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分子克隆技术试卷

分子克隆技术试卷

分子克隆技术

一、填空题

1.PCR反应中加入矿物油的作用是___________________________。

2.分子克隆实验中外源DNA和载体片段连接之前,要对载体进行去磷酸化处理,我

们在本次试验中去磷酸化使用的碱性磷酸酶是___________________________。它

的目的是___________________________。

3.用α互补筛选转化子是,带有外源片段的菌落显___________________________色。

4.Southern杂交中进行与杂交的目的是___________________________。

5.凝胶糖凝胶电泳时加入loading buffer作用是___________________________和

___________________________。

6.影响琼脂糖凝胶电泳的因素主要有___________________________、

___________________________、___________________________、

___________________________、___________________________。

二、简答题

1.简述PCR反应体系中都有哪些成分及各成分的作用。

2.为得到质量较好的水稻RNA,抽提前应做如何准备?RNA抽提过程中、RNA的

保存及以后对RNA的操作过程中应特别注意什么?

3.简述为防止放射性同位素外照射及内照射对人体造成伤害,在操作放射性同位素

时,我们可以采取哪些措施进行防护?

4.简述影响电转化感受态细胞转化效率的因素有哪些?

5.质粒抽提时用到的SolutionI,SolutionII,SolutionIII及异丙醇分别起什么作用?操

作时应注意什么?

三、分析问答题

1.描述并图示pUC19载体DNA及其在HindIII位点克隆了外源DNA片段的质粒DNA

和水稻总DNA及它们的HindIII和BamH1酶切产物在琼脂糖凝胶电泳时的带型。

2.利用质粒载体克隆外源DNA片段主要包括哪些步骤?涉及到哪些工具酶?要获得

理想的结果,各步骤操作中应主要注意哪些事项?

3.在Southern杂交实验中,同一根杂交管内的膜曝光的····(原卷此处不清晰)冲

洗后,有些组X光片信号很强,有些组信号很弱,有的样品点样孔附近有较强的

信号,但是有的地方信号较弱,请分析造成这种结果的可能原因。

4.下面是本次课生物技术班某组β-active基因RT-PCR(反转录前没有对总RNA进

行去除DNA 的处理)试验的琼脂糖凝胶电泳图,凝胶上共点了6个样,PCR使用

的模板从左至右分别是:该组提取的水稻总DNA,该组提取的水稻总RNA,该组

的4个反转录产物。(原卷本题图不清晰)

请问:

提取的RNA的质量如何?

RT-PCR是否成功?为什么会出现这样的结果?

有哪些地方需要改进?

分子克隆全过程

本文以大肠杆菌DH10B为例介绍外源基因在大肠杆菌中表达全过程 克隆步骤包括:模板制备(基因组DNA提取)-感受态细胞的制备-PCR-纯化回收-酶切-连接-转化-挑菌摇菌-质粒抽提-酶切鉴定-测序 1) 基因组DNA提取(以家蚕为例) 1. 取家蚕五龄后部丝腺约0.5g,于10ml匀浆器内,加2mlDNA抽提缓冲液,在 冰上充分研磨,转入5ml的离心管; 2. 加入RnaseA(10ul)至终浓度20ug/ml,37℃水浴1h; 3. 加入ProteinaseK(25ul)至终浓度100ug/ml,55℃水浴2h; 4. 分装到1.5ml eppendorff管,0.6ml/管; 5. 加入等体积的平衡酚(pH8.0),充分混匀,5000g,15min,取上清; 6. 重复5,再抽提1次; 7. 用等体积的酚/氯仿(1/1,v/v),氯仿各抽提1次 8. 将上清移入新离心管,加入1/10体积的3mol/L NaAc(pH 5.2),2倍体积的 无水乙醇,充分混匀,4℃过夜 9. 用牙签将絮状沉淀物挑出。用75%冰酒精洗涤3次,37℃控干; 10. 200μl 0.1 TE(pH8.0)溶解DNA; 11. 检测OD值; 12. 做好标记,以供进一步实验之用。 2) 感受态细胞的制备 1. -20℃冻藏的DH10B甘油菌在LB平板上复苏(划板),37℃,8-12小时; 2. 用灭菌牙签挑取单菌落,放入3ml LB培养基中,37℃振荡培养过夜; 3. 取100μl过夜培养物接种到另一3 ml LB培养基中,37℃振荡培养2~2.5 h, 使OD值在0.6左右(把握好浓度,OD值可以不用测);将菌液分装到1.5ml EP 管中(在超净台完成) 4. 5000 g离心4 min收集菌体,将菌体重悬于800 μl 75 mmol/L冷CaCl2中, 冰浴30 min;(CaCl2要用高纯度的,切记!) 5. 4℃,5 000 g离心4 min,弃上清; 6. 加入200μl 75 mmol/L冷CaCl2,轻轻敲打管壁,使混合均匀,冰上放4 h 后用于转化,或加0.1倍体积甘油混匀,-70℃保存备用。可以保存至少6个月。 3) PCR 1、PCR反应体系: ddH2O 37.7 μL 10×PCR buffer 5 μL (25mM) dNTP 4 μL 引物1/2 1μL/1μL Taq酶 0.3μL 模板 1μL PCR反应体系总体积 50 μL 充分混匀,稍离心。 2、PCR反应条件

分子克隆技术试卷

分子克隆技术 一、填空题 1.PCR反应中加入矿物油的作用是___________________________。 2.分子克隆实验中外源DNA和载体片段连接之前,要对载体进行去磷酸化处理,我 们在本次试验中去磷酸化使用的碱性磷酸酶是___________________________。它 的目的是___________________________。 3.用α互补筛选转化子是,带有外源片段的菌落显___________________________色。 4.Southern杂交中进行与杂交的目的是___________________________。 5.凝胶糖凝胶电泳时加入loading buffer作用是___________________________和 ___________________________。 6.影响琼脂糖凝胶电泳的因素主要有___________________________、 ___________________________、___________________________、 ___________________________、___________________________。 二、简答题 1.简述PCR反应体系中都有哪些成分及各成分的作用。 2.为得到质量较好的水稻RNA,抽提前应做如何准备?RNA抽提过程中、RNA的 保存及以后对RNA的操作过程中应特别注意什么? 3.简述为防止放射性同位素外照射及内照射对人体造成伤害,在操作放射性同位素 时,我们可以采取哪些措施进行防护? 4.简述影响电转化感受态细胞转化效率的因素有哪些? 5.质粒抽提时用到的SolutionI,SolutionII,SolutionIII及异丙醇分别起什么作用?操 作时应注意什么? 三、分析问答题 1.描述并图示pUC19载体DNA及其在HindIII位点克隆了外源DNA片段的质粒DNA 和水稻总DNA及它们的HindIII和BamH1酶切产物在琼脂糖凝胶电泳时的带型。 2.利用质粒载体克隆外源DNA片段主要包括哪些步骤?涉及到哪些工具酶?要获得 理想的结果,各步骤操作中应主要注意哪些事项? 3.在Southern杂交实验中,同一根杂交管内的膜曝光的····(原卷此处不清晰)冲 洗后,有些组X光片信号很强,有些组信号很弱,有的样品点样孔附近有较强的 信号,但是有的地方信号较弱,请分析造成这种结果的可能原因。 4.下面是本次课生物技术班某组β-active基因RT-PCR(反转录前没有对总RNA进 行去除DNA 的处理)试验的琼脂糖凝胶电泳图,凝胶上共点了6个样,PCR使用 的模板从左至右分别是:该组提取的水稻总DNA,该组提取的水稻总RNA,该组 的4个反转录产物。(原卷本题图不清晰) 请问: 提取的RNA的质量如何? RT-PCR是否成功?为什么会出现这样的结果? 有哪些地方需要改进?

分子克隆——主要步骤

笔记3(分子克隆2——主要步骤) 分子克隆可以分为以下几个步骤: 分离制备待克隆的DNA片段————将靶DNA片段与载体在体外进行连接————重组DNA分子转入宿主细胞————筛选、鉴定阳性重组子————重组子的扩增。 1.带有目的基因的DNA片段的获得: 可以用限制内切酶降解基因组DNA,再配合使用其他实验手段得到待定的DNA片段,可以用超速离心的方法分离出具有特定核苷酸组成的DNA片段,可以用mRNA做模板,用反转录酶合成互补DNA,即cDNA,也可以用化学合成的方法直接合成一段DNA。 2.重组DNA分子的构建: 重组DNA分子中包括两部分,一部分是外源DNA,即目的DNA片段,另一部分是载体DNA。用作载体的,有质粒、噬菌体或病毒DNA。它们的基本特征是能够独立复制。如果用同一种限制性内切酶切割这两种DNA,则它们的末端完全相同,由于有互补的单链末端序列存在,在连接酶的作用下,就可以形成重组DNA 分子。在没有互补单链末端的情况下,也可以用酶学方法造成一个互补单链末端之后再进行连接。

3.重组DNA分子的转化和重组克隆的筛选: 重组DNA分子必须进入宿主细胞中,才能得到扩增和表达.这个过程叫做转化。大肠杆菌是目前使用最广泛的宿主细胞。除此以外.其他细菌、酵母、哺乳动物细胞等也可作为宿主细胞,可以根据实验的需要加以选择。在被转化的宿主细胞中,不同的单个细胞(在平板上表现为单个菌落,亦称克隆)中可能含有不同的重组质粒或非重组质粒,因此必须进行筛选,以便确定哪些是重组克隆。筛选可以使用抗菌素抗性或其他方法,依载体的性质而定。 4.特定重组克隆的鉴别: 由于重组克隆往往是较多的,而在某一克隆实验中,我们感兴趣的目的克隆只有一个或几个,所以需要进一步鉴别。使用的方法主要有核酸杂交法和免疫化学法。 此外,找出了目的克隆之后,还需要根据实验的目的,进一步弄清目的克隆中外源DNA片段上的基因的结构和功能。主要有酶切图谱的制定,基因在DNA 片段上的精确定位,确定是否有内含子,DNA序列分析,离体翻译实验,外源基因在某些宿主细胞中的表达及产物的提纯等。

分子克隆技术步骤

分子克隆技术步骤 在分子水平上提供一种纯化和扩增特定DNA 片段的方法。常含有目的基因,用体外重组方法将它们插入克隆载体,形成重组克隆载体,通过转化与转导的方式,引入适合的寄主体内得到复制与扩增,然后再从筛选的寄主细胞内分离提纯所需的克隆载体,可以得到插入DNA 的许多拷贝,从而获得目的基因的扩增。 克隆在生物学中其名词含义系指一个细胞或个体以无性繁殖的方式产生一群细胞或一群个体,在不发生突变的情况下,具有完全相同的遗传性状,常称无性繁殖( 细胞)系;其动词(clone,cloned,cloning) 含义指在生物体 外用重组技术将特定基因插入载体分子中,即分子克隆技术。 将DNA 片段( 或基因)与载体DNA 分子共价连接,然后引入寄主细胞,再筛选获得重组的克隆,按克隆的目的可分为DNA 和cDNA 克隆两类。 cDNA 克隆是以mRNA 为原材料,经体外反转录合成互补的DNA(cDNA) ,再与载体DNA 分子连接引入寄主细胞。每一cDNA 反映一种mRNA 的结构,cDNA 克隆的分布也反映了mRNA 的分布。特点是:①有些生物,如RNA 病毒没有DNA ,只能用cDNA 克隆; ②cDNA 克隆易筛选,因为cDNA 库中不包含非结构基因的克隆,而且每一cDNA 克隆只含一个mRNA 的信息; ③cDNA 能在细菌中表达。cDNA 仅代表某一发育阶段表达出来的遗传信息,只有基因文库才包含一个生物的完整遗传信息。 1. 方法: (1) DNA 片段的制备:常用以下方法获得DNA 片段:①用限制性核酸内切酶将高分子量DNA 切成一定大小的DNA 片段; ②用物理方法( 如超声波) 取得DNA 随机片段;③在已知蛋白质的氨基酸顺序情况下,用人工方法合成对应的基因片段;④从mRNA 反转录产生cDNA 。 (2) 载体DNA 的选择: ①质粒:质粒是细菌染色体外遗传因子,DNA 呈环状,大小为1-200 千碱基对(kb) 。在细胞中以游离超螺旋状存在,很容易制备。质粒DNA 可通过转化引入寄主菌。在细胞中有两种状态,一是“紧密型”;二是“松驰型”。此外还应具有分子量小,易转化,有一至多个选择标记的特点。质粒型载体一般只能携带10kb 以下的DNA 片段,适用于构建原核生物基因文库,cDNA 库和次级克隆。 ②噬菌体DNA :常用的λ噬菌体的DNA 是双链,长约49kb,约含50 个基因,其中50% 的基因对噬菌体的生长和裂解寄主菌是必需的,分布在噬菌体DNA 两端。中间是非必需区,进行改造后组建一系列具有不同特点的载体分子。λ载体系统最适用于构建真核生物基因文库和cDNA 库。 M13 噬菌体是一种独特的载体系统,它只能侵袭具有 F 基因的大肠杆菌,但不裂解寄主菌。M13DNA(RF) 在 寄主菌内是双链环状分子,象质粒一样自主制复,制备方法同质粒。寄主菌可分泌含单链DNA 的M13 噬菌体,又能方便地制备单链DNA ,用于DNA 顺序分析、定点突变和核酸杂交。 ③拷斯(Cos) 质粒:是一类带有噬菌体DNA 粘性末端顺序的质粒DNA 分子。是噬菌体-质粒混合物。此类载体分子容量大,可携带45kb 的外源DNA 片段。也能象一般质粒一样携带小片段DNA ,直接转化寄主菌。这类载体常被用来构建高等生物基因文库。 (3) DNA 片段与载体连接:DNA 分子与载体分子连接是克隆过程中的重要环节之一,方法有:①粘性末端连接,DNA 片段两端的互补碱基顺序称之为粘性末端,用同一种限制性内切酶消化DNA 可产生相同的粘性末端。在连接酶的作用下可恢复原样,有些限制性内切酶虽然识别不同顺序,却能产生相同末端。②平头末端连接,用物理方法制备的DNA 往往是平头末端,有些酶也可产生平头末端。平头DNA 片段可在某些DNA 连接酶作用下连接起来,但连接效率不如粘性末端高;③同聚寡核苷酸末端连接。④人工接头分子连接,在平头DNA 片段末端加上一段人工合成的、具有某一限制性内切酶识别位点的寡核苷酸片段,经限制性内切酶作用后就会产生粘性末端。 连接反应需注意载体DNA 与DNA 片段的比率。以λ或Cos 质粒为载体时,形成线性多连体DNA 分子,载体与DNA 片段的比率高些为佳。以质粒为载体时,形成环状分子,比率常为1∶1。 (4) 引入寄主细胞:常用两种方法:①转化或转染,方法是将重组质粒DNA 或噬菌体DNA(M13) 与氯化钙处 理过的宿主细胞混合置于冰上,待DNA 被吸收后铺在平板培养基上,再根据实验设计使用选择性培养基筛选重组子,通常重

常用分子克隆实验方法

常用分子克隆实验方法I 一、植物总DNA的小量提取 方法1:提取吸附法。无须巯基乙醇、氯仿等有毒物质,产物无须Rnase处理。 (1)充分研磨。称取约0.2克植物组织,加入液氮充分研磨3-5min,稍后加约1ml溶液 A,继续研磨至略粘稠的组织匀浆,用大口1ml吸头将所有溶液移至1.5ml离心管 中,55℃水浴30min; (2) 高速离心去杂质。10,000rpm离心5min,取约600ul上清至新1.5ml离心管; (3) 核酸吸附。往上清液中加入1倍的异丙醇,轻轻混匀,再加入总体积1/4已混匀的 溶液B,静置3min; (4) 低速离心沉淀。5000rpm离心1min,轻轻倒掉上清,并用吸水纸轻吸离心管口, 再用移液枪吸走大部分残余液体; (5) 75%乙醇清洗。加入1ml75%乙醇,5000rpm离心30s,轻轻倒掉上清,用吸水纸稍 吸离心管口。重复该步骤一次,再5000rpm离心30s,然后用移液枪吸走管底的残 液,晾干5min; (6) 核酸洗脱。加入约55ul TE(PH8.0)至管底,轻轻重悬硅土,静置3min,10,000rpm 离心1min,用小枪头轻轻吸取出50ul管底溶液,冷藏。 方法2:CTAB法,此为在经典方法基础上,经过摸索改进,提高了得率,减少了污染。 (1)充分研磨。称取约0.2克植物组织,加入液氮充分研磨3-5min,稍后加约1ml CTAB 提取液,继续研磨至略粘稠的组织匀浆,用大口1ml吸头移至1.5ml离心管,65℃ 水浴30-60min。 (2) 氯仿抽提。10,000rpm离心3min,取约600ul上清。加入1倍的氯仿,轻轻混匀, 10,000rpm离心3min,取上清再抽提1遍。 (3) 核酸沉淀。加入预冷的1倍异丙醇或2倍乙醇,轻混匀,6000rpm离心3min,弃 上清。 (4) 清洗沉淀。轻加入1ml 75%乙醇,再吸掉上清,重复一次,倒置于吸水纸或横放于 离心管架上晾干5min。 (5) 溶解DNA。加50ul含Rnase A(约10ug/ml)的TE,常温下放置30min。取约3-5ul 电泳检测后,低温冷藏。

浅谈生物克隆技术及其未来应用问题与前景

浅谈生物克隆技术及其未来应用问题与前景 肖婷2012333500202 浙江理工大学经管学院工商管理专业 指导老师:解纯刚浙江理工大学生科学院 【摘要】:随着生命科学时代的到来,基因研究已经取得了巨大的进展,克隆技术特别是人的克隆技术作为基因研究的重要组成部分,愈来愈引起社会各界的广泛关注。克隆技术作为人类的创造性活动,有其产生和存在的合理性,在诸多领域蕴藏巨大的应用潜力与巨大应用价值和广阔的发展前景。但克隆技术目前仍存在一些问题,如克隆技术对社会伦理和人类健康的影响。人类克隆技术的进步为人类带来的利益是巨大的,因而它的发展是难以阻止的。应对人类克隆技术带来的巨大挑战。 【关键词】:克隆技术;利弊;社会影响;应用前景 一、克隆是什么? 克隆是英文Clone一词的音译,意为无性繁殖系,即通过无性繁殖(如细胞丝分裂)可连续传代并形成的群体,常用于细胞水平的描述。克隆的定义是指独立细胞繁殖系,指后代完全由一个细胞复制,具有完全相同的物遗传质。 一个细菌经过20分钟左右就可一分为二;一根葡萄枝切成十段就可能变成十株葡萄;仙人掌切成几块,每块落地就生根;一株草莓依靠它沿地“爬走”的匍匐茎,一年内就能长出数百株草莓苗。凡此种种,都是生物靠自身的一分为二或自身的一小部分的扩大来繁衍后代,这就是无性繁殖。时至今日,“克隆”的含义已不仅仅是“无性繁殖”,凡来自一个祖先,经过无性繁殖出的一群个体,也叫“克隆”。 自然界的许多动物,在正常情况下都是依靠父方产生的雄性细胞(精子)与母方产生的雌性细胞(卵子)融合(受精)成受精卵(合子),再由受精卵经过一系列细胞分裂长成胚胎,最终形成新的个体。这种依靠父母双方提供性细胞、并经两性细胞融合产生后代的繁殖方法就叫做有性繁殖,但是,如果我们用外科手术将一个胚胎分割成两块,四块、八块……最后通过特殊的方法使一个胚胎长成两个、四个,八个……生物体,这些生物体就是克隆个体,而这些个体就叫做无性繁殖系。 二、克隆技术是什么? 克隆技术是利用生物技术由无性生殖产生与原个体有完全相同基因组织后代的过程。科学家把人工遗传操作动物繁殖的过程叫克隆,这门生物技术叫克隆技术,含义是无性繁殖。

克隆技术的发展与应用前景

克隆技术的发展及应用前景 克隆通常是一种人工诱导的无性生殖方式或者自然的无性生殖方式(如植物)。一个克隆就是一个多细胞生物在遗传上与另外一种生物完全一样。克隆可以是自然克隆,例如由无性生殖或是由于偶然的原因产生两个遗传上完全一样的个体(就像同卵双生一样)。但是通常所说的克隆是指通过有意识的设计来产生的完全一样的复制。克隆技术在现代生物学中被称为“生物放大技术”,它已经历了三个发展时期:第一个时期是微生物克隆,即用一个细菌很快复制出成千上万个和它一模一样的细菌,而变成一个细菌群;第二个时期是生物技术克隆,比如用遗传基因――DNA克隆;第三个时期是动物克隆,即由一个细胞克隆成一个动物。克隆绵羊“多利”由一头母羊的体细胞克隆而来,使用的便是动物克隆技术。 目前,克隆技术发展十分迅速。各国政府有关人士、民间对克隆技术的评价褒贬不一。克隆技术已展示出广阔的应用前景,包括以下四个方面: (1)培育优良畜种和生产实验动物; (2)生产转基因动物; (3)生产人胚胎干细胞用于细胞和组织替代疗法; (4)复制濒危的动物物种,保存和传播动物物种资源。 在不久的将来,克隆技术技术将可以用来治疗糖尿病、中风、癌症、爱滋病、心脏病以及诸如帕金森综合症等精神疾病,并极大改变现有的器官移植理论和治疗手段,给人类带来福音。 克隆技术会给人类带来极大的好处,例如,英国PPL公司已培育出羊奶中含有治疗肺气肿的a-1抗胰蛋白酶的母羊。这种羊奶的售价是6千美元一升。一只母羊就好比一座制药厂,用什么办法能最有效、最方便地使这种羊扩大繁殖呢?最好的办法就是“克隆”。同样,荷兰PHP公司培育出能分泌人乳铁蛋白的牛,以色列LAS公司育成了能生产血清白蛋白的羊,这些高附加值的牲畜如何有效地繁殖?答案当然还是“克隆”。母马配公驴可以得到杂种优势特别强的动物——骡,骡不能繁殖后代,那么,优良的骡如何扩大繁殖?最好的办法也是“克隆”,我国的大熊猫是国宝,但自然交配成功率低,因此已濒临绝种。如何挽救这类珍稀动物?“克隆”为人类提供了切实可行的途径。具体应用有以下几个方面: 转基因动物研究 转基因动物研究是动物生物工程领域中最诱人和最有发展前景的课题之一,转基因动物可作为医用器官移植的供体、作为生物反应器,以及用于家畜遗传改良、创建疾病实验模型等。但转基因动物的实际应用并不多,除单一基因修饰的转基因小鼠医学模型较早得到应用外,转基因动物乳腺生物反应器生产药物蛋白的研究时间较长,已进行了10多年,但在全世界范围内仅有2例药品进入3期临床试验,5~6个药品进入2期临床试验;而其农艺性状发生改良、可资畜牧生产应用的转基因家畜品系至今没有诞生。转基因动物制作效率低、定点整合困难所导致的成本过高和调控失灵,以及转基因动物有性繁殖后代遗传性状出现分离、难以保持始祖的优良胜状,是制约当今转基因动物实用化进程的主要原因。 体细胞克隆 体细胞克隆的成功为转基因动物生产掀起一场新的革命,动物体细胞克隆技术为迅速放大转基因动物所产生的种质创新效果提供了技术可能。采用简便的体细胞转染技术实施目标基因的转移,可以避免家畜生殖细胞来源困难和低效率。同时,采用转基因体细胞系,可以在实验室条件下进行转基因整合预检和性别预选。在核移植前,先把目的外源基因和

分子克隆以及蛋白纯化流程

RNA提取 ①取TRIZOL冻存裂解的细胞,室温放5分钟使其完全溶解。 ②两相分离,每1ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2ml的氯仿,盖紧管盖。 手动剧烈振荡管体15秒后,15到30℃孵育2到3分钟。 4℃下12000rpm离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相,中间层以及无色水相上层。 RNA全部被分配于水相中。水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL试剂的60%。 ③RNA沉淀:将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中。 加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA,混匀后15到30℃孵育10分钟后,于4℃下12000rpm 离心10分钟。 此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。 ④RNA清洗:移去上清液,每1mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1ml的75%乙醇(75%乙醇用DEPCH2O配制),清洗RNA沉淀。混匀后,4℃下7000rpm离心5分钟。 ⑤RNA干燥:小心吸去大部分乙醇溶液,使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。 ⑥溶解RNA沉淀:溶解RNA时,先加入无RNA酶的水40μl用枪反复吹打几次,使其完全溶解,获得的RNA溶液保存于-80℃待用。 逆转录 1.First-strand cDNA synthesis 体系oligo(DT) 50uM 1ul 10pg-500ng mRNA 10ul Random primer 1ul dNTP mix (10mM) 1ul

2.65°C,5min后冰上孵育至少1min 3. 稍微离心后,加入 5Xfirst-strand buffer 4ul DTT(0.1M) 1ul RNase out Recombinant RNase Inhibitor 1ul Superscript IIIRT 1ul 4.PCR 25°C,10min;42°C,50min;70°C,5min;4°C 10min PCR 1. DNA 模板2ul 正向引物2ul 反向引物2ul 2×Taq PCR star mix 20ul ddH20 14ul 条件 94°C 5min 94°C 30S 55-65°C 30S 72°C 30-60s/kb 72°C 5min 25-30个cycles

克隆技术及其应用_陈大元

科技与社会 克隆技术及其应用 陈大元 (中国科学院动物研究所生殖生物学国家重点实验室 北京 100080) 摘要 “克隆”的含义是无性繁殖,即由同一个祖先细胞分裂繁殖而形成的纯细胞系,这个细胞系中每个细胞的基因彼此是相同的。动物克隆,就是指通过无性繁殖由一个细胞产生一个和亲代遗传性状一致,形态非常相像的动物。随着动物克隆研究的发展、克隆技术将广泛应用于医学、畜牧业和濒危动物保护等领域。 关键词 克隆,动物,胚胎细胞, 体细胞 “克隆”是“clone” 的音译,其含义是无性 繁殖,即由同一个祖先 细胞分裂繁殖而成的 纯细胞系,该细胞系中 每个细胞的基因彼此 是相同的。动物克隆, 就是指通过无性繁殖 由一个细胞产生一个 和亲代遗传性状一致、形态非常相像的动物。 科学家们很早就开始了动物克隆的研究。早在1938年,德国胚胎学家Sp emann即提出“奇异的实验”的设想。1952年,英国科学家Briggs和King 首次报道了蛙的核移植研究。1962年,英国剑桥大学的Gurdon获得了成年蛙。我国已故科学家童第周教授在20世纪60—70年代曾用囊胚细胞进行鱼类细胞核移植工作,获得属间和种间移核鱼,使我国鱼类核移植研究居世界领先水平。 早期的动物克隆研究仅限于两栖类和鱼类,直到20世纪80年代,核移植克隆技术才开始应用于哺乳动物。根据供核细胞的不同,可将动物克隆研究分为三个阶段: 1 胚胎细胞克隆阶段 1981年,Illmensee和Hop pe报道了他们用小鼠的正常囊胚或孤雌活化囊胚的内细胞团细胞作为核供体,直接注入去掉雌雄原核的受精卵胞质中,重构胚体外发育到桑葚胚或囊胚后移植寄母子宫,获得克隆小鼠,这是第一次用胚胎细胞对哺乳类进行核移植获得成功。1983年,美国科学家利用核移植技术和细胞融合方法获得了克隆小鼠。1986年,英国的Willadsen用绵羊的8—16细胞阶段的胚胎细胞作为供体进行核移植,首次应用电融合的方法克隆出一只小羊。此后,科学家们又相继克隆出小鼠、绵羊、牛、兔、猪和猴等。我国科学家也在20世纪90年代成功开展了胚胎细胞克隆兔、山羊、小鼠、牛和猪等研究。 2 同种体细胞克隆阶段 1997年2月,英国罗斯林研究所Wilmut等人宣布,他们用6岁成年羊的高度分化的乳腺细胞进行了核移植,成功地获得了克隆羊“多莉”[10]。这是第一次用成年体细胞作为供核细胞,由此说明高度分化的成年动物的体细胞可在适当条件下发生逆转,  2002年中 国 科 学 院 院 刊第3期 收稿日期:2002年4月25日 DOI:10.16418/j.issn.1000-3045.2002.03.005

分子克隆及细胞培养基本实验方法

分子克隆及细胞培养基本实验方法 1.载体构建实用操作技术 1.1菌种的保存—20%甘油菌 2体积菌液与1体积70%的甘油混合后,储存于-20℃或-70℃备用。(甘油菌中甘油的浓度为20-30%均可) 1.2甘油菌复苏、培养 方法一、挑取甘油菌一环,接种在含100ug/ml Amp的LB固体培养基上(活化菌种),37℃培养过夜(约16小时);挑取一个菌落转接在含100ug/ml Amp 的LB液体培养基中,37℃振荡过夜(约12~16小时)。 方法二、直接吸取10~20ul甘油菌,接种在含100ug/ml Amp的LB液体培养基中,37℃振荡过夜(约12~16小时)。 1.3小规模制备质粒DNA(QIA miniprep kit ) 适于从1~5ml 菌液中制备20ug高拷贝质粒 ⑴收集菌液,离心1000rpm,1分,弃上清 ⑵以250ul P1重悬细菌(P1中已加RNase) ⑶加入250ul P2,颠倒4~6次轻混,约2~3分(轻混以免剪切基因组DNA,并免 长时间消化) ⑷加入350ul N3,迅速颠倒4~6次轻混;离心10分,13 000rpm ⑸上清入QIAprep柱,离心30~60秒,滤液弃之 ⑹加入0.5ml PB洗,离心30~60秒 ⑺加入0.75ml PE洗,离心30~60秒,弃滤液,再离心1分 ⑻换新管,加入50ul EB,静置1分(EB 37℃预热),离心1分。 1.4酶切反应 ⑴体系构成(反应体系尽可能小!) pGEM3ZF-huCTLA4-Ig(ul)pAdTrack-CMV(ul)

①dd.H2O 17 17 ②10×NEbuff 2 3 3 ③10×BSA 3 3 ④底物DNA 5 5 ⑤内切酶HindⅢ 1 1 XbaⅠ 1 1 Total : 30 ul 30ul ⑵37℃水浴1~2小时,必要时延长酶切时间至12小时 ⑶酶切2小时后,取5-10ul 电泳观察酶解是否完全 ⑷65℃灭活内切酶 ⑸-20℃保存备用 1.5回收目的片段(QIAquick Gel extraction Protocol) ⑴胶,尽可能去除多余的胶,称重; ⑵加入适量buff QG(300ul QG /100mg胶);>2%的胶,应加大QG用量(600ul QG /100mg); ⑶水浴50℃,10min,每2-3min混匀一次,使胶完全溶解!必要时延长水浴时间, 胶完全溶解后混合物颜色应为黄色,与buff QG 相似; ⑷当DNA片段在<500bp或>4kb时,应加入异戊醇100ul/100mg胶,以提高产物 量。此步不离心。DNA片段在500bp~4kb时,加入异戊醇并不能提高产量; ⑸结合:将混合物转入QIAquick柱,离心13000rpm,1min;(柱容量800ul/次); ⑹洗:0.75ml buff PE,离心13000rpm,1min;(DNA用于盐敏感操作时,如平 端连接、直接测序,加入PE后静置2-5min);弃离心液,再离心13000rpm, 1min,以去除剩余的乙醇; ⑺将QIAquick柱置于一清洁的1.5ml Ep管,加入30~50ul buff EB或H2O (滴 于QIAquick 膜上!),静置1min,离心15000rpm,1min; ⑻-20℃保存备用。 1.6连接反应

克隆技术及其应用与发展

克隆技术及其应用与发展 目前克隆技术、基因工程研究正突飞猛进向前发展,基因概念及其理论的建立,打开了人类了解生命并控制生命的窗口。基因研究已成为当前科学研究中最有决定性的领域之一,成为推动生物、食品和制药产业发展的引擎。众所周知,20世纪遗传学的发展举世瞩目,由于遗传学的发展,科学的社会功能以及社会对科学的制约更受关注,从试管婴儿到克隆技术再到人类基因图谱的绘制无不牵动着世人的心。21世纪是生物技术革命的世纪,克隆技术的应用将促进遗传学,细胞发育生物学,产科学等学科的研究进展,有利于整个世界的科学进步和生活质量的提高,对人类的生活将会产生深远的影响。 克隆、克隆技术 以及克隆的基本过程 “克隆”一词源于“Clone”的音译,指的是人工诱导动、植物的无性繁殖过程,这门生物技术就叫克隆技术。无性繁殖是指不经过雌雄两性生殖细胞的结合,只由一个生物体产生后代的生殖方式,如:由植物的根、茎、叶等经过压条或嫁接等方式产生新个体。绵羊、猴子和牛等动物没有人工操作是不能进行无性繁殖的。克隆的基本过程是先将含有遗传物质的供体细胞的核移植到去除了细胞核的卵细胞中,利用微电流刺激等使两者融合为一体,然后促使这一新细胞分裂繁殖发育成胚胎,当胚胎发育到一定程度后再被植入动物子宫中使动物怀孕便可产下与提供细胞者基因相同的动物。这一过程中如果对供体细胞进行基因改造,那么无性繁殖的动物后代基因就会发生相同的变化。我们可将其研究或操作的对象分为基因克隆、细胞克隆和个体克隆三大类。 基因克隆是指在分子(DNA)水平上开展研究工作以获得大量的相同基因及其表达产物。 细胞克隆则是在细胞水平上开展研究工作以获得大量相同的细胞。 个体克隆则是经过一系列的操作产生一个或多个与亲代完全相同的个体,这种克隆所用的生物材料可能是一个细胞,也可能是一个组织。可以看出,基因克隆、细胞克隆和个体克隆是在三个不同的层次上开展的研究工作,以原有的基因或细胞或生物个体作为模板,复制出多个与原来模板完全相同的基因或细胞或生物个体来。这就有点像大家利用复印机复印资料,或用胶片冲洗照片一样,从原有的资料或底片复制出许多完全一样的资料或照片来。但实际上并非复制胚胎,只是从成年人体内的一个细胞抽取当中包含的基因资料,然后将植入一个没有核子的卵子细胞内,通过体外受精的方法使这个新细胞发育成一个胚胎。例如小羊多利就是利用体细胞进行细胞核移植而克隆成功的,多利羊的产生与三只母羊有关,其克隆过程如下:科学家选取了三只母羊,先将一只母羊的卵细胞中所有遗传物质吸出,然后将另一只6岁母羊的乳腺细胞与之融合,形成一个含有新遗传物质的卵细胞,并促使它分裂发育成胚胎,当这一胚胎生长到一定程度时再将它植入第三只母羊的子宫中,由它孕育并产下克隆羊多利,出生的“羊多”小绵羊与6岁母羊具有完全相同的外貌。 克隆技术在相关领域的应用 克隆的最终产物,如克隆牛、克隆鼠等都不是最重要的成果,基因克隆技术应是建立转基因动物模板的核心和关键性技术,利用转基因动物的体细胞大量复制出具有相同优良性状的个体。由于动物体细胞克隆可以复制出的数量巨大的优良个体,因此动物克隆技术可以首先应用于畜牧业育种上。通常在动物育种中所采用的方法主要是杂交育种,即把两个具有不同优良性状的雌雄个体进行交配,然后在后代中去选择人们所需要的个体。要获得一个优良品种,往往需要几年甚至几十年的时间,而且必须不断地进行育种。如果采用动物个体克隆技术,就可以大量复制出人类所需要的优良个体,还可以大大缩短育种时间和节省大量的人力、物力。克隆技术的完善为转基因动物的繁殖开辟了一条通道,应用克隆技术可以将转基因绵羊

分子克隆实验标准步骤

分子克隆实验标准步骤 一、 常规分子克隆实验流程: 二、 分子克隆实验标准步骤(含实验编号): 1. PCR 扩增目的基因(编号Clone SOP-1) 以本实验室常用酶KOD-Plus-Neo (TOYOBO )为例 体系(50ul ): 10×KOD buf 5ul dNTP(2mM) 5ul Mg 2+ 3ul Primer1 1ul Primer2 1ul Template50-200ng KOD0.5ul ddH 2O up to 50ul 程序: 95℃2min 98℃10s 58℃30s 35cycle 68℃2kb/min 68℃7min 12℃∞

2.PCR产物的琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶的制备(编号Clone SOP-2) 琼脂糖溶液的制备:称取琼脂糖,置于三角瓶中,按1%-1.5%的浓度加入相应体积的TBE或TAE缓液,将该三角瓶置于微波炉加热至琼脂糖溶解。 胶板的制备:①取有机玻璃内槽,洗净、晾干;②将有机玻璃内槽置于一水平位置模具上,安好挡板,放好梳子。在距离底板上放置梳子,以便加入琼脂糖后可以形成完好的加样孔。 ③将温热琼脂糖溶液倒入胶膜中,使胶液缓慢地展开,直到在整个有机玻璃板表面形成均匀 的胶层。④室温下静置30min左右,待凝固完全后,轻轻拔出梳子,在胶板上即形成相互隔开的上样孔。制好胶后将铺胶的有机玻璃内槽放在含有0.5~1×TAE(Tris-乙酸)或TBE(Tris-硼酸)工作液的电泳槽中使用,没过胶面1mm以上。 3.试剂盒回收DNA片段(编号Clone SOP-3) 以本实验室常用DNA凝胶回收试剂盒(天根)为例 使用前请先在漂洗液PW中加入无水乙醇,加入体积请参照瓶上的标签。 ①柱平衡步骤:向吸附柱CA2中(吸附柱放入收集管中)加入500μl平衡液BL, 12,000rpm(~13,400×g)离心1min,倒掉收集管中的废液,将吸附柱重新放回收集管中。(请使用当天处理过的柱子) ②将单一的目的DNA条带从琼脂糖凝胶中切下(尽量切除多余部分)放入干净的离心管中, 称取重量。 ③向胶块中加入等倍体积溶液PN(如果凝胶重为0.1g,其体积可视为100μl,则加入100μlPN 溶液),60℃水浴放置,其间不断温和地上下翻转离心管,以确保胶块充分溶解。如果还有未溶的胶块,可继续放置几分钟或再补加一些溶胶液,直至胶块完全溶解(若胶块的体积过大,可事先将胶块切成碎块)。 注意:对于回收<300bp的小片段可在加入PN完全溶胶后再加入1/2胶块体积的异丙醇以提高回收率;胶块完全溶解后最好将溶液温度降至室温再上柱,因为吸附柱在室温时结合DNA 的能力较强。 ④将上一步所得溶液加入一个吸附柱CA2中(吸附柱放入收集管中),室温放置2min, 12,000rpm(~13,400×g)离心30-60sec,倒掉收集管中的废液,将吸附柱CA2放入收集管中。 ⑤向吸附柱CA2中加入600μl漂洗液PW(使用前请先检查是否已加入无水乙醇), 12,000rpm(~13,400×g)离心30-60sec,倒掉收集管中的废液,将吸附柱CA2放入收集管中。 ⑥重复操作步骤⑤。 ⑦将吸附柱CA2放回收集管中,12,000rpm(~13,400×g)离心2min,尽量除尽漂洗液。将吸附 柱CA2置于室温放置数分钟,彻底地晾干,以防止残留的漂洗液影响下一步的实验。 ⑧将吸附柱CA2放到一个干净离心管中,向吸附膜中间位置悬空滴加适量洗脱缓冲液EB或 ddH2O,室温放置2min。12,000rpm(~13,400×g)离心2min收集DNA溶液。 4.酶切反应(编号Clone SOP-4) 以本实验室常用酶FastDigest restriction enzymes(Thermo)为例 双酶切体系(若是单酶切则只用加一种酶): 10×FastDigest? buffer or 10×FastDigest? Green buffer 5ul FastDigest restriction enzyme 1 0.5-1ul FastDigest restriction enzyme 2 0.5-1ul DNAN ddH2Oupto50ul 酶切体系混合均匀后置于37℃条件下反应,反应时间应大于30min,若是载体(2-3ug)至少酶切2小时。 5.酶切产物的回收(编号Clone SOP-5) 以本实验室常用Axygen?AxyPrep?PCRClean-UpKit(Axygen)为例 ①在PCR、酶切、酶标、或测序反应液中,加入3个体积的BufferPCR-A(若BufferPCR-A

克隆技术与遗传育种

.克隆技术与遗传育种 在农业方面,人们利用“克隆”技术培育出大量具有抗旱、抗倒伏、抗病虫害的优质高产品种,大大提高了粮食产量。在这方面我国已迈入世界最先进的前列。 2.克隆技术与濒危生物保护 克隆技术对保护物种特别是珍稀、濒危物种来讲是一个福音,具有很大的应用前景。从生物学的角度看,这也是克隆技术最有价值的地方之一。 3.克隆技术与医学 在当代,医生几乎能在所有人类器官和组织上施行移植手术。但就科学技术而言,器官移植中的排斥反应仍是最为头痛的事。排斥反应的原因是组织不配型导致相容性差。如果把“克隆人”的器官提供给“原版人”,作器官移植之用,则绝对没有排斥反应之虑,因为二者基因相配,组织也相配。问题是,利用“克隆人”作为器官供体合不合乎人道?是否合法?经济是否合算? 克隆技术还可用来大量繁殖有价值的基因,例如,在医学方面,人们正是通过“克隆”技术生产出治疗糖尿病的胰岛素、使侏儒症患者重新长高的生长激素和能抗多种病毒感染的干挠素,等等。 4.生长周期短,遗传性状稳定 克隆技术的应用前景: 克隆技术已展示出广阔的应用前景,概括起来大致有以下四个方面: (1)培育优良畜种和生产实验动物; (2)生产转基因动物; (3)生产人胚胎干细胞用于细胞和组织替代疗法; (4)复制濒危的动物物种,保存和传播动物物种资源。 以下就生产转基因动物和胚胎干细胞作简要说明。 转基因动物研究是动物生物工程领域中最诱人和最有发展前景的课题之一,转基因动物可作为医用器官移植的供体、作为生物反应器,以及用于家畜遗传改良、创建疾病实验模型等。但目前转基因动物的实际应用并不多,除单一基因修饰的转基因小鼠医学模型较早得到应用外,转基因动物乳腺生物反应器生产药物蛋白的研究时间较长,已进行了10多年,但目前在全世界范围内仅有2例药品进入3期临床试验,5~6个药品进入2期临床试验;而其农艺性状发生改良、可资畜牧生产应用的转基因家畜品系至今没有诞生。转基因动物制作效率低、定点整合困难所导致的成本过高和调控失灵,以及转基因动物有性繁殖后代遗传性状出现分离、难以保持始祖的优良胜状,是制约当今转基因动物实用化进程的主要原因。 体细胞克隆的成功为转基因动物生产掀起一场新的革命,动物体细胞克隆技术为迅速放大转基因动物所产生的种质创新效果提供了技术可能。采用简便的体细胞转染技术实施目标基因的转移,可以避免家畜生殖细胞来源困难和低效率。同时,采用转基因体细胞系,可以在实验室条件下进行转基因整合预检和性别预选。在核移植前,先把目的外源基因和标记基因(如LagZ基因和新霉素抗生基因)的融合基因导入培养的体细胞中,再通过标记基因的表现来

分子克隆技术实验讲义2016.3(最终版)

分子克隆技术实验讲义 黑龙江大学生命科学学院 2016年3月 甜菜M14品系BvM14-glyI基因的克隆与鉴定 一、实验目的 1、熟悉和了解目的基因克隆与鉴定的过程和方法。 2、学习和掌握质粒、T载体的特点。 3、学习和掌握TA克隆的连接体系及操作要点。 4、学习和掌握XcmⅠ酶切制备T载体的过程及方法。 5、学习和掌握CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞的原理和方法。 6、学习并掌握热激法转化技术的原理和操作步骤。 7、学习并掌握重组子鉴定和筛选的原理及蓝白筛选的原理和方法。 8、学习并掌握碱法小量制备质粒DNA的原理及操作步骤。

二、相关知识 (一)T载体的制备 pMD18-T Vector是一种高效克隆PCR产物(T-A Cloning)的商业化专用载体,由pΜC 18载体改建而成。在pΜC 18多克隆位点处的XbaⅠ和SalⅠ识别位点之间插入了Eco RⅤ识别位点,用Eco RⅤ进行酶切反应后,再左两侧的3′端添加“T”而成,可以大大提高PCR产物的连接、克隆效率。 相关知识点:(1)质粒的提取;(2)酶切;(3)PCR等。 (二)DNA的重组与连接(PCR产物的克隆) 把DNA片段从某一类型的载体无性繁殖到另一类型载体中,例如从某种质粒克隆到另一种质粒,这个过程称为亚克隆。所谓重组,就是把外源目的基因“装进”载体的过程,即DNA的重新组合。为了将目的基因重组于载体分子中,需要将载体DNA和目的基因分别进行适当处理,一般采用内切酶法将载体DNA分子切割成可与外源基因连接的线性分子,使其与相同酶切过的载体分子相互连接,彼此成为配伍末端(compatible end),以产生末端连接。现在一些生物公司也开发了针对不同插入DNA片段的专用载体,如专门用于克隆PCR产物的载体,大大方便了实验操作。 相关知识点:(1)克隆与亚克隆;(2)DNA重组;(3)内切酶;(4)粘性末端与平末端;(5)连接酶;(6)连接酶的分类及功能等。 (三)大肠杆菌感受态细胞的制备 外源基因与载体在体外连接成重组体DNA分子后,需将其导入受体细胞进行扩增和筛选,得到大量、单一的重组体分子,这就是外源基因的无性繁殖,或称为克隆。受体细胞也叫宿主细胞,大肠杆菌宿主菌是目前基因工程最常用的受体细胞。感受态细胞(competent cell)是经过一定方法处理后,具有接受外源DNA能力的大肠杆菌,只有发展了感受态的细胞才能稳定地摄取外来的DNA分子。 相关知识点:(1)克隆;(2)宿主细胞的定义及分类;(3)感受态细胞定义及其功能;(4)转化定义及方法(DMSO、MnCl2、TB aq、PEG)等。 (四)重组DNA的转化及重组子的鉴定 将外源DNA分子导入某一宿主细胞的过程称为转化。把重组DNA分子导入到细菌中产生克隆有两个目的,一是大量产生重组DNA分子,在完成连接反应后,重组DNA分子往往只有纳克级的量,不易操作和进行下一步的分析,若把重组DNA分子导入到细菌细胞中,细菌细胞可分裂多次产生克隆,克隆中每一个细胞都含有很多个拷贝的重组DNA分子,这样重组DNA分子的量就多了;二是对重组DNA 分子进行纯化,在构建重组DNA分子的过程中很难保证体系中不污染其他的DNA分子,连接过程完成以后体系中有多种分子存在,除了需要的重组DNA分子以外,还含有没有连接上的载体分子、没有连接上的DNA片段、自身环化的DNA分子和连接上污染DNA片段的重组DNA分子,未连接上的载体和DNA片段对实验影响不大,因为它们即使导入细菌细胞,因为不能复制,很快就要被细菌细胞中的酶降

分子克隆(亚克隆)实验总体流程详解

一、扩增 1、LB培养基5ml; 2、抗生素:1000X,即1:1000比例。种类根据细菌抗性决定; 3、菌体:看浑浊度,1%-5%,取500ul于其中; 4、37℃摇床220转,过夜,12-16h。 二、纯化质粒DNA 1、1.5ml离心管,编号一定要写清楚; 2、加满离心管,离心12000xg. 1min,弃上清。取三次; 3、加Buffer S1 200ul,溶解沉淀,5min; 4、加S2(用完立刻盖紧瓶盖,以免CO2中和Buffer中的NaOH)200ul,不能剧烈(以免基因组DNA的污染),上下翻转4-6次,直至形成透亮的溶液,时间少于5min。目的是使蛋白包裹基因组DNA,游离质粒; 5、加S3 280ul,温和充分翻转混合6-8次,12000xg,10min(此步呈白色絮状); *备注:S1:S2:S3=5:5:7 6、取上清加入制备管(置于2ml离心管),12000xg,1min,去滤液; 7、加Buffer W1 500ul,12000xg,1min,弃滤液; 8、加Buffer W2 700ul,12000xg,1min,弃滤液。重复一遍; 9、空管离心12000xg,1min; 10、制备管移入新的1.5ml离心管,管膜中加60-80ul去离子水,静置1min,12000xg,1min。(将去离子水加热至65度,将提高洗脱效率) 四、跑胶回收:sost回收失败 1、2%浓度胶,Loading Buffer如是6X,则加10ul到样品,全部加样到胶孔中。 插入:配胶方法 大块胶60ml;小块胶25ml; 需要配置大块胶、大孔胶; Agarose 0.6g,TAE60ml,微波中火2min; 趁热但不烫手时加入gold view 0.5ul/25ml; 倒入槽里。 2、跑胶:单位厘米/5-10v。所以大槽25cm,150v即可。小槽100v即可。 3、紫外灯下切胶,纸巾吸进液体,计算凝胶重量(1mg=1ul); 4、加3个凝胶体积的凝胶结合液DB(0.1ul视为100ul;如凝胶浓度大于2%,则加入6倍体积溶胶液;凝胶块最大不能超过400ul,超过可多个离心柱);

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