大鼠结缔组织生长因子siRNA荧光逆转录病毒表达载体的构建
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大鼠结缔组织生长因子siRNA荧光逆转录病毒表达载体的构建
作者：杨邱刘伏友彭佑铭刘虹肖力
来源：《医学信息》2014年第12期
摘要：目的构建针对大鼠结缔组织生长因子（connective tissue growth factor ，CTGF）的小分子干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）荧光逆转录病毒表达载体。方法将体外合成的两对各段含65碱基的寡核苷酸连接到pSIREN-RetroQ-ZsGreen载体，构建重组质粒，同时设立非特异对照。结果酶切、DNA 序列鉴定均证实插入片段的正确性。结论成功地构建了鼠CTGF-siRNA荧光逆转录病毒表达载体。为进一步研究其对体内外抗纤维化作用打下基础。
关键词：CTGF； siRNA；荧光逆转录病毒表达载体
RNA干扰（RNA in terference， RNA i）是抑制目标基因的强有力的手段，人工合成的
19-21核苷酸的干扰RNA在哺乳动物中能够诱导序列专一性的RNA干扰作用，已经在哺乳动物RNA干扰的分子机制方面铺平了道路[1]。大量研究证明，结缔组织生长因子（CTGF）是组织器官纤维化的关键和共同因子，可介导血管内皮生长因子、转化生长因子-β等多种信号刺激的纤维化效应，以CTGF为特异性靶标将给器官纤维化治疗开创新纪元[2]。本研究通过设
计针对大鼠CTGFmRNA的序列，构建能够表达siRNA 的荧光逆转录病毒载体，旨在为进一
步应用CTGF siRNAs抗纤维化研究创造条件。
1 资料与方法
1.1一般资料 pSIREN-RetroQ-ZsGreen载体及JM109大肠杆菌菌种由中南大学湘雅医学院医学遗传国家重点实验室提供， siRNA序列及引物由大连宝生生物公司合成。
1.2方法
1.2.1 siRNA作用靶序列的选择按照siRNA作用靶序列的设计要求[3]，从大鼠CTGF基因最完整的编码序列（序列号AF120275）中设计4对序列分别为： T1序列为：
5′AgCTgACCTAgAggAAAAC，T2序列为：5′AAgACACATTTggCCCTgA，T3序列为：
5′gTTCTAAgACCTgTgggAT，T4序列为：5′CAggAAgATgTATggAgAC，阴性对照：CAgACAACTATgTACgTCg。经过BLAST[4]，与同种属的其它基因无同源性。
1.2.2.1退火将正义和反义两条链以100μM浓度1：1混合在PCR仪上95℃30s，72°C
2min，37°C for 2min，25°C for 2min。行6%聚丙稀酰胺凝胶电泳，180V、30min，银染后观
察退火是否成功。