缢蛏_Sinonovaculac_省略_微卫星标记的分离及近缘物种通用性_吴雪萍
第45卷 第6期 海 洋 与 湖 沼
Vol.45, No.6 2014年11月
OCEANOLOGIA ET LIMNOLOGIA SINICA
Nov., 2014
*山东省农业良种工程课题“优质高产抗逆贝类良种选育”, 2009—2013; 山东省自然科学基金, ZR2012CM037号; 泰山学者岗位“水生动物营养与饲料”, 2008—2013; 国家自然科学基金项目, 31060353号。吴雪萍, 硕士研究生, E-mail: ab8711xp@https://www.wendangku.net/doc/256910728.html,
① 通讯作者: 刘相全, 副研究员, E-mail: lxq6808@https://www.wendangku.net/doc/256910728.html,; 潘英, 教授, E-mail: nnpying@https://www.wendangku.net/doc/256910728.html,
收稿日期: 2013-12-15, 收修改稿日期: 2014-02-19
缢蛏(Sinonovacula constricta )微卫星标记的
分离及近缘物种通用性*
吴雪萍1, 2 马海涛2 冯艳微2 刘相全2①
潘 英1①
(1. 广西大学动物科学技术学院 南宁 530004;
2. 山东省海洋资源与环境研究院 山东省海洋生态修复重点实验室 烟台 264006)
提要 采用磁珠富集和PCR 筛选相结合的方法, 得到12对缢蛏(Sinonovacula constricta )的多态性微卫星引物。每个位点的观测等位基因数为2—15个, 有效等位基因数为1.0339—8.8063个; 观测杂合度(H o )为0.0333—1.0000, 平均观测杂合度为0.7525; 期望杂合度(H e )为0.0333—0.9020, 平均期望杂合度为0.6866; 多态信息含量(PIC)为0.0320—0.8680。所有位点中, 有8个位点属于高度多态位点(PIC>0.5), SC1-5和SC4-6属于低度多态位点(PIC<0.25); 经Bonferroni 校正后, 无显著偏离哈迪-温伯格平衡的位点; 连锁不平衡检验结果表明, 位点间不存在连锁不平衡现象。此外, 分析了这些引物在近缘种长竹蛏(Solen strictus )、大竹蛏(Solen grandis )和小刀蛏(Cultellus attenuatus )的通用性情况, 结果显示: 长竹蛏中, 位点SC1-4、SC2-8、SC3-1、SC3-14表现出了高度多态(PIC>0.5); 在大竹蛏中, 位点SC3-4、SC3-7、SC4-6表现出了高度多态性(PIC>0.5), SC2-9为低态位点(PIC<0.25); 在小刀蛏中, 位点SC1-7、SC2-9、SC3-4、SC3-14表现出了高度多态性(PIC>0.5), SC4-6为低态位点(PIC<0.25)。
关键词 缢蛏; 长竹蛏; 大竹蛏; 小刀蛏; 微卫星标记; 通用性 中图分类号 S968.3 doi: 10.11693/hyhz20131200199 缢蛏(Sinonovacula constricta Lamarck)俗称蛏子, 属于软体动物门(Mollusca)、瓣鳃纲(Lamellibranchia)、异齿亚纲(Heterodonta)、帘蛤目(Veneroida)、竹蛏科(Solenidae)、缢蛏属(Sinonovacula ), 在中国和日本沿海均有分布, 为广温广盐性的海产双壳贝类。其肉味鲜美, 营养丰富, 具有食用和药用价值, 是中国四大养殖贝类之一。近年来, 无序养殖、盲目移种, 以及海洋资源的过度捕捞和海水环境污染的加剧, 造成缢蛏种质资源混杂和野生群体数量衰减(刘博等, 2013)。
微卫星DNA 是指以少数几个核苷酸(多数为2—6个)为单位的多次串联重复的DNA 序列, 亦称简单
重复序列(simple sequence repeats, SSR)、短串联重复(short tandem repeats, STR)、简单序列长度多态性(simple sequence length polymorphism, SSLP)等。由于其遵循孟德尔遗传规律, 具有共显性、高度多态性、数量丰富、可重复性强等特点, 已经被广泛应用于贝类遗传多样性分析及遗传连锁图谱构建等方面的工作。关于缢蛏微卫星标记的开发, 仅有少数学者作了相关报道: 牛东红等(2008)利用磁珠富集法和PCR 筛选法开发了18对微卫星引物; Jiang 等(2010)利用磁珠富集法开发了14对微卫星引物; 刘博等(2012)从EST 数据库中开发了14对多态性引物并对乐清湾缢蛏群体进行多样性分析。但这些标记远不能满足其遗
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传图谱构建及数量性状位点定位(QTL)等方面的研究, 急需开发出更多的微卫星标记。本研究利用磁珠富
集和PCR筛选相结合的方法, 快速分离得到12对
微卫星引物并在长竹蛏(Solen strictus)、大竹蛏(Solen grandis)和小刀蛏(Cultellus attenuatus)进行通用性
分析。
1材料与方法
1.1材料
缢蛏、长竹蛏及大竹蛏活体样品均采自山东省烟台市, 小刀蛏活体样品采自东营市, 取其闭壳肌保存于75%酒精中, –20°C备用。
1.2缢蛏基因组DNA的提取及酶切
利用北京天根海洋动物组织基因组提取试剂盒提取缢蛏基因组DNA后, 再用限制性核酸内切酶Sau 3AI对至少5μg的DNA进行酶切, 反应总体积50μL, 包含: 10×buffer (TaKaRa) 5μL, DNA模板40μL, Sau 3AI 0.6μL, 超纯水4.4μL。经1.2%的琼脂糖凝胶检测酶切完全后, 使用生工生物(上海)有限公司的SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒进行回收400—1000bp片段。
1.3接头序列的制备及连接
等摩尔混合两条寡核苷酸链Sau A: 5’-GATCGT CGGTACCGAATTCT-3’, Sau B: 5’-GTCAAGAATTC GGTACCGTCGAC-3’, 经95°C变性10min后, 室温放置4—5小时使其复性。回收产物与双链接头的连接采用10μL的反应体系, 包含: 接头5μL; 胶回收DNA 3μL; 10×buffer (Takara) 1μL; T4连接酶(Takara) 1μL, 16°C过夜连接。
1.4第一次PCR扩增及纯化
PCR反应的总体积为25μL: 去离子水13.6μL; 5×buffer (promega) 5μL; dNTP 1μL; Mg2+ 2μL; Sau A (10μmol/L) 2μL; 目标DNA 100ng; Taq酶(promega) 0.4μL。
PCR程序为94°C预变性5min, 94°C 50s, 60°C 50s, 72°C 1min, 30个循环, 最后72°C延伸10min。1.5磁珠富集
磁珠(Promega)上包被的链霉亲和素(Strep tavidin)可与探针(CA)16和(GA)16上的生物素(biotin)结合, 从而通过磁力将探针连同所需的微卫星序列一同分离出来。
1.5.1PCR产物变性与杂交探针杂交体系为100μL: PCR纯化产物10μL, 生物素标记的DNA探针(CA)16和(GA)16各200pmol, 20×SSC 15μL。杂交液放入PCR仪中95°C变性5min, 迅速置于冰上冷却后, 68°C温浴1h。
1.5.2磁珠准备取一管新鲜的磁珠(Promega), 轻柔混匀磁珠悬浮液, 吸取100μL放入1.5mL灭菌离心管中, 在磁力架上除去上清后, 用100μL 0.5×SSC清洗3次并除去上清。
1.5.3富集
(1) 将杂交混合液加入到磁珠管中, 25°C放置30min, 每10min 混匀1次, 除去上清;
(2) 用100μL 6×SSC, 室温清洗2次, 每次4min;
(3) 用100μL 3×SSC, 68°C清洗2次, 每次13min;
(4) 用 100μL 6×SSC, 室温清洗2次, 每次8min。
1.5.4捕获含微卫星序列的单链DNA 除去上清, 加入30μL灭菌水, 转入PCR管, 95°C热洗脱10min, 迅速吸取上清液至另一灭菌1.5mL离心管中, 即为杂交后单链DNA。
1.6第二次PCR扩增含微卫星序列的DNA片段
以Sau A为引物, 对富集的DNA单链片段进行PCR扩增, 25μL反应体系: Sau A 2μL, 5×buffer (Promega) 5μL, dNTP 1μL, Mg2+2μL, 目标DNA 6μL, Taq酶0.4μL。1.2%的琼脂糖凝胶电泳检测后经生工生物(上海)柱式PCR纯化试剂盒去除多余的dNTP、Sau A等, 置于4°C备用。
1.7富集片段的T载体连接和转化
使用 pMD TM 20-T Vector Cloning Kit (Takara)对纯化后的DNA片段进行连接。载体连接的反应体系为10μL: pMD TM 20-T Vector 1μL; solution I 5μL; 纯化DNA 4μL。16°C反应连接过夜。将全部连接产物加入到100μL大肠杆菌DH5α感受态细胞中, 37°C 振荡培养箱培养1h, 菌液涂于含有IPTG、X-gal的氨苄青霉素抗性LB平板上, 37°C培养12h, 挑取阳性克隆在含LB液体培养基(含氨苄青霉素抗性)的96孔细胞培养板中, 37°C培养12h。用载体引物M13-47、RV-M及无生物素标记的探针序列(CA)12或(GA)12对随机挑选的白斑克隆进行PCR菌落鉴定。扩增得到的PCR产物通过1.2%琼脂糖电泳检测后, 克隆中若存在相应微卫星核心, 每条产物带应为2条或2条以上。将符合上述条件的菌落送往上海英俊生物公司测序。
1332 海洋与湖沼45卷
1.8引物设计
测序结果用SSR Hunter软件查找含有微卫星核心的序列, Primer Premier 5.0 (http://www.premierbiosoft.om/)软件进行引物设计, 并挑选部分引物送生工生物(上海)有限公司进行合成。
1.9引物筛选及检测
利用三个样品对合成引物进行退火温度梯度PCR扩增, PCR反应体系10μL包括: 模板DNA 100ng, 引物F 10μmol/L, 引物R 10μmol/L, 10×Buffer 1μL, dNTP 2mmol/L, MgCl2 1.5mmol/L, Taq 0.25 U。PCR 反应程序: 94°C, 3min, 94°C, 45s, 退火温度45s, 72°C, 45s, 35个循环数, 72°C终延伸5min。通过琼脂糖凝胶电泳, 选出能获得清晰条带的引物, 并确定每对引物的最适退火温度。然后用8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳, 以缢蛏30个个体进行群体多态性分析。
用软件MICROSATELLITE ANALYSER (MSA) (Dieringer et al, 2003)统计每个微卫星位点的等位基因数、有效等位基因数(N e)、观测杂合度(H e)及期望杂合度(H o); 用GENEPOP v.4.1.4 (Rousset, 2008)进行每个微卫星位点哈迪-温伯格平衡指数计算以及位点间连锁不平衡分析; 用软件CERVUS 3.0 (Marshall et al, 1998)分析各微卫星位点的多态信息含量值(Polymorphic Information Content, PIC)。
1.10近缘种中的通用性研究
筛选出的12对缢蛏微卫星引物, 在长竹蛏、大竹蛏及小刀蛏各12个个体中进行PCR扩增, 8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳, 硝酸银染色检测扩增结果。扫描仪记录电泳图谱, 根据电泳图谱分析各个微卫星位点在三个近缘种中的扩增情况。
2结果
2.1测序结果分析
32个缢蛏测序样品中, 有21个含有微卫星序列, 共设计出17对引物。依据Weber等(1990)提出的微卫星的划分标准, 微卫星的类型包括完美型(perfect)、非完美型(imperfect)和复合型(compound)。完美型微卫星是指无中断的重复序列, 非完美型是指具有1个或者多个中断的重复序列, 复合型则为3个以下的非重复碱基间隔不同的重复序列或者不间隔直接相连。其中完美型占52.38%, 非完美型占33.33%, 复合型占14.29%。这些微卫星含的重复单元观察到的有CA、GA、TG、AG、TACA、AAC、CAAG, 其中CA重复次数最低为5次, 最高可达58次; TG 最低为7次, 最高为37次。
2.2多态性微卫星位点的筛选结果
经筛选后得到12个多态微卫星位点(表1)。所有位点在缢蛏30个个体中进行扩增, 经8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(图1)。结果显示: 每个位点的观测等位基因数为2—15个, 有效等位基因数为1.0339—8.8063个; 观测杂合度(H o)为0.0333—1.0000, 平均观测杂合度为0.7525; 期望杂合度(H e)为0.0333—0.9020, 平均期望杂合度为0.6866; 多态信息含量(PIC)为0.0320—0.8680。所有位点中, 有8个位点属于高度多态位点(PIC>0.5), SC1-5和SC4-6属于低度多态位点(PIC<0.25); 经Bonferroni校正后, 无显著偏离哈迪-温伯格平衡的位点; 连锁不平衡检验结果表明, 位点间不存在连锁不平衡现象。
2.3缢蛏微卫星引物对长竹蛏、大竹蛏及小刀蛏的
通用性
对所有引物在近缘种长竹蛏、大竹蛏和小刀蛏的通用性情况进行了分析, 结果显示: 长竹蛏中, 共有8对引物扩增出了相应大小的产物, 位点SC1-7、SC1-12、SC4-4、SC4-6表现为单态, 位点SC1-4、SC2-8、SC3-1、SC3-14表现出了高度多态性(PIC>0.5); 大竹蛏中, 有8对引物可扩增出目的条带, 位点SC1-12、SC3-1、SC3-14、SC4-4表现为单态, 而位点SC3-4、SC3-7、SC4-6表现出了高度多态性(PIC>0.5), SC2-9为低态位点(PIC<0.25); 小刀蛏中, 共有7对引物扩增出了目的条带, 位点SC1-12、SC3-4表现为单态, 而位点SC1-7、SC2-9、SC3-1、SC3-14表现出了高度多态性(PIC>0.5), SC4-6为低态位点(PIC<0.25)(表2)。
3讨论
3.1缢蛏微卫星标记的筛选结果分析
真核动物基因组中, 认为二核苷酸序列(CA)n (Brenner et al, 1993)或者(GA)n (Zhan et al, 2005)的重复十分丰富, 每50—150kb就会在哺乳动物基因组中出现一次(Orit et al, 1997)。本研究以生物素标记的(CA)16和(GA)16为探针, 通过磁珠富集缢蛏微卫星序列, 并采用三引物法筛选阳性克隆, 筛选的66个白斑菌落中, 检测出32个阳性克隆含有微卫星片段, 阳性克隆率为48.48%。这一方法可提高检测阳性克隆中的微卫星序列的准确性, 也可专一确定核心序列(CA)n或者(GA)n, 此次也检测出三碱基、四碱基重复元件。Winter等(1992)认为不同物种间3种类型的
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1334 海 洋 与 湖 沼 45卷
图1 SC3-14、SC4-4在30个缢蛏个体中的PCR 扩增结果
Fig.1 PCR amplification of two loci (SC3-14, SC4-4) in 30 S. constricta individuals
微卫星(完美型、非完美型和复合型)在真核生物基因组中存在差异, 完美型所占比例一般显著高于非完美型。在缢蛏中, 这3种类型所占比例分别为52.38%、33.33%和14.29%, 与其他水产经济动物的研究结果一致(赵莹莹等, 2006)。
3.2 缢蛏微卫星标记在近缘种中的通用性分析
微卫星侧翼序列在属内种间和有较近亲缘关系的种间相当保守, 并且在有较远亲缘关系的分类群中也具有一定的保守性(Rico et al , 1996)。海萨等(2009)用10对伊犁鲈(Perca schrenkii )引物在河鲈(P. fluviatilis )中有4对适用, 而在黄金鲈(P. flavescens )中有2对。本实验中, 12对缢蛏微卫星引物在同属的长竹蛏及大竹蛏中均有8对引物可扩增, 扩增效率为66.67%, 表现出了很高的通用性, 其中均有4对引物属于单态; 在不同亚科的小刀蛏中也有7对引物可扩增, 扩增效率为58.33%, 其中2对引物属于单态。该结果表明这些微卫星位点的侧翼序列在长竹蛏、大竹蛏及小刀蛏中具有较高的保守性。
一般用杂合度、有效等位基因数及多态信息含量来衡量遗传标记的多态性高低和其应用价值。据Botsein 等(1980)提出的量度基因座位变异程度高低的多态信息含量标准: 当PIC<0.25时, 此位点表现为低度多态性; 当0.25
3.3 缢蛏微卫星标记在近缘种中扩增状况差异
微卫星核心单元重复次数的差异及其侧翼序列的突变(DNA 片段插入或缺失)均可导致物种间等位基因长度分布范围的差异, 这种差异可用于鉴定物种特别是近缘种(Chistiakov et al , 2006)。林能锋等(2008)用大黄鱼(Pseudosciaena crocea )微卫星标记对石首鱼科进行通用性分析中发现: 黄鱼亚科(Pseudosciaeninae)、叫姑鱼亚科(Johniinae)
及牙
亚科
(Otolithinae)中的近缘种在一些微卫星位点上的等位基因长度分布范围存在很大差异。本研究也发现长竹蛏、大竹蛏及小刀蛏在一些微卫星位点上的等位基因长度分布范围存在差异。例如, 微卫星位点SC2-8、SC3-7在缢蛏中等位基因片段大小范围分别为300—348bp 、176—212bp, 但SC2-8在长竹蛏中为188—214bp, SC3-7在大竹蛏中为250—256bp 。
另外, 等位基因数目的不同也可作为鉴定近缘种的一个指标(Turner et al , 2004)。McQuown 等(2000)将108对铲鲟(Scaphirhynchus platorynchus Rafinesque)引物在高首鲟(Acipenser transmontanus )、湖鲟(Acipenser fulvescens )及中吻鲟(Green sturgeon )中扩增, 表现为多态的引物分别占9.2%、22.2%和11%。本次实验中也发现缢蛏中扩增效果好且等位基因较多的微卫星引物, 在长竹蛏、大竹蛏及小刀蛏中等位基因数较少或者表现为单态, 如位点SC4-4在缢蛏中属于高度多态位点(PIC=0.7601), 而在长竹蛏、大竹蛏及小刀蛏中均属单态。
微卫星标记在近缘种间的通用性可降低其开发成本, 提高利用率, 也有利于促进遗传研究较为薄弱物种的分子遗传学研究。本文将开发出的微卫星标记
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在其近缘种中进行通用性分析, 这些通用引物将为长竹蛏、大竹蛏及小刀蛏遗传多样性评价、连锁图谱的构建等方面的研究提供帮助, 对尚未见微卫星引物开发报道的长竹蛏及小刀蛏意义尤为重大。
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6期吴雪萍等: 缢蛏(Sinonovacula constricta)微卫星标记的分离及近缘物种通用性 1337 ISOLATION OF MICROSATELLITE LOCI FROM RAZOR CLAM SINONOVACULA
CONSTRICTA AND TRANSFERABILITY TO RELATED SPECIES
WU Xue-Ping1, 2, MA Hai-Tao2, FENG Yan-Wei2, LIU Xiang-Quan2, PAN Ying1
(1. College of Animal Science and Technology, Guangxi University, Nanning 530004, China; 2. Shandong Marine Resource and
Environment Research Institute, Shandong Provincial Key Laboratory of Restoration for Marine Ecological Restoration, Yantai
264006, China)
Abstract Using magnetic-bead enrichment and PCR screening method, we obtained 12 pairs of microsatellite primers
from razor clam Sinonovacula constricta. The allele number and the effective allele number of these markers ranged from 2
to 15 and from 1.0339 to 0.8063; the observed and expected heterozygosity values ranged from 0.0333 to 1.0000 (average
0.7525) and 0.0333 to 0.9020 (average 0.6866), respectively. The polymorphic information content (PIC) of these loci
changed from 0.0320 to 0.8680. Among them, eight were highly polymorphic loci, and SC1-5 and SC4-6 were slightly
polymorphic loci. No loci was significantly deviated from Hardy-Weinberg equilibrium after Bonferroni correction, and no
significant linkage disequilibria was detected between the comparisons of these loci. In addition, the transferability of all
polymorphic short sequence repeats (SSRs) was assessed in three closely-related species. SC1-4, SC2-8, SC3-1, and
SC3-14 were highly polymorphic loci in Solen strictus, SC3-4, SC3-7, SC4-6 were highly polymorphic loci in Solen
grandis, and SC1-7, SC2-9, SC3-4, SC3-14 highly polymorphic in Cultellus attenuatus.
Key words Sinonovacula constricta; Solen strictus; Solen grandis; Cultellus attenuatus; microsatellites; transferability
浙江省主要水稻品种微卫星标记数据库的初步构建
浙江省水稻品种DNA指纹数据库的初步构建及其应用 程本义1吴伟2*夏俊辉1刘鑫2庄杰云1杨仕华1 (1中国水稻研究所，浙江杭州310006；2浙江省种子总站，浙江杭州310020；*通讯联系人，E-mail:wuwei1610@https://www.wendangku.net/doc/256910728.html,) 摘要：利用前期研究建立的一套水稻品种DNA指纹检测技术体系，对2002-2006年浙江省主要的水稻品种98个、2007-2008年省区试水稻品种155个（181个次，含26个续试品种）进行了DNA 指纹检测，构建了279个次水稻品种×12个微卫星标记的DNA指纹图谱数据库。系统分析了指纹库中各标记的多态性和品种的相似性。基于构建的指纹数据库，对所有品种的特异性及区试续试品种年度间的一致性进行了鉴定。 关键词：水稻品种；微卫星标记；DNA指纹库；特异性 Construction and Application of DNA Fingerprint Database of Rice Varieties in Zhejiang Province CHENG Ben-yi1,WU Wei2,*,XIA Junhui1,LIU Xin2,ZHUANG Jie-yun1,YANG Shi-hua1 (1China National Rice Research Institute,Hangzhou310006,China;2Zhejiang Provincial Seed Management Station,Hangzhou310020,China;*Corresponding author,E-mail:wuwei1610@https://www.wendangku.net/doc/256910728.html,) Abstract:A total of98major rice varieties in Zhejiang province from2002to2006 and155rice varieties in Zhejiang provincial regional trial from2007to2008were assayed with a set DNA fingerprint testing system on rice variety.A DNA fingerprint database containing genotypic data of279rice variety times at the12marker loci was constructed.The polymorphism of different markers and genetic similarity of varieties in the DNA fingerprint database were analyzed.Based on the DNA fingerprint database,the distinctness of all rice varieties and consistency of the same varieties in different years were identified. Key words:rice variety;microsatellite marker;DNA fingerprint database; distinctness 特异性（Distinctness）是农作物新品种权申请和品种审（认）定的前提条件。“九五”中后期以来，在种子产业快速发展的推动下，浙江省包括水稻在内的农作物品种数量明显增加，在促进农业生产发展的同时，也不同程度存在品种雷同、侵权等现象。而目前，水稻品种特异性鉴定的主要方法是新品种DUS测试，该方法测试周期长、工作量大，难以及时高效地对浙江省大量水稻品种进行特异性鉴定，有必要寻求一种快速、准确、高效的新方法。 二十世纪九十年代以来，随着分子生物学的发展，以分子标记为基础的DNA指纹 基金项目：浙江省“三农五方”科技协作项目（Sn200606）；中央级公益性科研院所专项资金项目（2006RG002）。 作者简介：程本义（1977-），男，浙江淳安人，助理研究员，主要从事水稻新品种评价和品种DNA指纹鉴定研究。 E-mail：cby_951019@https://www.wendangku.net/doc/256910728.html,。
微卫星DNA标记
1微卫星DNA标记的发现 1974年，Skinner等在研究寄居蟹的基因组时发现了微 卫星DNA的重复序列。此后，在人、动物和酵母的基因组中都发现了类似大量的简单重复序列。直到1986年，Ail等首次用合成的微卫星寡核苷酸作为探针用于人的指纹分析，这时才得到重视。1988年，Jeffreys等人做了进一步的研究并使之发展成为新的遗传分子标记系统。1989年，Litt等[1]扩增到了人类基因组微卫星序列，从而创造了“微卫星（microsatellite）”这个名称。 2微卫星DNA的结构 微卫星DNA又称简单重复序列(simplesequencere-peats，SSR)或短串联重复序列(shorttandemrepeats，STR)，是指以少数几个核苷酸（一般是1~6个）为单位串联重复的DNA序列。这些重复序列的重复次数和重复程度在不同的生物体内高度变化，并且随机分布于真核生物基因组中。普遍认为，在染色体上，除着丝粒及端粒区域外，其他区域也广泛散在分布有微卫星位点。Weber根据微卫星核心序列排列方式的不同，将其分为完全（无间隔）、不完全（有非重复单位的碱基间隔）和复合型（2个或更多重复单位彼此毗邻连续出现）微卫星3种类型。 3微卫星DNA标记的优缺点 3.1优点 ①分布广泛。微卫星DNA广泛且均匀地分布于真核生物基因组中。②多态性丰富。由于微卫星在不同个体中的重复单位数目变异大，因而造成其长度具有高度的多态性，使其可以包含大量丰富的信息。③简易高效安全性。微卫星检测方法简便且效率高，单个位点检测时间很短，一般不超过24h，并可以多个位点同时进行检测。微卫星标记没有任何表型效应，因而不存在对家畜个体的有害或次级效应。④保守与通用性。微卫星侧翼序列的保守性以及物种间某些染色体区段的共线性，某一物种的微卫星引物可以应用于相近物种。⑤共显性遗传。微卫星标记的等位基因遵循孟德尔共显性遗传，因而易区分纯合型和杂合型。 3.2缺点 ①建立和筛选基因文库，进行克隆和测序，都是非常繁琐、耗时的工作。②由于不同物种的微卫星侧翼序列不尽相同，因此针对不同物种设计相应的特异性引物也非常耗时。③微卫星进化具有复杂性，可能出现同源异型或异源同型。④PCR 扩增受许多因素的影响，使一些等位基因无法被扩增出来，即“无效基因”。影响亲子鉴定的正确性。⑤目前还没有发现哪个DNA探针能很好地匹配他们各自的多态性 4微卫星DNA的筛选方法 获得微卫星DNA的常规方法主要有两种:①通过构建基因组文库,核心重复序列探针标记,杂交筛选,测序及特异引物设计等一系列步骤;②可利用近缘物种间某些染色体片段的同源关系,以已知的微卫星DNA引物作跨物种使用,从中筛选出适宜于另一物种的微卫星DNA标记. 5微卫星DNA的筛选步骤: ①基因组文库的构建,提取基因组DNA,酶切后与载体连接,将连接产物转入大肠杆菌,涂板后在37℃下培养,用α-互补法筛选阳性的重组质粒;②质粒DNA的提取;
女性生殖系统解剖生理一
女性生殖系统解剖生理一 1.保持正常子宫前倾位置的主要韧带是下列哪一项 A.阔韧带 B.主韧带 C.圆韧带 D.宫骶韧带 E.骨盆漏斗韧带 2.不属于外生殖器的组成是 A.阴阜 B.大阴唇 C.小阴唇 D.阴道 E.阴蒂 3.测定卵巢功能最简便的方法是 A.宫颈黏液结晶检查 B.女性激素测定 C.基础体温测定 D.诊断性刮宫 E.阴道脱落细胞涂片检查 4.成年女子卵巢的体积及重量正确的是 A.4cm×3cm×1cm，5～6g B.4cm×2cm×2cm，5～6g C.5cm×4cm×3cm，6～7g D.4cm×3cm×2cm，5～6g E.3cm×2cm×1cm，4～5g 5.促进乳房发育，使乳腺管增生的激素是 A.雌激素 B.孕激素 C.雄激素 D.胎盘生乳素 E.生乳素抑制激素 6.关于成年妇女子宫体积，下列哪项正确 A.长7～8cm，宽4～5cm，厚2～3cm B.长7～8cm，宽2～3cm，厚4～5cm C.长8～9cm，宽4～5cm，厚2～3cm D.长7～8cm，宽2～3cm，厚1～2cm E.长4～5cm，宽7～8cm，厚2～3cm 7.关于正常育龄妇女子宫大小和容积的描述，正确的是 A.7cm×5cm×2cm；3ml B.8cm×5cm×3cm；5ml C.9cm×6cm×2cm；5ml D.10cm×5cm×2cm；7ml E.11cm×5cm×2cm；7ml 8.关于子宫的描述，正确的是 A.子宫位于盆腔的后壁呈梨形 B.子宫内膜的基底层周期性脱落 C.柱形的子宫颈内腔称宫颈腔 D.宫体与宫颈间最狭窄处为子宫峡 部 E.子宫下部较窄呈棱形称子宫颈 9.横行于子宫颈到盆腔壁两侧的韧 带是 A.圆韧带 B.骨盆漏斗韧带 C.主韧带 D.子宫骶骨韧带 E.阔韧带 10.黄体生成素LH来自 A.丘脑下部 B.脑垂体 C.卵巢 D.肾上腺素 E.黄体 11.健康妇女的月经量大约是 A.10～20ml B.30～50ml C.60～70ml D.80～90ml E.100～120ml 12.经期卫生的保健，下列不正确的 是 A.每天进行阴道冲洗 B.要用干净的月经带或卫生巾 C.可照常参加工作 D.保持愉快的心情 E.防止寒冷刺激 13.卵巢除了产生卵子并排卵的生 殖功能外还有内分泌功能，它合成 及分泌的的激素有 A.雌激素激素、孕激素和少量雄激 素 B.雌激素、孕激素和少量卵泡刺激 素 C.雌激素、孕激素和少量黄体生成 素 D.雌激素、雄激素和少量孕激素 E.孕激素、雄激素和少量黄体生成素 14.卵巢内有卵泡发育成熟，子宫内 膜会产生何种变化 A.增生期变化 B.分泌期变化 C.月经期变化 D.月经前期变化 E.蜕膜变化 15.某妇女月经周期为33天，其排 卵日期在月经周期的天数是 A.第14天 B.第15天 C.第16天 D.第18天 E.第19天 16.哪一个阶段在妇女一生中历时 最长 A.新生儿期 B.青春期 C.性成熟期 D.更年期 E.老年期 17.能降低子宫平滑肌对缩宫素的 敏感性，同时松弛子宫肌的激素为 A.雌激素 B.孕激素 C.雄激素 D.绒毛膜促性腺激素 E.生乳素 18.能增加子宫平滑肌对缩宫素的 敏感性，同时增强子宫收缩力的激 素为 A.雌激素 B.孕激素 C.雄激素 D.绒毛膜促性腺激素 E.生乳素 19.青春期年龄大致为 A.10～19岁 B.14～17岁 C.12～20岁 D.10～15岁 E.9～15岁 20.人体骨盆的组成包括 A.两块髂骨，一块骶骨，一块尾骨 B.两块坐骨，一块骶骨，一块尾骨 C.两块髋骨，一块骶骨，一块尾骨 D.两块耻骨，一块髂骨，一块尾骨 E.两块耻骨，一块尾骨，一块骶骨 21.输卵管由内向外可分为哪几部
STR SSR 微卫星分析
STR/SSR/微卫星分析 背景介绍 微卫星标记（Microsatellite）也称为短串联重复序列（STR）或简单重复序列（SSR），是广泛分布在真核生物基因组中的简单重复序列。微卫星位点通常通过PCR扩增和电泳检测，并根据片段大小分离等位基因进行分析；扩增后的等位微卫星可以用多种方法检测，传统方法采用聚丙烯酰胺凝胶电泳加放射显影或银染的方法，费时费力效率低。阅微基因基于5年的经验，利用ABI遗传分析仪对荧光标记的DNA片段进行检测，结合分子量内标进行DNA片段长度计算，使STR分型变得高效快捷，结果也更加精确。 服务项目 １．SSR引物开发 通过富集微卫星序列，开发出20-30条具有一定重复特征的微卫星序列，并且对序列进行多态性和特异性验证。 ２. 引物筛选 选取部分代表性样本，利用普通引物进行PCR扩增，然后利用高分辨率芯片电泳或PAGE验证引物的特异性、扩增效率和基因座多态性等信息（图1）。
图1. 用岛津MultiNA芯片电泳仪进行引物筛选的结果 ３．样本批量扩增 用带有荧光标记（FAM／HEX／TMR／ROX等）的引物，对批量样本进行PCR扩增。我公司拥有高通量PCR仪平台，可以满足大量样本扩增需求。４．测序仪检测 带有荧光标记的PCR产物进行稀释后与分子量内标混合，用3730xl等测序仪进行毛细管电泳，并得到原始数据（fsa文件，见图2）。 图2.应用3730xl测序仪检测得到的原始图谱 ５．原始数据分析 编制panel和bin等文件，使用正版GeneMapper v4.0软件分析测序仪得到
的fsa文件，并生成PDF图谱和Excel文档（包括size、基因分型等信息），分析后的电泳图谱见图3。 图3.GeneMapper软件分析后的电泳图谱 ６．群体遗传学分析 利用生物信息学软件（POPGENE、MEGA、PHYLIP、ARLEQUIN等）对上述数据进行进一步分析，绘制遗传连锁图谱、分析连锁不平衡和分析多态性等。送样要求 细胞（≥106）、组织（≥300mg）、血液（≥1ml）、基因组DNA（≥20μl，浓度≥ 50ng/μl）；引物信息、片段长度范围、琼脂糖电泳图等。 提供结果 引物、微卫星分析的原始数据以及GeneMapper生成的PDF图谱、包含片段长度等信息的Excel文档和进一步的分析结果等。 成功案例 到目前为止，我公司与上百家科研机构建立合作，进行过多个物种的引物开发、多态性分析、种系鉴定和连锁图谱构建等工作，包括人、小鼠、大鼠、兔、马、犬、牛、大熊猫、鱼、虾、麻雀、蜜蜂、蚊子、蚜虫、瓢虫、小麦、玉米、大豆、棉花、杨树、苹果、葡萄和真菌等。
微卫星位点筛选方法综述
论文综述 微卫星分子标记筛选方法综述 摘要：微卫星是一种短的串联重复序列(short tandem repeat, STR)或简单重复序列(simple sequence repeats, SSR)。它作为一种重要的分子遗传标记，能较好地反映物种的遗传结构和遗传多样性变化，被广泛应用于实验动物的研究。本文概述了获得和富集微卫星位点的常用方法。最简便、最省时的方法是从从公共数据库（如Genbank、EMBL、EST数据库等）或已发表的文献中查找到微卫星位点，但只限于已经有序列数据发布的物种；第二种方法是种间转移扩增，即从相近物种的数据库中查找微卫星位点，或使用已有数据发表的遗传距离相近物种的微卫星标记。第三种方法是从基因组DNA中筛选微卫星位点，其中用于富集微卫星的方法有引物法、磁珠杂交法、尼龙膜杂交法以及分子标记技术法。 关键词：微卫星；分子标记；实验动物 微卫星（Microsatellite），又称为简单序列重复（Simple Sequence Repeat , SSR），短串联重复（Short Tandem Repeat STR），是以少数几个核苷酸（一般1～6个）为重复单位的串联重复DNA序列。微卫星位点广泛分布于真核生物的基因组中[1]，在植物基因组中平均每33 Kb存在一个20 bp长的微卫星位点，而在哺乳动物中每6 Kb存在一个20 bp长的微卫星位点[2]。并且SSR的重复次数不同和重复程度不同，使其呈现高度的多态性。微卫星标记共显性的特点使它能够用于研究等位基因，区分二倍体（或多倍体）的纯合体或杂合体，这是AFLP、RAPD 等显性标记所无法做到的。另外，微卫星的特异性引物扩增具有良好的重复性和保真性，方便各实验室间的交流。目前，微卫星标记已被广泛应用到基因连锁与遗传图谱构建、遗传多样性研究、谱系和发育研究、疾病检测以及品种鉴定、亲本分析与个体、纯系检验上。 随着微卫星标记在图谱上的丰富,将显现出更大的优势。但微卫星分析中引 物的获得需要预先获知核酸序列,其广泛应用受限于从特定的物种中分离微卫星 位点的难度和花费。微卫星标记分离最大的困难是引物的获得。同RAPD、AFLP 等遗传标记不同，微卫星研究首先需要获知位点的序列信息，以便从重复序列两端侧翼的保守序列中设计引物。因而微卫星引物的开发是应用该技术的关键。目前已知微卫星位点的物种很有限，这是因为微卫星位点的获得需经过克隆、杂交筛选、测序等步骤，因此需花费一定的人力、金钱，这限制了微卫星标记的大量
微卫星荧光标记基因组扫描
文章编号:1007-7847(2000)S0-0018-06 微卫星荧光标记基因组扫描 X 邓 昊,何云贵,夏家辉(湖南医科大学医学遗传学国家重点实验室,中国湖南长沙 410078) 摘 要:微卫星荧光标记基因组扫描为20世纪90年代发展起来的一项分子生物学技术,在基 因定位、个体识别等方面有广泛的应用.文中对其原理、策略、分析方法及应用作了论述,并探讨 了它的发展前景. 关键词:微卫星;荧光标记基因组扫描;基因定位;分析方法 中图分类号:Q78 文献标识码:A Fluorecence -based Genescan with Microsatellite Markers DENG Hao,HE Yun -gui XIA Jia -hui (National Laboratory of Medical Genetics,Hunan Medical University ,Changsha 410078,Hunan,China) Abstract:Fluorescence -based genescan with microsatllite markers is a molecular -biology technique which developed in 1990p s.It is used widely in the field such as gene mapping,personal identifica -tion.Here we demonstrate its principle,research stra te gy,analysis methods,applications and discuss the developing prospec t. Key words:microsatellite;fluorescence based genescan;gene mapping;analysis method 人类基因组计划已开展了近10年,1999年12月1日美、日等国科学家宣布,人类22号染色体的测序工作业已完成,其余染色体的大规模测序工作在近3年也已将完成.运用大规模测序的大量数据,将cDNA 与致病基因一一对应起来,将疾病定位到染色体某一位置后进行突变检测,不失为基因克隆的一条捷径.微卫星(Microsatellite)DNA 标记是简单重复的DNA 片段,每个重复单位一般1~6个碱基(bp),重复次数10~20次左右,广泛存在于真核生物中[1].由于其种类多,高度多态,基本上呈平均分布并可用PC R 检测,具有共显性遗传特征,因而广泛用于遗传作图.近年来绝大部分基因定位和克隆都运用了微卫星荧光标记的基因组扫描分析技术. 1 原理与策略 微卫星DNA 在人基因组中平均每30kb 存在1个,人类基因组中以(CA/GT)n 重复序列 第4卷 第2期(专辑)2000年6月 生命科学研究Life Science Research Vol 14 No 12(Suppl.)Jun 12000 X 收稿日期:2000-06-12 基金项目:国家杰出青年基金资助项目(39525012);国家自然科学基金重大项目(39896200) 作者简介:邓昊(1973-),男,湖南长沙人,硕士研究生,从事细胞遗传学和分子遗传学研究;何云贵(1970-),男,湖南湘乡人,博士研究生,从事细胞遗传学和分子遗传学研究;夏家辉(1937-),男,湖南医科大学教授,中国工程院院士,博士生导师.
【开题报告】龙头鱼微卫星标记的开发及筛选
开题报告 生物科学 龙头鱼微卫星标记的开发及筛选 一、论述龙头鱼微卫星多态标记研究现状，说明选题的依据和意义 目前，国内对龙头鱼的研究主要集中在属间的远缘杂交等方面，但是尚未研究成功。对龙头鱼微卫星多态标记的开发目前尚未见报道，而本文主要是通过对龙头鱼微卫星进一步研究，希望能够利用远缘杂交所带来的杂交优势获得具有优良性状子代，那在生产上或遗传学上都将有重大意义。 微卫星标记技术是基于基因组DNA水平的差异进行检测，不受组织，器官种类、环境条件等因素影响，因此可作为水生动物种质鉴定、亲缘关系及种质分类等研究的理想标记。 龙头鱼俗称狗母鱼，属于脊索动物门,硬骨鱼纲,灯笼鱼目,狗母鱼科,龙头鱼属。其形体柔软，长形，略侧扁，头背稍圆。吻短，钝圆，口甚大。龙头鱼生活于暖温性海洋的中下层。运动能力不强。常栖息于浅海泥底的环境中。每年春季为产卵期。杂食性，以小鱼、小虾、底栖动物为食。分布于印度洋和太平洋、我国南海、东海和黄海南部均产之、尤以浙江的温、台和舟山近海以及福建沿海产量较多。属暖水性底层近岸鱼类，缓潮时常到上层。一般只在近海作短距离移动。属捕食性鱼类，生长甚快。以3～4月和9～12月渔获为大。 鉴于恢复与保护野生龙头鱼资源的需要,有必要对龙头鱼的种质遗传基础和种质资源鉴定开展深入的研究。目前,有关龙头鱼群体遗传背景方面的研究很少,仅见于部分学者对龙头鱼野生群体和养殖群体进行了RAPD 分析。然而,迄今为止,尚未见有关龙头鱼微卫星标记研究方面的报道,这严重制约了微卫星标记在龙头鱼遗传学研究中的应用。因此,筛选多态信息含量丰富的龙头鱼微卫星标记,分析龙头鱼群体遗传结构用于标记选择育种等,具有重要的理论意义和应用价值。然而,利用微卫星标记最关键的一步就是微卫星位点的分离和富集。目前,常用的富集微卫星标记的方法主要有3 种: ①构建目标生物小片段插入基因组DNA 文库,通过含有重复序列的探针筛选含有微卫星的阳性克隆; ②通过生物素探针结合链霉亲和素包被的磁珠进行微卫星DNA 片段的富集; ③从公共核酸序列数据库资源中筛选微卫星。其中,传统的构建小
棉花微卫星标记的PAGE_银染快速检测
收稿日期:2000-06-24,3论文联系人 基金项目:国家自然科学基金(39830240,3980089),国家 转基因植物研究专项(J 992A 2023)资助项目 作者简介:张 军(1968-),男,在职博士研究生,工作单 位为山东省农业科学院.棉花微卫星标记的PA GE 银染快速检测 张 军,武耀廷,郭旺珍,张天真3 (农业部农作物种质资源与育种重点开放实验室,南京农业大学农学系,南京210095)摘要:利用一种简便、快速的PA GE 银染方法检测了异源四倍体棉花栽培种陆地棉与海岛棉之间 的微卫星多态性,并检测到了微卫星在陆地棉品 种间的多态及微卫星标记位点在陆地棉品种间的 复等位性。 关键词:棉花;微卫星;PA GE ;银染 中图分类号:S 562.035.3 文献标识码:A 文章编号:100227807(2000)0520267203Fa st Screen i ng of M icrosa tell ite M arkers i n Cotton w ith PAGE sil -ver Sta i n i ng ZHAN G Jun ,W U Yao 2ting ,GUO W ang 2zhen ,ZHAN G T ian 2zhen (A g rono m y D ep a rt m en t ,N anj ing A g ricu ltu ra l U n iversity ;K ey L abora tory of C rop Ger m p las m and B reed ing ,M in istry of A g ricu ltu re ,N anj ing 210095,Ch ina )Abstract :Po lym o rph is m of m icro satellite m ark 2ers betw een cu ltivars of allo tetrap lo id co tton species (Gossyp ium h irsu tum L .)and the seais 2land co tton (G .baba rd ense L .)w as screened u s 2ing a rap id and si m p le m ethod of PA GE silver stain ing .T he po lym o rp h ic and m u ltiallelic char 2acter of m icro satellite m arkers am ong up land co tton cu ltivars w ere iden tified as w ell .Key words :co tton ;m ico satellite ;PA GE ;silver stain ing 微卫星(m icro satellite )或短串联重复(STR ) 又称简单序列重复(SSR )。是指一类遍布于生物基因组中的由几个核苷酸对(称为核心序列,一般为1～6bp S )为重复单位组成的简单串联重复。其重复次数在同一物种不同的遗传型间是高度可变的,但这段重复的两端却是相对保守的单拷贝序列,据此设计引物,即可通过PCR 技术分析核心序列重复次数的变异,在不同的遗传型间检测到多态,称为简单序列长度多态性(SSL P )。微卫星首先是在人类遗传研究中发现的[1],以后发现在 植物中也普遍存在。现在,微卫星作为一种分子标 记技术已经用于植物遗传、育种研究。Yu 等[2]利 用研究开发出的棉花微卫星的引物,进行棉花遗 传图谱构建及Q TL 分析。但是,微卫星的长度很 小,一般为100～300bp S ,有时甚至小于100bp S , 其多态性有时仅表现为几个bp S 的差异。因此一 般的琼脂糖凝胶电泳很难检测微卫星的多态性。 早期的研究是在PCR 反应体系中加入一种用放 射性同位素标记的脱氧核苷酸底物,利用变性或 非变性的PA GE 经放射自显影检测多态性[3,4], 这给研究中利用微卫星标记带来很大的麻烦。利 用高分辨率的琼脂糖凝胶电泳可以检测到大多数 微卫星的多态[4],但这种琼脂糖凝胶的制备费时、 费力。Panaud 等[5]尝试利用PA GE 银染技术检 测微卫星的多态性。银染的灵敏度非常高,但一般 的银染方法操作比较繁琐,不容易控制染色背景, 使得结果不稳定。我们利用一种快速简便的银染 方法,通过非变性的PA GE 有效地检测了陆地棉 与海岛棉种间及陆地棉种内品种间微卫星的多 态性。1 材料和方法1.1 植物材料 陆地棉遗传标准系TM —1、海岛棉高产抗病 品系海7124及其杂交F 1。陆地棉6个栽培品种。 1.2 棉花基因组DNA 的分离纯化参考郭旺珍等[6]的方法。1.3 微卫星的PCR 扩增PCR 反应体系(67mM T ris 2HC l (pH 8.8), 16mM (N H 4)2SO 4,0.002%明胶,0.2mM dN T P S , 7 62 棉花学报 A cta Go ssyp ii Sinica 2000,12(5):267～269
D3S1358等10个短串联重复序列位点在亲子鉴定中的应用
D3S1358等10个短串联重复序列位点在亲子鉴定中的应用 短串联重复序列(STR)在人类基因组中分布广泛、多态性高且易于扩增。因而成为重要的遗传标记系统。被广泛应用于法医学个体识别和亲予鉴定等。汕头出入境检验检疫局恒正司法鉴定中心采用AmpF/ STR SGM Plus试剂盒获得了广东汕头地区汉族人群群体遗传学数据。并应用于亲子鉴定。为综合评估这10个STR位点的应用价值。该文从几个常用的法医统计指标和亲予鉴定的角度进行探讨。 双亲亲子鉴定共21例：排除亲子关系2例，排除指标（位点数）分别为6和4：可以肯定亲子关系19例，亲权概率RCP在0.9993～0.99999998，其中1例出现1个排除指标，其余1 8例所有位点完全匹配，未出现排除指标。 单亲亲予鉴定共93例：排除亲子关系5例，排除指标最少有4个，最多有7个：可以肯定亲子关系51例，RCP均≥99. 900/0，其中3例出现1个排除指标；其余37例的RCP< 99. 90%。其中1例出现1个排除指标，1例出现2个排除指标。 3讨论 3.1 群体遗传学分析所有位点中以D18S51和FGA位点基因型和等位基因最多。最少的位点是D 3S1358和TH01。按从大到小顺序大致可排列为：D 18S 51、FGA、D2S13 38、D21Sll、D19S433、D8S1179、D16S539、vWA、D3S1358、TH01. 将该文报道等位基因频率和美国人群f黑人、白人和拉美人1的等位基因分布资料‘习比较分析可见。汕头地区汉族人群检见美国人群中未经报道的基因：D 21S11- 28.2、33;FG每2 4.2、2 5.2、2 6.2。与“中国罪犯DNA数据库”报道一裂刨。该中心2003年4月发表昀1篇文章曾报道，汕头地区汉族人群D19S433位点不符合HWE平衡，并分析认为原因之一可能是样本数太岁1J。笔者经增加样本数重新计算后该位点已符合HWE平衡，验证了之前的推测。因此，汕头地区汉族人群基因频率分布应按此进行修正。 3.2 多态性指标分析参照标准‘7]：高度多态性STR位点的DP≥0.95,H≥0_85,PE≥0.65;中高度多态性STR位点的DP接近0.9，H>0.7。PE接近或>0.6。那么，这10个STR位点中，高度多态性位点4个fD 2S1338、FGA、D18S51和D8S1179)；中高度多态性位点4个f D19S433、D21Sll、vW A和D16 S5 39)：另有2个位点D3S1358、TH 01的多态性方面较差(DP分别为0. 8653和0.8240，H分别为0.7231和0. 64 87, PE分别为0_4749和0.4037)，但与其他位点联合应用时，仍具有较高的价值。同时，获得各项指标的累积值，最小的排除概率也达到0. 99995。平均偶合率为9.8×10 13。按目前地球现有人口60亿计，除同卵双生子外，出现2个基因型完全相同的人的概率几乎为零。 3.3亲子鉴定在19例可以肯定亲子关系的双亲亲子鉴定中，有1例出现了1个排除指标的情况，由于其RCP为0.99997，因此可以认为该排除指标为突变点。同理。在可以肯定亲予关系的单亲亲子鉴定中。3例出现了1个排除指标的情况，也可以认为是突变所致。 对于37例RCP< 99. 900/0的单亲亲子鉴定个案。需要增加鉴定位点，或者补充鉴定双亲中未参加方样本，观察是否有新的排除指标出现，或者已出现的排除指标是否为突变点，防止误判。 此外，如果隐去双亲亲子鉴定2例排除亲子关系鉴定案中母亲提供的基因型信息，排除指标分别下降为4和3个。由此可见。由于缺乏一方的基因信息。单亲鉴定时的排除指标可能减少，极端的甚至可能出现零指标排谢8J。因此，单亲亲予鉴定时，对于出现1个或2个排除指标的情况下。应综合考虑突变的可能性和RCP的大小，谨慎地做出结论：而对于那些未出现排除指标但亲权概率达不到要求的情况，也应充分考虑零排除事件的可能性，增加鉴定位点鉴定后，方可做出结论。 总之，联合应用这10个STR位点进行双亲亲子鉴定。可以得到认定或排除的结论。在
人类短串联重复序列
人类短串联重复序列(STR)的研究进展 短串联重复序列( Short tandem repeat ,STR)又称微卫星DNA， STR 是一种可遗传的不稳定的并且具有高度多态性的短的核苷酸重复序列. STR 多态性具有种类多,分布广,高度多态性等特点,并按孟德尔遗传规律[ 1 ]在人群中世代相传. 通过对STR 多态性的认识,极大地推动了人类基因组的研究. 这种多态性标志已广泛用于构建人类遗传连锁图谱、基因定位、遗传病诊断、肿瘤细胞染色体分离与重组以及亲子鉴定等法医学检查. DNA遗传标记的多态性研究发展按时间顺序可分为三代[4 ]。第1代遗传标记:限制性片段长度多态性( restriction fragment length polymorphism, RFLP)是Wyman 和White 于1980年偶然发现的,人类14号染色体上存在DNA片段长度有变化的区域,这些区域的结构特点是DNA由一段序列串联重复、首尾相接而成。重复次数可在几次至数百上千次之间变化。DNA重复单位长度在数bp至数十bp之间,组成串联重复的DNA是小卫星DNA。第2代遗传标记:短串联重复序列是由Holly等发现的重复单位的长度只有2～6 bp、重复次数一般在数次至几十次之间的串联重复DNA 序列,即微卫星DNA。微卫星DNA的等位基因片段的长度一般在400 bp 以下,故又称为短串联重复序列( STR)。第3代遗传标记:单核甘酸多态性( single nucleotide polymorphism, SNP)是单个碱基的置换、插入或缺失而形成的,是美国MIT提出的新一代多态性标记系统[5],近年来成为多种研究的焦点。虽然SNP的多态性位点是最多的,能比STR提供更全面的基因信息,但是STR还是以其独特的优点保存下来,仍被广泛的研究。 1.1 STR 的构成 STR 的核心序列为2～7bp ,呈串联重复排列.重复次数10～60 次左右,其总长度常小于400 bp.常见的有一、二、三、四核苷酸重复序列,约占真核生物基因组的5 %. 人类基因组的STR 单核苷酸重复以polyA ,polyT 多见,双核苷酸重复以(CA) n ,( GT) n , (AA) n , ( GG) n 常见, ( GC/ CG) 少见,其原因是由于3′端为G的C(即CPG) 易于甲基化. 三核苷酸重复以(CXG) n 类型常见,由于三核苷酸具有高度多态性,常用作DNA 的标记物. 每个特定位点的STR 均由两部分构成:中间的核心区和外围的侧翼区. 核心区含有一个以上称为“重复”的短序列,一般该重复单位的碱基对数目不变,而串联在一起的重复单位数目是随机改变的,如果用一种不切重复单位的限制性内切酶把DNA 分子切割成限制性片段,该限制性片段中位于核心区的外围即是侧翼区. 人群中不同个体可表现为侧翼区相同而串联重复单位的数目不同;也可为相同数目的重复单位,但侧翼区大小不同,或
应用微卫星标记分析
湖南农业大学 毕业论文 应用微卫星标记分析 湘西黄牛与其他黄牛品种的亲缘关系 学生姓名：陈东 年级专业：2009级动物医学 指导教师及职称： 学院：继续教育学院 湖南·长沙 提交日期：
湖南农业大学成人高等教育本科生毕业论文 诚信声明 本人郑重声明：所呈交的本科毕业论文是本人在指导老师的指导下，进行研究工作所取得的成果，成果不存在知识产权争议。除文中已经注明引用的内容外，本论文不含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体在文中均作了明确的说明并表示了谢意。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 毕业论文作者签名： 年月日
目录 摘要 (1) 关键词 (1) 一、前言 (1) 二、材料与方法 (2) （一）材料 (2) （二）方法....................................................................................2-3 三、结果 (4) （一）牛样本DNA的聚丙烯酰胺凝胶电泳 (4) （二）湘西黄牛各杂交牛的遗传多样性分析 (4) （三）遗传距离分析 (4) 四、分析与讨论 (5) （一）湘西黄牛各杂交牛的特有等位基因和缺失的等位基因 (5) （二）杂合度、期望杂合度、观测杂合度和多态信息含量 (6) 参考文献 (6) 致谢词 (6)
应用微卫星标记分析 湘西黄牛与其他黄牛品种的亲缘关系 学生：陈东 指导老师： （湖南农业大学动物医学院，长沙 410128） 摘要：为了分析湘西黄牛与国内外其他品种的亲缘关系，本研究利用8个微卫星标记对湘西黄牛进行了遗传多样性分析。结果发现湘西黄牛等位基因丰富，在57-72个之间；平均多态信息含量在0.8547～0.9024之间，为高度多态性；平均杂合度在0.8867～0.9248之间；各杂交牛之间都存在一些特有等位基因和缺失等位基因；通过Nei’s聚类分析，其与引进种公牛的遗传距离较大，与国内4个优良肉牛品种相比，可以单独聚为一类。 关键词：湘西黄牛；微卫星；亲缘关系；遗传距离 一、前言 进入20世纪70年代以来，随着DNA重组技术的产生以及分子生物学、分子遗传学等学科的迅猛发展，人类已经能够从分子水平上对遗传物质 DNA的结构进行更直接、更精确的研究，并建立了一系列的分子遗传标记 ( Molecular Genetic Markers )技术。由于微卫星 DNA标记具有多态性高，呈共显性遗传，能准确判别等位基因，遍布于整个基因组且分布均匀等特点，在畜禽遗传育种工作中被广泛应用于构建基因图谱[1-4]，制作DNA指纹图谱[5-7]，定位功能基因和数量性状座位(QTL)[8]，进行血缘鉴定和血缘控制[9-10]，遗传多样性评估等研究。汤青萍等[11]利用微卫星标记对中国部分地方鸡种的遗传多样性进行了分析、Reed等利用微卫星座位对家鸡和火鸡的遗传结构进行了对比分析[12]、牛荣等利用35个微卫星座位对版纳小耳猪近交系进行了遗传分析[13]、张亚平等对大熊猫微卫星DNA的筛选及应用进行了研究[14]。湘西黄牛是湖南省地方家畜优良品种，为了能更有效地对地方品种开展合理保护、开发和利用，本研究采用微卫星 DNA标记对湘西黄牛与国内外的8个其他黄牛品种的遗传多样性进行研究，以期为相关工作提供必要的遗传学依据。 二、材料与方法 （一）材料 1.实验材料 采集湘西黄牛的杂一代牛作为实验样本，采样地点分别在永顺县（152头）和新晃
什么是简单重复序列(SSR)
生物的基因组中，特别是高等生物的基因组中含有大量的重复序列，根据重复序列在基因组中的分布形式可将其分为串联重复序列（Tandem Repeats Sequence，TRS）和散布重复序列（Dispersed Repeats Sequence，DRS）。其中，串联重复序列是由相关的重复单位首位相连、成串排列而成的。目前发现的串联重复序列主要有两类：一类是由功能基因组成的（如rRNA和组蛋白基因）；另一类是由无功能的序列组成的。根据重复序列的重复单位的长度，可将串联重复序列分为卫星DNA、微卫星DNA、小卫星DNA等。 微卫星DNA又叫简单重复序列（Simple Sequence Repeat，SSR），指的是基因组中由1-6个核苷酸组成的基本单位重复多次构成的一段DNA，广泛分布于基因组的不同位置，长度一般在200 bp以下。研究表明，微卫星在真核生物的基因组中的含量非常丰富，而且常常是随机分布于核DNA中。在植物中通过对拟南芥、玉米、水稻、小麦等的研究表明微卫星在植物中也很丰富，均匀分布于整个植物基因组中，但不同植物中微卫星出现的频率变化是非常大的，如在主要的农作物中两种最普遍的二核苷酸重复单位（AC）n和（GA）n在水稻、小麦、玉米、烟草中的数量分布频率是不同的。在小麦中估计有3000个（AC）n序列重复和约6000个（G A）n序列重复，两个重复之间的距离平均分别为704 kb、440 kb，而在水稻中，（AC）n 序列重复约有1000个左右，（GA）n 重复约有2000个，重复之间的平均距离分别为450 kb、225 kb。另外在植物中也发现一些三核苷酸和四核苷酸的重复，其中最常见的是（AAG）n、（AAT）n。在单子叶和双子叶植物中SSR数量和分布也有差异，平均分别为64.6 kb和21.2 kb中有一个SSR。研究还发现，单核苷酸及二核苷酸重复类型的SSR主要位于非编码区，而有部分三核苷酸类型位于编码区。另外在叶绿体基因组中，目前也报道了一些微卫星，以A/T序列重复为主。 研究发现，微卫星中重复单位的数目存在高度变异，这些变异表现为微卫星数目的整倍性变异或重复单位序列中的序列有可能不完全相同，因而造成多个位点的多态性。如果能够将这些变异揭示出来，就能发现不同的SSR在不同的种甚至不同个体间的多态性，基于这一想法，人们发展了SSR标记。SSR标记又称为序列标签微卫星位点（sequence tagged mic rosatell ite site），简写为STMS，是目前最常用的微卫星标记之一。由于基因组中某一特定的微卫星的侧翼序列通常都是保守性较强的单一序列，因而可以将微卫星侧翼的DNA片段克隆、测序，然后根据微卫星的侧翼序列就可以人工合成引物进行PCR扩增，从而将单个微卫星位点扩增出来。由于单个微卫星位点重复单元在数量上的变异，个体的扩增产物在长度上的变化就产生长度的多态性，这一多态性称为简单序列重复长度多态性（Simple Sequence length polymorp
高效快速筛选新发现的微卫星位点的方法-HRM
高效快速筛选新发现的微卫星位点的方法-HRM 摘要：本文介绍了一种新的识别微卫星位点的方法，微卫星标记是一种功能强大的共显性标记，扩增产物可靠且可以确定已知物种的高度的多态信息含量，但是对于新位点的发现依然是一种费时费力的方法。相对于大肠杆菌文库分离方法，新一代测序技术（NGS）可以得到更多可用的候选基因。我们对已知微卫星引物的注释作了系统的论述，并发现无论采用什么分离技术，由于PCR 未充分扩增，基因位点的单态性或多拷贝都会导致一半以上的候选基因丢失。因此，在分子标记技术上，筛选候选基因依然是一个很关键的步骤。我们通过重新评估毛细电泳法进行基因分型，发现HRM可以用于基因分型及筛选候选基因，对此列出了具体的流程。通过该流程，或许我们可以快速地进行新一代标记的检测，并可以把费用降低到传统方法的一半甚至四分之一。 关键词：HRM 微卫星重新分离技术分子标记新一代测序技术群体遗传学 引言 微卫星也叫简单重复序列（SSRs），是群体遗传学中最强大的共显性标记，具有广泛的应用(e.g., Chambers and MacAvoy 2000; Ellegren 2004; Jarne and Lagoda 1996;MacDonald et al. 2011)。最近由于新一代测序技术（NGS）的发展正解决SSRs技术中的一个重要的缺陷，不能获得足够的设计引物的数据。扩增片段多态位点的选择，依然是一件费时费力的工作，这是SSRs发展
中的另一个瓶颈。因此我们引进了HRM用于识别潜在的SSR位点，并且HRM有望加快SSR的发展速度，降低传统方法的费用。SSRs 一般是以核心序列1-6bp为重复单位首尾串联而成的短的DNA序列(Wan et al. 2004)。微卫星具有高突变率、易于进行PCR扩增、便于毛细电泳法(CE)的分析以及可以利用许多软件工具进行生物学推论的诸多优点，使其在群体遗传学方面得到广泛应用。传统的SSR位点的重新分离，是借助于丰富的基因文库(Glenn and Schable 2005; Zane et al. 2002)，但是该法对于SSR位点不多的物种则不能检测到足够的位点进行分析(Arthofer et al. 2007; Megle′cz et al. 2004)。由于NGS的不断改进，尤其是罗氏454 FLX 钛化学（ Titanium XL ?试剂盒可以使其被更广泛的应用）能够识别更多的片段，NGS如今已逐渐取代克隆文库(Castoe et al. 2010; Santana et al. 2009; Vanpe′ et al. 2009)。最重要的一点是NGS建立了无可比拟的信息含量，而在大部分文献中大肠杆菌文库的克隆序列却低于1000个（参考本文文献评论），NGS可以产生成千上万的序列，其中SSR位点达好几千。这些重复区域可以用来设计引物，也可以用软件包进行分析了(Kofler et al. 2007; Megle′cz et al.2009)。借助于传统的和是基于NGS的分离技术，就可以对扩增的新位点、基因组中单拷贝位点及丰富的多态性进行检测。筛选步骤通常包括个体序列的扩增，确定扩增片段质量的凝胶电泳和评定等位基因多样性的毛细管电泳。