琼脂糖凝胶电泳技术

电泳检测技术是指利用带电颗粒在电场中能向异性电极泳动这一现象来分离、纯化或分析检测供试品的一种生物化学技术。

原理：许多生物分子都带有电荷，在电场作用下可发生移动，由于混合物中各组分所带电荷性质、数量以及相对分子质量各不相同，使在同一电场作用下，各组分的泳动方向和速率也各有差异，所以在一定时间内，它们移动距离不同，从而可达到分离鉴定的目的。

DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，包括电荷效应和分子筛效应。

琼脂糖是由天然的琼脂加工制得，是一种直链杂聚多糖，溶于热水，形成溶胶，冷却后成为孔径范围从50nm到大于200nm的大网孔径凝胶。由于孔径较大，对一般蛋白质不起分子筛作用，该电泳技术是目前分离、分析DNA片段的标准方法。

DNA琼脂糖凝胶电泳的原理

DNA 分子是两性电解质，在高于其等电点的溶液（pH8.0~pH8.3 DNA分子本身的大小和构型、凝胶浓度决定了DNA分子的迁移速度。）中，碱基几乎不解离，磷酸基团全部解离，DNA 分子带负电荷，在电场中向正极移动。

DNA分子大小对迁移速率的影响：相对分子质量大，迁移慢；相对分子质量小，迁移快。DNA分子构型对迁移速率的影响：迁移速度：闭环﹥直链DNA﹥开环DNA。

琼脂糖凝胶浓度的影响：同样大小的线性DNA片段，在不同浓度的琼脂糖凝胶中的迁移速度不同，浓度越大，迁移的越慢

常用的电泳上样缓冲液含溴酚蓝，有的还含有二甲苯青，这些指示剂可以指示电泳的速度。溴化乙淀（EB）是核酸的染色剂，能插入DNA分子中形成荧光结合物，EB在紫外线照射下的发射荧光。荧光的强度与DNA的含量成正比，从而可以确定DNA片段在凝胶中的位置及估计出待测样品的浓度。

EB是强致癌剂。

电泳操作步骤(整个过程要求带一次性手套

1、胶槽准备

①将凝胶托盘放入制胶盒中;

②将加样梳垂直插入到制胶盒的小凹槽内，梳齿底端和凝胶托盘有1mm的间隙;

③将制胶盒放在调整好的水平台上。

2、凝胶准备用1×TAE配制1％琼脂糖凝胶。

①称0.15g琼脂糖置三角瓶中，加15ml 1×TAE;

②微波炉加热大约1分钟，熔化琼脂糖;

③熔化的琼脂糖自然冷却到60～70℃时，加入DNA染料，并轻轻混匀。

3、倒胶：将冷却致60℃的凝胶倒入准备好的制胶盒内，凝胶厚度3～5mm,室温下静置半小时左右冷却，凝胶固化。

4、轻轻拔出固定在凝胶中的加样梳。将带凝胶的凝胶托盘置于电泳槽中，并使样品孔位于电场负极，向电泳槽中加入1×TAE电泳缓冲液，越过凝胶表面即可,出去样品孔的气泡。

6、样品准备：向核酸样品中加入约为样品体积1/10的上样缓冲液，用加样器轻轻混匀。

7、上样：用加样器吸取样品，轻轻的加入到凝胶的样品孔中。加样量一般5-7μl。

8、盖上电泳槽，接通电源，开始电泳。

开始电泳前，再次确认凝胶样品孔处于电场的负极。

电泳条件：5v/cm；时间20-30分钟左右

9、电泳结束后，切断电源，取出凝胶。

10、电泳结果分析：

①紫外检测仪直接观察电源条带

②摄影记录

有下列因素会影响DNA在琼脂糖凝胶中的迁移速率：

1、市售的琼脂糖的提纯等级。提纯等级越高，电渗及静电相互作用越少，分离效果越好。

2、DNA的相对分子质量和空间结构。

3、琼脂糖浓度。浓度越高，分离的DNA分子片段越小。

4、电场强度。常用的5v/cm的分辨率不高。在精确测定DNA分子大小时，应降低电压至1v/cm。电压过高，电泳分离的线性范围越窄，同时也会由于电泳中产生的大量热量导致DNA片段的降解。

5、嵌入染料的存在。EB嵌入到DNA碱基对间，会使线状双链DNA分子迁移率降低15%左右，而对其他构型DNA影响较小。如果对实验结果的精度要求较高，可以在电泳后再染色，而不是把EB直接加入凝胶板中。由于EB为致癌剂，操作时应戴手套，尽量减少台面污染。

6、电泳缓冲液。电泳缓冲液多次使用后，离子强度降低，pH上升，缓冲能力减弱，从而影响电泳效果，建议经常更换电泳缓冲液。

RNA变性琼脂糖凝胶电泳

1、原理：

RNA和DNA是2种不同类型的核酸，但它们的结构和组成相似，琼脂糖凝胶电泳检测技术同样可以用于RNA的研究。

常用的RNA琼脂糖凝胶电泳有非变性电泳和变性电泳2种。非变性电泳可以分离混合物中不同相对分子质量的RNA分子，但是无法确定相对分子质量。因为RNA 是单链分子，局部区域会形成二级结构，在电场中泳动的距离不能反映RNA分子本身的大小。只有在变性情况下，RNA分子完全伸展成线性，才能根据Marker推算相应谱带RNA的相对分子质量。

2、注意事项：

①RNA的变性处理如果选择甲醛为变性剂，则需要在通风橱中进行相关操作。如果选用乙二醛-DSMO（二甲亚砜）做变性剂，在电泳时则需要电泳缓冲液的再循环装置，用来避免形成过高H+梯度。

②不同的变性剂，电泳缓冲液和加样缓冲液通常也要相应配制。

③如果选用乙二醛-DSMO体系作为变性剂，在制胶时，不能直接把染料EB加入凝胶中，乙二醛与EB发生化学反应，会干扰实验进行。要等电泳完毕后把胶浸入EB溶液染色30～40min后紫外灯下观察。

④实验室用的普通玻璃器皿和塑料制品经常有RNA酶污染，使用前必须于180℃干烤8h或更长时间（玻璃器皿）或用DEPC水溶液浸泡（塑料制品）。任何一个环节造成了RNAase 污染都可能会使电泳结果呈现为无明显谱带或谱带散乱，失去实验价值。

核酸分离纯化的原则:

保持核酸一级结构的完整性

尽可能提高核酸制品的纯度

（一）选择原则

1.尽量清除其它分子的污染，保证核酸纯度

2.保持核酸的完整性

尽量简化分离纯化步骤，缩短提取时间

尽量避免各种有害因素对核酸的破坏

（二）技术路线的设计

1核酸的释放：化学法、机械法、物理法

2分离与纯化：应该清除的杂质主要包括:

1.非核酸的大分子污染物

蛋白质、多糖及脂类物质等

2.非需要的核酸分子

分离某一核酸分子时，其它核酸皆为杂质

3.加入的有机溶剂和某些金属离子

3浓缩、沉淀于洗涤：沉淀是浓缩核酸最常用的方法

常用的盐类: 醋酸钠、醋酸钾、醋酸铵、氯化钠、氯化钾及氯化镁

常用的有机溶剂:乙醇、异丙醇和聚乙二醇

核酸沉淀常常含有少量共沉淀的盐，需用70%～75%乙醇洗涤去除

原理：加入高浓度醋酸钠（0.3M）后，钠离子可以均匀的分散到DNA的表面，屏蔽掉DNA 链上磷酸根上的负电荷，有利于DNA链的压缩。否则，磷酸根相互排斥，DNA不容易聚集。4晾干与溶解：晾干DNA，让乙醇充分挥发（不要过分干燥）；若长期储存建议使用TE缓冲液溶解

琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳实验原理)

打印 琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳实验原理 聚丙烯酰胺凝胶电泳，普遍用于分离蛋白质及较小分子的核酸。琼脂糖凝胶孔径较大适用于分离同工酶及其亚型，大分子核酸等应用较广。琼脂糖和聚丙烯酰胺可以制成各种形状、大小和孔隙度。琼脂糖凝胶分离DNA度大小范围较广，不 同浓度琼脂糖凝胶可分离长度从200bp至近50kb的DNA段。琼脂糖通常用水平装置在强度和方向恒定的电场下电泳。聚丙烯酰胺分离小片段DNA (5-500bp) 效果较好，其分辩力极高，甚至相差1bp的DNA段就能分开。聚丙烯酰胺凝胶电泳很快，可容纳相对大量的DNA,但制备和操作比琼脂糖凝胶困难。聚丙烯酰胺凝胶采用垂直装置进行电泳。目前，一般实验室多用琼脂糖水平平板凝胶电泳装置进行DNA电泳。 琼脂糖凝胶电泳原理： 琼脂糖是从琼脂中提纯出来的，主要是由D-半乳糖和3,6脱水L-半乳糖连接而成的一种线性多糖。琼脂糖凝胶的制作是将干的琼脂糖悬浮于缓冲液中，通常使用的浓度是1%-3%,加热煮沸至溶液变为澄清，注入模板后室温下冷却凝聚即成琼脂糖凝胶。琼脂糖主要在DNA制备电泳中作为一种固体支持基质。琼脂糖之间以分子内和分子间氢键形成较为稳定的交联结构，这种交联的结构使琼脂糖凝 胶有较好的抗对流性质。琼脂糖凝胶的孔径可以通过琼脂糖的最初浓度来控制，低浓度的琼脂糖形成较大的孔径，而高浓度的琼脂糖形成较小的孔径。尽管琼脂糖本身没有电荷，但一些糖基可能会被羧基、甲氧基特别是硫酸根不同程度的取代，使得琼脂糖凝胶表面带有一定的电荷，引起电泳过程中发生电渗以及样品和凝胶间的静电相互作用，影响分离效果。 琼脂糖凝胶可以用于蛋白质和核酸的电泳支持介质，尤其适合于核酸的提纯、分析。如浓度为1%的琼脂糖凝胶的孔径对于蛋白质来说是比较大的，对蛋白质的阻碍作用较小，这时蛋白质分子大小对电泳迁移率的影响相对较小，所以适用于 一些忽略蛋白质大小而只根据蛋白质天然电荷来进行分离的电泳技术，如免疫电泳、平板等电聚焦电泳等。琼脂糖也适合于DNA、RNA分子的分离、分析，由于DNA、RNA分子通常较大，所以在分离过程中会存在一定的摩擦阻碍作用，这时分子的大小会对电泳迁移率产生明显影响。例如对于双链DNA,电泳迁移率 的大小主要与DNA分子大小有关，而与碱基排列及组成无关。另外，一些低熔点的琼脂糖在62 C时熔化，因此其中的样品(如DNA)，可以在加热到熔点的水浴中放置一段时间，重新溶解到溶液中而回收。 由于琼脂糖凝胶的弹性较差，难以从小管中取出，所以一般琼脂糖凝胶不适合于管状电泳，管状电泳通常采用聚丙烯酰胺凝胶。琼脂糖凝胶通常是形成水平式板状凝胶，用于等电聚焦、免疫电泳等蛋白质电泳，以及DNA、RNA的分析。垂 直式电泳应用得相对较少。 目前多用琼脂糖为电泳支持物进行平板电泳，其优点如下:

琼脂糖凝胶电泳目的及后续工作

琼脂糖凝胶电泳的应用 琼脂糖凝胶电泳是用琼脂或琼脂糖作支持介质的一种电泳方法。对于分子量较大的样品，如大分子核酸、病毒等，一般可采用孔径较大的琼脂糖凝胶进行电泳分离。 1.分离纯化大片段DNA 琼脂糖凝胶约可区分相差100bp的DNA片段，其分辨率虽比聚丙烯酰胺凝胶低，但它制备容易，分离范围广，尤其适于分离大片段DNA。普通琼脂糖凝胶分离DNA的范围为0.2-20kb，利用脉冲电泳，可分离高达10^7bp的DNA片段。分离后如需回收：将需要的DNA胶部分切下，尽量不要切到多余的胶。切胶后加入3倍体积TE，水浴熔化后，酚、酚或氯仿抽提干净，乙醇沉淀即可。 2.提取大分子DNA构建大片段基因组文库的关键就是获得高分子量的基因组DNA。而利用成熟的商品化试剂盒提取基因组DNA只能得到大小约在20kb左右的DNA;酶抽提法需经过多次抽提法才能得到较纯的DNA，但极易造成基因组断裂，也难以得到大于300kb的基因组DNA。两种方法均不能达到目的，但经过研究人员不懈的研究，利用琼脂糖凝胶制备成凝胶块提取基因组DNA能够获得足够大的DNA片段，可以完全符合构建粘粒基因组文库的要求。在此过程中研究人员在用低熔点琼脂糖还是普通熔点琼脂糖制备凝胶块的问题中选择了后者，因为低熔点琼脂糖价格昂贵且胶块在制备纯化的过程中容易断裂，而普通熔点琼脂糖与低熔点琼脂糖在基因组DNA制备方面没有区别。 3.PCR产物检测在基因组DNA的提取中，DNA经孵育及抽提、沉淀后以70%乙醇洗涤2次，再适量的双蒸水溶解DNA。然后在1.0%的琼脂糖凝胶上进行电泳，以1kb DNA ladder 为参照，估计DNA溶液浓度。具体检验方法是:2.0%琼脂糖制成凝胶，取6 微升AFLP-PCR产物与1微升上样缓冲液混匀后上样，用1×TBE电泳缓冲液，120V电泳50min，使用EB溶液染色后在凝胶成像系统(ChampGel-3200)上观察拍照。 4.免疫扩散法中的应用免疫扩散法是指抗原与抗体在同一凝胶中扩散的方法，是观察可溶性抗原与相应抗体反应和抗原抗体鉴定的最基本方法之一。利用琼脂糖凝胶作为扩

琼脂糖凝胶电泳及其影响因素

琼脂糖凝胶电泳及其影响因素 琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳是分离鉴定和纯化DNA片段的标准方法。该技术操作简便快速，可以分辨用其它方法（如密度梯度离心法）所无法分离的DNA片段。当用低浓度的荧光嵌入染料溴化乙啶(Ethidium bromide, EB)染色,在紫外光下至少可以检出1-10ng的DNA条带,从而可以确定DNA片段在凝胶中的位置。此外,还可以从电泳后的凝胶中回收特定的DNA条带,用于以后的克隆操作。 琼脂糖和聚丙烯酰胺可以制成各种形状、大小和孔隙度。琼脂糖凝胶分离DNA片度大小范围较广,不同浓度琼脂糖凝胶可分离长度从200bp至近50kb的DNA片段。琼脂糖通常用水平装置在强度和方向恒定的电场下电泳。聚丙烯酰胺分离小片段DNA(5-500bp)效果较好,其分辩力极高,甚至相差1bp的DNA片段就能分开。聚丙烯酰胺凝胶电泳很快,可容纳相对大量的DNA,但制备和操作比琼脂糖凝胶困难。聚丙烯酰胺凝胶采用垂直装置进行电泳。目前,一般实验室多用琼脂糖水平平板凝胶电泳装置进行DNA电泳。 琼脂糖主要在DNA制备电泳中作为一种固体支持基质,其密度取决于琼脂糖的浓度。在电场中,在中性pH值下带负电荷的DNA向阳极迁移,其迁移速率由下列多种因素决定: 1、 DNA的分子大小: 线状双链DNA分子在一定浓度琼脂糖凝胶中的迁移速率与DNA分子量对数成反比，分子越大则所受阻力越大，也越难于在凝胶孔隙中蠕行，因而迁移得越慢。 2、琼脂糖浓度 一个给定大小的线状DNA分子,其迁移速度在不同浓度的琼脂糖凝胶中各不相同。DNA电泳迁移率的对数与凝胶浓度成线性关系。凝胶浓度的选择取决于DNA分子的大小。分离小于0.5kb的DNA片段所需胶浓度是1.2-1.5%,分离大于10kb的DNA分子所需胶浓度为0.3-0.7%, DNA片段大小间于两者之间则所需胶浓度为0.8-1.0%。 3、 DNA分子的构象 当DNA分子处于不同构象时,它在电场中移动距离不仅和分子量有关,还和它本身构象有关。相同分子量的线状、开环和超螺旋DNA在琼脂糖凝胶中移动速度是不一样的,超螺旋DNA移动最快,而线状双链DNA 移动最慢。如在电泳鉴定质粒纯度时发现凝胶上有数条DNA带难以确定是质粒DNA不同构象引起还是因为含有其他DNA引起时,可从琼脂糖凝胶上将DNA带逐个回收,用同一种限制性内切酶分别水解,然后电泳,如在凝胶上出现相同的DNA图谱,则为同一种DNA。 4、电源电压 在低电压时,线状DNA片段的迁移速率与所加电压成正比。但是随着电场强度的增加，不同分子量的DNA片段的迁移率将以不同的幅度增长,片段越大,因场强升高引起的迁移率升高幅度也越大,因此电压增加，琼脂糖凝胶的有效分离范围将缩小。要使大于2kb的DNA片段的分辨率达到最大,所加电压不得超过5v/cm。 5、嵌入染料的存在 荧光染料溴化乙啶用于检测琼脂糖凝胶中的DNA,染料会嵌入到堆积的碱基对之间并拉长线状和带缺口的环状DNA，使其刚性更强,还会使线状DNA迁移率降低15％。 6、离子强度影响 电泳缓冲液的组成及其离子强度影响DNA的电泳迁移率。在没有离子存在时(如误用蒸馏水配制凝胶),电导率最小,DNA几乎不移动,在高离子强度的缓冲液中(如误加10×电泳缓冲液),则电导很高并明显产热,严重时会引起凝胶熔化或DNA变性。

琼脂糖凝胶电泳标准操作流程

琼脂糖凝胶电泳操作标准流程 一、实验目的 琼脂糖凝胶电泳是常用的检测核酸的方法，具有操作方便、经济快速等优点。本铜人阵学习DNA 琼脂糖凝胶电泳的使用技术，此关为能力考核，通关成功后，代表具备操作琼脂糖电泳的能力。 二、实验原理 琼脂糖凝胶电泳是常用的用于分离、鉴定DNA 、RNA 分子混合物的方法，这种电泳方法以琼脂凝胶作为支持物，利用DNA 分子在泳动时的电荷效应和分子筛效应，达到分离混合物的目的。DNA 分子在高于其等电点的溶液中带负电，在电场中向阳极移动。在一定的电场强度下，DNA 分子的迁移速度取决于分子筛效应，即分子本身的大小和构型是主要的影响因素。DNA 分子的迁移速度与其相对分子量成反比。不同构型的DNA 分子的迁移速度不同。如环形DNA 分子样品，其中有三种构型的分子：共价闭合环状的超螺旋分子（cccDNA ）、开环分子（ocDNA）、和线形DNA分子（IDNA）。这三种不同构型分子进行电泳时的迁移速度大小顺序为：cccDNA > IDNA >ocDNA 影响核酸分子泳动率的因素主要还是：1、DNA 分子大小；2、琼脂糖浓度； 3、DNA 构想； 4、所用的电压； 5、琼脂糖种类； 6、电泳缓冲液 核酸电泳中常用的染色剂是溴化乙锭（ethidium bromide EB ）。溴化乙锭是一种扁平分子，可以嵌入核酸双链的配对碱基之间。在紫外线照射BE-DNA 复合物时，出现不同的效应。254nm的紫外线照射时，灵敏度最高，但对DNA损伤严重；360nm紫外线照射时，虽然灵敏度较低，但对DNA损伤小，所以适合对DNA样品的观察和回收等操作。300nm紫外线照射的灵敏度较高，且对DNA 损伤不是很大，所以也比较适用。 三、材料、试剂及器具 1、材料 不同大小的基因组片段； 2、试剂 Hind III digest DNA Marker （分子量标准）（TaKaRa）；D2000（TianGen）；

凝胶电泳实验原理与步骤

一、实验目的 学习和掌握琼脂糖电泳法鉴定DNA的原理和方法。 二、实验原理 琼脂糖凝胶电泳是用于分离、鉴定和提纯DNA片段的标准方法。琼脂糖是从琼脂中提取的一种多糖，具亲水性，但不带电荷，是一种很好的电泳支持物。DNA在碱性条件下（pH8.0的缓冲液）带负电荷，在电场中通过凝胶介质向正极移动，不同DNA分子片段由于分子和构型不同，在电场中的泳动速率液不同。溴化乙锭（EB）可嵌入DNA分子碱基对间形成荧光络合物，经紫外线照射后，可分出不同的区带，达到分离、鉴定分子量，筛选重组子的目的。 三、实验材料 实验14提取的DNA样品， 四、器具及药品 电泳仪，电泳槽，紫外透射反射仪，恒温水浴锅，微波炉，微量进样器，三羟甲基氨基甲烷，盐酸，醋酸钠，EDTA，琼脂糖，溴酚蓝，溴化乙锭。 五、实验步骤 1、安装电泳槽 将有机玻璃的电泳凝胶床洗净，晾干，用胶带将两端的开口封好，放在水平的工作台上，插上样品梳。 2、琼脂糖凝胶的制备 称取琼脂糖溶解在电泳缓冲液中，（按0.3-1.5%的琼脂糖含量，1-25kb大小的DNA用1%的凝胶，20-100kb的DNA用0.5%的凝胶，200-2000bp的DNA用1.5%的凝胶）置微波炉或沸水浴中加热至完全溶化（不要加热至沸腾），取出摇匀。 3、灌胶 将冷却到60℃的琼脂糖溶液轻轻倒入电泳槽水平板上。 4、待琼脂糖胶凝固后，在电泳槽内加入电泳缓冲液，然后拔出梳子。 5、加样 将DNA样品与加样缓冲液按4：1混匀后，用微量移液器将混合液加到样品槽中，每槽加10-20μl，记录样品的点样次序和加样量。 6、电泳 安装好电极导线，点样孔一端接负极，另一端接正极，打开电源，调电压至3-5V/cm，电泳1-3hr，当溴酚蓝移到距凝胶前沿1-2cm时，停止电泳。 7、染色和观察 取出凝胶，放在含有溴化乙锭的染色液中染色30min，即可在254nm的紫外灯下观察，有橙红色荧光条带的位置，即为DNA条带，或在紫外灯下照相记录电泳图谱。溴化乙锭是致癌剂，操作时要小心，必须戴手套。 附： ⑴5×TBE（tris-硼酸及EDTA）缓冲液的配制(1000ml)： Tris 54g，硼酸27.5g，0.5mol/L EDTA 20ml，将pH调到8.0，定容至1000ml，4℃冰箱保存，用时稀释10倍。 ⑵加样缓冲液的配制： 0.25%溴酚蓝，40%（W/V）蔗糖水溶液，4℃冰箱保存。 ⑶溴化乙锭的配制： 称取0.1g溴化乙锭，溶于10ml水，配成终浓度为10mg/ml的母液，4℃冰箱保存。染

琼脂糖凝胶电泳 配方与步骤

?RNA琼脂糖凝胶电泳： 配制： 1.0.5M EDTA（pH=8.0）： 100ml：称取18.61g Na2EDTA·2H2O（分子量372.24），加80ml ddH2O剧烈搅拌， 用NaOH调节PH值至8.0（约需2g NaOH）.高压灭菌，室温保存。 2.50×TAE loading buffer:（Tris acetate-EDTA buffer）电泳缓冲液 组分：2M Tris-乙酸；100mM EDTA（pH=8.0） 500mL:称121.1g Trisbase（分子量121.14），加800ml ddH2O溶解，加57.1ml 乙酸和50ml0.5M EDTA溶液（pH=8.0），搅拌，ddH2O定容至500mL.室温保存。 3.1×TAE loading buffer: 取20ml50×TAE，ddH2O定容至1L.室温保存。 4.100×Sybergreen： 500ul：取495ul1×TAE于1.5ml离心管，加入5ul Sybergreen原液混匀，4℃锡纸 避光保存。 注意：Sybergreen原液需稀释10000倍； 6×DNA loading buffer上样缓冲液需稀释六倍，最终稀释倍数应不小于1×。 步骤： 1.制备1%琼脂糖凝胶(大胶用70ml,小胶用50ml，我们用30ml): 称0.3g琼脂糖置于100ml锥形瓶中，加入30ml1×TAE，瓶口倒扣小烧杯。 微波炉加热煮沸3次，至琼脂糖全部融化，摇匀，即成1.0%琼脂糖凝胶液。 2.胶板制备: 取电泳槽内的有机玻璃内槽(制胶槽)洗干净,晾干,放入制胶玻璃板.取透明胶带将玻璃板与内槽两端边缘封好,形成模子.将内槽置于水平位置,并放好梳子. 将冷却到65℃左右的琼脂糖凝胶液混匀小心地倒入内槽玻璃板上,使胶液缓慢展开,直到整个玻璃板表面形成均匀胶层.室温下静置直至凝胶完全凝固,垂直轻拔梳子,取下胶带,将凝胶及内槽放入电泳槽中.添加1×TAE电泳缓冲液至没过胶板为止. 3.加样: 样品制备：（10ul体系/样品槽）于0.25ml离心管中 样品RNA（最后加）:2ul/3ul/5ul 6×DNA loading buffer:10/6=1.7ul 100×Sybergreen：0.1ul DEPC水：至10ul (注意:加样前要先记下加样的顺序).分别将样品加入胶板的样品小槽内,每加完一个样品,应更换一个枪头,以防污染,加样时勿碰坏样品孔周围的凝胶面. 4.电泳: 加样后的凝胶板立即通电进行电泳,电压60-100V,样品由负极(黑色)向正极(红色)方向移动.电压升高,琼脂糖凝胶的有效分离范围降低.当溴酚蓝移动到距离胶板下沿约1cm处时,停止电泳. 5.电泳完毕后,取出凝胶,利用科212凝胶成像系统,在紫外灯（trans UV）下观察拍照 保存.DNA存在则显示出红色荧光条带.RNA完美提出应该是三条带：28，18,5.8。 28和18比较亮,而且28是18亮度的2倍,5.8基本很模糊，可有可无

琼脂糖凝胶电泳

DNA琼脂糖凝胶电泳 跑胶即走电泳，是DNA 和protein 最基本的定性定量方法。一般是琼脂糖胶或page 胶，琼脂糖胶一般是检测DNA的，可以检验一下你到底提到dna没过确定你提dna分子量的大小：page胶一般是检测蛋白特性的，通过page胶里marker的分子量大小来确定你需要的目的蛋白分子量大小，如果有杂带那就可以判断那条带是你需要的目的条带，如果想知道蛋白浓度，还可以在page胶里带上一条定量marker，通过条带粗细，来判断你需要蛋白的浓度。二者原理一致，小分子量用大浓度的胶，大分子量用小浓度的胶，特别小的DNA 用丙烯酰胺凝胶。 一、基本原理 当把一个带净电荷(q)的颗粒放入电场，便有一个电场力(F)作用于其上。F的大小取决于颗粒静电荷量及其所处的电场强度(E)，它们之间的关系可以表示成：F=E×q。 由于F的作用，使带电颗粒在电场中向一定方向泳动。此颗粒在泳动的过程中还受到一个相反方向的摩擦力(f*v)阻挡。当这两种力相等时，颗粒则以速度(v)向前泳动：v=F/f,其中f为摩擦系数。根据Stoke公式，阻力大小取决于带电颗粒的大小、形状以及所处介质的粘度，即f=6πγη, γ为颗粒半径，η为介质粘度。该公式指球形颗粒所受的阻力。代入F＝E×q得到: v=E×q/6πγη.从这个公式可以看出，带电颗粒在电场中泳动的速度与电场强度和带电颗粒的净电荷量成正比，与颗粒半径和介质粘度成反比。 带电颗粒在电场中泳动的速度常用泳动度(m)或者迁移率以下列公式表示：m＝μ/E=d*l/V*t d为带电颗粒泳动的距离(cm)，l为支持物的有效长度(cm)，t为通电时间(s)，V为加在支持物两端的电压。 在一定条件下，任何带电颗粒都具有自己特定的泳动度。它是胶体颗粒的一个物理常数，可用其鉴定蛋白质、核酸等物质的纯度，还可以用其来研究蛋白质、核酸等物质的一些理化性质。影响泳动度的因子有颗粒的性质、电场强度、溶液的性质等。 二、琼脂糖凝胶电泳 通常情况下，核酸类物质的分离、鉴定是采用琼脂糖凝胶(做支持物)电泳法进行的。用琼脂糖分离线性DNA时，其迁移率与该物质分子质量的关系密切，而与结构和碱基组成无关。这也是采用凝胶电泳法测定核酸分子质量的依据所在。此方法除了可以分离线性DNA外，还可以分离、分析细菌质粒的闭环DNA和开环DNA，以及分子质量不等的RNA片段。一般实验室采用的琼脂糖凝胶的浓度为0.3%——2%。不同的凝胶浓度，可以分离不同长度的DNA片段。具体见表格： 琼脂糖凝胶 /% m/V 分离线性DNA片段的范围 /kb 0.3 50---60 0.6 1----20 0.7 0.8---10 0.9 0.5---7.0 1.2 0.4----6.0 1.5 0.3---3.0

(完整word版)DNA的琼脂糖凝胶电泳实验原理和操作步骤

一、实验目的 琼脂糖凝胶电泳是常用的检测核酸的方法，学习DNA琼脂糖凝胶电泳的使用技术，掌握有关的技术和识读电泳图谱的方法。 二、实验原理 琼脂糖凝胶电泳是常用的用于分离、鉴定DNA、RNA分子混合物的方法，这种电泳方法以琼脂凝胶作为支持物，利用DNA分子在泳动时的电荷效应和分子筛效应，达到分离混合物的目的。DNA分子在高于其等电点的溶液中带负电，在电场中向阳极移动。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即分子本身的大小和构型是主要的影响因素。DNA分子的迁移速度与其相对分子量成反比。不同构型的DNA分子的迁移速度不同。如环形DNA分子样品，其中有三种构型的分子：共价闭合环状的超螺旋分子（cccDNA）、开环分子(ocDNA)、和线形DNA分子(IDNA)。这三种不同构型分子进行电泳时的迁移速度大小顺序为:cccDNA＞IDNA＞ocDNA 核酸分子是两性解离分子，pH3.5是碱基上的氨基解离，而三个磷酸基团中只有一个磷酸解离，所以分子带正电，在电场中向负极泳动；而pH8.0-8.3时，碱基几乎不解离，而磷酸基团解离，所以核酸分子带负电，在电场中向正极泳动。不同的核酸分子的电荷密度大致相同，因此对泳动速度影响不大。在中性或碱性时，单链DNA与等长的双链DNA的泳动率大致相同。 影响核酸分子泳动率的因素主要是： 1、样品的物理性状 即分子的大小、电荷数、颗粒形状和空间构型。一般而言，电荷密度愈大，泳动率越大。但是不同核酸分子的电荷密度大致相同，所以对泳动率的影响不明显。 对线形分子来说，分子量的常用对数与泳动率成反比，用此标准样品电泳并测定其泳动率，然后进行DNA分子长度（bp）的负对数——泳动距离作标准曲线图，可以用于测定未知分子的长度大小。 DNA分子的空间构型对泳动率的影响很大，比如质粒分子，泳动率的大小顺序为：cDNA ＞IDNA＞ocDNA但是由于琼脂糖浓度、电场强度、离子强度和溴化乙锭等的影响，会出现相反的情况。 2、支持物介质 核酸电泳通常使用琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶两种介质，琼脂糖是一种聚合链线性分子。含有不同浓度的琼脂糖的凝胶构成的分子筛的网孔大小不同，是于分离不同浓度范围的核酸分子。聚丙烯酰胺凝胶由丙烯酰胺（Acr）在N,N,N′-四甲基乙四胺（TEMED）和过硫酸铵

PCR扩增技术与琼脂糖凝胶电泳检测

实验五 PCR扩增技术与琼脂糖凝胶电泳检测 一、实验目的 1. 掌握PCR扩增技术的基本原理 2. 掌握PCR的常规操作 3. 熟悉PCR反应体系中几种主要成分的作用 4. 了解PCR技术的应用 5. 掌握琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的方法 6. 熟悉DNA在电泳过程中迁移率的决定因素 二、实验原理 1. PCR基本原理 聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction)，简称PCR，是一种分子生物学技术，用于在体外快速扩增DNA，类似DNA的细胞内复制过程:由一对引物介导，通过温度的调节，使双链DNA变性为单链DNA、单链DNA能与引物复性（退火）成为引物-DNA单链复合物、以及在dNTPs存在下DNA聚合酶能使引物沿单链模板延伸成为双链DNA（引物的延伸）；这种热变性-复性-延伸的过程，就是一个PCR循环；一般通过20-30个循环之后，就可获得大量（106倍）的要扩增的DNA片段。 PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成： ①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备； ②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合； ③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链。 重复循环“变性—退火—延伸”三个过程就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。 2. PCR反应体系 3. 琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖凝胶电泳是分离、纯化、鉴定DNA片断的典型方法，其特点为简便、快速。DNA 片断琼脂糖凝胶电泳的原理与蛋白质的电泳原理基本相同，DNA分子在高于其等电点的pH 溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。DNA分子在电场中通过介质而泳动，除电荷效应外，凝胶介质还有分子筛效应，与分子大小及构想有关。对于线形DNA分子，其电场中的迁移率与其分子量的对数值成反比。在凝胶中加入少量溴化乙锭（有毒！），其分子可插入DNA的碱基之间，形成一种光络合物，在254~365nm波长紫外光照射下，呈现桔红色的

琼脂糖凝胶电泳

琼脂糖凝胶电泳 1.原理 琼脂糖凝胶电泳是用琼脂糖作支持介质的一种电泳方法。其分析原理与其他支持物电泳最主要区别是：它兼有“分子筛”和“电泳”的双重作用。 琼脂糖凝胶具有网络结构，物质分子通过时会受到阻力，大分子物质在涌动时受到的阻力大，因此在凝胶电泳中，带电颗粒的分离不仅取决于净电荷的性质和数量，而且还取决于分子大小，这就大大提高了分辨能力。但由于其孔径相当大，对大多数蛋白质来说其分子筛效应微不足道，现广泛应用于核酸的研究中。 蛋白质和核酸会根据pH不同带有不同电荷，在电场中受力大小不同，因此跑的速度不同，根据这个原理可将其分开。电泳缓冲液的pH在6~9之间，离子强度0.02~0.05为最适。常用1%的琼脂糖作为电泳支持物。琼脂糖凝胶约可区分相差100bp的DNA片段，其分辨率虽比聚丙烯酰胺凝胶低，但它制备容易，分离范围广。普通琼脂糖凝胶分离DNA的范围为0.2-20kb，利用脉冲电泳，可分离高达10^7bp的DNA片段。 DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速率向正极方向移动。 2操作流程 准备干净的配胶板和电泳槽 琼脂糖凝胶电泳：水平电泳 注意DNA酶污染的仪器可能会降解DNA，造成条带信号弱、模糊甚至缺失的现象。 (1)电泳方法

一般的核酸检测只需要琼脂糖凝胶电泳就可以；如果需要分辨率高的电泳，特别是只有几个bp的差别应该选择聚丙烯酰胺凝胶电泳；用普通电泳不合适的巨大DNA链应该使用脉冲凝胶电泳。注意巨大的DNA链用普通电泳可能跑不出胶孔导致缺带。 (2)凝胶浓度 对于琼脂糖凝胶电泳，浓度通常在0.5～2%之间，低浓度的用来进行大片段核酸的电泳，高浓度的用来进行小片段分析。低浓度胶易碎，小心操作和使用质量好的琼脂糖是解决办法。注意高浓度的胶可能使分子大小相近的DNA带不易分辨，造成条带缺失现象。 (3)缓冲液 常用的缓冲液有TAE和TBE，而TBE比TAE有着更好的缓冲能力。电泳时使用新制的缓冲液可以明显提高电泳效果。注意电泳缓冲液多次使用后，离子强度降低，pH值上升，缓冲性能下降，可能使DNA电泳产生条带模糊和不规则的DNA带迁移的现象。 三羟甲基氨基甲烷（Tris(hydroxymethyl)aminomethane，一般简称为Tris）是一种有机化合物，其分子式为(HOCH2)3CNH2。Tris被广泛应用于生物化学和分子生物学实验中的缓冲液的制备。例如，在生物化学实验中常用的TAE和TBE 缓冲液（用于核酸的溶解）都需要用到Tris。 (4)电压和温度 电泳时电压不应该超过20V/cm，电泳温度应该低于30℃，对于巨大的DNA 电泳，温度应该低于15℃。注意如果电泳时电压和温度过高，可能导致出现条带模糊和不规则的DNA带迁移的现象。特别是电压太大可能导致小片段跑出胶而出现缺带现象 (5)DNA样品的纯度和状态 注意样品中含盐量太高和含杂质蛋白均可以产生条带模糊和条带缺失的现象。乙醇沉淀可以去除多余的盐，用酚可以去除蛋白。注意变性的DNA样品可能导致条带模糊和缺失，也可能出现不规则的DNA条带迁移。在上样前不要对DNA样品加热，用20mM NaCl缓冲液稀释可以防止DNA变性。 (6)DNA的上样

琼脂糖凝胶电泳技术

电泳检测技术是指利用带电颗粒在电场中能向异性电极泳动这一现象来分离、纯化或分析检测供试品的一种生物化学技术。 原理：许多生物分子都带有电荷，在电场作用下可发生移动，由于混合物中各组分所带电荷性质、数量以及相对分子质量各不相同，使在同一电场作用下，各组分的泳动方向和速率也各有差异，所以在一定时间内，它们移动距离不同，从而可达到分离鉴定的目的。 DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，包括电荷效应和分子筛效应。 琼脂糖是由天然的琼脂加工制得，是一种直链杂聚多糖，溶于热水，形成溶胶，冷却后成为孔径范围从50nm到大于200nm的大网孔径凝胶。由于孔径较大，对一般蛋白质不起分子筛作用，该电泳技术是目前分离、分析DNA片段的标准方法。 DNA琼脂糖凝胶电泳的原理 DNA 分子是两性电解质，在高于其等电点的溶液（pH8.0~pH8.3 DNA分子本身的大小和构型、凝胶浓度决定了DNA分子的迁移速度。）中，碱基几乎不解离，磷酸基团全部解离，DNA 分子带负电荷，在电场中向正极移动。 DNA分子大小对迁移速率的影响：相对分子质量大，迁移慢；相对分子质量小，迁移快。DNA分子构型对迁移速率的影响：迁移速度：闭环﹥直链DNA﹥开环DNA。 琼脂糖凝胶浓度的影响：同样大小的线性DNA片段，在不同浓度的琼脂糖凝胶中的迁移速度不同，浓度越大，迁移的越慢 常用的电泳上样缓冲液含溴酚蓝，有的还含有二甲苯青，这些指示剂可以指示电泳的速度。溴化乙淀（EB）是核酸的染色剂，能插入DNA分子中形成荧光结合物，EB在紫外线照射下的发射荧光。荧光的强度与DNA的含量成正比，从而可以确定DNA片段在凝胶中的位置及估计出待测样品的浓度。 EB是强致癌剂。 电泳操作步骤(整个过程要求带一次性手套 1、胶槽准备 ①将凝胶托盘放入制胶盒中; ②将加样梳垂直插入到制胶盒的小凹槽内，梳齿底端和凝胶托盘有1mm的间隙; ③将制胶盒放在调整好的水平台上。 2、凝胶准备用1×TAE配制1％琼脂糖凝胶。 ①称0.15g琼脂糖置三角瓶中，加15ml 1×TAE; ②微波炉加热大约1分钟，熔化琼脂糖; ③熔化的琼脂糖自然冷却到60～70℃时，加入DNA染料，并轻轻混匀。 3、倒胶：将冷却致60℃的凝胶倒入准备好的制胶盒内，凝胶厚度3～5mm,室温下静置半小时左右冷却，凝胶固化。 4、轻轻拔出固定在凝胶中的加样梳。将带凝胶的凝胶托盘置于电泳槽中，并使样品孔位于电场负极，向电泳槽中加入1×TAE电泳缓冲液，越过凝胶表面即可,出去样品孔的气泡。 6、样品准备：向核酸样品中加入约为样品体积1/10的上样缓冲液，用加样器轻轻混匀。 7、上样：用加样器吸取样品，轻轻的加入到凝胶的样品孔中。加样量一般5-7μl。 8、盖上电泳槽，接通电源，开始电泳。 开始电泳前，再次确认凝胶样品孔处于电场的负极。 电泳条件：5v/cm；时间20-30分钟左右 9、电泳结束后，切断电源，取出凝胶。

琼脂糖凝胶电泳实验

琼脂糖凝胶电泳实验 2011-11-03 09:43:56 来源：生物秀评论：0 我要评论 实验二琼脂糖凝胶电泳实验【实验目的】(1)学习琼脂糖凝胶电泳的基本原理；(2)掌握使用水平式电 泳仪的方法；(3)学习在含有甲醛的凝胶上进行RNA电泳的方法。【实验原理】琼脂糖凝胶电泳是基因工 程实验室中分离鉴定核酸的常规方法。核酸是两性电解质，其等电点为pH2-2.5，在常规的… 实验二琼脂糖凝胶电泳实验 【实验目的】 (1)学习琼脂糖凝胶电泳的基本原理； (2)掌握使用水平式电泳仪的方法； (3)学习在含有甲醛的凝胶上进行RNA电泳的方法。 【实验原理】 琼脂糖凝胶电泳是基因工程实验室中分离鉴定核酸的常规方法。核酸是两性电解质，其等电点 为pH2-2.5，在常规的电泳缓冲液中(pH约8.5),核酸分子带负电荷，在电场中向正极移动。 核酸分子在琼脂糖凝胶中泳动时，具有电荷效应和分子筛效应，但主要为分子筛效应。因此，核酸分子的迁移率由下列几种因素决定： (1)DNA的分子大小。线状双链DNA分子在一定浓度琼脂糖凝胶中的迁移速率与DNA分子量对数成反比，分子越大则所受阻力越大，也越难于在凝胶孔隙中移动，因而迁移得越慢。 (2) DNA分子的构象。当DNA分子处于不同构象时，它在电场中移动距离不仅和分子量有关 ，还和它本身构象有关。相同分子量的线状、开环和超螺旋质粒DNA在琼脂糖凝胶中移动的速度是不一样的，超螺旋DNA移动得最快，而开环状DNA移动最慢。如在电泳鉴定质粒纯度时发 现凝胶上有数条DNA带难以确定是质粒DNA不同构象引起还是因为含有其他DNA引起时，可从琼脂糖凝胶上将DNA带逐个回收，用同一种限制性内切酶分别水解，然后电泳，如在凝胶上出现相同的DNA图谱，则为同一种DNA。 (3)电源电压。在低电压时，线状DNA片段的迁移速率与所加电压成正比。但是随着电场强 度的增加，不同分子量的DNA片段的迁移率将以不同的幅度增长，片段越大，因场强升高引起的迁移率升高幅度也越大，因此电压增加，琼脂糖凝胶的有效分离范围将缩小。要使大于2kb的DNA片段的分辨率达到最大，所加电压不得超过5v/cm。 (4)离子强度影响。电泳缓冲液的组成及其离子强度影响DNA的电泳迁移率。在没有离子存 在时(如误用蒸馏水配制凝胶)，电导率最小，DNA几乎不移动；在高离子强度的缓冲液中(如误加10 X 电泳缓冲液)，则电导很高并明显产热，严重时会引起凝胶熔化或DNA变性。 溴化乙啶(Ethidium bromide, EB) (1) 能插入DNA分子中形成复合物，在波长为254nm紫外 光照射下EB能发射荧光，而且荧光的强度正比于核酸的含量，如将已知浓度的标准样品作电泳

琼脂糖凝胶电泳的操作步骤

琼脂糖凝胶电泳是用琼脂或琼脂糖作支持介质的一种电泳方法。对于分子量较大的样品，如大分子核酸、病毒等，一般可采用孔径较大的琼脂糖凝胶进行电泳分离。 琼脂糖凝胶约可区分相差100bp的DNA片段，其分辨率虽比聚丙烯酰胺凝胶低，但它制备容易，分离范围广，尤其适于分离大片段DNA。普通琼脂糖凝胶分离DNA的范围为 0."2-20kb，利用脉冲电泳，可分离高达10A7bp的DNA片段。 操作流程 准备干净的配胶板和电泳槽 注意DNA酶污染的仪器可能会降解DNA，造成条带信号弱、模糊甚至缺失的现象。 选择电泳方法 一般的核酸检测只需要琼脂糖凝胶电泳就可以；如果需要分辨率高的电泳，特别是只有几个bp 的差别应该选择聚丙烯酰胺凝胶电泳；用普通电泳不合适的巨大DNA 链应该使用脉冲凝胶电泳。注意巨大的DNA链用普通电泳可能跑不出胶孔导致缺带。 正确选择凝胶浓度 对于琼脂糖凝胶电泳，浓度通常在 0."5?2%之间，低浓度的用来进行大片段核酸的电泳，高浓度的用来进行小片段分析。低浓度胶易碎，小心操作和使用质量好的琼脂糖是解决办法。注意高浓度的胶可能使分子大小相近的DNA带不易分辨，造成条带缺失现象。 适合的电泳缓冲液 常用的缓冲液有TAE和TBE而TBE比TAE有着更好的缓冲能力。电泳时使用新制的缓冲液可以明显提高电泳效果。注意电泳缓冲液多次使用后，离子 强度降低，PH值上升，缓冲性能下降，可能使DNA电泳产生条带模糊和不规则的DNA 带迁移的现象。

电泳的合适电压和温度 电泳时电压不应该超过20V/cm，电泳温度应该低于30C，对于巨大的DNA 电泳，温度应该低于15C。注意如果电泳时电压和温度过高，可能导致出现条带模糊和不规则的DNA带迁移的现象。特别是电压太大可能导致小片段跑出胶而出现缺带现象 DNA样品的纯度和状态 是电压太大可能导致小片段跑出胶而出现缺带现象DNA样品的纯度和状态 注意样品中含盐量太高和含杂质蛋白均可以产生条带模糊和条带缺失的现象。乙醇沉淀可以去除多余的盐，用酚可以去除蛋白。注意变性的DNA样品可能导 致条带模糊和缺失，也可能出现不规则的DNA条带迁移。在上样前不要对DNA 样品加热，用20mM NaCI缓冲液稀释可以防止DNA变性。 DNA的上样 正确的DNA上样量是条带清晰的保证。注意太多的DNA上样量可能导致DNA带型模糊，而太小的DNA上样量则导致带信号弱甚至缺失。TIANGEN公司DNA分子量标准每次上样6ul即可得到清晰均匀的条带。 Marker 的选择 DNA电泳一定要使用DNAMarker或已知大小的正对照DNA来估计DNA片段大小。Marker 应该选择在目标片段大小附近ladder 较密的，这样对目标片段大小的估计才比较准确。TIANGEN公司的DNA Marker条带清晰，亮度均匀，质量稳定，是您实验的首选。需要注意的是Marker的电泳同样也要符合DNA电泳的操作标准。如果选择QNA/HindHI或者QNA/EcoRI的酶切Marker，需要预先65C加热5min，冰上冷却后使用。从而避免HindHI或EcoRI酶切造成的粘性接头导致的片段连接不规则或条带信号弱等现象。 凝胶的染色和观察 实验室常用的核酸染色剂是溴化乙啶（EB）,染色效果好，操作方便，但是稳定性差，具有毒性。而其他系列例如SYBR Green GelRed虽然毒性小， 但价格昂贵。TIANGEN公司的GeneGreen相比则是性价比高的低毒替代染料，其灵敏度比传统EB染料高10倍以上。注意观察凝胶时应根据染料不同使用合适的光源和激

琼脂糖凝胶电泳的操作步骤

琼脂糖凝胶电泳的操作步骤如下： 1. 制备1%琼脂糖凝胶(大胶用70ml,小胶用50ml):称取0.7 g(0.5 g)琼脂糖置于锥形瓶中,加入70 ml(50ml)1×TAE,瓶口倒扣小烧杯.微波炉加热煮沸3次至琼脂糖全部融化,摇匀,即成1.0%琼脂糖凝胶液. 2. 胶板制备:取电泳槽内的有机玻璃内槽(制胶槽)洗干净,晾干,放入制胶玻璃板.取透明胶带将玻璃板与内槽两端边缘封好,形成模子.将内槽置于水平位置,并在 固定位置放好梳子.将冷却到65℃左右的琼脂糖凝胶液混匀小心地倒入内槽玻 璃板上,使胶液缓慢展开,直到整个玻璃板表面形成均匀胶层.室温下静置直至凝 胶完全凝固,垂直轻拔梳子,取下胶带,将凝胶及内槽放入电泳槽中.添加 1×TAE电泳缓冲液至没过胶板为止. 3. 加样:在点样板或parafilm上混合DNA样品和上样缓冲液,上样缓冲液的最终稀释倍数应不小于1X.用10 ul微量移液器分别将样品加入胶板的样品小槽内, 每加完一个样品,应更换一个加样头,以防污染,加样时勿碰坏样品孔周围的凝胶面.(注意:加样前要先记下加样的顺序). 4. 电泳:加样后的凝胶板立即通电进行电泳,电压60-100V,样品由负极(黑色)向正极(红色)方向移动.电压升高,琼脂糖凝胶的有效分离范围降低.当溴酚蓝移动 到距离胶板下沿约1cm处时,停止电泳. (5)电泳完毕后,取出凝胶,用含有0.5 ug/ml的溴化乙锭1×TAE溶液染色约20 min,再用清水漂洗10 min. (6)观察照相:在紫外灯下观察,DNA存在则显示出红色荧光条带,采用凝胶成像系统拍照保存 实验原理 闭合环状质粒、线性质粒和开环质粒DNA由于构形不同，在加溴化乙锭的琼脂糖凝胶电泳上呈现不同的迁移率，因而在紫外灯下观察，能区别闭合环状质粒DNA（cccDNA）、线性质粒DNA（L-DNA）和开环质粒DNA（ocDNA）。 实验材料和试剂 （一）实验样品 质粒pUC118 （二）试剂 1．l DNA/HindIII分子量标准 2．溴酚蓝指示剂点样缓冲液 0.2% 溴酚蓝 50% 蔗糖 3．1mg/ml溴化乙锭溶液 4．电泳缓冲液（TAE） 40 mmol/L Tris-乙酸 1 mol/L EDTA (配制方法：24.2克Tris碱，5.71ml冰乙酸，10ml 0.5mol/L EDTA(pH8.0)，定容至5000ml） 5．0.7% 琼脂糖凝胶

RNA的琼脂糖凝胶电泳实验原理和步骤

RNA的琼脂糖凝胶电泳实验原理和步骤 关键词：RNA琼脂糖电泳2012-03-09 00:00 来源：互联网点击次数：38148 一、实验目的 掌握植物总RNA非变性胶电泳的原理和方法。 二、实验原理 RNA电泳可以在变性及非变性两种条件下进行。非变性电泳使用%%的凝胶，不同的RNA条带也能分开，但无法判断其分子量。只有在完全变性的条件下，RNA 的泳动率才与分子量的对数呈线性关系。因此要测定RNA分子量时，一定要用变性凝胶。在需快速检测所提总RNA样品完整性时，配制普通的1%琼脂糖凝胶即可。 三、实验材料、器具及药品

蘑菇的总RNA溶液。电泳仪，电泳槽，电子天平，移液器，枪头，微波炉，紫外透射检测仪等。琼脂糖，1XTAE电泳缓冲液，μg/ml溴化乙锭（EB）10X载样缓冲液。 四、实验步骤 （1）用1×TAE电泳缓冲液制作琼脂糖凝胶，加1×TAE电泳缓冲液至液面覆盖凝胶。 （2）在超净工作台上，用移液器吸取总RNA样品4μl于封口膜上。在实验台上再加入5μl 1×TAE电泳缓冲液及1μl 的10X载样缓冲液，混匀后，小心加入点样孔。 （3）打开电源开关，调节电压至100V，使RNA由负极向正极电泳，约30min 后将凝胶放入EB染液中染色5min,用清水稍微漂洗。在紫外透射检测仪上观察RNA电泳结果。

RNA的变性琼脂糖凝胶检测 试剂： （1）MOPS缓冲液（10*）:L 吗啉代丙烷磺酸（MOPS），L NaAc, 10mol/L EDTA。 （2）上样染料：50%甘油，1mmol/L EDTA ,%溴酚蓝，%二甲苯蓝。 （3）甲醛。 （4）去离子甲酰胺。v电泳槽清洗：去污剂洗干净（一般浸泡过夜）——水冲洗——乙醇干燥——3%H2O2灌满——室温放置10分钟——%DEPC水冲洗。 操作： （1）将制胶用具用70%乙醇冲冼一遍，晾干备用。 （2）配制琼脂糖凝胶。

DNA的琼脂糖凝胶电泳实验原理和方法步骤

DNA的琼脂糖凝胶电泳实验原理和方 法步骤 琼脂糖凝胶电泳是用于分离、鉴定和提纯DNA片段的标准方法。琼脂糖是从琼脂中提取的一种多糖，具亲水性，但不带电荷，是一种很好的电泳支持物。DNA 在碱性条件下（pH8 0的缓冲液）带负电荷，在电场中通过凝胶介质向正极移动，不同DNA分子片段由于分子和构型不同，在电场中的泳动速率液不同。溴化乙锭（EB）可嵌入DNA分子碱基对间形成荧光络合物，经紫外线照射后，可分出不同的区带，达到分离、鉴定分子量，筛选重组子的目的。… 一、实验目的 学习和掌握琼脂糖电泳法鉴定DNA的原理和方法。 二、实验原理 琼脂糖凝胶电泳是用于分离、鉴定和提纯DNA片段的标准方法。琼脂糖是从琼脂中提取的一种多糖，具亲水性，但不带电荷，是一种很好的电泳支持物。DNA在碱性条件下（pH8.0的缓冲液）带负电荷，在电场中通过凝胶介质向正极移动，不同DNA分子片段由于分子和构型不同，在电场中的泳动速率液不同。溴化乙锭（EB）可嵌入DNA分子碱基对间形成荧光络合物，经紫外线照射后，可分出不同的区带，达到分离、鉴定分子量，筛选重组子的目的。 三、实验材料 实验14提取的DNA样品， 四、器具及药品 电泳仪，电泳槽，紫外透射反射仪，恒温水浴锅，微波炉，微量进样器，三羟甲基氨基甲烷，盐酸，醋酸钠，EDTA，琼脂糖，溴酚蓝，溴化乙锭。 五、实验步骤 1、安装电泳槽 将有机玻璃的电泳凝胶床洗净，晾干，用胶带将两端的开口封好，放在水平的工作台上，插上样品梳。 2、琼脂糖凝胶的制备 称取琼脂糖溶解在电泳缓冲液中，（按0.3-1.5%的琼脂糖含量，1-25kb大小的DNA用1%的凝胶，20-100kb的DNA用0.5%的凝胶，200-2000bp的DNA用1.5%的凝胶）置微波炉或沸水浴中加热至完全溶化（不要加热至沸腾），取出摇匀。 3、灌胶 将冷却到60℃的琼脂糖溶液轻轻倒入电泳槽水平板上。 4、待琼脂糖胶凝固后，在电泳槽内加入电泳缓冲液，然后拔出梳子。 5、加样 将DNA样品与加样缓冲液（loading buffer）按4：1混匀后，用微量移液器将混合液加到

DNA琼脂糖凝胶电泳原理

琼脂糖凝胶电泳进行DNA/RNA定量原理 DNA（RNA）定量分析可用紫外光谱分析，原理是DNA（RNA）分子在260 nm处有特异的紫外吸收峰，且吸收强度与DNA(RNA)的浓度成正比。此外，还可通过琼脂糖凝胶电泳上显示的DNA（RNA）带的亮度来分析，因为EB 作为一种荧光染料，能插入DNA(RNA)的碱基对平面之间而结合于其上，在紫外光的激发下产生荧光，DNA(RNA)分子上EB的量与DNA分子的长度和数量成正比。在电泳时加入已知浓度的DNA（RNA）Marker作为DNA（RNA）分子量及浓度的参考，样品DNA(RNA)的荧光强度就可以大致表示DNA （RNA）量的多少。这种方法的优点是简便易行，可结合琼脂糖凝胶电泳分析DNA(RNA)样品的完整性来进行，缺点是不太准。 琼脂糖凝胶的配制 根据所需凝胶的浓度秤取琼脂糖，加入相应电泳缓冲液中，用微波炉加热煮沸至琼脂糖完全溶解，加入适量 EB 混匀，适当冷却后倾入凝胶铸槽中，插入梳子，凝胶厚度不超过梳孔，如有气泡产生则用玻璃棒驱除，不能过早拔除梳子，应待凝胶完全凝结后才能拔除梳子。 3．P1、P2、P3的配制P1 的配制：在 800ml 去离子水中溶入 Tris 碱 6.06g， Na2EDTA?2H2O 3.72g，用 HCl 调整 pH 至 8.0，用去离子水调整容积至1升，每升P1内加入RNaseA100mg。 P2 的配制：在 950ml 去离子水中溶入 NaOH 8.0g，20％SDS 50ml，调整容积至 1 升。 P3 的配制：在 500ml 去离子水中溶入醋酸钾 294.5g，用冰醋酸调整 pH 值至 5.5，用去离子水调整容积至1升。 4．常用缓冲液： TE pH 7.4 10mmol/LTris?Cl （pH7.4） 1mmol/L EDTA（pH8.0）