@单细胞凝胶电泳

将混有待测细胞的琼脂糖铺于载玻片上，凝固后浸入冷溶解液中使细胞裂解，在电泳液中解链后水平电泳，洗涤后用DNA 结合荧光染料染色，在荧光显微镜下观察玻片上细胞的荧光图像，评价DNA 的损伤程度。
3.1 形状指标
这是一类比较粗略的指标。根据细胞荧光图像是否象慧星一样头尾分明将其分为慧星一样细胞和非慧星样细胞，计数一定量细胞中慧星样细胞所占的比例，即慧星样细胞发生率，估计DNA 的损伤程度。这种指标可通过镜下观察直接得到，方便实用。
3.2 距离指标
直接在显微镜下或在照片上测出慧星的一些长度数值，如尾长，即沿电泳方向“慧星”尾部最远端与头部中心间接的距离；总慧星长度，即“慧星”电泳方向上的最大长度；尾长与头部直径比值等，以评价DNA损伤程度。这些指标描述电泳中DNA泳动的距离，易于测量，无需复杂的仪器设备及图像处理软件，而且在损伤因素剂量较大时，这些数值的大小与作用剂量之间有较为良好的线性关系。
3.3 强度指标
Ostling等人最初用SCGE 技术检测射线对DNA损伤时用“慧星”头部中心处荧光强度与电泳方向上一定距离处荧光强度的比值来描述DNA 的损伤。PoI1er 等人用“慧星”尾部总荧光强度同“慧星”头部总荧光强度的比值来表示DNA 的损伤程度。新近有报道根据“ 星”尾部荧光强度将细胞分为五类，由弱到强分别计为0、1、2、3、4，将100 个细胞的分值加在一起表示DNA 的损伤程度，并证明该数值与总慧星长度有较好的相关性。这些指标都不同程度地反映了电泳中泳动DNA 的量。
3.4 “矩”类指标
为反映DNA 损伤，上述距离类指标和强度类指标均不全面，有实验证明损伤因素作用剂量增大时，DNA 损伤程度明显增加而尾长基本不变。为将二者结合起来，更全面反映DNA 损伤程度，Olive 等人于1990 年首次描述了“尾矩”（tail moment ，TM ）的概念，定义为尾部DNA 占总DNA 的百分比与头、尾部中心间距的乘积。作者用实验证实该指标比上述其它指标都优越，很快就被广泛接受。


具体流程如下：①镀膜法制备底胶，将洁净的载玻片在0.2％的常熔点琼脂糖中浸没1 min后，置37 ℃孵箱烘烤过夜；实验时将细胞悬液与低熔点琼脂糖(42 ℃)以1∶1的比例在离心管中混匀，立即灌胶(先用盖玻片在已包被的载片上搭一个22 mm×10 mm×0.17 mm的小槽再灌胶)，4 ℃静置15 min后取下盖片，制得含细胞胶层。②裂解，4 ℃，1 h。③水洗，三蒸水4 ℃水洗3 次，5 min/次。④解旋，4 ℃，20 min。⑤电泳，4 ℃，20 min，0.8 V/cm。⑥中和，3 次，每次5 min。⑦梯度酒精脱水，(50％、70％、80％、90％

、100％、100％，常温下各一次，每次5 min)。⑧染色(EB，20 μg/ml，20 μl),之后镜检，每组随机取50 个细胞，用CASP分析软件进行分析用改良彗星实验检测损伤程度。


目的 探讨Comet分析法检测人癌体外培养细胞的初始DNA损伤及损伤修复能力与细胞放射敏感性的关系。材料与方法 选择人鼻咽高分化鳞状上皮癌细胞系(CNE-1)和人肺腺癌细胞系(973)作为实验对象。采用经中国医学科学院肿瘤医院肿瘤研究所放射生物室杨伟志课题组优化和标准化的碱性Comet分析法，分析不同细胞系的放射敏感性差异及放射损伤修复特性。以尾力矩(Tail Moment，TM)作为细胞DNA损伤的定量评价指标，检测细胞照射后的初始DNA损伤(DNA单链断裂)和损伤后的修复能力。同时用经典的克隆形成方法绘制细胞存活曲线，作为评价放射敏感性的参照，并对Comet分析法和克隆形成方法所测结果进行比较。照射用6MV-X射线，用于检测DNA损伤的细胞照射剂量依次为0Gy、2Gy、5Gy、10Gy和15Gy，用于检测DNA损伤修复的细胞照射剂量为6Gy；用于克隆形成分析的细胞照射剂量依次为0Gy、1Gy、2Gy、3Gy、5Gy、7Gy和10Gy。结果①Comet分析法测定CNE-1和973细胞的初始DNA损伤：两种细胞对照组的TM值均很小，在荧光显微镜下呈圆形，随着照射剂量增加，在相同实验条件下，CNE-1细胞的初始损伤均大于973细胞，差异均有显著性(P＜0.01)，表明CNE-1细胞的放射敏感性高于973细胞。②细胞存活曲线的分析结果显示：CNE-1细胞的D〓值为1.631，973细胞系的D〓值为1.822，显示CNE-1细胞的放射敏感性高于973细胞。③实验结果显示，用Comet分析法和经典的细胞存活曲线法分析两种细胞放射敏感性的趋势一致，表明Comet分析法可用于分析细胞的放射敏感性。④Comet分析法检测973细胞DNA损伤的半修复时间为33min，显著地小于CNE-1细胞的半修复时间41min(P＜0.01)，提示973细胞对DNA放射损伤的自身修复能力强于CNE-1细胞；细胞存活曲线测得973细胞的Dq值为2.152，CNE-1细胞的Dq值为0.626，表明973细胞的亚致死损伤修复能力大于CNE-1细胞；两种方法测定结果所反映的损伤修复能力也相一致。结论 ①Comet分析法是一种较为简便的检测DNA损伤与损伤修复的方法。②Comet分析法检测CNE-1和973两种细胞系的DNA初始损伤及修复所反映的放射敏感性，与经典细胞存活曲线法所测的放射敏感性相一致，说明Comet分析法是一种能够快速、准确检测细胞放射敏感性的方法。

1、分离制备单细胞悬液：

（1）体外培养的细胞株：用胰酶消化，最后用PBS悬浮吹打成单细胞悬液，细胞要计数，具体的量我前边已经说过。

（2）体内脏器细胞：处死动物，取出脏器，于Hanks’液中制备

成单个细胞悬液。

2、胶板制备：

（1）取100μl于45℃水浴中保温的0.5%NMA，铺于磨沙载玻片上，形成底胶。盖玻片推匀，不能有气泡，4度凝固5至8分钟。

（2）水平取下盖片，取100μl于37℃水浴中保温的0.5%LMA与20μl细胞悬液（约400个细胞）混匀，立即铺片，加上盖玻片，4度凝固5至8分钟。

3、细胞裂解与电泳：

（1）将制备好的胶板去掉盖玻片后，浸于4℃预冷的细胞裂解液中，在4℃下裂解2.5到3小时。

（2）取出胶板，用双蒸水浸没漂洗后放入电泳槽中，浸泡在4℃预冷的电泳液中解旋20分钟。

（3）玻片水平放置阳极端附近，4℃电泳20到25分钟（25V，300mA）。可在电泳槽周围加冰块以保持低温。

4、中和与染色：

（1）电泳结束，将胶板浸泡于中和液中，每次10分钟，共中和3次，每次要更换中和液。最后晾干。

（2）取出胶板，置于染色缸中，在2μg/ml的EB染色液中，暗处染色5到10分钟。

（3）蒸馏水漂洗2次，每次5分钟。

稍晾干，滤纸吸去多余水分，尽快在荧光显微镜下观察。

从胶板制备开始到最后都应该在暗光下操作。


辐射生物剂量：此法适于照后短期内的剂量评价，中性条件优于碱性条件；

旁观效应：查阅了许多国外文献，尚无此方法观察旁观效应的研究报道，所以我采用此方法观察了1Gy照后的旁观效应，试验今天上午刚刚结束，结果待分析，粗略看，此法对于旁观效应还是很敏感的，此法的优势在于成本低，操作比较简单。

低剂量照射的适应性反映：本实验室的一个相关课题刚刚结提，论文在法医学与特种医学版的军事医学子版已有上传，感兴趣的可以去看。

凋亡细胞的观察：看过国外此法作出的凋亡细胞彗星图像，很漂亮，用CASP软件分析后，其曲线呈典型的双峰，而正常细胞为单峰。我的一些教训：观察凋亡细胞最好把电压、电流、和电泳时间均调低，否则，凋亡细胞中的DNA片断跑的太块，荧光下根本看不到凋亡细胞的尾巴。

注：我用的是中性条件，20V，200mA,20min, 凋亡细胞观察宜选用10V,100mA,10min。

单细胞凝胶电泳技术应用非常广泛，本单位正在进行荷瘤小鼠放疗后的淋巴细胞DNA损伤研究，初步结果：大剂量放化疗前给予小剂量照射（分不同时间），动物的淋巴细胞彗星尾长、尾矩等指标试验组均小于对照组，证明该方法在放射医学的实用性。

丁香园网友biomed96提问：

lq6688你好，本人也正要做这个实验，预实验做了两次，但什么都没看到，也不知道是什么问题，望指教。

铺3层胶，第一层100ul1％regular胶，50度烤干，第二层50000个细胞100ul0.5％低熔点胶，第三层100ul 0.5％低熔点

胶。

裂解液：EDTA 100mM Nacl 2.5M Tris(10mM)pH10 1%TritonX-100 裂解 1小时

解旋液：EDTA1mM NaoH 300mM Ph>13 孵育20分钟。电泳40分钟。

染色： PI 50ug/ml染色15分钟。

结果是什么都看不到，好像一点都没染色。

另外，用软件分析能不能区分是单链损伤还是双链损伤？

丁香园网友lq6688认为：

首先，此试验的生物学原理目前还不是很清楚，Sighn和Olive这两个单细胞凝胶电泳的鼻祖首先提出的中性和碱性条件，中性条件检测双链断裂，而碱性条件检测单链断裂，有人曾提出这是为什么，我查阅了大量文献，国外文献没有具体的说明，国内文献更是人云亦云，所以，目前只能按照大家比较默认的：中性－－双链，碱性－－单链，这不是用软件来区分的，而是你的试验条件决定的，我看了您的裂解液ph10，所以检测结果应是单链断裂。

其次，您用的是三层三明治铺胶法，目前多数彗星试验已经少用此法，而是双层法甚至单层灌胶，有人担心双层或单层铺胶的脱胶问题，只要在凝胶的承载载体上做点文章，就解决了！我用的是双层铺胶法，我不知道您的第一层正常熔点胶为什么要烤干，是为了防治脱胶吗？我建议您采用双层法（卖瓜人不说自己的瓜苦，呵呵），这样在实验操作上可以节省时间，不必担心脱胶问题，我做了一年多了，自认为很成熟了，从来没有出现脱胶问题，（我不知道您用的凝胶承载体是什么？）。

第三，解旋20分钟应该没问题，但是我认为您的电泳时间过长，当然我不知道您的电泳条件（电压、电流、），我认为20分钟足够了，时间长了一是浪费时间，二是彗星图像不好，不利于分析。

第四，因为我用的EB染色，2ug/ml，效果很好，您用PI染色，我可能没有发言权，因为我不知道PI 的荧光激发光波长是多少，是否您的荧光条件不对？可以查查文献，这一点您对PI应该比我更了解吧。

第五，您的裂解时间有点短了，文献报道，最好不要少于1.5小时。

第六，我不知道您用的什么细胞，50000个细胞加入100ul0.5％低熔点胶，是不是细胞太多了，含细胞层的凝胶如果细胞密度过大，即使做出结果，彗星图像过于密集，头尾连接互相影响，无法分析。一般100ul0.5％低熔点胶中含400个细胞就足够了。

主要的影响因素作如下分析。

1.琼脂糖凝胶薄板的制备：

该实验需要制备两层琼脂糖凝胶薄板，应注意琼脂糖的浓度、制备时间和温度。第1层是紧贴冰冻玻片砂面的1%正常凝点（42±2）℃的琼脂糖凝胶，吸取85μl制成面积为18mm×18 mm，厚度为0.25mm的凝胶。然后置4℃存放约20分钟，如时间过短，不能得到“老化”的凝胶与玻片粘合不紧，

容易在液体浸泡处理和电泳过程中自然脱落，造成实验失败；反之，如果放置时间过长，凝胶极易干裂而脱落。第2层凝胶是1%低凝点（26±2）℃琼脂糖液，与细胞混合时琼脂糖液的温度30~37℃，温度过高可引起细胞损伤，此操作过程力求快速，以免加速细胞DNA的修复。

2.细胞数和实验温度的影响：

（1）实验细胞数应调至约3.0×105，如果细胞数过低，一张片子中细胞数太少，很难完成100个彗星计数分析；反之细胞数过高，片中细胞过密，位于不同层面的细胞相互重叠，难以分析彗星DNA损伤。

（2）实验温度的控制。样品应置4℃环境下进行，以抑制或降低核酸内切酶等活性，阻止DNA损伤的修复，从而达到准确地检测DNA初级损伤。已有研究表明一些细胞DNA断裂损伤能在1小时内达到90%的修复，3小时达到97%，因此，应严格控制细胞在分析过程中的温度。

3.碱化处理及电泳的条件：

凝胶内的细胞需在碱性（pH值10）环境下进行处理，其作用一是去除细胞蛋白质，使DNA暴露出来；其次是碱化处理使DNA紧密螺旋结构解旋，DNA损伤片断及其极性端暴露出来。

电泳条件：电压或电流过大，严重受损伤的细胞可能出现的拖尾过长，彗星消失而影响结果，其次是正常的细胞可能因电压或电流过大而形成少许拖尾的假阳性结果。反之，电压或电流过小，受损伤的细胞不会出现拖尾，而出现假阴性结果。电泳的电压多选用低电压，一般在18~50v，在电泳过程中电泳液的温度应不超过15℃（应在4℃条件下进行），电泳时间多在20~40分钟。

4.荧光染色及彗星图象分析：

（1） 采用DAPI荧光剂染色，质量浓度在1~5μg/ml，用量为10μl。染色15分钟后即可观察，视野中明亮荧光的“彗星”被光照时间一般不易超过2分钟，以免荧光剂快速衰退而不宜继续观察和拍照。

（2） 彗星的图像分析主要靠肉眼显微镜读片，对DNA损伤程度标准的正确判断是非常重要的。不同程度损伤可根据彗星的尾部与其头部的比率大小分为0、1、2、3、4五个等级。0级无拖尾表明无损伤，当DNA损伤程度由轻到重，则彗星的尾部逐渐变长变大，头部逐渐变小荧光强度逐渐变弱。用肉眼观察判断的分级需要通过计算机彗星图象分析加以确定，目前已有彗星电脑分析软件可供使用，如Komet3.0等。总之，严格控制SCGE的各种影响因素，使其真正成为一种可靠、易于掌握和有效的DNA断裂损伤和修复检测的新技术。

试剂及材料：

1）PBS
2）0.8%正常熔点凝胶（PBS配制）
3）0.6%低熔点凝胶（PBS配制）
4）毛玻璃片
5）盖玻片
6）碱性裂解液（2.5mol/L NaCl；100mmol/L Na2EDTA；10mmol/L T

ris；1%肌氨酸钠），临用前加10%DNMSO，1%Triton X-100
7）电泳缓冲液（1mmol/L Na2EDTA；300mmol/L NaOH；Tris.Cl，pH7.5）
8）EB（2ug/ml）

步骤：

1.制备第一层胶：100ml 0.8%正常熔点胶，加盖盖玻片，4℃固化10min；

2.制备第二层胶：轻轻地去除盖玻片，在第一层胶上滴加75ul含1×10000个细胞的0.6%低熔点胶（cell与凝胶比例为1：5），加盖盖玻片，4℃固化10min；

4.取出玻片，用PBS缓冲液漂洗3次后置于水平电泳槽内，加入pH13的电泳缓冲液（没过玻片2～3min），放置20min（黑闭）。

3.裂解：去掉盖玻片，将凝胶浸入冰冷的碱性裂解液内（临用前加10% DMAO，1%Triton X-100），4℃裂解1h；

5.电泳：电压20V，300mA，30min

6.取出玻片，用PBS或Tris.Cl，pH7.5漂洗3次，每次3min；

7.染色：胶上滴加3ulEB，加盖盖玻片，24h检测。或者4℃，潮湿，闭光的条件下保有胶片，观察时再染色，镜检。