二代测序(NGS)实验方案和应用

这里为您介绍二代测序的相关流程和应用。

随着人类基因组工程的完成，对于低花费的测序技术的需求促进了高通量二代测序技术的发展。这些新的测序平台允许进行高通量测序，具有广泛的应用：

?全基因组从头测序或者重测序

?目标序列重测序

?转录组分析

?微生物组研究

?基因调控研究

NGS 序列

二代测序仪器有很多种组合，在通量、片段长度、准确度、每一轮测序成本、每百万碱基对测序成本、初始成本、规格和技术方面存在存在差异。

从规格和初始成本的角度而言，二代测序仪器可轻松地分类为更窄的围，也就是所谓的“台式测序仪”和高通量仪器。

台式测序仪使得任何实验室都可以像使用real-time PCR一样，自己进行测序。这些仪器可以和一些靶标序列富集技术相结合，用在一些临床的应用中，其中：选定的靶标基因用于深度分析，以检测稀有的突变，或者检测多样样本中（比如癌症样本）中的突变。目前，这些仪器的通量在10 Mb到7.5 Gb之间，但是随着硬件，软件和试剂的持续改善，通量也在稳步增加。

高通量测序仪非常适合于大量的，基因组围的研究，每次测序能测定600 Gb的序列。一些这样的高通量和高精度的平台，能测定的片段长度相对较短，这对于高重复性的序列和未知基因组的从头测序就可能成为问题。与此相反，也有一些仪器能测序的片段较长（达到2500 bp），但是其精度和测序能力（90 Mb）要低很多。还有一些测序能力位于两者之间的仪器（~800 bp，700 Mb）。

因此，应用决定了哪一种仪器是最合适的。

有一种新的方法被称作“纳米孔测序”。这种技术中，根据一个DNA链通过一个合成的或者蛋白纳米孔道所引起的电流的改变，可以确定通过这个孔道的碱基。这理论上可以仅用一步就测序一个完整的染色体，而不需要生成新的DNA链。

DNA测序

二代DNA测序的工作流程如下：

?DNA样本制备

?文库构建和验证

?文库分子大规模平行克隆扩增

?测序

二代测序DNA样本的质量控制

首先，评价基因组DNA的质量是非常必要的（完整性和纯度）。

凝胶电泳法

基因组DNA的完整性和大小，可以用常规或者脉冲场琼脂糖凝胶电泳(PFGE)来检测。常规的凝胶电泳的精确度不高，这是因为大的DNA 分子在凝胶中移动的时候，本质上是用一种与尺寸无关的方式一起移动的。但是，它仍然能够提供完整性（大小围）和纯度（RNA污染物在凝胶底部形成脱尾条带）方面的有效信息。因此，它仍然是评价基因组DNA质量的有效方法之一。

注：RNA污染会导致DNA浓度高估，并且抑制一些下游步骤。如果能肯定有RNA污染，则可使用去DNase的RNase I处理样本。

分光光度测定法

分光光度仪在260 nm和280 nm处读数的比例（A260/A280）可以用来估计DNA相对于一些吸收紫外光的杂质（比如蛋白）的纯度。纯净的DNA的A260/A280比例大约为1.7–1.9。

注：想要获得精确的A260/A280值，需要在弱碱性的缓冲溶液中测定吸光度(比如, 10 mM Tris?Cl, pH 7.5)。

第二个步骤是测定基因组DNA的浓度。

分光光度法

DNA的浓度可以通过使用分光光度仪测定其在260 nm波长的吸光度来确定。Nanodrop目前被广泛使用，因为它需要的样本量少(1 μl)，并且使用方便（不需要比色皿）。为了确保结果的可靠性，读数应该在0.1到1.0之间。

注：吸光度测定不能区别DNA和RNA。RNA污染物会导致DNA浓度高估。但是，纯净RNA的A260/A280比值在2.0左右，而纯净的DNA大约为1.8。因此，如果这个值为1.95，那么说明样本里面有RNA杂质。

注：苯酚在270–275 nm的波长围有最大的吸光度，非常接近于DNA。因此苯酚能提高样本在260 nm附近的吸光度，从而导致高估DNA 的产量和纯度。

荧光法

荧光法使用荧光染料测定DNA的浓度，具有特异性和灵敏性。Hoechst 33258结合到DNA上后，能增大458 nm波长附近的发光强度，除此之外，也可以使用一些更加灵敏的荧光染料，比如PicoGreen染料。基于PicoGreen染料的实验，比紫外吸光光度法灵敏10，000倍，而比使用Hoechst 33258染料的方法至少灵敏400倍。和紫外吸光光度法不同，PicoGreen实验对双链DNA的选择性要远高于RNA和单链DNA。

DNA标准品和样本与荧光染料混合，并且使用荧光计检测。将样本的测定结果与标准品的测定结果相比较，以确定DNA的浓度。

Real-time PCR

可以使用real-time PCR 技术来测定DNA样本的数量和质量。多重PCR技术使用引物集在多个位点扩增不同大小的片段，是检测DNA损伤和片段化的有效质控手段。此类技术试验专门测定可经PCR扩增，适于二代测序的DNA分子。上述提到的这些常规方法，通常不能测定的样本中扩增得到的DNA的量，或者会高估了DNA的量。与它们相比，real-time PCR更加适用于预测DNA样本是否适合于二代测序。

文库制备

对于大多数商业化的二代测序平台，使用诸如桥式扩增或者乳液PCR方法，对文库中的DNA片段进行克隆扩增，以产生足够拷贝数量的测序模板非常必要。通过将平台特异性的适配子与感兴趣的DNA源（比如基因组DNA、双链cDNA或者PCR扩增子等所产生的DNA片段）退火，得到片段文库。适配子序列的存在，使得我们可以对文库分子进行选择性的克隆扩增。因此，这种方法不需要像传统的方法那样，在微生物中间体中，对基因组片段进行微生物克隆。另外，适配子序列中，还含有平台特异性的测序引物的结合位点。

通常情况下，一个常规的DNA文库构建方案包含四步：

?片段化DNA

?对DNA片段进行末端修复

?连接适配子序列（不适用于单分子测序）

?对可选的文库进行扩增

目前有四种方法用于产生基因组DNA碎片：酶消化法、超声波法、喷雾法和水动力剪切法。这四种方法都可以用于文库构建，但是每一种方法都有其优点和局限性。核酸切酶消化的方法快速并且容易，但是难以精确的控制片段长度的分布。另外这种方法可能会对基因组DNA的呈递引入偏倚。另外三种技术使用物理的方法将DNA的双链打断，这种断裂是随机的，因此能在文库中对DNA进行无偏的呈递。可以使用琼脂糖凝胶电泳或者自动化的DNA分析方法，对DNA片段的尺寸分布进行控制。

片段化DNA之后，需要将DNA修复，产生5’磷酸化的平末端DNA，以便能够和测序平台特异性的适配子相连接。文库构建的效率直接依赖于DNA末端修复的效率和准确性。

末端修复混合溶液将5’或者3’的粘性末端转变成5’磷酸化的平末端DNA。在大多数情况下，末端修复通过T4 DNA聚合酶的5’—3’聚合酶活性和3’—5’的核酸外切酶活性完成。而T4多聚核苷酸激酶确保平末端的DNA片段5’端的磷酸化，以便进行后续的适配子连接。

根据所使用的测序平台，平末端DNA片段可以直接与适配子连接，或者需要在其片段的3’端增加一个单独的突出的腺苷酸A，以便与平台特异性适配子上突出的胸苷酸T相互配对。通常情况下，使用Klenow片段（具有最低的3’到5’端的核酸外切酶活性），或者使用其它具有末端转移酶活性的聚合酶催化这一步骤。

T4 DNA连接酶将双链的适配子与文库片段修复过的末端相连，然后使用回收反应或者根据DNA的尺寸，选择性去除文库中未连接的适配子和适配子二聚体。大小筛选方法包括使用琼脂糖凝胶电泳分离，使用磁珠或者使用高等的基于柱的纯化方法。在连接过程中可能出现适配子的二聚体，它们会和与适配子连接的文库片段共同扩增，从而降低测序平台对真正文库片段测序的能力并且降低测序的质量，因此在测序之前，必须将它们从文库中除去。一些测序平台要求文库片段的长度分布在比较窄的围，以得到最佳的结果，很多时候，这只能通过去除凝胶电泳上的相应的片段条带实现。这种方法也可以用来去除适配子二聚体。

完成这一步骤之后，应该对DNA片段文库的质量进行检测，并进行定量检测。根据浓度和测序文库的适配子设计，既可以直接稀释溶液并用于测序，也可以对文库进行选择性扩增。在文库扩增阶段，使用高保真的DNA聚合酶，合成完整的适配子序列，通过与PCR引物的重叠，用于后续的克隆扩增和与测序引物结合，或者提高DNA文库的产量。为了得到最佳的文库扩增结果，要求DNA聚合酶具有高保真性和最小的序列偏倚。

文库质量评估方法，参见NGS文库质控。

为了充分利用测序能力，不同样本得到的测序文库可以放在一起，在同一轮实验中一同测序。通过将DNA片段与具有不同特征的适配子相连接，可以实现这一过程，即对于每一个样本使用不同的短核苷酸序列作为适配子。

有一些其它的方法可以用于简化文库构建。有一种新方法使用转位酶/DNA的复合物进行体外转座，以便在同一个试管中同时将DNA片段化并标记。通过对所标记的DNA片段进行有限次数的PCR扩增，可以构建完整的测序文库，这节省了操作步骤和时间。但是，使用体外转座构建的文库，与传统方法构建的文库相比，具有更高的序列偏倚。

NGS文库质控

高质量的文库是成功进行第二代测序的关键。文库构建包含复杂的步骤，比如片段化样本、修复末端、将末端腺苷酰化、连接适配子和扩增文库。根据使用的平台和文库类型，这些步骤也会发生变化。监控每一个步骤非常必要，包括在片段化样本之后检查片段的尺寸，以及连接适配子之后检查片段的大小和浓度。文库验证过程中，需要分析文库中片段的大小和数量，这是质控的最后步骤。

评估文库中片段的大小

琼脂糖和PAGE凝胶电泳是传统的检测片段大小的方法，它们比较耗时。

最近，基于微流技术的电泳或者毛细管电泳越来越广泛的用于检测片段的大小和浓度。即买即用的芯片和胶盒省去了配置凝胶的步骤，使用方便。它们具有更高的通量，并且省去了很多的手动操作时间。除此之外，它们的灵敏度更高（对于检测的限制更少），并且能完全自动化的获取数据和输出电子化的数据资料。这些仪器能同时检测片段的大小和浓度。

?测定文库中的片段数量

?分光光度法和荧光法

?参见分光光度法和荧光法

电泳设备

如前所述，基于微流技术的电泳和毛细管电泳除了提供片段大小的信息之外，还提供了定量检测数据。但是，电泳、分光光度法和荧光法的一个共同的局限性是，都只检测总的核苷酸的浓度，而非与适配子连接的分子的浓度。

Real-time PCR

将适配子连接到文库分子的两端，使得可以在平行的PCR扩增步骤中扩增上百万个独立的DNA分子（乳液PCR或者桥式PCR）。在有些仪器中，乳液PCR可以将一个DNA分子扩增到数百万个相同序列的拷贝，并全都结合在同一个珠子上。在另一种平台上，桥式PCR能够将一个DNA分子转变成一个包含相同序列的多个拷贝的DNA簇。因此，两端连接了适配子的扩增之后的分子，决定了乳液PCR中模板和珠子的比例以及桥式PCR中产生的最佳DNA簇。

对扩增后的文库中的分子进行精确的定量检测，对于确保片段的质量和高效的获得数据是非常重要的。低估扩增文库中的分子数量，会导致混杂的信号以及难以解析的数据；相反地，高估分子的数量会降低结合模板的珠子或者DNA簇的产量，并且没有充分利用测序能力。

Real-time PCR能够特异性的定量检测两端结合有适配子的DNA分子，因此能够对扩增文库中的分子进行高度精确的定量检测。Real-time PCR的灵敏性非常高，可以对浓度非常低的文库分子进行定量检测，即使其浓度低于传统方法可以检测的阈值。因此，这种方法能尽量减少对文库的扩增，降低可能的偏倚。

用于决对定量检测的数字PCR

数字PCR能够对二代测序的文库进行绝对定量检测，而不需要标准品。这个技术对文库进行有限的稀释，并进行大量独立的PCR反应；

因此，大多数反应没有模板，得到阴性的结果。一个单独的阳性PCR反应统计为一个单独的模板分子。通过统计所有阳性PCR的数量，能够确定文库分子的绝对数目。数字PCR的主要优点在于：

?单分子的敏感性

?与PCR扩增的效率无关，因为成功的扩增被统计为一个分子，而与最终产物的数量无关

但是，这种技术需要特殊的仪器，并且花费较高，因此尚未广泛用于文库定量检测。

因组学Metagenomics

DNA测序的应用领域之一是因组领域，即从环境样本中直接回收的遗传物质的非培养研究。因组学是指一个环境样本中所包含的所有微生物基因组的功能和序列分析。这个词汇起源于“meta”（在这里指对于基因多样性的系统性理解）和“genomics”（对一个物种的遗传物质的综合分析）。

因组不是一个新的学科，但由于二代测序技术所带了的诸多可能性，因组的应用经历了巨大的提升。

据估计，微生物中仅有1%左右是可培养的，因此因组学的研究能极大的拓展我们对于环境的认识。

很多年以来，“因组”这个词汇仅与环境样本的分析有关，比如，分析从极端的生存环境下分离得到的DNA，以便发现能用于工业的新的生物催化剂。但是，通量的极大提高，以及所花费的费用和时间的降低，将这个领域的应用扩展到了很多其他方面。

因组学可分成几个领域，包括：

?病理基因组学/感染基因组学

?微生物组分析

?环境因组学

注：这并不是全面的分类，研究者可以选择其他的分类标准。

病理基因组学/感染基因组学和疾病的诊断相关，用于确定有疾病症状的患者体未知的病原体。这通常是极具挑战性的过程，因为微生物的数量可能非常少（每毫升血液概有1–10个细胞）。

与之相反，微生物组分析则涉及到数量巨大的微生物，比如口腔或者直肠拭子中的微生物。此时，我们的目标是分析这些菌群的组成。

考虑到人体仅包含1%的人类细胞而其它99%都是微生物细胞，微生物组分析在未来的诊断技术中有潜在的巨大应用。更多细节，请见人类微生物组工程(https://www.wendangku.net/doc/243447270.html,)。

环境因组学的目标除了包括传统的寻找新的生物催化剂之外，还包括研究和鉴定栖息环境。

从理论上来讲，环境因组学有两种不同的研究方法：

?全基因组分析：对所有存在的DNA进行测序

?16S分析：仅对16S rRNA DNA进行测序

第一种方法只是简单的对样本中存在的所有DNA进行测序。这可以完整地描绘所有出现过的微生物，并且可能发现新的酶或者酶家族，

以及抗生素的抗性。另一方面，这种方法需要较高的测序能力，因而，相对于第二种方法，其通量较低并且花费较高。与此相关的进一步的方在研发。

在因组的应用中，通常需要能提供较高的片段长度的测序仪，这是因为通常没有参考序列可供参照。对于16S rRNA分析而言，测序仪的读长需要覆盖整个区域（另请参照二代测序仪）。

RNA 测序

RNA测序（RNA-seq）是使用深度测序技术来研究生物体转录组的方法。此方法在构建合适的文库之后，对样本中的RNA直接测序，得到丰富的数据集以进行分析。这项技术的高灵敏度和高分辨率使得它成为研究整个转录情形的有价值的工具。数据的定量性以及测序技术的高动态围使得其对基因表达的分析具有高度的灵敏性。数据的单个碱基的分辨率提供了关于单核苷酸多态性(SNP)、选择性剪接、外显子/含子边界、非翻译区及其它元件的详细信息。除此之外，RNA-seq不需要预先知道参考序列，这使得从头的转录组分析和新的变异体和突变体的检测成为可能。RNA-seq是研究转录组的强大、革命性方法，但是使用这种技术需要非常仔细以获得最高质量的数据。

RNA-seq中需要考虑的因素

第一个需要考虑的因素是样本富集。总RNA通常只包含比例很少的编码RNA或者功能RNA；样本部分RNA是核糖体RNA（rRNA：大约占到了总RNA的80–90%）和较少的转运RNA (tRNA)。为了避免将80–90%的测序资源用在重复的rRNA序列上，通常在测序之前，需要从样本中去除rRNA。这通常可以通过特定的消耗rRNA实现，也可以通过使用寡聚胸腺嘧啶富集技术选择性富集Poly A实现。消耗rRNA的方法可以同时保留编码RNA和非编码RNA（一项非常重要的研究容）的信息，而Poly A富集则仅保留了编码mRNA。Poly A富集可能会丢掉特定的RNA和具有高转换率的RNA。

有一些其他的方法可以避免rRNA的影响，比如选择性降解大量转录物，或者不扩增rRNA的扩增技术。但是这些方法不像rRNA消耗或者poly A富集那么常见，并且可能扭曲转录物表征的正常水平。

另外一个需要考虑的因素是要研究的RNA的大小。RNA转录物跨越比较大的大小围；与常规的RNA分析相比，关注小RNA的实验（比如microRNA或者长度围在15–35bp的RNA），需要特别的纯化和文库构建方案。大多数其他大小的RNA片段可以同时测序（RNA测序的常用步骤之一是将RNA分割成普通长度，比如200–300 nt长度的片段）。

RNA-seq测序操作步骤

一旦确定了移除核糖体的方法和要研究的片段大小，就可以将RNA构建成一个文库。对于大多数测序仪器而言，这包括首先将RNA打碎成片段，其次通过逆转录方法构建双链cDNA。在后续的文库构建过程中，这些双链的cDNA被当作普通的基因组DNA来对待。如果想要保留RNA的直接信息（链型），必须使用修改过的文库构建方案，比如将mRNA与连接适配子直接相连，或者标记cDNA的一条链以便在测序之前移除。

在进行测序计划过程中，需要考虑三个主要的因：测序深度、读长和是否使用双端测序数据。测序深度可以提供RNA转录物的丰度信息，并且较大的测序深度使得对于稀有转录物的检测更加灵敏。读长也很重要，因为较长的读段对于检测剪接事件更加灵敏（含子–外显子边界，外显子–外显子边界）。双端测序数据能提供更多关于转录物结构的信息，特别是相互分隔的较远的外显子。一般而言，从头分析以及寻找新的结构变异要求较高的测序深度和读长，并且会得益于双端测序数据。典型的测序应用包含100–200 M片段，长度为2 x 50–100 bp。与之相反，表达分析得益于较高的测序深度，但是读长和双端测序数据则对结果的改善作用较小。这方面应用的一个典型实验包含10–30 M片段，读长为1 x 35–100 bp。

基因调控研究

二代测序技术也是研究基因调控网络的强有力的工具。比如ChIP-seq技术(染色质免疫共沉淀测序)可以用于分析蛋白-DNA的相互作用。二代测序技术也能用于确定基因组的全局甲基化模式。

ChIP-Seq

染色质免疫共沉淀技术(ChIP)是用于研究转录因子和修饰组蛋白基因调控机制的强大、多功能方法。这种技术用于确定活细胞中染色质上那些与转录因子、共调节因子、修饰组氨酸、染色质重塑蛋白或者其它的核因子相互结合的区域。

整个操作过程非常耗时，包含了很多步骤和变量，每一个步骤都需要研究者根据自己的模型体系进行优化。将细胞与甲醛交联之后，将染色质中共价相连的基因组DNA和核因子复合物分离出来，然后经过超声波处理，剪切成可以处理的大小。抗体与目标核蛋白特异性免疫共沉淀时，也将与这些核蛋白特异性结合的基因组DNA也沉淀下来了。去除化学交联并经过核酸纯化处理的这些DNA可用于测序、基于微阵列的基因组杂交或者PCR扩增。ChIP与二代测序技术联用（ChIP-Seq）可研究与感兴趣蛋白相结合的位点在基因组的围的分布。与微阵列分析(ChIP-Chip)相比，ChIP-Seq技术提供了较高的空间分辨率，动态围和基因组覆盖度，因而它对于DNA结合位点的检测具有超级的灵敏度和准确度。另外，ChIP-Seq技术通常只要很少的起始样本输入量，并且不需要杂交探针，具有较高的灵活性，任何测序过基因组的物种都可以使用这种方法进行研究。

高效的ChIP-Seq过程需要优化几个关键的变量。首先，甲醛交联的温度和时间需要优化。如果蛋白和DNA交联的过于紧密，则在测序之前无法将染色质有效地打碎成片段，并且去除交联也会遇到困难。通常情况下，最好以在37°C下与1%的甲醛共培育10分钟起始，然后在此基础上进一步优化。

有几种不同的方法可以将染色质打成碎片，比如超声波和酶消化（比如使用微球菌核酸酶）。如果使用二代测序技术来分析免疫共沉淀的DNA，染色质碎片的大小应在大约100–300核苷酸长度围，并且每一个测试系统中（细胞的类型、组织的类型），将染色质打碎成片段的参数也需要严格优化。

ChIP实验的成功与否取决于所使用的抗体的量和特异性。最好选用能从多家抗体厂商处获得的，经过ChIP实验验证的抗体。为了确定抗体能特异性地沉淀目标蛋白，可以使用蛋白印迹技术检测核提取物。如果在结果中，仅能观察到一条特定大小的条带，则可认为该抗体是特异性的。使用选定的抗体进行免疫共沉淀，然后通过蛋白印迹分析技术确定抗体是否能特异性的沉淀目标蛋白。如果这样的实验失败了，那么还可以将选定的抗体与培养的细胞进行免疫荧光试验。如果仅有细胞核显色，则说明抗体至少能特异性的识别一种位于细胞核并可结合到DNA上面的蛋白。

根据目标蛋白的丰度，经过验证的抗体的量以及用于免疫共沉淀的染色质的量必须经过优化，以便获得足够的DNA进行测序。对于识别组蛋白和组蛋白修饰的抗体而言，每一次免疫共沉淀反应大概需要100，000到1百万个细胞中的染色质。如果转录因子与DNA结合的动态性较高或者与组蛋白相比，仅在有限的基因组位点上结合，那么实验就需要更多的染色质。为避免多余的抗体与非目标蛋白和染色质的非特异性结合，同时保证能沉淀足够多的目标蛋白，每一次免疫共沉淀反应使用的抗体的数量也非常重要。通常而言，1–10 μg的抗体即可得到合理的结果。

可以用对照反应来比对ChIP反应的特异性。在平行的ChIP反应中，使用同样数量的染色质，可以使用同型的对照抗体或者没有抗体的珠子用来比照抗体和珠子与蛋白和染色质的非特异性的结合。通过比较阴性对照样本和ChIP样本中在特定位点沉淀的DNA的量，能计算这个位点的富集因子。但是，在这种免疫共沉淀对照实验中得到的沉淀物的量通常很少，不足以提供足够的片段进行二代测序。因此，ChIP-Seq实验通常使用输入对照样本作比对。在这种情况下，每个ChIP反应常有1%交联并且打碎的染色质被用来去除交联并且与沉淀的样本一同纯化并进行后续的深度测序。这使得我们可以比对由于打碎染色质所引起的偏移，这些偏移表现在染色质的局部结构，DNA

扩增，测序，拷贝数量的变化，以及测定基因组区域的能力。

在沉淀的DNA碎片去除交联和纯化之后，建议使用real-time PCR技术确认与目标蛋白结合的基因组位点的回收和富集效果。通过比较

输入对照组与ChIP样本的qPCR结果，可以计算出输入物质的回收比例（ΔC T方法）。如果使用了同型对照抗体样本（或者空白珠子的对照样本），则可以与ChIP样本相互比对，以进一步对qPCR技术检测到的位点的富集进行定量分析(ΔΔC T方法)。

为了能稳定地构建二代测序文库，至少需要10 ng的ChIP DNA。因此，必须仔细的定量免疫共沉淀得到的DNA。但由于每一次ChIP反应得到的总的DNA量通常很低，因此需要比吸光光度定量法更加灵敏的方法。荧光测定方法（比如使用PicoGreen）在定量ChIP DNA时具有较高的灵敏度和动态围。如果仍然没有得到足够的DNA，可将从几次ChIP反应所得到的所有物质可以放到一起，用来构建一个测序文库。

由于用于构建文库的起始材料的数量非常低，因此在片段与测序适配子连接之后对其进行扩增很有必要。这通常需要16–18轮PCR。太多轮的扩增会降低文库的复杂性，因此需要确定得到足够材料所需的最少PCR轮数。

在确定文库的品质（使用一些商业化的仪器，比如QIAxcel或者Bioanalyzer）和浓度（比如使用qPCR技术）之后，需要使用乳液PCR （emulsion PCR, Ion Torrent）或者桥式PCR技术（bridge PCR, illumina）对文库进行进一步的扩增，然后才能用于最后的深度测序。通常而言，较短的25–36核苷酸长度的单个读段对于定位目标蛋白在基因组上的结合位点就已经足够了。但是，为了能够定位更困难的区域（比如重复区域），也可以使用双末端测序方法（2 x 25的核苷酸长度或者2 x 36的核苷酸长度）。所需要的总的测序读段取决于与因子结合的基因组位点的数目。对于转录因子而言，它们仅仅和基因组上有限的几个位点相结合，5百万–1千2百万读段可能足够了。而如果要分析修饰后的组蛋白，由于它们结合在基因组更广泛的区域上，因此需要更多的测序读段。通过增加测序读段的数量，能够改进分析的灵敏性，从而确定亲和力更弱的位点。一些免费的软件（比如MACS）能用来确定比统计水平具有更多读段的基因组区域（与局部本底相比或者与单独测序的输入对照样本相比）。对于这样的数据，上述的软件能够产生一个列表，显示那些显著增加的目标蛋白的结合位点。

细胞收集，超声波参数和ChIP富集得到的基因组DNA的real-time PCR分析的优化都需要通过实验来确定。

基于序列的甲基化分析请参考关于表观遗传学的试验方案和应用指南部分。

几种常见的基因测序技术的优缺点及应用复习过程

几种常见的基因测序技术的优缺点及应用

随着人类基因组计划的完成，人类对自身遗传信息的了解和掌握有了前所未有的进步。与此同时，分子水平的基因检测技术平台不断发展和完善，使得基因检测技术得到了迅猛发展，基因检测效率不断提高。从最初第一代以 Sanger 测序为代表的直接检测技术和以连锁分析为代表的间接测序技术，到 2005 年，以 Illumina 公司的 Solexa技术和 ABI 公司的 SOLiD 技术为标志的新一代测序(next-generation sequencing，NGS) 的相继出现，测序效率明显提升，时间明显缩短，费用明显降低，基因检测手段有了革命性的变化。其技术正向着大规模、工业化的方向发展，极大地提高了基因检测的检出率，并扩展了疾病在基因水平的研究范围。2009 年 3 月，约翰霍普金斯大学的研究人员在《Science》杂志上发表了通过 NGS外显子测序技术，发现了一个新的遗传性胰腺癌的致病基因PALB2，标志着 NGS 测序技术成功应用于致病基因的鉴定研究。同年，《Nature》发表了采用 NGS 技术发现罕见弗里曼谢尔登综合征MYH3 致病基因突变和《Nat Genet》发表了遗传疾病米勒综合征致病基因。此后，通过 NGS 技术，与遗传相关的致病基因不断被发现，NGS 技术已成为里程碑式的进步。2010 年，《Science》杂志将这一技术评选为当年“十大科学进展”。 近两年，基因检测成为临床诊断和科学研究的热点，得到了突飞猛进和日新月异的发展，越来越多的临床和科研成果不断涌现出来。同时，基因检测已经从单一的遗传疾病专业范畴扩展到复杂疾病和个体化应用更加广阔的领域，其临床检测范围包括高危疾病的新生儿筛查、遗传疾病的诊断和基因携带的检测以及基因药物检测用于指导个体化用药剂量、选择和药物反应等诸多方面的研究。目前，基因检测在临床诊断和医学研究的应用正越来越受到医生的普遍重视和引起研究人员的极大的兴趣。 本文介绍了几种 DNA 水平基因检测常见的方法，比较其优缺点和在临床诊断和科学研究中的应用，对指导研究生和临床医生课外学习，推进临床科研工作和提升科研教学水平有着指导意义。 1、第一代测序 1.1 Sanger 测序采用的是直接测序法。1977年，Frederick Sanger 等发明了双脱氧链末端终止法，这一技术随后成为最为常用的基因测序技术。2001 年，Allan Maxam 和 Walter Gibert 发明了 Sanger 测序法，并在此后的 10 年里成为基因检测的金标准。其基本原理即双脱氧核苷三磷酸(dideoxyribonucleoside triphosphate，ddNTP) 缺乏PCR 延伸所需的 3'-OH，因此每当 DNA 链加入分子 ddNTP，延伸便终止。每一次 DNA 测序是由 4个独立的反应组成，将模板、引物和 4 种含有不

NGS在临床中的应用

高通量测序在临床分子诊断中的应用与展望 对于单基因遗传病，以往临床实验室主要借助于Sanger测序、等位基因特异性聚合酶链反应（allele-specific polymerase chain reaction，AS-PCR）、荧光原位杂交、DNA印记杂交等技术进行检验。NGS技术针对癌症、心血管疾病、肾病、糖尿病等复杂性疾病的遗传学筛查与诊断提供了便捷的途径。另外，NGS技术在病原微生物的快速鉴定、药物的靶向治疗以及产前筛查等多个领域具有潜在的应用优势。 1 测序技术的发展及性能比较 2006年，Illumina公司推出了Solexa测序平台。目前，该公司已经推出了多种型号的测序平台，如MiSeq、HiSeq、NextSeq等系列，其中MiSeq系列适合于小型基因组测序，HiSeq系列适用于大型基因组测序。2007年，美国应用生物系统公司推出SOLiD测序平台。该平台采用五轮测序法以4色荧光标记寡核苷酸的连接合成为基础，测序准确性得以提高。2010年，美国生命科学公司和太平洋生物科学公司分别发布了半导体测序平台和第3代单分子实时（single molecule realtime，SMRT）DNA测序平台。这2种测序技术与以往的基于光学信号的检测技术不同，半导体测序平台通过半导体芯片直接感应在序列合成过程中磷酸二酯键3'OH基团释放的质子；第3代测序仪通过纳米孔技术记录单个聚合酶在不受干扰情况下连续合成，其中PacBio RS II每次运行能够产生60 000×16条序列，每条序列的平均长度达8 500 bp。 一般来说，以上每种测序仪在序列读段长度、准确性、测序通量、价格等多个方面存在一定的差异。焦磷酸测序平台测序读段较长，测序通量较低，成本相对较高；Illumina系列平台产生的读段相对较短，测序费用相对较低，应用比较广泛；SOLiD测序平台在通量和准确性方面相对以上2种类型的测序平台有明显改善，但是测序长度更短；半导体测序平台以及SMRT测序平台相比其他测序平台运行时间较短，另外单分子测序平台减少了测序前的扩增准备工作，测序读段较长，但是测序成本和错误率都相对较高[8-10]。一些常用的测序仪的测序原理和性能见表1。

几种常见的基因测序技术的优缺点及应用

几种常见的基因测序技术的优缺点及应用 发布时间:2014-07-19 来源:毕业论文网 随着人类基因组计划的完成，人类对自身遗传信息的了解和掌握有了前所未有的进步。与此同时，分子水平的基因检测技术平台不断发展和完善，使得基因检测技术得到了迅猛发展，基因检测效率不断提高。从最初第一代以Sanger 测序为代表的直接检测技术和以连锁分析为代表的间接测序技术，到2005 年，以Illumina 公司的Solexa技术和ABI 公司的SOLiD 技术为标志的新一代测序(next-generation sequencing，NGS) 的相继出现，测序效率明显提升，时间明显缩短，费用明显降低，基因检测手段有了革命性的变化。其技术正向着大规模、工业化的方向发展，极大地提高了基因检测的检出率，并扩展了疾病在基因水平的研究范围。2009 年 3 月，约翰霍普金斯大学的研究人员在《Science》杂志上发表了通过NGS外显子测序技术，发现了一个新的遗传性胰腺癌的致病基因PALB2，标志着NGS 测序技术成功应用于致病基因的鉴定研究。同年，《Nature》发表了采用NGS 技术发现罕见弗里曼谢尔登综合征MYH3 致病基因突变和《Nat Genet》发表了遗传疾病米勒综合征致病基因。此后，通过NGS 技术，与遗传相关的致病基因不断被发现，NGS 技术已成为里程碑式的进步。2010 年，《Science》杂志将这一技术评选为当年“十大科学进展”。 近两年，基因检测成为临床诊断和科学研究的热点，得到了突飞猛进和日新月异的发展，越来越多的临床和科研成果不断涌现出来。同时，基因检测已经从单一的遗传疾病专业范畴扩展到复杂疾病和个体化应用更加广阔的领域，其临床检测范围包括高危疾病的新生儿筛查、遗传疾病的诊断和基因携带的检测以及基因药物检测用于指导个体化用药剂量、选择和药物反应等诸多方面的研究。目前，基因检测在临床诊断和医学研究的应用正越来越受到医生的普遍重视和引起研究人员的极大的兴趣。 本文介绍了几种DNA 水平基因检测常见的方法，比较其优缺点和在临床诊断和科学研究中的应用，对指导研究生和临床医生课外学习，推进临床科研工作和提升科研教学水平有着指导意义。 1、第一代测序 1.1 Sanger 测序采用的是直接测序法。1977年，Frederick Sanger 等发明了双脱氧链末端终止法，这一技术随后成为最为常用的基因测序技术。2001 年，Allan Maxam 和Walter Gibert 发明了Sanger 测序法，并在此后的10 年里成为基因检测的金标准。其基本原理即双脱氧核苷三磷酸(dideoxyribonucleoside triphosphate，ddNTP) 缺乏PCR 延伸所需的 3'-OH，因此每当DNA 链加入分子ddNTP，延伸便终止。每一次DNA 测序是由4个独立的反应组成，将模板、引物和 4 种含有不同的放射性同位素标记的核苷酸的ddNTP 分别与DNA 聚合酶混合形成长短不一的片段，大量起始点相同、终止点不同的DNA 片段存在于反应体系中，具有单个碱基差别的DNA 序列可以被聚丙烯酰胺变性凝胶电泳分离出来，得到放射性同位素自显影条带。依据电泳条带读取DNA 双链的碱基序列。 人类基因组的测序正是基于该技术完成的。Sanger 测序这种直接测序方法具有高度的准确性和简单、快捷等特点。目前，依然对于一些临床上小样本遗传疾病基因的鉴定具有很高的实用价值。例如，临床上采用Sanger 直接测序FGFR 2 基因证实单基因Apert 综合征和直接测序TCOF1 基因可以检出多达90% 的与Treacher Collins 综合征相关的突变。值得注意的是，Sanger 测序是针对已知致病基因的突变位点设计引物，进行PCR 直接扩增测序。

《二代测序技术在NSCLC中的临床应用中国专家共识(2020版)》要点

《二代测序技术在NSCLC中的临床应用中国专家共识 （2020版）》要点 1 引言 肺癌是目前全球最常见、致死率最高的恶性肿瘤。2018年全球肺癌新发病例近209.4万例，占所有恶性肿瘤的11.6%，死亡病例176.1万例，占所有恶性肿瘤的18.4%。全国肿瘤登记中心数据显示，2014年我国新发肺癌患者数为78.1万，死亡数达到62.6万，居所有恶性肿瘤发病和死亡人数首位。 随着对疾病认识的不断加深，肿瘤的治疗模式也在发生变革，个体化精准治疗模式逐渐成为主流。在非小细胞肺癌（NSCLC）领域，随着基因检测技术的进步和一系列新药临床研究的突破，近10年间新发现的肿瘤驱动基因不断增多，推动了NSCLC靶向治疗药物的研发和临床应用。近年来兴起的免疫治疗是肿瘤治疗领域的革命性突破。NSCLC的免疫治疗研发和应用速度进步显著，目前已有多个针对NSCLC患者的免疫治疗方案获批。但如何筛选出可从免疫治疗中获益的人群，仍是该疗法在临床应用中的一大挑战。研究表明，全面的分子生物学检测信息可为肺癌患者免疫治疗的方案选择、预后判断，以及为临床试验入组提供依据。 二代基因测序（NGS）又称为高通量测序，该技术能够同时对上百万

甚至数十亿 个DNA进行分析，实现了高通量测序的目标。 2 NGS检测的适用人群 2.1 常规推荐进行NGS检测的NSCLC患者 【共识1】：推荐所有病理诊断为肺腺癌、含有腺癌成分的肺癌以及不能分型的晚期新发或术后复发的NSCLC患者常规进行基因检测。[级推荐] 对经小标本活检诊断为含有腺癌成分或具有腺癌分化的混合型鳞癌，以及年轻或不吸烟/少吸烟肺鳞癌患者，也推荐进行基因检测。[级推荐] 2.2 NGS和传统检测方法的比较 【共识2】：针对敏感型突变发生率高的NSCLC患者（见“共识1”），常规基因检测结果为阴性时，建议使用中国国家药品监督管理局（NMPA）或美国食品药品监督管理局（FDA）批准的NGS产品进行复检。[级推荐] 3 晚期新发或术后复发NSCLC患者首次进行基因检测的

NGS在临床中的应用

N G S在临床中的应用集团企业公司编码：（LL3698-KKI1269-TM2483-LUI12689-ITT289-

高通量测序在临床分子诊断中的应用与展望对于单基因遗传病，以往临床实验室主要借助于Sanger测序、等位基因特异性聚合酶链反应（allele-specificpolymerasechainreaction，AS-PCR）、荧光原位杂交、DNA印记杂交等技术进行检验。NGS技术针对癌症、心血管疾病、肾病、糖尿病等复杂性疾病的遗传学筛查与诊断提供了便捷的途径。另外，NGS技术在病原微生物的快速鉴定、药物的靶向治疗以及产前筛查等多个领域具有潜在的应用优势。 1测序技术的发展及性能比较 2006年，Illumina公司推出了Solexa测序平台。目前，该公司已经推出了多种型号的测序平台，如MiSeq、HiSeq、NextSeq等系列，其中MiSeq系列适合于小型基因组测序，HiSeq系列适用于大型基因组测序。2007年，美国应用生物系统公司推出SOLiD测序平台。该平台采用五轮测序法以4色荧光标记寡核苷酸的连接合成为基础，测序准确性得以提高。2010年，美国生命科学公司和太平洋生物科学公司分别发布了半导体测序平台和第3代单分子实时（singlemoleculerealtime，SMRT）DNA 测序平台。这2种测序技术与以往的基于光学信号的检测技术不同，半导体测序平台通过半导体芯片直接感应在序列合成过程中磷酸二酯键 3'OH基团释放的质子；第3代测序仪通过纳米孔技术记录单个聚合酶在不受干扰情况下连续合成，其中PacBioRSII每次运行能够产生60000×16条序列，每条序列的平均长度达8500bp。

2020版：中国宏基因组学第二代测序技术检测感染病原体的临床应用专家共识(完整版)

2020版：中国宏基因组学第二代测序技术检测感染病原体的临床应 用专家共识（完整版） 病原学诊断始终是感染性疾病诊断中最重要的环节。传统的病原学诊断是临床医师根据患者的临床表现做出一系列鉴别诊断，然后针对这些进行检测，通常一项检测只能对应一种病原体，而宏基因组学第二代测序(metagenomics next generation sequencing,以下简称二代测序)技术检测能覆盖更广范围的病原体。本专家共识就二代测序的临床应用范围、样本采集、分析解读和诊断效能等方面进行证据总结和意见推荐。 一、证据强度和证据质量的分级定义 证据强度：A为强烈推荐；B为推荐，但其他替代方案也可接受；C为推荐强度低，寻求替代方案；D为从不推荐。证据质量：Ⅰ为证据来自随机对照试验，Ⅱ为证据来自非随机对照试验，Ⅲ为证据仅来自专家意见。 二、二代测序的临床需求与应用范围 (一)背景及概述 推荐意见1：若怀疑细菌、真菌、DNA病毒、寄生虫、不典型病原体感染且需进行二代测序检测时，建议采用DNA检测；若怀疑RNA病毒感染时，则建议采用RNA检测(A，Ⅱ)。 推荐意见2：对于临床疑似感染的病重、病危或免疫抑制、免疫缺陷患者，建议在完善传统实验室及分子生物学检测的同时，采集疑似感染部位的标本进行二代测序(B，Ⅱ)。

二代测序检测能覆盖较大范围的病原体，病毒、细菌、真菌、寄生虫都能被同时检测，不论临床样本培养成功与否，只要含有可检测到的DNA 或RNA即可[1,2,3,4,5,6]。从接收样本至完成数据分析，二代测序的周转时间根据测序技术、方法和生物信息学分析方法的不同而不同，已有报道为6 h至7 d不等(平均48 h)[7,8]。 二代测序在感染性疾病诊断领域中的优势在于其能检测到其他传统手段无法检测到的病原体。因此，二代测序可能在应用于临床疑难杂症或免疫抑制患者时有更大意义。另外，二代测序也被报道可用于"排除"检测，即检测阴性有助于排除感染性疾病的诊断，但前提条件是测序覆盖度足够高，能确保样本中存在的病原微生物被检测出来[1]。二代测序的其他潜在应用还包括病原体的耐药基因检测、医院感染控制的监测，以及社区传染性疾病暴发的监测，但这些应用通常需要极高的覆盖深度[9]。 从传统培养转向分子生物学诊断需要临床医师及临床微生物学家的思维转变。传统的微生物学是建立在体外分离培养的基础上，而实际上许多环境中或人体的致病微生物难以被培养，或许只能通过二代测序才能被发现[4]。所以临床医师及临床微生物学家很有必要熟悉这个新工具，知晓其优势和局限性。 目前，尚鲜见针对二代测序结果解读的规范，包括序列数阈值，以及灵敏性、特异性评估的统一临床标准等。就像所有其他新技术，在解释数据和报告数据方面仍有很大的困难与挑战[10]。如能进一步规范二代测序在临床感染性疾病中的应用，就可给予临床实践非常重要的线索和信息，协助临床诊断。

二代测序技术在血液肿瘤中的应用中国专家共识(2018年版)

血液肿瘤是一类具有高度异质性的疾病，其诊疗需要结合形态学、免疫学、遗传学和分子生物学进行综合分析。二代测序（Next-generation sequencing, NGS）作为新的分子生物学技术，具有通量高、灵敏度高、成本低等优势，是探索血液肿瘤的分子发病机制并指导临床诊疗的重要手段。为推动NGS在血液肿瘤诊疗中的应用，提高诊疗水平，中国抗癌协会血液肿瘤专业委员会、中华医学会血液学分会、中华医学会病理学分会组织国内相关的血液、病理和检验专家，结合国外权威资料和已积累的大样本数据，制订了NGS在血液肿瘤中应用的中国专家共识。 血液肿瘤中常见的分子生物学异常主要包括基因突变、融合基因及基因异常表达。目前NGS在基因突变的检测方面应用最为广泛和成熟，本共识仅涉及基因突变的检测。 一、NGS在血液肿瘤诊疗中的应用价值 1．诊断分型： 基因突变的检测在急性髓系白血病（AML）伴重现性遗传学异常、遗传易感性髓系肿瘤、骨髓增殖性肿瘤（MPN）、骨髓增生异常综合征伴环形铁粒幼红细胞（MDS-RS）、毛细胞白血病（HCL）和淋巴浆细胞淋巴瘤/华氏巨球蛋白血症（LPL/WM）的诊断中具有关键性的作用，对于其他血液肿瘤则起到辅助诊断的作用[1,2,3,4,5,6,7,8]。 2．预后判定：

基因突变是各类血液肿瘤预后判断的重要依据，目前NCCN指南已提出了基于基因突变的AML预后分层体系[1]。此外，MDS、MPN、MDS/MPN、急性淋巴细胞白血病（ALL）、慢性淋巴细胞白血病/小淋巴细胞淋巴瘤（CLL/SLL）、LPL/WM、大颗粒淋巴细胞白血病（LGLL）中，已经证实了一些具有明确预后意义的突变基因[2,3,4,5,6,7,8]。其他血液肿瘤中突变基因的预后意义尚有待于进一步研究。3．指导治疗： 一方面，基因突变检测可提供分子治疗靶点，对应靶向药物进行治疗，目前已有基于突变基因的靶向药物应用于临床或处于临床试验阶段，其中FLT3、IDH1/2、BRAF及JAK-STAT信号通路相关的突变基因已有靶向药物上市[1,4,5]；另一方面，基因突变可以导致对某些药物的敏感或者耐受，及时检测有助于治疗方案的调整。例如，TP53突变的CLL/SLL患者对常规化疗反应差，MYD88和CXCR4基因突变可影响伊布替尼在LPL/WM中的治疗效果，ABL1激酶区突变是慢性髓性白血病（CML）和Ph ALL酪氨酸激酶抑制剂（TKI）耐受的主要机制之一[4,7,8]。4．微小残留病（MRD）监测： 基因突变是MRD监测的分子标志物之一[9]。虽然实时定量PCR方法和流式细胞学是目前主流的MRD监测方法，但是由于NGS灵敏度随测序深度加深可进一步提高，在MRD监测方面具有更大的优势。 5．克隆演变：

二代测序技术在NSCLC中的临床应用中国专家共识(2020版)

二代测序技术在NSCLC中的临床应用中国专家共识 （2020版） 二代基因测序（next generation sequencing, NGS）又称为高通量测序，该技术能够同时对上百万甚至数十亿个DNA进行分析，实现了高通量测序的目标。 NGS检测的适用人群 共识1：推荐所有病理诊断为肺腺癌、含有腺癌成分的肺癌以及不能分型的晚期新发或术后复发的NSCLC患者常规进行基因检测。【I级推荐】对经小标本活检诊断为含有腺癌成分或具有腺癌分化的混合型鳞癌，以及年轻或不吸烟/少吸烟肺鳞癌患者，也推荐进行基因检测。【II级推荐】 注：虽然单纯肺鳞癌患者中有4%的表皮生长因子受体（EGFR）突变率，但尚无证据支持肺鳞癌患者使用靶向EGFR酪氨酸激酶抑制剂（TKI）显著获益，因此不推荐对单纯肺鳞癌患者进行EGFR基因检测。 共识2：针对敏感型突变发生率高的NSCLC患者（见“共识1”），常规基因检测结果为阴性时，建议使用中国国家药品监督管理局（National Medical Products Administration, NMPA）或美国食品药品监督管理局（Food and Drug Administration,FDA）批准的NGS产品进行复检。【III级推荐】 晚期新发或术后复发NSCLC患者首次进行基因检测的共识意见

共识3：针对晚期新发或术后复发的NSCLC患者，首次检测建议采用NMPA批准的检测产品，检测至少包括NSCLC常见驱动基因: EGFR突变（应涵盖18号、19号、20 号、21号外显子），以及ALK融合、ROS1融合。【I级推荐】 共识4：针对晚期新发或术后复发的NSCLC患者，结合患者实际临床情况，如需获得更多的潜在靶点信息，首次检测建议采用NMPA或FDA 批准的检测产品，检测包括BRAF V600E、KRAS（如G12C等）、NTRK1/2/3融合、MET14号外显子跳跃突变和MET扩增、ERBB2 20号外显子插入、RET融合等少见驱动基因变异。【II级推荐】 共识5：共识3和共识4中基因检测均为阴性的NSCLC患者再次检测时，建议采用NMPA或FDA批准的NGS产品，检测包含EGFR罕见变异形式（包括激酶区重复和融合）、BRAF罕见变异形式（包括激酶区重复和融合）、MET罕见变异形式（包括激酶区重复和融合）、ERBB2融合等罕见变异形式。【III级推荐】 共识6：结合患者实际临床情况，如需获取免疫治疗相关的分子标志物信息，晚期新发或术后复发的NSCLC患者，建议采用NMPA或FDA 批准的NGS产品进行检测，检测包含MSI、tTMB、免疫治疗正负向相关基因和免疫治疗超进展相关基因在内的免疫治疗相关分子标志物。【III级推荐】

二代测序技术在NSCLC中的临床应用中国专家共识(2020版)

2020ACOG《胎膜早破临床实践指南》解读 胎膜破裂发生在临产前称胎膜早破（PROM），其中，妊娠37周之前发生的PROM被称为未足月胎膜早破（PPROM）。胎膜早破是妊娠期最常见的并发症之一，是围产儿病率及死亡的主要原因。足月PROM的发生率约为8%，未足月胎膜早破（PPROM）的发生率约为3%，未足月胎膜早破（PPROM）的处理策略，一直是产科临床工作的棘手问题。近期，美国妇产科医师学会（ACOG）发布了“胎膜早破临床实践指南（2020）”，在2018年版本基础上进行了补充完善，主要更新了PROM的诊断、足月PROM的期待疗法、妊娠34周至36+6周PPROM孕妇分娩时机等方面。为了诸位同道能对ACOG《胎膜早破临床实践指南（2020）》更加全面的了解和学习，中国妇产科网特邀请重庆医科大学附属第一医院漆洪波教授对共识进行了权威解读。 Simple Style 明确诊断病例至关重要，推荐羊膜腔注射染料辅助诊断 2020年最新版本指南在诊断方面并未作出更多的更新，只是特别强调了在可疑胎膜早破时，可以应用一些生化标记物进行辅助诊断，这些标志物包括胎盘ɑ-微球蛋白、引导生长因子结核球蛋

白-1（IGFBPY）。ACOG指南一直主张可疑胎膜早破可以通过羊膜腔注射染料来辅助诊断，推荐应用于需要明确诊断的病例。目前，全球范围内相关指南对于足月胎膜早破均不推荐期待疗法，而是强调尽快终止妊娠。有自发性宫缩更好，如果没有，则需要诱发子宫收缩。考虑到安全性，首先推荐应用缩宫素，如果宫颈成熟度不佳，可考虑应用前列腺素制剂进行引产。 Simple Style 科学分类处理PROM，贴合实际情况进行治疗 对于足月胎膜早破，包括有自发性宫缩，应该尽快终止妊娠，进行产程观察，促进阴道分娩，无自发性宫缩者，可应用缩宫素或前列腺素诱发宫缩。对于近足月的胎膜早破，即孕34周至36+6周的胎膜早破，这一孕周的胎膜早破处理在国际上尚存争议。众所周知，未足月胎膜早破≥34周应该终止妊娠；但对于孕34周至36+6周的胎膜早破、无自发性宫缩是采用期待治疗还是终止妊娠仍然存在争议。自从2016年国际上发表的PPLJM的研究中谈到，这一时期的未足月胎膜早破，若无自发性宫缩，可以采取短时间的期待治疗，也包括应用糖皮质激素促进胎肺成熟，应用抗生素预防感染，但是不诱导宫缩。适当地延长孕周，新生儿发生呼吸窘迫综合征的几率会下降，新生儿败血症的