不同输注途径对CIK细胞体内分布和抑瘤作用的影响
[文章编号]1000-8861(2007)04-0416-05
不同输注途径对CIK 细胞体内分布和抑瘤作用的影响
李 慧a
,岳 欣b
,安秀梅a
,张 澎a
,刘 虹a
,任秀宝a
,郝希山a
(天津医科大学附属肿瘤医院a.免疫
室;b.结直肠科,天津300060)
[收稿日期]2006-04-10;[修回日期]2006-07-19
[作者简介]李 慧(1974-),女,天津市人,助理研究员,博士,主要
从事肿瘤生物治疗方面的研究。(Tel)022-********-5223;(E -mail)li hui _0105@yahoo.c om
[摘 要] 目的 研究不同输注途径(皮下、腹腔、瘤周注射)对CIK 细胞在活体内的分布规律和抑瘤活性的影响。方法 以同位素32P -A d ATP 标记CIK 细胞,而后经尾静脉途径和腹腔途径注射入裸鼠体内,用放射性定量检测方法分析CIK 细胞在各器官的动态分布。裸鼠皮下注射结肠癌细胞建立肿瘤活体模型,分别按瘤周、腹腔和尾静脉注射途径接受CIK 细胞治疗,观察肿瘤的体积和重量变化。结果 CIK 细胞输入裸鼠体内后,迅速分布至肝、脾、肾、肺、胃、肠等器官,其中肝、脾、肾的分布浓度最高,CIK 细胞在各脏器的分布规律与不同的输注途径存在一定的联系。裸鼠皮下接种结肠癌细胞系HC T -8后,瘤周和尾静脉注射CIK 细胞可以明显抑制皮下移植肿瘤的生长,而腹腔注射CIK 细胞对于皮下肿瘤的抑制没有统计学意义。结论 CIK 细胞体内分布的广泛性表明它可以用于身体各部位恶性肿瘤的治疗;针对不同解剖部位的肿瘤可以选择不同的CIK 细胞输注途径以最大限度地提高疗效。
[关键词] CIK 细胞;器官分布;抑瘤作用
[中图分类号] R730.3 [文献标识码] A
Effects of different infusion routes on the distribution and ant-i tumor activity of C IK cells in vivo
LI Hui,YUE Xin,AN Xiu -mei,ZHANG Peng,LIU Hong,REN Xiu -bao,HAO X-i shan(Department o f Immunology ,Cancer Hospital ,Tianjin Medical University ,Tianjin 300060,China )
[Abstract ] Objective To investi gate the influence of different injection pathways on the distribution pattern and ant-i tumor activi ty of
CIK cells in vivo .Methods CIK cells were labeled with isotope 32
P -A dATP,and then inoculated to nude mice by intraperitoneal and tail vein injection,respectively.Quan titative radiometric measurement was used to analyze dynamic distribution of CIK cells in organs of mice.Nude mice were inoculated with HCT -8colon cancer cells by subcu taneous injection to build in vivo solid tu mor model.Tumorgenesis mice were treated with CIK cells either through in traperitoneal injection,tail vein injection or subcutaneous injection around tumor.The size and weigh t of tu mor were recorded for evaluation.Results The CIK cells were quickly dis tributed to organs such as liver ,spleen,kidney,lung,stomach,and intestine after inoculation into nude mice.Among those organs,the liver,spleen,and kidney had highest distribution concentration of CIK cells.The distribution of CIK cells in organs was correlated with injection path ways.The tumorgenesis rate of nude mice inoculated with HCT -8cells by subcutaneous injection was 88%.The tu mor growth was inhibited significantly in the case of tail vein injection and per-i tumor injec -ti on of CIK cells,while the an t-i tu mor effects were not significant in the case of in traperitoneal i njection.C onclusion The extensive distribution pattern of CIK cells among organs shows that CIK cells can be used as drugs against various malignant tumors in organism.The maximum effect can be achieved by proper choosing delivery path way of CIK cells based on individual anatomic si te of the tumor.
[Key w ords ] CIK cell;Organ distribu tion;Ant-i tumor activity
CIK 细胞作为一种体外诱导扩增的免疫活性细胞,在体外显示出了强大的抗瘤活性,但作为一种临床治疗的手段,其应用的疗效必然要取决于其体内的杀瘤活性。过继免疫细胞在体内发挥作用受许多因素的影响,其中一个重要因素就是免疫效应细胞能否到达靶器官,实现与肿瘤细胞的直接接触,从而有效杀伤肿瘤组织。了解免疫活性细胞在活体内的分布迁徙规律对于其发挥调节免疫、杀伤肿瘤作用来说非常重要。关于这方面的研究日益增多,主要焦点集中在免疫效应细胞可否归巢于淋巴循环以及
可以分布的器官以及是否对肿瘤组织选择性富集。
另外,目前关于过继免疫治疗细胞的体内转归研究多是建立在静脉传输途径的基础之上。关于这些免疫治疗细胞经静脉途径输入体内后的移行规律,国内外许多学者进行了大量的研究。普遍认为,外周静脉静脉输注后,过继细胞首先进入肺脏,2~6h 出现在肺内积聚达到高峰,而后肺内浓度逐渐下降,迅速出现的二次分布使肝、肾、脾的积聚高峰稍
晚于肺而出现,24h 后分布趋于稳定[1]
。类似于药物的首过效应,过继免疫细胞在最先经过的器官获
得最大限度的截留,并且最早达到积聚峰值[2]
。过继免疫细胞可以分布到大多数器官以及肿瘤组织似乎已经被普遍认可,但关于过继免疫细胞是否对肿瘤组织有偏嗜性积聚,目前争议颇多。此外,有证据
#
416#
免疫学杂志 第23卷 第4期 2007年7月 IMMUNOLOGICAL J OURNAL Vol.23No.4Jul.2007
表明过继免疫细胞的体内杀伤活性主要体现在最初
的输注高峰期内[3]
。
本研究采用同位素标记方法观察CIK 细胞经不同途径输注在体内的迁徙、分布以及存活时间等特征;建立皮下移植性肿瘤的裸鼠活体模型,通过不同输注途径给予CIK 细胞治疗,以活体内的抑瘤效果检验这种过继免疫效应细胞治疗对活体肿瘤的疗效以及不同输注途径对治疗效果的影响。通过对实验结果的整理、分析,探讨过继免疫活性细胞在体内的分布规律以及进行相关研究的方法,结合不同输注途径的疗效比较为CIK 细胞的临床应用提供具有参考意义的信息。
1 材料与方法
1.1 实验动物 6~8周龄的Balb P c 雌性裸鼠,购自中国医学科学院动物繁育中心及北京实验动物中心(维通利华公司)。
1.2 CIK 细胞在活体内的分布研究
1.2.1 CIK 细胞的制备 采集并分离外周血单个核细胞,用无血清培养基X -Vivo20调整细胞数为
1@106~3@106mL -1
,培养第1天加入抗人CD3单抗(100ng P mL)、人重组IL -1A (100U P mL)、人重组I FN -C (1000U P m L),培养第2天加入人重组IL -2(300U P mL),每3天更换新鲜培养液,同时添加补充人重组I L -2和人重组IFN -C ,培养12~14d 收获CIK 细胞。1.2.2 CIK 细胞的标记 收获CIK 细胞,重悬于培
养液中,按185KBq P mL 加入32
P -A dATP,充分混匀,放入37e 水浴中3h,洗去未标记的同位素。
1.2.3 CIK 细胞的体内输注 CIK 细胞经尾静脉途径输注:以生理盐水悬浮标记后的CI K 细胞并调整
为2@107mL -1
,每只裸鼠经尾静脉注射0.1mL 细胞悬液,对照组注射生理盐水0.1mL 。CI K 细胞腹腔内输注:以生理盐水悬浮标记后的CI K 细胞并调
整为1@107mL -1
,每只裸鼠经腹腔注射0.2mL 细胞悬液,对照组注射生理盐水0.2mL 。
1.2.4 CIK 细胞体内分布的监测 于注射后4、8、
16、24、48、72、96h 的各观察时点分别处死裸鼠5只,
取动物的肺脏、肝脏、脾脏、肾脏、胃、肠、子宫卵巢、骨髓,并取血样0.1mL 。切碎待测组织,放于同位素测量盘上,测定放射值。
1.3 CIK 细胞的体内抑瘤实验
1.3.1 肿瘤细胞接种裸鼠 于裸鼠腹股沟部位皮
下注射肿瘤细胞悬液,每只0.1m L,含2@106
细胞。1.3.2 CI K 细胞输注 每日观察裸鼠成瘤情况,于肿瘤形成时开始注射CIK 细胞,每周注射1次,共4次,共分为以下4组:瘤周注射组,于瘤周围多点
注射0.2mL CIK 细胞5@107m L -1
;腹腔注射组,于
裸鼠腹腔注射0.2mL CIK 细胞5@107m L -1
;尾静脉注射组,经尾静脉注射0.1mL CIK 细胞1@108mL -1
;对照组,经尾静脉注射生理盐水0.1mL 。1.3.3 肿瘤生长情况的观察 每日观察裸鼠肿瘤生长情况,每3天用卡尺测量肿瘤大小,并按照公式
(肿瘤体积=a @b 2
P 2,其中a 代表肿瘤长径,b 代表肿瘤宽径)计算肿瘤的体积。至第5周将裸鼠颈椎脱臼处死,剥离肿瘤块并称重。
2 结果
2.1 尾静脉途径输注CIK 细胞在体内的分布 每
只实验动物输注的CIK 细胞为2@106
,经同位素标记后放射性检测值为(68699.7?3154.0)cpm 。
同位素标记的CI K 细胞在尾静脉输入后的4h,即可在肝、肺、肾、肠、胃、脾和子宫卵巢等器官中检测到不同程度的放射性,在96h 的观察期间内,器官cpm 值的最大值出现于注射后第8小时的肠组织[(6404.4?105.5)cpm],其次是肝[第16小时,(5935?73.7)cpm],多数器官的峰值出现于8~24h 之间。观察期间内,最早达到高峰的是肺,在注射后4h 达到最高值[(749.8?24.3)cpm],除了第8小时以外,在第16小时和第24小时的均维持在峰值水平[(65114?1916)和(670.6?14.5)cpm],而后逐步降低(表1,表2)。
表1 同位素标记CIK 细胞经尾静脉输注后在裸鼠体内的各器官的动态分布 Tab 1 Dynamic distri bu tion of CIK cells labeled by isotope in nude mice (via tail vein)
CPM value
Control
4h 8h 16h 24h 48h 72h 96h Lung 18.8?10.2749.8?24.3
360.8?62.0
651.4?19.6670.6?14.5
313.8?25.9
284.6?42.5
180?47.2Li ver 35.6?12.42264.6?439.82808.2?338.35935?73.74428.8?126.32572.8?270.51680.4?88.51077.4?123.3Spleen 12.4?3.1403.6?11.6531.4?70.8876.6?199.8890.4?45.1546.4?95.0351.2?31.8 232?73.4Kidne y 15.8?3.6847.0?88.3720.2?85.01614.4?122.61403?66 880.4?30.4 572?52.2 384?91.3Stomach 15.8?3.6225.6?57.9456.0?13.6
539.4?102.7
673.4?36.2
381.8?26.7
312.4?31.3
176?89.6
Intes ti ne
75?13.92571?13.36404.4?105.55451.6?772 5348?225.92909.4?252.32904.4?154.21497.4?519.3Uterus &ovary 11.8?3.8188?64.2284.4?5.1188.8?21.4190.2?25.2187.4?22.9145.4?58.2 132?50.0Blood 15.0?4.1
224.6?21.4
211.8?34.7
162.2?18.0
114.4?6.3
70.4?6.9
116.8?25.1
66.8?16.5
n =5
#
417#第4期 李 慧,等1不同输注途径对CIK 细胞体内分布和抑瘤作用的影响
表2经尾静脉输注CIK细胞在各器官密度分布的峰值Tab2M ax-value of the distribution density of CIK cells in dif-ferent organs of nude mice(via tail vein)
Organ CPM P(g)T i me P(h) Spleen15963.6?819.424 Kidney8006.0?612.816
Liver7374.3?92.116
Lung6091.7?202.54 Intestine3516.3?58.68 Stomach2192.0?120.824
Uterus&ovary1363.0?25.68
n=5
剔除检测器官的自然本底、质量等因素,将去除本底值的绝对检测值再重新按单位质量数计算。按单位质量的cpm峰值,即标记细胞在各器官的分布浓度排列从高到低各检测器官依次为脾、肾、肝、肺、肠、胃和子宫卵巢(图1)。
2.2腹腔途径输注C IK细胞在体内的分布每只实验动物输注的CIK细胞为2@106,经同位素标记后放射性检测值为(61496.3?2099.3)cpm。
标记细胞输注后,在各观察时点中,肝、肾、胃、肠、子宫卵巢在第4h的分布达到峰值,而脾、肺和骨髓在第8h达到峰值,血液中第4、8h的cpm值接近。观察期间分布最多的器官仍然是肠和肝,按各器官标记细胞的分布密度排列从高到低依次为脾、肝、肾、肠、肺、胃和子宫卵巢。骨髓中的放射性分布始终处于低水平(表3,表4,图2)。
2.3两种不同输注途径对分布的影响在2种输注途径中,肠和肝的器官分布总量均是最多的。肺内分布在静脉输注途径中4h即达到峰值,而在腹腔输注途径中其达到峰值的时间是8h。除肺之外,其他观察器官的分布在静脉途径中达到峰值的时间要晚于腹腔途径。
在多数观察时点,腹腔输注途径中CI K细胞在腹腔器官(肝、肠、胃)的分布与在肺内分布的比值要高于尾静脉输注途径。
2.4不同输注途径对CIK细胞体内抑瘤作用的影响注射CI K细胞后,每3d用卡尺测量肿瘤大小,计算肿瘤体积(图3)。至接受治疗后第5周将裸鼠颈椎脱臼处死,剥离肿瘤块、称重计算肿瘤抑制率(表5)。其中瘤周和尾静脉注射CI K细胞可以明
表3同位素标记CIK细胞经腹腔输注后在裸鼠体内各器官的动态分布
Tab3Dynamic distri bu tion of CIK cells labeled by isotope in nude mice(via peritoneal cavity)
Organ
CPM value
Control4h8h16h24h48h72h96h
Lung14.0?3.2264.4?25.5425.2?64.7396.0?47.7247.6?12.3216.8?31.6153.6?34.5176.4?17.6 Li ver32.6?3.05080.4?389.74634.4?453.13028.0?465.02406.8?210.52209.6?62.21136.8?204.4687.6?60.2 Spleen10.6?3.6786.4?17.8989.2?89.9509.8?129.2440.8?15.8375.2?95.2298.0?47.1216.4?18.9 Ki dney13.8?4.31187.8?81.6960.0?86.7821.4?140.4834.8?26.3766.8?72.9376.4?58.7325.6?65.0 Stomach13.8?2.5881.2?46.0598.0?139.4436.8?56.3421.6?31.3431.4?23.6246.8?40.4205.6?32.9 Intes ti ne70.0?1.46855.6?474.55076.0?305.24241.8?575.83884.4?270.63934.0?406.22008.0?305.71454.8?99.3 Uterus&ovar14.0?2.9453.2?4.7450.8?118.2223.2?81.9194.0?56.9197.6?44.3152.8?23.0102.8?23.3 Bone-marrow11.0?3.023.6?3.839.2?2.330.8?8.729.2?12.528.4?2.217.0?4.421.6?1.7 Blood10.6?3.4243.6?67.8220.4?17.7112.4?33.8110.0?11.090.4?15.671.2?4.156.0?14.6 n=5
表4经腹腔输注CIK细胞在各器官密度分布的峰值Tab4M ax-value of the distribution density of CIK cells in dif-ferent organs of nude mice(via peri toneal cavi ty)
Organ CPM P(g)T i me P(h)
Spleen17792.7?1634.58
Liver6309.8?487.24
Kidney5870.0?407.94
Intestine3769.8?263.64
Lung3426.7?539.58
Stomach2891.3?153.24 Uterus&ovar2196.0?23.34
n=5
表5CIK细胞不同输注途径对于裸鼠移植性肿瘤生长的影响
Tab5Effects of di fferent infusion ways of CIK cells on the growth of transplan tation tumor in nude mice
Group Weight of tumor P(g)Inhi bitory rate of tumor P(%)
Control 1.15?0.23-
Peritoneal cavi ty inj.0.96?0.1716.5 Tail vei n inj.a0.65?0.1443.5
Peri tumor inj.a0.54?0.1853.0
n=5;a)P<0.05,compare with control
显抑制皮下移植肿瘤的生长,而腹腔注射组与对照组比较差异无显著性。
#
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#免疫学杂志第23卷
图1 同位素标记CIK 细胞经尾静脉输注后在各器官
分布密度的动态变化
Fig 1 Dynamic distribution density of CIK cells labeled by isotope
in different organs of nude mice (via tail
vein)
图2 同位素标记腹腔途径输注后CIK 细胞在各器官分布密度的动态变化
Fig 2 Dynamic distribution density of CIK cells labeled by isotope
in different organs of nude mice (via peritoneal
cavity)
图3 CIK 细胞治疗后肿瘤体积的变化Fi g 3 Changes of tumor bul k after CIK therapy
3 讨论
细胞原代培养和各种细胞系的建立使得学者们对于细胞在体外环境中的生物学特性有了逐渐深入的认识,但是细胞的某些特性只有在体内环境才能表现出来。因此,了解细胞在活体内的迁徙和分布规律以及其体内的生物学活性,对指导治疗具有重
要的意义。
目前关于活细胞体内示踪的研究方法越来越
多,例如同位素标记法、荧光染料标记[4]
、利用Lucif -erase 进行活体成像[5,6]
、标记特异基因及其相应蛋白产物等[7]
。本研究采用了同位素标记法,32
P -A dATP 体外标记CIK 细胞,通过核酸代谢掺入标记细胞的DNA 中将携带放射性核素的细胞导入裸鼠体内,通过定时处死实验动物将各脏器分别取出检测放射量的方法了解输注细胞的分布。其优点是灵敏度高、方法简便、定位定量准确、符合生理条件,缺点在于需要放射防护措施及方法、对生物体存在辐射效应,检测时程受核素的衰减的限制[8,9]
。其中32
P 的半衰期为14d,所以在较短的观察时段内因为核素衰变
造成的对观察指标的影响较小;32
P 标记化合物是以物质代谢原料的形式掺入细胞代谢过程,所以对标记细胞的生物活动过程不会有过多的干扰,实验结果更接近于正常的生理特点;由于放射性检测的灵敏性和易操作性,标记细胞在体内各种器官的微量分布得到了精确、及时的反映。
关于免疫活性细胞在活体内的分布迁徙规律的研究,其主要焦点集中在免疫效应细胞可否归巢于淋巴循环以及可以分布的器官以及是否对肿瘤组织选择性富集,这一过程要涉及多种趋化因子的参与,如SLC 、RANTES 等[10,11]
。本研究中,将CIK 细胞经尾静脉途径注射后,细胞迅速分布到各个脏器,分布浓度较高的器官为脾、肾、肝、肺,在各观察点中,肺在注射后4h 浓度最高,但其峰值低于脾,考虑可能是由于第1个观察时点设定偏后错过了肺内积聚高峰,脾内高浓度聚集可能与其属于免疫器官和免疫细胞的归巢特性有关,过继免疫细胞在肝、肾的较多分布应该与丰富的血液供应有关。本研究还发现,尽管相对分布浓度较低,移植细胞在胃肠组织中也有可测量的分布。既往的关于过继免疫细胞的同类研究主要以LAK 细胞、TI L 细胞P LNL 细胞、CD3AK 细胞等为研究对象,关于CIK 细胞的此类研究相对较少。本研究中外周静脉途径使用CIK 细胞其体内
的分布特征与其他免疫效应细胞的分布特征还是基本相似的,外周静脉静脉输注后过继细胞首先进入肺脏,2~6h 出现在肺内积聚达到高峰,而后肺内浓度逐渐下降,迅速出现的二次分布使肝、肾、脾的积聚高峰稍晚于肺而出现,24h 后分布趋于稳定。类似于药物的首过效应,过继免疫细胞在最先经过的器官获得最大限度的截留,并且最早达到积聚峰值。本研究中肺内第一观测时点的峰值与其他器官比高的不明显,与观察时点设置偏后有关,此时肺内浓度已经处于下降趋势;与大多数研究一致,CIK 细胞作
#
419#第4期 李 慧,等1不同输注途径对CIK 细胞体内分布和抑瘤作用的影响
为一种过继免疫治疗细胞经外周静脉途径输注后可以广泛地分布至大多数器官组织,分布的多少与血运的丰富程度、器官的免疫属性和流经次序有关[12,13]。
本研究中经腹膜腔途径应用标记CIK细胞,结果表明腹腔内移植的CIK细胞并不只局限于输注部位,在注射后4h即可在肺等非腹膜腔内器官达到较高浓度的分布,并且在观察末期腹腔和尾静脉途径输注的CIK细胞在器官分布上的区别已经不甚明显。国内类似的研究相对较少,葛薇等[14]将C M-DiI 标记的CIK细胞经腹腔注入Balb P c裸鼠体内后,1周后仍可以在裸鼠脾脏、淋巴结和肿瘤组织内检测到标记细胞的存在。关于移植细胞经腹腔进入全身血液和淋巴循环的机制目前尚不明确,但腹膜腔途径应用CIK细胞后,首过直接效应必然导致初期腹膜腔内治疗细胞的最大限度富集,而有文献表明过继免疫治疗细胞在注入早期治疗效果最明显,所以我们有理由认为CIK细胞等免疫效应细胞的体腔途径输注可以用于恶性胸腹水或局限体腔恶性病变的治疗。
本研究还比较不同途径注射CI K细胞对裸鼠体表移植瘤的抑制作用,发现瘤周局部注射的效果最明显,表明瘤周注射导致肿瘤局部CI K细胞早期高度积聚并与肿瘤细胞直接接触,获得最大限度的效靶比;尾静脉途径的抑瘤作用弱于瘤周注射而强于腹腔注射,结合CIK细胞的体内分布规律,可以考虑为尾静脉途径使肿瘤组织相对较早、较多的接触效应细胞;腹腔途径应用CIK细胞与对照相比抑瘤作用不明显,但一定程度上的肿瘤生长抑制提示这种途径应用的CIK细胞同样具有全身作用,可能是CI K细胞相对滞后或相对较少地到达位于体表的肿瘤部位,也可能是CI K细胞通过免疫调节作用或者分泌细胞因子所发挥的抑瘤效应。
CIK细胞抗肿瘤作用的有效发挥,依赖于免疫活性细胞在肿瘤局部的富集,并保持其生物学活性。通过本研究探讨了不同输注途径对CIK细胞体内迁徙规律和抑瘤作用的影响,提示对于不同部位的肿瘤可以选择不同的输注方式,以期得到更好的治疗效果,从而为临床治疗提供了依据。
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(编辑李海鸥)
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#免疫学杂志第23卷