动物结核病原菌检测方法变性高效液相色谱法

动物结核病原菌检测方法变性高效液相色谱法

1范围

本标准规定了结核分枝杆菌复合群、结核分枝杆菌、牛分枝杆菌多重PCR联合变性高效液相色谱（mPCR-DHPLC）检测方法的技术要求和操作规范。

本标准适用于快速检测细菌培养物、动物组织、血样、痰液等临床样品中结核分枝杆菌复合群、结核分枝杆菌、牛分枝杆菌。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法

GB 19489 实验室生物安全通用要求

3 缩略语

下列缩略语适用于本标准。

3.1 DHPLC：Denaturing high-performance liquid chromatography，变性高效液相色谱。

3.2 dNTP：deoxyribonuclesosde triphosphate，脱氧核苷三磷酸。

3.3 PBS：phosphate buffer solution，磷酸盐缓冲液。

3.4 mPCR：multiplex-polymerase chain reaction，多重聚合酶链式反应。

3.5 TEAA：三乙基铵醋酸盐

4 概述

人与动物结核病涉及多种病原菌或病原菌复合群。结核分枝杆菌复合群（Mycobacterium tuberculosis complex, MTC）是感染人与哺乳动物的结核病原菌，包括结核分枝杆菌和牛分枝杆菌、非洲分枝杆菌和田鼠分枝杆菌。其中，主要感染人与家畜并致病的是结核分枝杆菌和牛分枝杆菌。与MTC相对应的是种类繁多的各种非结核分枝杆菌（NTM）。NTM感染患者的临床症状及病理变化与MTC引起的结核病极为相似，但多数NTM对抗结核药物有天然耐药性。此外，NTM感染可造成结核菌素皮内变态反应或血清学检测假阳性。采用多重PCR联合变性高效液相色谱检测的方法可同步区分结核分枝杆菌复合群与非结核分枝杆菌复核群，并鉴别结核分枝杆菌与牛分枝杆菌

多重PCR反应的原理、操作过程与普通PCR相同。在同一PCR反应体系里加入多对特异性引物，对多个DNA模板或同一模版不同区域扩增出多个目的DNA片段。DHPLC分析技术是利用液相色谱技术，在高压闭合液相流路中，将DNA样品自动注入并在缓冲液携带下流过DNA分离柱，DNA片段分子中带负电荷的磷酸根基团与TEAA分子中带正电荷的氨基发生静电作用相互吸引，同时TEAA分子中的三个乙基与固定相C18表面的烷基发生疏水作用力而相互吸引，通过流动相中的乙腈的梯度洗脱达到将不同大小的DNA片段分离。由紫外或荧光检测被分离的DNA样品。根据DNA扩增片段长度大

小，不同分子量的特异扩增产物在特定位置呈现吸收峰，从而对结核分枝杆菌复合群、结核分枝杆菌和牛分枝杆菌进行快速检测。

5材料与试剂

5.1 仪器与耗材。

5.1.1 变性高效液相色谱分析仪。

5.1.2 核酸扩增仪。

5.1.3 II级生物安全柜。

5.1.4 接种棒。

5.1.5 恒温水浴锅（室温至100℃）。

5.1.6 离心机。

5.1.7 微量可调移液器和灭菌吸头：10μL、100μL、200μL、1000μL。

5.1.8 天平。

5.1.9 PCR光学反应管。

5.2 试剂。

5.2.1 试剂级别：除另有规定，所用化学试剂均为分析纯。

5.2.2 检测用引物：见表1。

表1 分枝杆菌PCR-DHPLC检测扩增引物序列

采用无DNA酶、无RNA酶水将每条引物（序列见表1）配制成100μmol/L储存液，置-20℃或更低温度冻存；使用时取适量配制成10μmol/L工作液，避免多次冻融。

5.2.3 0.01 mol/L PBS（pH7.6）：配方见附录A中A.1。

5.2.4 柠檬酸钠缓冲液：配方见附录A中A.2。

5.2.5 0.5 mol/L EDTA（pH8.0）：配方见附录A中A.3.

5.2.6 柠檬酸钠-磷酸缓冲液：配方见附录A中A.4

5.2.7 4% 氢氧化钠溶液：配方见附录A中A.5

5.2.8Triton X-100。

5.2.9DNA提取液：含100 mmol/L Tris-HCL（pH8.0），0.01% Triton X-100，20μg/μL蛋白酶K。

5.2.10灭菌双蒸水。

5.2.11三氯甲烷。

5.2.12 dNTPs: dATP、dTTP、dCTP和dGTP。

5.2.13 Taq DNA聚合酶。

5.2.14 DHPLC缓冲液：配方见附录A中A.7。

6 生物安全要求

采样、样品处理及检测过程所涉及的实验操作，应遵守GB 19489的有关规定。

7 样品采集与前处理

7.1 培养物

直接取液体培养基培养的菌液；对于在固体培养基上生长的菌落，用接种棒挑取适量（取用量达到肉眼可见，菌团大小不超过接种环）菌样，放到1mL 0.01 mol/L pH7.6 PBS中，振荡混匀形成悬浮菌液。

取1 mL菌液样品，15 000×g离心10 min，弃上清，加1 mL 0.01 mol/L pH 7.6 PBS，充分振荡混匀，15 000×g离心10 min；弃上清，收集沉淀物，按8.1进行核酸提取，或置-20℃贮存备用。

7.2全血、血清

用无菌注射器或真空采血管，无菌自动物静脉采血。将血液直接滴入抗凝剂中，并立即连续摇动，充分混合。抗凝剂采用柠檬酸钠缓冲液，或O.5 mol/L EDTA。每6 mL血液加1 mL抗凝剂。条件允许时，建议优先采集全血，以更有利于富集菌体。

取1 mL～2 mL全血样品，15 000×g离心10 min，弃上清；加等体积灭菌双蒸水充分振荡，15 000 ×g离心10 min；弃上清，若红血球裂解不完全，需采用灭菌双蒸水重复洗涤；收集沉淀物，按8.1进行核酸提取，或置-20℃贮存备用。

血清样品处理方法同7.1。

7.3 痰液

动物痰液采集：动物咯痰极少，宜在清晨采集，用橡胶管自口腔伸入至气管内，外接注射器吸取痰液。亦可取咳出的痰块。

在痰液样品中加入2～4倍体积4％氢氧化钠溶液，振荡混匀，室温放置30 min，间或振荡混匀，使其充分液化（无明显固状物并且吸出时无拖丝现象即为液化完全；若液化不完全，可适当再加入少量4％氢氧化钠溶液直至液化完全）；15 000×g离心10 min；弃上清，加1 mL 0.01 mol/L pH 7.6 PBS，充分振荡混匀，15 000×g 离心10 min，弃上清，重复本步骤1次；收集沉淀物，按8.1进行核酸提取，或置-20℃贮存备用。

7.4 组织器官

采集动物下颌、咽后、支气管、肺（特别是肺门及肺门淋巴结）、纵隔和肠系膜淋巴结，以及病变组织器官如肝、脾、肺等。

取适量组织样品（剔除脂肪、被膜），剪碎，按1：5的比例加入柠檬酸钠-磷酸缓冲液（例，1g 组织样品，加入5 mL缓冲液），充分研磨；加等量4％氢氧化钠溶液，继续研磨5 min～10 min，使组织

液化；移入离心管，充分振荡，75℃水浴0.5 h ～1 h；取上清（避免吸取粗渣），15 000×g 离心10 min；弃上清，加等量0.01 mol/L pH 7.6 PBS ，振荡混匀，使沉淀充分悬浮，15 000×g 离心10 min，弃上清，重复本步骤1次；收集沉淀物，按8.1进行核酸提取，或置-20℃贮存备用。

注：可采用其他经验证有效的样品处理方法。

8 操作方法

8.1 核酸提取

在上述已完成前处理的样品（沉淀物）中加入50 μL～100 μL DNA提取液，充分振荡混匀， 56℃水浴30 min，98℃～100℃加热10 min，瞬时离心使液滴聚集管底，加等体积三氯甲烷，振荡混匀，12 000×g离心5 min，取上清，直接用于PCR或贮存于-80℃备用。

注：可采用经验证的商品化核酸提取试剂盒或其他经验证有效的核酸提取纯化方法。

8.2 mPCR扩增

采用50μL反应体系，反应液中含dNTPs 0.2 mmol/L，IS6110、IS1081、MTss127、MBss229上下游引物每条各0.2 μmmol/L，Mg2+ 1.0 mmol/L，1 unit Taq酶，模版DNA 5μL。扩增循环条件为：94℃预变性2min；94℃变性15s，62℃退火15s，68℃延伸15s,进行40个循环；72℃延伸1min。

8.3 DHPLC分析

将装有PCR产物的反应管放置在DHPLC金属板的微孔中。登录DHPLC分析系统，在非变性分析条件下，采用双链DNA多片段（double-stranded multiple fragment）分析模式,设定方法分析100-430bp 片段；清洗模式采用active；清洗持续时间0.5 min，平衡持续时间0.9 min；流速0.9 mL/min。温度设定50℃；样品进样量设为5μL~10μL，同一组分析采用同样的进样量。分析速度为每100bp需2.5 min，每个样品约13.4 min。分析过程流动相梯度参数由Navigator software分析软件控制设定，具体参数见表2。

8.4 质控对照设置

检测过程中应分别设阳性对照和阴性对照。阳性对照为结核分枝杆菌、牛分枝杆菌菌株DNA或扩增片段的阳性克隆质粒DNA，阴性对照为非目标致病菌DNA或双蒸水。

表2. DHPLC 流动相参数

9 结果及判定

9.1 质控标准（参考附录B）

9.1.1阴性对照：无特异吸收峰出现。

9.1.2阳性对照：结核分枝杆菌菌株DNA可扩增出结核分枝杆菌复合群IS6110目标基因165bp片段、IS1081目标基因380bp片段及结核分枝杆菌MTss127目标基因213bp片段的产物；牛分枝杆菌菌株DNA 可扩增出结核分枝杆菌复合群IS6110目标基因165bp片段、IS1081目标基因380bp片段及牛分枝杆菌MBss229目标基因241bp片段的产物。DHPLC分析出现相应片段大小的PCR产物吸收峰，且峰吸收值大于2mV。

9.1.3 不符合上述对照质控标准的视为无效。

9.2 检测结果判定

9.2.1 阴性：检测样品无典型PCR产物阳性吸收峰出现，可判定为结核分枝杆菌复合群、结核分枝杆菌、牛分枝杆菌阴性。

9.2.2 结核分枝杆菌复合群阳性：检测样品出现165bp和/或380bp典型的PCR产物阳性吸收峰，且吸收峰值大于2mV时，可判定该样品结果为结核分枝杆菌复合群阳性。

9.2.3 结核分枝杆菌阳性：检测样品出现213bp典型的PCR产物阳性吸收峰，且吸收峰值大于2mV时，可判定该样品结果为结核分枝杆菌阳性。结核分枝杆菌阳性同时还应出现165bp和/或380bp产物吸收峰，但也可能由于样品模板浓度或具体反应效果等原因不出现，这些情况不影响判定。

9.2.4 牛分枝杆菌阳性：检测样品出现241bp典型的PCR产物阳性吸收峰，且吸收峰值大于2mV时，可判定该样品结果为牛分枝杆菌阳性。牛分枝杆菌阳性同时还应出现165bp和/或380bp产物吸收峰，但也可能由于样品模板浓度或具体反应效果等原因不出现，这些情况不影响判定。

9.2.5 可疑结果：检测样品出现典型的PCR产物阳性吸收峰，但吸收峰值小于2mV时，建议对样品重做。重做结果峰吸收值仍小于2mV则判为阴性，否则判为可疑，应重新采集样品进行检测。

附录A

（规范性附录）

试剂的配制

A.1 0.01 mol/L PBS （pH7.6)

先配制A液、B液

A液（0.2 mol/L NaH2PO4溶液）：称取一水合磷酸二氢钠（NaH2PO4?H2O）27.6g，或二水合磷酸二氢钠（NaH2PO4?2H2O）31.2g，溶于蒸馏水中，定容至1L。

B液(0.2 mol/L Na2HPO4溶液）:称取十二水合磷酸氢二钠（Na2HPO4?12H2O）71.6g，或二水合磷酸氢二钠（Na2HPO4?2H2O）35.6g，溶于蒸馏水中，定容至1L。

称取17g氯化钠，用适量蒸馏水溶解，量取13mL A液和87mL B液，混合，用蒸馏水定容至2L。

A.2 柠檬酸钠缓冲液

柠檬酸（C6H8O7?H2O） 5.3g

柠檬酸钠（Na3C6H5O7?H2O） 15g

葡萄糖（C6H12O6?H2O） 16.2g

称取上述试剂，溶解于蒸馏水，定容至1L，混匀。采用（121±2）℃/0.1 MPa，15min高压灭菌后贮存于4℃。

A.3 0.5 mol/L EDTA (pH8.0)

称取186.1g EDTA，加入800mL蒸馏水中，磁力搅拌器上剧烈搅拌，用氢氧化钠（NaOH）调pH至8.0，定容至1L，分装，采用（121±2）℃/0.1 MPa，15min高压灭菌后贮存于4℃。

A.4 柠檬酸钠-磷酸缓冲液

先配制pH6.8 磷酸缓冲液。

A液（0.2 mol/L磷酸二氢钠溶液）：称取磷酸二氢钠（NaH2PO4?2H2O）15.61g，加双蒸水溶解，定容至500 mL。

B液（0.2 mol/L磷酸氢二钠溶液）：称取磷酸氢二钠（Na2HPO4?12H2O）35.82g，加双蒸水溶解，定容至500 mL。

分别量取51 mL A液、49 mL B液，混合即成100 mL pH6.8磷酸缓冲液。

称取2.84 g柠檬酸钠（Na3C6H5O7?2H2O），加入100 mL pH6.8磷酸缓冲液中，充分溶解。采用（121±2）℃/0.1 MPa，15min高压灭菌后贮存于4℃。

A.5 4% 氢氧化钠溶液

称取8 g 氢氧化钠，加入200 mL双蒸水，充分溶解。室温贮存。

A.6 DHPLC缓冲液

A液：50mL TEAA和250μL乙腈混合，加双蒸水定容至1000mL；B液：50mL TEAA和250mL乙腈混合，加双蒸水定容至1000mL；D液：750mL 乙腈和250mL双蒸水混合。

附录B

（资料性附录）

动物结核病原菌mPCR-DHPLC检测图谱

1——结核分枝杆菌阳性对照

2——牛分枝杆菌阳性对照

3——阴性对照

峰A——结核分枝杆菌复合群IS6110吸收峰

峰B——结核分枝杆菌MTss127吸收峰

峰C——牛分枝杆菌MBss229吸收峰

峰D——结核分枝杆菌复合群IS1081吸收峰

图B.1动物结核病原菌mPCR-DHPLC检测图谱