症的方法主要是通过化验血肿瘤指标及B超、CT、MRI、PET-CT 等检查，但这些方法的敏感性和特异性均不高，发现有异常时往往已是中晚期。 17种常见高发肿瘤，包括乳腺癌（breast cancer）、结肠癌（colorectalcancer）、子宫癌（endometrial cancer）、脑胶质瘤（glioma）、白血病（leukemia）、肺癌（lungcancer）、淋巴癌（lymphoma）、成神经管细胞瘤（medulloblastoma）、黑色素癌(melanoma)、间皮瘤(mesothelioma) 、多性骨髓瘤(multiple myeloma) 、卵巢癌(ovarian cancer)、胰腺癌(pancreatic cancer) 、真性红细胞增多(polycythemia vera) 、前列腺癌(prostatecancer) 、肾细胞癌(renal cell cancer)和恶性内瘤(sarcoma)，其发病机制涉及与多种肿瘤发生共同相关的肿瘤易感基因群介导的分子改变，参与了肿瘤发生的早期分子事件。系统寻找和探讨它们在肿瘤发生发展过程中的遗传学变异，对阐明肿瘤早期发生机制及寻找肿瘤早期预警、早期诊断和早期治疗的分子靶标都具有重要的现实意义。利用高通量分子测序技术平台，可同时开展多个肿瘤基因突变检测项目，如EGFR、K-RAS 、N-RAS、B-RAF、PI3K 、p53、p16、BRCA1、

基因突变的检测方法

中国肺癌相关基因突变谱系研究进展

中国肺癌相关基因突变谱系研究进展 1 中国肺癌的流行病学研究 2014年我国新发的肺癌患者超过78万人，在我国恶性肿瘤中，发病率第一，死亡率第一。 2 中国肺癌的组织学分型肺癌主要分为非小细胞肺癌（NSCLC）与小细胞肺癌（SCLC）2大类，NSCLC主要分为肺腺癌、肺鳞癌和大细胞癌等；2016年发表于《中国肺癌杂志》上的一项研究，对6058例中国郑州大学肺癌患者的病理类型和临床流行病学特征进行了分析，显示：（1）男女性肺癌患者均以腺癌为主，在各类病理类型中分别占37.64%和73.63%，差异具有统计学意义（χ2=562.382, P<0.001）；（2）吸烟患者中以鳞癌居多，占38.39%；（3）饮酒患者中也以鳞癌居多，占37.37%；（4）中国女性肺癌患者以腺癌为主，可能与室内烹调油烟的空气污染有关，特别是菜籽油、二手烟和生物燃料的污染。 3 中国NSCLC分子变异研究及EGFR-TKIs/ALK-TKIs常见的耐药机制关于东亚及欧美NSCLC分子变异的研究目前已经有了很多，由于不同的研究中所纳入样本的数目有所差别、吸烟/非吸烟人群的比例有所差别、男性/女性患者的比例有所差别、检测方法的灵敏度也有所差别等原因，因此在不同研究中各分子变异的频率有所差异。在《Translational Lung Cancer Research》上发表的一篇综述中[1]，EGFR突变、KRAS突变、ALK融合、ROS1融合、RET融合、HER2突变、BRAF突变在东亚肺腺癌中的频率分别约为：40-55%、8-10%、3-5%、2-3%、1-2%、2-3%、0.5-1%。石远凯教授[2]牵头所作的PIONEER研究（NCT01185314）是确定在亚洲肺腺癌患者中具有EGFR 高突变频率（总体51.4%）的第一个前瞻性研究；在该研究中，共评估了亚洲7个地区的1482 例患者中的1450例（97.8%）患者肿瘤中的EGFR突变状态；EGFR突变在女性患者与男性患者中的频率分别为：61.1%与44.0%；EGFR突变在从未吸烟患者中的比例为60.7%。吴一龙教授团队[3]于2014年对多项研究进行了汇总分析。Tony Mok教授等[4]于2015年对亚太国家/地区的NSCLC患者中EGFR基因的突变频率进行了研究与报道。 2015年发表于《Oncotarget》上的一项研究[5]，全面分析了中国非小细胞肺癌中的驱动基因变异图谱；其中，肺腺癌1356 例、鳞状细胞癌503例、腺鳞癌57例、大细胞癌19例、肉瘤样癌8例。随着研究的不断深入，越来越多的EGFR-TKIs与ALK-TKIs的耐药机制被揭示[6]；其中，2014年发表于《Nature Reviews Clinical Oncology》的《Acquired resistance to TKIs insolid tumours: learning from lung cancer》最具有代表性。参考文献 [1]Transl Lung Cancer Res. 2015 Apr;4(2):156-64. doi: 10.3978/j.issn.2218-6751.2014.11.11. [2]J Thorac Oncol. 2014 Feb;9(2):154-62. doi: 10.1097/JTO.0000000000000033.

基因突变的检测方法

基因突变的检测方法基因突变的检测方法基因突变的研已成为当今生命科学研究的热点之一，检测方法也随之迅速发展。人类细胞癌基因的突变类型已如上所述，对于基因突变的检测，1985以前，利用Southern印迹法，可以筛选出基因的缺失、插入和移码重组等突变形式。对于用该法法不能检测的突变，只能应用复杂费时的DNA序列测定分析法。多聚酶链反应（polymerase chain reaction,PCR）技术是突变研究中的最重大进展，使基因突变检测技术有了长足的发展，目前几乎所有的基因突变检测的分子诊断技术都是建立于PCR的基础之上，并且由PCR衍生出的新方法不断出现，目前已达二十余种，自动化程度也愈来愈高，分析时间大大缩短，分析结果的准确性也有很大很提高。其中包括单链构象多态性（single-strand comformational polymorphism,SSCP）和异源双链分析法（heteroduplex analysis,HA）。下面分别介绍几种PCR衍生技术及经典突变检测方法，可根据检测目的和实验室条件选择时参考。 PCR-SSCP法 PCR-SSCP法是在非这性聚丙烯酰胺凝胶上，短的单链DNA和RNA分子依其大街基序列不同而形成不同构象，一个碱基的改变将影响其构象而导致其在凝胶上的移动速度改变。其基本原理为单链DNA在中性条件下会形成二级结构，这种二级结构依赖于其碱基组成，即使一个碱基的不同，也会形成不同的二级结构而出刺同的迁移率。由于该法简单快速，因而被广泛用于未知基因突变的检测。用PCR-SSCP法检测小于200bp的PCR产物时，突变检出率可达70％-95％，片段大于400bp时，检出率仅为50％左右，该法可能会存在1％的假阳性率。应用PCR-SSCP法应注意电泳的最佳条件，一般突变类型对检测的灵敏度无大的影响，同时该法不能测定突变的准确位点，还需通过序列分析来确定。Sarkar等认为对于大于200bp的片段，用其RNA分子来做SSCP会提高其录敏度。应用PCR-SSCP检测点突变已见报道于人类大部分的肿瘤组织或细胞，如乳腺癌、食管癌、肺癌、胃癌、肝癌、胰腺癌等。检测的基因包括多种癌基因及抑癌基因，也是检测抑癌基因p53突变最常用的方法，仅检测第5-8外显子即可发现85％以上的p53基因突变。由于该法简便快速，特别适合大样本基因突变研究的筛选工作。异源双链分析法（HA） HA法直接在变性凝胶上分离杂交的突变型一野生型DNA双链。由于突变和野生型DNA形成的异源杂合双链DNA在其错配处会形成一突起，在非变性凝胶中电泳时，会产生与相应的同源双DNA不同的迁移率。该法与SSCP相似，所不同的是SSCP分离的是单链DNA，HA法分离的是双链DNA，也只适合于小片段的分析。但HA对一些不能用SSCP 检出的突变有互补作用，两者结合使用，可使突变检出率提高到近100％。突变体富集PCR法（mutant-enriched PCR）本法的基本原理是利用ras基因家族某个密码子部位存在已知的限制性内切酶位点，如K-ras基因第12密码子的BstNI位点，第13密古巴子有BgⅠⅡ位点。用链续二次的巢式PCR来扩增包括K-ras第12、13密码子的DNA片段，在两次扩增反应之间用相应的内切酶消化扩增的DNA片段，野生型因被酶切而不能进入第二次PCR扩增，而突变型则能完整进入第二次PCR扩增并得到产物的富集。变性梯度凝胶电泳法（denaturing gradinent electrophoresis,DGGE） DGGE法分析PCR 产物，如果突变发生在最先解链的DNA区域，检出率可达100％，检测片段可达1kb，最适

肺腺癌KRAS基因突变怎么治疗

非小细胞肺癌又称非小细胞癌，是肺癌常见的一种，也是目前较为高发的恶性肿瘤疾病之一，同时，根据相关的调查数据显示，肺癌在现阶段处于高发，死亡率较高的阶段。也是目前威胁我国人民健康的头号公敌。现在较为全新的治疗方式靶向药物治疗的出现，虽然从客观上延长了患者的生存期，但是一些靶向药物在服用不到几个月的时间就出现了抗药。这是为什么？其中的一部分因素就是来自于RAS基因突变。在动物基因组里存在着三种RAS癌基因家族成员：HRAS，KRAS，NRAS。这三种基因编码的蛋白质大约有90%的氨基酸序列同源。研究发现HRAS、KRAS、NRAS都是通过点突变被激活。其中KRAS突变在恶性肿瘤中频发，对恶性肿瘤影响最大。小编在此提示，NSCLC 中90%的RAS基因突变是KRAS突变，并且NSCLC中近97%KRAS基因突变涉及吸烟相关的12或13位密码子，两种密码子主要发生G-T颠换（嘧啶替换嘌呤）。研究发现不吸烟患者中存在一种特殊的G-A转换，但尚未明确临床意义。而KRAS基因突变在肺鳞癌中很罕见。KRAS信号通路是EGFR和其他信号转导的下游通路，突变后的KRAS基因可获得调节细胞生长与分化能力。这些突变抑制了KRAS的GTP酶活性，导致KRAS信号处于持续激活状态，进而引起细胞恶性转化。作为在NSCLC发生发展中起重要作用的分子标记，若能研究出针对KRAS基因的分子靶向治疗方法，将会为NSCLC患者带来新希望。目前抑制RAS突变的治疗方法可分为三大类：抑制RAS蛋白的合成；改变RAS膜定位；抗RAS制剂。通过抑制突变的GTP酶下游效应分子（例如，RAF-，AKT-，MEK-，PI3K-抑制剂）发挥作用。由于KRAS基因突变在人类恶性肿瘤中常发，很多学者投入大量时间精力在这些制剂的研制上。其中抗RAS制剂有了一个成果，目前来说还处在研发阶段的安卓健在这个方面的优势非常突出，他是RAS 基因强效抑制剂，针对RAS基因突变，RAS基因高表达都有不错的治疗效果，目前这款抗癌新药已经让部分患者受益，更多的详情0请患者们自行查看他们的官网。当然还有一些抗癌新药也在不断的研发，相信不久的将来将会有更多的新药让患者来选择治疗。非小细胞肺癌中存在RAS基因突变，要想得到很好的治疗，我们需要做基因检测，及时的发现是否存在RAS基因突变情况，然后根据情况看是否采用抗癌新药（如安卓健）等等，或者在医师的指导下进行个性化的诊疗方案，以延长患者的生存期。

基因变异的研究方法与进展

基因变异广义上说就是指基因结构变化从而产生了可遗传的变异。也就是说DNA水平上的突变造成的基因改变。而这一突变过程可能有很多原因，有自发性的，比如DNA配对过程中的装配错误，也有外源性的诱导因素，如物理，化学，生物因素等造成染色体结构改变或者基因结构的直接变化。突变的形式多种多样，常见的有：点突变，即一个或多个核苷酸发生了改变；框内突变指的是3个或是的倍数的碱基缺失或插入导致的突变，使基因丢失或增加1个或几个氨基酸；除此之外，还存在着DNA大片段的缺失，通常是指几百个bp至几十个kb的碱基缺失或复制。这其中，最常见的莫过于点突变，他是指一个或者几个核苷酸的缺失或改变，通常会形成三种类型，第一种是同义突变，即碱基替换后，虽然密码子发生改变，但编码氨基酸没有改变（遗传密码的兼并性），亦称静止突变，第二种是错义突变，指的是碱基替换，密码子发生改变后，编码氨基酸亦发生改变，编码另一个氨基酸，第三种是无义突变，即碱基替换后，使编码氨基酸的密码子变成一个终止密码子。基于上述的变化，常见的基因变异研究方法有如下几种一、筛选性方法有人将这类方法分为2类，根据电泳性质不同及其他包括化学修饰法等 1 RNase 法该法是一种最早提出的检测DNA突变的方法口。其原理是RNase可以识别RNA：DNA或RNA：RNA杂交链中错误配对的碱基并将其切断。经聚丙烯酰胺凝胶电泳将正常链及被切断的含有突变点的链区分开来。杂交方法是将同位素或其它方法标记的正常野生型RNA 片段与相对应的待测DNA 片段混合，90"C

左右变性并在室温下复性形成杂交分子。当待测DNA 片段中存在碱基突变时，在该位点上二条链不能正常配对，便成为RNase的识别和切割位点 2 DGGE、CDGE、TGGE、TSGE法梯度变性凝胶电泳（DGGE）原理是当双链DNA在梯度变性的聚丙烯酰胺凝胶中行进到与DNA变性温度(熔点温度)一致的凝胶变性浓度位臵时，DNA 发生解旋变性此时电泳速度迅速降低。而当解旋的DNA链中有一个碱基突变时，将会影响其电泳速度变化的程度，从而将正常与突变的DNA区别开。 CDGE(constant denatural gel electrophoresis)法通过预实验或理论计算预先精确确定待测DNA片段的熔点温度后采用单一变性浓度凝胶电泳，简化了DGGE 法的操作类似于CDGE法，TSGE (temperature sweep gel electropnoresis)法则取消了温度梯度而代之以单一温度这类方法的优点是：(1)检出率高，～100 (2)可用于分析突变——正常DNA 混合样品；(3)可以回收分离出的DNA 片段；(4)可以直接测定未经扩增的DNA 。这类方法的缺点也很多，如(1)分析片段较小，<500 bp；(2)需要制备昂贵的GC clamp(3)需要事先经过复杂的计算机处理计算熔点温度或预试验确定变性条件； (4)位于高度富含GC的片段中的突变可能漏检。鉴于以上不利因素，DGGE等一类方法有逐渐被SSCP(单链构象多态性)法取代的倾向。尽管如此，这类方法一经建立，应用十分方便，适于大规模样品分析 3 SSCP法单链构象多态性(single strand conlotraation polymorphism，)是在非变性聚丙烯酰胺凝胶上，短的单链DNA或RNA分子依其碱基序列不同而形成不同构象，