制备单克隆抗体的技术要点

制备单克隆抗体的技术要点

1．交瘤技术的技术流程

如图4-1所示。

图4 杂交瘤技术制备单克隆抗体的基本流程2．技术要点

1）免疫脾细胞的制备制备单克隆抗体的动物多采用纯系Balb/c小鼠。免疫的方法取决于所用抗原的性质。免疫方法同一般血清的制备，也可采用脾内直接免疫法。

2）骨髓瘤细胞的培养与筛选在融合前，骨髓瘤细胞应经过含8-AG的培养基筛选，防止细胞发生突变恢复HGPRT的活性（恢复HGPRT的活性的细胞不能在含8-AG的培养基中存活）。骨髓瘤细胞

用10%小牛血清的培养液在细胞培养瓶中培养，融合前24h换液一次，使骨髓瘤细胞处于对数生长期。

3）细胞融合融合是杂交瘤技术的关键一步，细胞融合应在无菌条件下，于室温或37℃水浴中进行。瘤细胞与脾细胞之比为1：8～10，在l～2min内滴加50%PEG 1.0ml 边加边摇，静置1-2min。然后再在2～3min内缓慢滴加无血清培养液，终止反应。1000rpm离心10min。最后加含20%小牛血清的HAT培养液。将细胞混匀，接种于96孔培养板中培养，每孔加0．1ml，同时还加0．1ml的饲养细胞悬液。

4）阳性克隆的筛选应尽早进行。通常在融合后10天作第一次检测，过早容易出现假阳性。检测方法应灵敏、准确、而且简便快速。具体应用的方法应根据抗原的性质，以及所需单克隆抗体的功能进行选择。常用的方法有RIA法、ELISA法和免疫荧光法等。其中ELISA 法最简便，RIA法最准确。阳性克隆的筛选应进行多次，均阳性时才确定为阳性克隆进行扩增。

5）克隆化克隆化的目的是为了获得单一细胞系的群体。克隆化应尽早进行并反复筛选。这是因为初期的杂交瘤细胞是不稳定的，有丢失染色体的倾向。反复克隆化后可获得稳定的杂交瘤细胞株。克隆化的方法很多，而最常用的是有限稀释法。

（1）显微操作法：在显微镜下取单细胞，然后进行单细胞培养。这种方法操作复杂，效率低，故不常用。

（2）有限稀释法：将对数生长期的杂交瘤细胞用培养液作一定

的稀释后，按每孔1个细胞接种在培养皿中，细胞增值后成为单克隆细胞系。第一次克隆化时加一定量的饲养细胞。由于第一次克隆化生长的细胞不能保证单克隆化，所以为获得稳定的单克隆细胞株需经2～3次的再克隆才成。应该注意的是，每次克隆化过程中所有有意义的细胞都应冷冻保存，以便重复检查，避免丢失有意义的细胞。

（3）软琼脂法：将杂交瘤细胞稀释到一定密度，然后与琼脂混悬。在琼脂中的细胞不能自由移动，彼此互不相混，从而达到单细胞培养的目的。但此法不如有限稀释法好。

（4）荧光激光细胞分类法：用抗原包被的荧光乳胶微球标记杂交瘤细胞，然后根据抗原与杂交瘤细胞结合的特异性选出细胞，并进行单细胞培养。

6）细胞的冻存与复苏细胞冻存与复苏的总原则是缓慢冷冻和快速复苏，反之则容易导致细胞内的冰晶形成。细胞株用5%～10%甘油或二甲基亚砜(DMSO)为保护剂，并含有高浓度(40%～60%)的小牛血清，在液氮中保存。细胞悬液以10C～30C / 分的速度降温，15～20分钟后放入液氮罐的气室中，以100C / 分的速度降温至-1000C～-1500C，3～4个小时后快速放入液氮中。复苏时，将存有冷冻细胞的试管直接放入370C～400C的水浴中迅速解冻，然后在解冻的试管中快速加10ml的新鲜培养液，离心去除冷冻剂，再加含小牛血清的新鲜培养液进行培养。

7）单克隆抗体的制备大量生产单克隆抗体的方法可分为体内和体外两大类，目前仍以体内法为主。先给小鼠腹腔注射降植烷(pristane)

造成无菌性腹膜炎，7～14天后将l×106个杂交瘤细胞悬浮于0．5 ml 生理盐水中，并注入小鼠腹腔。10～14天后即可从小鼠腹水中获得高浓度的单克隆抗体。

8）单克隆抗体的纯化与保存

（1）亲和层析法本法的成本高而效率低，故比较少用，但用本法获得的产品纯度高。

（2)中性盐沉淀法小鼠腹水在40C下，2000×g离心20分钟，去除纤维蛋白、不溶性颗粒、以及表面的脂肪层。然后向上清中滴加等体积的pH = 7～8的饱和硫酸铵溶液，边加边搅拌，然后静置4～6小时。离心后取沉淀物再用半饱和硫酸铵溶液洗两次。最后将沉淀溶于少量PBS中，并直接用PBS透析。

（3)离子交换层析法小鼠腹水在40C下，2000×g离心20分钟，去除纤维蛋白、不溶性颗粒、以及表面的脂肪层后，对0.02M Tris、0.1M NaCl、pH = 8.4的缓冲液(含0.02%叠氮钠) 40C下充分透析。然后将其加至经同一缓冲液平衡的DEAE-Sepharose CL6B离子交换柱，用该平衡液洗脱，分管收集并测OD280值。一般情况下，单克隆抗体集中在第一峰中。虽然有时出现第二峰，但该峰常无抗体活性。

（4）凝胶过滤法用Sephadex G200或Sephacryl S300进行层析。此法主要用于IgM类单克隆抗体的纯化。

（5)Protein A-Sepharose CL4B层析本法适用于IgG1 和IgM类单克隆抗体的纯化。

纯化后的单克隆抗体最好保存在0.3M NaCl- 0.04%NaN3 -0.03M 6-氨

基己酸的环境中。在此环境中，40C下可保存数月。有条件时在上述环境中冷冻干燥保存。

9）单克隆抗体的鉴定

（1）纯度的鉴定：可用聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电聚焦电泳等方法进行纯度的鉴定。单克隆抗体在SDS-PAGE上表现为一条区带，但在等电聚焦电泳上并不是一条区带。王世中等报告，纯化后的单克隆抗体在等电聚焦电泳上表现为三条区带。在等速电泳上，单克隆抗体表现为一个主峰，而多克隆抗体则表现有4～5各主峰。目前认为这一指标可作为区别单克隆抗体和多克隆抗体快速而灵敏的方法。

（2）免疫球蛋白及其亚型的鉴定：可用兔抗小鼠各类别及其亚型的抗血清进行鉴定。常用的方法是免疫扩散试验。

（3）抗原决定簇属性的鉴定：可用RIA法或ELISA法进行鉴定。用同位素(或酶)标记一个抗体，另一个不标记。当两个抗体同时与抗原作用时，如有明显的竞争现象，说明是两个不同抗原决定簇的单克隆抗体，否则就是一个。

（4）特异性的鉴定：与多克隆抗体相同，也是用交叉反应率表示。

（5）亲和力的鉴定：与多克隆抗体相同。

10）杂交瘤细胞染色体的鉴定：杂交瘤细胞应为整倍体细胞，所以染色体的数目应成倍的增加。

3．影响杂交瘤技术的因素

影响杂交瘤技术的因素主要有如下几个方面:

1）试剂和器材所有应用的试剂如水、培养基、融合剂(PEG等)、胎牛或小牛血清等，最重要的是血清和融合剂，应用前都必须经过严格的筛选。

2）培养技术在培养技术方面重要的是保证无菌操作，避免污染，其中最常见和最严重的是支原体污染和真菌污染。因此，应确保工作台、培养箱以及各种用具的清洁消毒。所有用具均应高压灭菌后使用。

3）早期克隆化克隆化应早期进行，以避免无关细胞克隆过度生长。有些克隆在低细胞密度时生长较差，此时加适量的饲养细胞、使用高质量的胎牛血清可能有帮助。在克隆化过程中，应保留所有可能有意义的细胞，以便作进一步的克隆化和检查，避免杂交瘤细胞的丢失。

生物选修3专题1 基因工程知识点复习学案

专题1 基因工程 基因工程的概念 基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过________________________，赋予生物以 _____________________，创造出______________________________________。基因工程是在____________上进行设计和施工的，又叫做__________________。 1. （1 （2 （3 2. (1)两种DNA ②区别：E· (2)与DNA 酸二酯键。 3. （1 （2 _____________________的双链___________DNA （3）其它载体： _________________________________ (二)基因工程的基本操作程序 第一步：__________________________ 1.目的基因是指： ______________________________________________________ 。 2.目的基因可采取_______________-获得，也可以用_____________________。人工合成目的基因的常用方 法有________________和_________________。 3.PCR技术扩增目的基因 （1）原理：_____________________ 将目的基因导入植物细胞：采用最多的方法是________________，其次还有基因枪法和花粉管通道法等。将目的基因导入动物细胞：最常用的方法是 _______________。此方法的受体细胞多是 ____________。将目的基因导入微生物细胞：★原核生物作为受体细胞的原因是繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少， 最常用的原核细胞是 ____________，其转化方法是：先用 ________处理细

单克隆抗体制备的基本原理

单克隆抗体制备的基本原理 一、单克隆抗体的概念 抗体（antibody）是机体在抗原刺激下产生的能与该抗原特异性结合的免疫球蛋白。常规的抗体制备是通过动物免疫并采集抗血清的方法产生的，因而抗血清通常含有针对其他无关抗原的抗体和血清中其他蛋白质成分。一般的抗原分子大多含有多个不同的抗原决定簇，所以常规抗体也是针对多个不同抗原决定簇抗体的混合物。即使是针对同一抗原决定簇的常规血清抗体，仍是由不同B细胞克隆产生的异质的抗体组成。因而，常规血清抗体又称多克隆抗体（polyclonal antibody），简称多抗。由于常规抗体的多克隆性质，加之不同批次的抗体制剂质量差异很大，使它在免疫化学试验等使用中带来许多麻烦。因此，制备针对预定抗原的特异性均质的且能保证无限量供应的抗体是免疫化学家长期梦寐以求的目标。随着杂交瘤技术的诞生，这一目标得以实现。 1975年，Kohler和Milstein建立了淋巴细胞杂交瘤技术，他们把用预定抗原免疫的小鼠脾细胞与能在体外培养中无限制生长的骨髓瘤 细胞融合，形成B细胞杂交瘤。这种杂交瘤细胞具有双亲细胞的特征，既像骨髓瘤细胞一样在体外培养中能无限地快速增殖且永生不死，又能像脾淋巴细胞那样合成和分泌特异性抗体。通过克隆化可得到来自单个杂交瘤细胞的单克隆系，即杂交瘤细胞系，它所产生的抗体是针

对同一抗原决定簇的高度同质的抗体，即所谓单克隆抗体（monoclonal antibody，McAb），简称单抗。 与多抗相比，单抗纯度高，专一性强、重复性好、且能持续地无限量供应。单抗技术的问世，不仅带来了免疫学领域里的一次**，而且它在生物医学科学的各个领域获得极广泛的应用，促进了众多学科的发展。 德国科学家柯勒（Georges Ko1er）和英国科学家米尔斯坦（Cesar Milstein）两人由此杰出贡献而荣获1984年度诺贝尔生理学和医学奖。 二、杂交瘤技术 （一）杂交瘤技术的诞生 淋巴细胞杂交瘤技术的诞生是几十年来免疫学在理论和技术两方面 发展的必然结果，抗体生成的克隆选择学说、抗体基因的研究、抗体结构与生物合成以及其多样性产生机制的揭示等，为杂交瘤技术提供了必要理论基础，同时，骨髓瘤细胞的体外培养、细胞融合与杂交细胞的筛选等提供了技术贮备。1975年8月7日，Kohler和Milstein 在英国《自然》杂志上发表了题为“分泌具有预定特异性抗体的融合细胞的持续培养”（Continuous cultures of fused cells secreting antibody of

选修三《现代生物技术专题》必背知识点(人教版)教学提纲

生物选修三易考知识点背诵 专题1 基因工程 1.基因工程:又名或 操作环境:；操作对象:；操作水平: 基本过程: 特点:；本质（原理）： 2．基因工程的基本工具 Ⅰ.“分子手术刀”—— （1）来源：主要是从中分离纯化出来的。 （2）功能：能够识别，并且使 断开。 （3）结果：产生的DNA片段末端——。 （4）要获得某个特定性状的基因必须要用限制酶切几个切口？可产生几个黏性末端？ Ⅱ.“分子缝合针”—— (1)两种DNA连接酶（和）的比较： ①相同点：都缝合键。 ②区别：前者来源于，只能连接；而后者来源于， 能连接，但连接平末端的之间的效率较低。 (2)与DNA聚合酶作用的区别：DNA聚合酶只能将加到已有的核苷酸片段的 末端，形成磷酸二酯键。DNA连接酶是连接的末端，形成磷酸二酯键。 Ⅲ.“分子运输车”——载体 （1）载体具备的条件： ①能在受体细胞中上，并随染色体DNA同步复制； ②具有一至多个，供外源DNA片段插入； ③具有，供重组DNA的鉴定和选择。 （2）最常用的载体是，它是一种裸露的、结构简单的、独立于细菌拟核之外，并具有自我复制能力的。 （3）其它载体： 3.基因工程的基本操作程序 第一步： (1)获取目的基因的方法：、、

(2)PCR技术 ①原理： ②条件：、、、 ③PCR技术与体内DNA复制的区别： a. PCR不需要酶；体内DNA复制需要； b. PCR需要酶（即Taq酶），生物体内的聚合酶在高温时会变性； c. PCR一般要经历三十多次循环，而生物体内DNA复制受生物体遗传物质的控制。 (3)注意：构建基因文库需要哪些操作工具？ 第二步：——基因工程的核心 基因表达载体组成： +复制原点 （1）：是一段有特殊的DNA片段，位于基因的首端，是识别和结合的部位，能驱动基因转录出mRNA。没有启动子，基因就不能转录。 （2）：也是一段有特殊的DNA片段，位于基因的尾端，使转录终止。 （3）标记基因的作用：，常用的标记基因是。 第三步：将目的基因导入受体细胞 常用的转化方法： (1)导入植物细胞：采用最多的方法是法，其次还有基因枪法和花粉管通道法等。 (2)导入动物细胞：最常用的方法是技术。此方法的受体细胞多是。 (3)将目的基因导入微生物细胞：原核生物作为受体细胞的原因是，最常用的原核细胞是大肠杆菌，其转化方法是：先用处理细胞，使其成为，有利于促进感受态细胞吸收DNA分子，完成转化过程。 注意：重组细胞导入受体细胞后，筛选含有基因表达载体受体细胞的依据是。第四步： （1）首先要检测转基因生物的DNA上是否插入了目的基因，方法是采用。用 （2）其次还要检测目的基因是否转录出了mRNA，方法是采用方法是。 用 （3）最后检测目的基因是否翻译成蛋白质，方法是。 （4）有时还需进行个体生物学水平的鉴定。如转基因抗虫植物是否出现抗虫性状，需要。

4第四章 单克隆抗体与基因工程抗体制备技术

第四章单克隆抗体与基因工程抗体制备技术 本章考点 1.概念 2.杂交瘤技术基本原理 3.杂交瘤抗体的制备技术 4.基因工程抗体 由杂交瘤细胞产生的针对抗原分子上某一单个抗原决定簇的抗体，称为单克隆抗体。其理化性状高度均一、生物活性单一、与抗原结合的特异性强、且来源容易。 传统的方法是将抗原注入动物，由动物体内B细胞产生的抗体。由于多数天然的抗原分子具有多种抗原决定簇，每一种决定簇可激活具有相应抗原受体的B细胞产生针对某一抗原决定簇的抗体。因此，将抗原注入机体后，刺激多个B细胞克隆所产生的抗体是针对多种抗原决定簇的混合抗体，故称为多克隆抗体（PoAb）。 第一节杂交瘤技术基本原理 单克隆是指利用在细胞融合基础上的B细胞杂交瘤技术。 杂交瘤技术的基本原理是通过融合两种细胞而同时保持两者的主要特征。这两种细胞分别是经抗原免疫的小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞。被特异性抗原免疫的小鼠脾细胞（B淋巴细胞）的主要特征是它的抗体分泌功能，但不能在体外连续培养，小鼠骨髓瘤细胞则可在培养条件下无限分裂、增殖，即具有所谓永生性。在选择培养基的作用下，只有B细胞与骨髓瘤细胞融合的杂交细胞才能具有持续培养的能力，形成同时具备抗体分泌功能和保持细胞永生性两种特征的细胞克隆。 一、B细胞杂交瘤技术 1.细胞的选择和融合：杂交瘤技术的目的是制备对抗原特异性的单克隆抗体，所以融合一方必须是经过抗原免疫的B细胞，通常选用被免疫动物的脾细胞，脾淋巴细胞的主要特征是抗体分泌功能。融合细胞另一方则要求在培养条件下的永生性，只有肿瘤细胞才是具备这一条件，所以选择同一体系的骨髓瘤细胞，因多发性骨髓瘤是B细胞系恶性肿瘤，其特点是稳定易培养、自身不分泌免疫球蛋白及细胞因子、融合率高、是次黄嘌呤磷酸核酸核糖转化酶（HGPRT）的缺陷株，是理想的脾细胞融合对象。 2.选择培养基的应用：细胞融合的选择培养基中有三种关键成分：次黄嘌呤（H）、氨甲蝶呤（A）、胸腺嘧啶核苷（T），所以取三者的字头称为HAT培养基。次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷是细胞DNA合成的途径；氨甲蝶呤（A）是叶酸的拮抗剂，可阻断瘤细胞利用正常途径合成DNA，而融合作用的瘤细胞是经毒性培养基选取出的缺乏HGPRT细胞株，不能在该培养基上生长，只有融合细胞具有亲代双方遗传性能，才能在HAT 培养基上长期存活与繁殖。 3.有限稀释与抗原特异性的选择：细胞融合是一个随机的过程，需在融合细胞抗体筛选的基础上进行特异性筛选。将融合细胞进行充分稀释，进行克隆化处理，再将阳性细胞进行再次克隆化，应用特异性抗原包被的ELISA找出针对目标抗原的抗体阳性细胞株进行增殖，再进行冰冻，体外培养或动物腹腔接种。

单克隆抗体的制备流程

单克隆抗体的制备流程 （一）动物的选择与免疫 1．动物的选择纯种BALB/C小鼠，较温顺，离窝的活动范围小，体弱，食量及排污较小，一般环境洁净的实验室均能饲养成活。目前开展杂交瘤技术的实验室多选用纯种BALA/C小鼠。 2．免疫方案选择合适的免疫方案对于细胞融合杂交的成功，获得高质量的McAb 至关重要。一般在融合前两个月左右根据确立免疫方案开始初次免疫，免疫方案应根据抗原的特性不同而定。 （1）可溶性抗原免疫原性较弱，一般要加佐剂，半抗原应先制备免疫原，再加佐 剂。常用佐剂：福氏完全佐剂、福氏不完全佐剂。 初次免疫抗原1～50μg加福氏完全佐剂皮下多点注射或脾内注射（一般0.8～1ml,0.2ml/点） ↓3周后 第二次免疫剂量同上，加福氏不完全佐剂皮下或ip（腹腔内注射）（ip剂量不宜超过0.5ml） ↓3周后 第三次免疫剂量同一，不加佐剂，ip（5～7天后采血测其效价） ↓2～3周 加强免疫，剂量50～500μg为宜，ip或iv（静脉内注射） ↓3天后 取脾融合 目前，用于可溶性抗原（特别是一些弱抗原）的免疫方案也不断有所更新，如：① 将可溶性抗原颗粒化或固相化，一方面增强了抗原的免疫原性，另一方面可降低抗 原的使用量。②改变抗原注入的途径，基础免疫可直接采用脾内注射。③使用细胞 因子作为佐剂，提高机体的免疫应答水平，增强免疫细胞对抗原的反应性。 （2）颗粒抗原免疫性强，不加佐剂就可获得很好的免疫效果。以细胞性抗原为例，免疫时要求抗原量为1～2×107个细胞。 初次免疫1×107/0.5ml ip ↓2～3周后 第二次免疫1×107/0.5ml ip ↓3周后 加强免疫（融合前三天）1×107/0.5ml ip或iv ↓ 取脾融合 （二）细胞融合

生物选修三知识点

生物选修三知识点 专题1 基因工程 基因工程的概念 基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过体外DNA重组和转基因技术，赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，又叫做DNA重组技术。 （一）基因工程的基本工具 1.“分子手术刀”——限制性核酸内切酶（限制酶） （1）来源：主要是从原核生物中分离纯化出来的。 （2）功能：能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开，因此具有专一性。 （3）结果：经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式：黏性末端和平末端。2.“分子缝合针”——DNA连接酶 (1)两种DNA连接酶（E·coliDNA连接酶和T4-DNA连接酶）的比较： ①相同点：都缝合磷酸二酯键。 ②区别：E·coliDNA连接酶来源于T4噬菌体，只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间 的磷酸二酯键连接起来；而T4DNA连接酶能缝合两种末端，但连接平末端的之间 的效率较低。 (2)与DNA聚合酶作用的异同:DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核苷酸片段的末 端，形成磷酸二酯键。DNA连接酶是连接两个DNA片段的末端，形成磷酸二酯键。 3.“分子运输车”——载体 （1）载体具备的条件：①能在受体细胞中复制并稳定保存。 ②具有一至多个限制酶切点，供外源DNA片段插入。 ③具有标记基因，供重组DNA的鉴定和选择。

）最常用的载体是质粒,裸露的、结构简单的、独立于细菌染色体之外，并具有自我复制能力的双链环状DNA分子。 （3）其它载体：噬菌体的衍生物、动植物病毒 (二)基因工程的基本操作程序 第一步：目的基因的获取 1.目的基因是指：编码蛋白质的结构基因。 2.原核基因采取直接分离获得，真核基因是人工合成。人工合成目的基因的常用方法有反 转录法_和化学合成法_。 技术扩增目的基因 （1）原理：DNA双链复制 （2）过程：第一步：加热至90～95℃DNA解链；第二步：冷却到55～60℃，引物结合到互补DNA链；第三步：加热至70～75℃，热稳定DNA聚合酶从引物起始互补链的合成。 第二步：基因表达载体的构建 1.目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传至下一代，使目的基因能够表达和发挥作用。 2.组成：目的基因＋启动子＋终止子＋标记基因 （1）启动子：是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，是RNA聚合酶识别和结合的部位，能驱动基因转录出mRNA，最终获得所需的蛋白质。 （2）终止子：也是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的尾端。 （3）标记基因的作用：是为了鉴定受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。常用的标记基因是抗生素基因。 第三步：将目的基因导入受体细胞_ 1.转化的概念：是目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。

单克隆抗体的制备及应用

单克隆抗体的制备及应用 单克隆抗体是由淋巴细胞杂交瘤产生的、只针对复合抗原分子上某一单个抗原决定簇。单克隆抗体技术(monoclonal antibody technique)：一种免疫学技术，将产生抗体的单个B淋巴细胞同骨髓肿瘤细胞杂交，获得既能产生抗体，又能无限增殖的杂种细胞，并以此生产抗体。是仅由一种类型的细胞制造出来的抗体，对应于多克隆抗体、多株抗体——由多种类型的细胞制造出来的一种抗体。 1 单克隆抗体的优点与局限性： 单克隆抗体的优点：(1)杂交瘤可以在体外“永久”地存活并传代，只要不发生细胞株的基因突变，就可以不断地生产高特异性、高均一性的抗体。(2)可以用相对不纯的抗原，获得大量高度特异的、均一的抗体。(3)由于可能得到“无限量”的均一性抗体，所以适用于以标记抗体为特点的免疫学分析方法，如IRMA和ELISA等。(4)由于单克隆抗体的高特异性和单一生物学功能，可用于体内的放射免疫显像和免疫导向治疗。 总体来说，即：高特异性、高纯度、重复性好、敏感性强、成本低和可大量生产等。 单克隆抗体的局限性：(1)单克隆抗体固有的亲和性和局限的生物活性限制了它的应用范围。由于单克隆抗体不能进行沉淀和凝集反应，所以很多检测方法不能用单克隆抗体完成。 (2)单克隆抗体的反应强度不如多克隆抗体。(3)制备技术复杂，而且费时费工，所以单克隆抗体的价格也较高。 2 单克隆抗体的制备： 单克隆抗体的制备原理：应用细胞杂交技术使骨髓瘤细胞与免疫的淋巴细胞二者合二为一，得到杂种的骨髓瘤细胞。这种杂种细胞继承两种亲代细胞的特性，它既具有B淋巴细胞合成专一抗体的特性，也有骨髓瘤细胞能在体外培养增殖永存的特性，用这种来源于单个融合细胞培养增殖的细胞群，可制备抗一种抗原决定簇的特异单克隆抗体。 单克隆抗体的制备过程：抗原准备、动物的选择与免疫、细胞融合、选择杂交瘤细胞及抗体检测、杂交瘤的克隆化、杂交瘤细胞的冻存与复苏、单克隆抗体的纯化等步骤。 抗原准备 抗原，是指能够刺激机体产生（特异性）免疫应答，并能与免疫应答产物抗体和致敏淋巴细胞在体外结合，发生免疫效应（特异性反应）的物质。抗原的基本特性有两种，一是诱导免疫应答的能力，也就是免疫原性，二是与免疫应答的产物发生反应，也就是抗原性。很多物质都可以成为抗原，抗原的具体分类可以参见抗原，在进行单克隆抗体制备过程中，很多物质都可以成为抗原，在常规的科研实验中，科研者经常选用每只小鼠/大鼠每次注射10~50ug 重组蛋白、偶联多肽、偶联小分子等作为抗原产生特异性的单克隆抗体。 动物的选择与免疫

单克隆抗体制备流程

单抗制备流程 1975年，Kohler和Milstein发现将小鼠骨髓瘤细胞和绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合，形成的杂交细胞既可产生抗体，又可无限增殖，从而创立了单克隆抗体杂交瘤技术。这一技术上的突破不仅为医学与生物学基础研究开创了新纪元，也为临床疾病的诊、防、治提供了新的工具。 制备单克隆抗体包括动物免疫、细胞融合、选择杂交瘤、检测抗体、杂交瘤细胞的克隆化、冻存以及单克隆抗体的大量生产，要经过几个月的一系列实验步骤，下面按照制备单克隆抗体的流程顺序，逐一介绍其实验方法。 一、细胞融合前准备 (一) 免疫方案 选择合适的免疫方案对于细胞融合杂交的成功，获得高质量的McAb至关重要。一般要在融合前两个月左右确立免疫方案开始初次免疫，免疫方案应根据抗原的特性不同而定。 1.颗粒性抗原免疫性较强，不加佐剂就可获得很好的免疫效果。下面以细胞性抗原为例的免疫方案: 初次免疫1×10７／0.5ml ip (腹腔内注射) ↓2～3周后 第二次免疫1×10７／0.5ml ip ↓3周后 加强免疫(融合前三天) 1×10７／0.5ml ip或iv(静脉内注射) ↓ 取脾融合 2.可溶性抗原免疫原性弱，一般要加佐剂，常用佐剂：福氏完全佐剂，福氏不完全佐剂。要求抗原和佐剂等体积混合在一起，研磨成油包水的乳糜状，放一滴在水面上不易马上扩散呈小滴状表明已达到油包水的状态。商品化福氏完全佐剂在使用前须振摇，使沉淀的分枝杆菌充分混匀。 初次免疫 Ag 1～50μg 加福氏完全佐剂皮下多点注射

│(一般0.8～1ml 0.2ml／点) ↓3周后 第二次免疫剂量同上，加福氏不完全佐剂皮下或ip │(ip剂量不宜超过0.5ml) ↓3周后 第三次免疫剂量同上，不加佐剂，ip │ (5～7天后采血测其效价，检测免疫效果) ↓2～3周后 加强免疫，剂量50～500μg为宜，ip或iv ↓3天后 取脾融合 目前，用于可溶性抗原(特别是一些弱抗原)的免疫方案也不断有所更新，如①将可溶性抗原颗粒化或固相化，一方面增强了抗原的免疫原性，另一方面可降低抗原的使用量。②改变抗原注入的途径，基础免疫可直接采用脾内注射。③使用细胞因子作为佐剂，提高机体的免疫应答水平，促进免疫细胞对抗原反应性。 (二) 饲养细胞 在制备单克隆抗体过程中，许多环节需要加饲养细胞，如：在杂交瘤细胞筛选、克隆化和扩大培养过程中，加入饲养细胞是十分必要的。常用的饲养细胞有：小鼠腹腔巨噬细胞(较为常用)、小鼠脾脏细胞或小鼠胸腺细胞，也有人用小鼠成纤维细胞系3T3经放射线照射后作为饲养细胞，使用比较方便，照射后可放入液氮罐长期保存，随用随复苏。 小鼠腹腔巨噬细胞的制备 小鼠采用与免疫小鼠相同的品系，常用BaLb／c小鼠6～10周龄 ↓ 拉颈处死浸泡于75％酒精，消毒3～5分钟 ↓

(完整word版)高中生物选修3细胞工程知识点

细胞工程 考点一植物细胞工程1.细胞工程 (1)操作水平：细胞水平或细胞器水平。 (2)目的：按照人的意愿来改变细胞内的遗传物质或获得细胞产品。 2.植物细胞的全能性 (1)概念：具有某种生物全部遗传信息的任何一个细胞，都具有发育成完整生物体的潜能。 (2)原理：细胞内含有本物种的全部遗传信息。 (3)全能性表达条件：具有完整的细胞结构，处于离体状态，提供一定的营养、激素和其他适宜外界条件。 3.植物组织培养技术 (1)原理：植物细胞具有全能性。 (2)过程： 4.植物体细胞杂交技术 (1)概念：将不同种的植物体细胞，在一定条件下融合成杂种细胞，并把杂种细胞培育成新的植物体的技术。 (2)原理：体细胞杂交利用了细胞膜的流动性，杂种细胞培育成杂种植株利用了植物细胞的全能性。 (3)过程(4)意义：克服不同种生物远缘杂交的不亲和性。 5.植物细胞工程的实际应用 (1)植物繁殖的新途径 ①微型繁殖：用于快速繁殖优良品种的植物组织培养技术。 ②作物脱毒技术：选取作物无毒组织(如茎尖)进行组织培养，获得脱毒苗的技术。 ③人工种子：以植物组织培养得到的胚状体、不定芽、顶芽和腋芽等为材料，经过人工薄膜包装得到的种子。 (2)作物新品种的培育 ①单倍体育种 a.实质：花药离体培养过程就是植物组织培养过程。 b.流程：花药单倍体幼苗――――――――→ 秋水仙素诱导 染色体数目加倍 纯合子。 c.优点：后代不发生性状分离，都是纯合子，能够稳定遗传，明显缩短了育种年限。 ②突变体的利用：筛选出对人们有用的突变体，进而培育成新品种。 (3)细胞产物的工厂化生产 1.植物组织培养的关键 (1)条件：离体，一定营养物质，激素(生长素、细胞分裂素)等。

高考生物必背知识点总结

高考生物必背知识点总结 1．人工诱导多倍体最有效的方法：用秋水仙素来处理，萌发的种子或幼苗。2．单倍体是指：体细胞中含本物种配子染色体数目的个体。单倍体特点：植株弱小，而且高度不育。 单倍体育种过程：杂种F1 单倍体纯合子。 单倍体育种优点：明显缩短育种年限。 3．现代生物进化理论基本观点：种群是生物进化的基本单位，生物进化的实质是种群基因频率的改变。突变和基因重组，自然选择及隔离是物种形成过程的三个基本环节，通过它们的综合作用，种群产生分化，最终导致新物种形成。在这个过程中，突变和基因重组产生生物进化的原材料，自然选择使种群的基因频率定向改变并决定生物进化的方向，隔离是新物种形成的必要条件。 4．物种是：指分布在一定的自然区域，具有一定形态结构和生理功能，而且在自然状态下能相互交配和繁殖，并能够产生可育后代的一群生物个体。 5．达尔文自然选择学说意义：能科学地解释生物进化的原因，生物多样性和适应性。 局限：不能解释遗传变异的本质及自然选择对可遗传变异的作用。 6.基因重组只发生在减数分裂过程和基因工程中，(三倍体，病毒，细菌等不能基因重组。) 7.细胞生物的遗传物质就是DNA，有DNA就有RNA，有5种碱基，8种核苷酸。 8.双缩尿试剂不能检测蛋白酶活性，因为蛋白酶本身也是蛋白质。 9.高血糖症，不等于糖尿病，高血糖症尿液中不含葡萄糖，只能验血，不能用本尼迪特试剂检验，因为血液是红色的。 10.洋葱表皮细胞不能进行有丝分裂，必须是连续分裂的细胞才有细胞周期。 11.细胞克隆，就是细胞培养，利用细胞增值的原理。 12.细胞板不等于赤道板，细胞板是植物细胞分裂后期由高尔基体形成，赤道板不是细胞结构。 13.激素调节是体液调节的主要部分，CO2刺激呼吸中枢使呼吸加快属于体液调节。 9.注射血清治疗患者不属于二次免疫，(抗原加记忆细胞才是)，血清中的抗体是多种抗体的混合物。 10.刺激肌肉会收缩，不属于反射，反射必须经过完整的反射弧(这个点昨天一摸理综就考了)，判断兴奋传导方向有突触或神经节。 11.递质分兴奋行递质和抑制性递质，抑制性递质能引起下一个神经元电位变化，但电性不变，所以不会引起效应器反应。

单克隆抗体制备方法(全)

单克隆抗体制备方法 1975年Kohler和Milstein发现将小鼠骨髓瘤细胞与和绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合，形成的杂交瘤细胞既可产生抗体，又可无性繁殖，从而创立了单克隆抗体杂交瘤技术。这一技术上的突破使血清学的研究进入了一个高度精确的新纪元。 采用杂交瘤技术制备单克隆抗体包括动物免疫、细胞融合、选择杂交瘤、检测抗体、杂交瘤细胞的克隆化、冻存以及单克隆抗体的大量生产，要经过几个月的一系列实验步骤。 主要仪器设备： 超净工作台、CO2恒温培养箱、超低温冰箱（-70℃）、倒置显微镜、精密天平或电子天平、液氮罐、离心机（水平转子，4000r/min）、37℃水浴箱、纯水装置、滤器、真空泵等。其需要的主要器械包括：100ml、50ml、25ml细胞培养瓶，10ml、1ml刻度吸管，试管，滴管（弯头、直头），平皿，烧杯，500ml、250ml、100ml盐水瓶，青霉素小瓶，10ml、5ml、1ml注射器等，96孔、24孔细胞培养板，融合管（50ml圆底带盖玻璃或塑料离心管），眼科剪刀，眼科镊，血细胞计数板，可调微量加样器（~50ul，~200ul，~1000ul），弯头针头，200目筛网，小鼠固定装置等。此外，一般的单克隆抗体制备方法大同小异。 方法 动物的选择与免疫 1. 动物的选择 BALB/C小鼠，较温顺，离窝的活动范围小，体弱，食量及排污较小，一般环境洁净的实验室均能饲养成活。目前开展杂交瘤技术的实验室多选用纯种BALA/C小鼠。 2. 免疫方案 选择合适的免疫方案对于细胞融合杂交的成功，获得高质量的McAb至关重要。一般在融合前两个月左右根据确立免疫方案开始初次免疫，免疫方案应根据抗原的特性不同而定。 （1）可溶性抗原免疫原性较弱，一般要加佐剂，半抗原应先制备免疫原，再加佐剂。常用佐剂：福氏完全佐剂、福氏不完全佐剂。 初次免疫抗原1～50μg加福氏完全佐剂皮下多点注射或脾内注射（一般0.8～1ml,0.2ml/点） ↓3周后 第二次免疫剂量同上，加福氏不完全佐剂皮下或ip（腹腔内注射）（ip剂量不宜超过0.5ml） ↓3周后 第三次免疫剂量同一，不加佐剂，ip（5～7天后采血测其效价） ↓2～3周 加强免疫，剂量50～500μg为宜，ip或iv（静脉内注射） ↓3天后取脾融合 目前，用于可溶性抗原（特别是一些弱抗原）的免疫方案也不断有所更新，如：①将可溶性抗原颗粒化或固相化，一方面增强了抗原的免疫原性，另一方面可降低抗原的使用量。②改变抗原注入的途径，基础免疫可直接采用脾内注射。③使用细胞因子作为佐剂，提高机体的免疫应答水平，增强免疫细胞对抗原的反应性。

单克隆抗体制备过程中经过两次筛选

单克隆抗体制备过程中经过两次筛选 单克隆抗体制备过程中，总共有两次筛选，第一次筛选出杂交瘤细胞，第二次筛选出能产生特异性抗体的杂交瘤细胞，两次筛选的原理和方法是不相同的。 第一次筛选的原理与方法：细胞融合后，杂交瘤细胞的选择性培养是第一次筛选的关键。普遍采用的HAT选择性培养液是在普通的动物细胞培养液中加入次黄嘌呤（H）、氨基喋呤（A）和胸腺嘧啶核苷酸（T）。其依据是细胞中的DNA合成有两条途径：一条途径是生物合成途径（“D途径”），即由氨基酸及其他小分子化合物合成核苷酸，为DNA分子的合成提供原料。在此合成过程中，叶酸作为重要的辅酶参与这一过程，而HAT培养液中氨基喋呤是一种叶酸的拮抗物，可以阻断DNA合成的“D途径”。另一条途径是应急途径或补救途径（“S途径”），它是利用次黄嘌呤—鸟嘌呤磷酸核苷转移酶（HGPRT）和胸腺嘧啶核苷激酶（TK）催化次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷生成相应的核苷酸，两种酶缺一不可。因此，在HAT培养液中，未融合的效应B细胞和两个效应B细胞融合的“D途径”被氨基喋呤阻断，虽“S途径”正常，但因缺乏在体外培养液中增殖的能力，一般10d左右会死亡。对于骨髓瘤细胞以及自身融合细胞而言，由于通常采用的骨髓瘤细胞是次黄嘌呤—鸟嘌呤磷酸核苷转移酶缺陷型（HGPRT）细胞，因此自身没有“S途径”，且“D途径”又被氨基喋呤阻断，所以在HA T培养液中也不能增殖而很快死亡。惟有骨髓瘤细胞与效应B细胞相互融合形成的杂交瘤细胞，既具有效应B细胞的“S途径”，又具有骨髓瘤细胞在体外培养液中长期增殖的特性，因此能在HA T培养液中选择性存活下来，并不断增殖。 第二次筛选的原理和方法：在实际免疫过程中，由于采用连续注射抗原的方法，且一种抗原决定簇刺激机体形成相对应的一种效应B淋巴细胞，因此，从小鼠脾脏中取出的效应B淋巴细胞的特异性是不同的，经HA T培养液筛选的杂交瘤细胞特异性也存在差异，所以必须从杂交瘤细胞群中筛选出能产生针对某一预定抗原快定簇的特异性杂交瘤细胞。通常采用有限稀释克隆细胞的方法，将杂交瘤细胞多倍稀释，接种在多孔的细胞培养板上，使每一孔含一个或几个杂交瘤细胞（理论上30%的孔中细胞数为0时，才能保证有些孔中是单个细胞），再由这些单细胞克隆生长，最终选出分泌预定特异抗体的杂交细胞株进行扩大培养。因此，单克隆抗体制备过程中，两次筛选的原理和方法是不相同的。 单克隆抗体制备的基本原理与过程 原理： B淋巴细胞在抗原的刺激下，能够分化、增殖形成具有针对这种抗原分泌特异性抗体的能力。B细胞的这种能力和量是有限的，不可能持续分化增殖下去，因此产生免疫球蛋白的能力也是极其微小的。将这种B细胞与非分泌型的骨髓瘤细胞融合形成杂交瘤细胞，再进一步克隆化，这种克隆化的杂交瘤细胞是既具有瘤的无限生长的能力，又具有产生特异性抗体的B淋巴细胞的能力，将这种克隆化的杂交瘤细胞进行培养或注入小鼠体内即可获得大量的高效价、单一的特异性抗体。这种技术即称为单克隆抗体技术。 过程： 1）免疫脾细胞的制备制备单克隆抗体的动物多采用纯系Balb/c小鼠。免疫的方法取决于所用抗原的性质。免疫方法同一般血清的制备，也可采用脾内直接免疫法。 2）骨髓瘤细胞的培养与筛选在融合前，骨髓瘤细胞应经过含8-AG的培养基筛选，防止细胞发生突变恢复HGPRT 的活性（恢复HGPRT的活性的细胞不能在含8-AG的培养基中存活）。骨髓瘤细胞用10%小牛血清的培养液在细胞培养瓶中培养，融合前24h换液一次，使骨髓瘤细胞处于对数生长期。 3）细胞融合的关键: 1技术上的误差常常导致融合的失败。例如，供者淋巴细胞没有查到免疫应答。这必然要失败的。 2融合试验最大的失败原因是污染，融合成功的关键是提供一个干净的环境，以及适宜的无菌操作技术。 4）阳性克隆的筛选应尽早进行。通常在融合后10天作第一次检测，过早容易出现假阳性。检测方法应灵敏、准确、而且简便快速。具体应用的方法应根据抗原的性质，以及所需单克隆抗体的功能进行选择。常用的方法有RIA法、ELISA法和免疫荧光法等。其中ELISA法最简便，RIA法最准确。阳性克隆的筛选应进行多次，均阳性时才确定为阳性克隆进行扩增。 5）克隆化克隆化的目的是为了获得单一细胞系的群体。克隆化应尽早进行并反复筛选。这是因为初期的杂交瘤细胞是不稳定的，有丢失染色体的倾向。反复克隆化后可获得稳定的杂交瘤细胞株。克隆化的方法很多，而最常用的是有限稀释法。 （1）显微操作法：在显微镜下取单细胞，然后进行单细胞培养。这种方法操作复杂，效率低，故不常用。 （2）有限稀释法：将对数生长期的杂交瘤细胞用培养液作一定的稀释后，按每孔1个细胞接种在培养皿中，细胞增值后成为单克隆细胞系。第一次克隆化时加一定量的饲养细胞。由于第一次克隆化生长的细胞不能保证单克隆化，所以为获得稳定的单克隆细胞株需经2～3次的再克隆才成。应该注意的是，每次克隆化过程中所有有意义的细胞都

高中生物选修3细胞工程知识点

细胞工程 植物细胞工程) 1.细胞工程 (1)操作水平：细胞水平或细胞器水平。 (2)目的：按照人的意愿来改变细胞内的遗传物质或获得细胞产品。 2.植物细胞的全能性 (1)概念：具有某种生物全部遗传信息的任何一个细胞，都具有发育成完整生物体的潜能。 (2)原理：细胞内含有本物种的全部遗传信息。 (3)全能性表达条件：具有完整的细胞结构，处于离体状态，提供一定的营养、激素和其他适宜外界条件。 3.植物组织培养技术 (1)原理：植物细胞具有全能性。 (2)过程： 4.植物体细胞杂交技术 (1)概念：将不同种的植物体细胞，在一定条件下融合成杂种细胞，并把杂种细胞培育成新的植物体的技术。 (2)原理：体细胞杂交利用了细胞膜的流动性，杂种细胞培育成杂种植株利用了植物细胞的全能性。 (3)过程 (4)意义：克服不同种生物远缘杂交的不亲和性。 5.植物细胞工程的实际应用 (1)植物繁殖的新途径 ①微型繁殖：用于快速繁殖优良品种的植物组织培养技术。 ②作物脱毒技术：选取作物无毒组织(如茎尖)进行组织培养，获得脱毒苗的技术。 ③人工种子：以植物组织培养得到的胚状体、不定芽、顶芽和腋芽等为材料，经过人工薄膜包装得到的种子。 (2)作物新品种的培育 ①单倍体育种 a.实质：花药离体培养过程就是植物组织培养过程。 b.流程：花药单倍体幼苗纯合子。 c.优点：后代不发生性状分离，都是纯合子，能够稳定遗传，明显缩短了育种年限。 ②突变体的利用：筛选出对人们有用的突变体，进而培育成新品种。 (3)细胞产物的工厂化生产 1.植物组织培养的关键 (1)条件：离体，一定营养物质，激素(生长素、细胞分裂素)等。 (2)培养基状态：固体培养基(需再分化生根培养基及生芽培养基)

7单克隆抗体制备教案

单克隆抗体的制备 一、教学目标 知识目标：1、单克隆抗体的概念 2、单克隆抗体的制备过程，以及过程中涉及的具体筛选过程。 3、单克隆抗体的应用，和普通抗体相比的优点。 能力目标：1、学会从复杂的制备过程中找出简单的流程图 2、注意前后知识点的对比学习。 情感态度价值观：从生物导弹的应用了解单克隆抗体目前在抗癌方面的贡献，并努力掌握更多的相关知识。 二、教学的重点难点： 单克隆抗体的制备过程，以及过程中涉及的具体筛选过程。 三、教学课时：1课时 四、教学过程： 【一】锚式问题：从“生物导弹”一个新颖而又陌生的画面入手。引发学生的探究热情。具体结合材料和图片来介绍生物导弹。资料：“生物导弹”是免疫导向药物的形象称呼，它由单克隆抗体与药物或放射性同位素配合而成，因带有单克隆抗体而能自动导向，在生物体内与特定目标细胞或组织结合，并由其携带的药物产生治疗作用。 问题：生物导弹中的关键成分是什么？什么是单克隆抗体？ 【二】自主探究（4分钟，学生看课本完成） 1、长期人们怎样获得抗体？这样的抗体有什么缺点？ （给动物反复注射抗原，然后在动物的血清中提取抗体。抗体产量低、纯度低、特异性差）2、B淋巴细胞在分泌抗体时有什么特点？B淋巴细胞实际指的是什么细胞？ （一个或是一种B淋巴细胞只能分泌一种抗体；效应B细胞或是浆细胞） 分析：这两个问题比较简单，而且在课本中能直接找到答案，学生迅速阅读课本就能完成。【三】继续探究（10分钟，学生看课本，查阅资料，讨论合作完成） 1、写出单克隆抗体制备的过程简图（略，见课件） 2、怎么获得免疫小鼠，目的是什么？ （给小鼠注射特定的抗原，使小鼠发生特定的体液免疫，产生相应的B淋巴细胞） 3、为何选择B淋巴细胞和骨髓瘤细胞？ （B淋巴细胞能产生特定的抗体，单不能无限增殖；骨髓瘤细胞能无限增殖） 4、过程中大致需要几次筛选？怎么筛选？目的是什么？ （主要是2次。第一次为了筛选出杂交瘤细胞；第二次筛选出能大量产生特定抗体的杂交瘤细胞。） 5、最终获得单克隆抗体的办法有几种？分别是？ （两种。体内在小鼠的腹水中提取；体外在细胞的培养液中提取） 6、单克隆抗体制备过程涉及的技术及其原理有哪些？ （细胞融合：原理是细胞膜具有流动性；动物细胞培养原理：细胞增殖） 分析：上述的6个问题涉及的内容是本节课的重点和难点，也是考点，需要和学生一起系统化的梳理，并强调重点内容作好笔记。 【四】继续探究总结 1、单克隆抗体的“单”和“克隆”分别指的是什么？ （单：单个能产生大量抗体的杂交瘤细胞；克隆：无性繁殖即有丝分裂）

单克隆抗体制备简要流程

制备单克隆抗体是复杂而费时的工作，整个技术流程如图: 单克隆抗体制备（免疫2-3月，总周期4-6 月） 准备抗原 动物免疫——选择免疫动物 Elisa测抗血清--------- ? ￥ 分离脾细胞骨髓瘤细胞 细胞融合（融合剂：PEJ HAT培养基筛选杂交瘤细胞 筛选阳性细胞------- * （三天内做完流式）“ 阳性克隆并扩大培养呻—细胞冻存 性！ 扩大培养收集上清动物接种收集腹水 单克隆抗体纯化保存 1、抗原提纯与动物免疫： 选择BALB/c健康小鼠。如为细胞抗原，可取 1 X 107个细胞作腹腔免疫；可溶性抗原需加完全福氏佐剂并经充分乳化，可将抗原所在的电泳条带切下，研磨后直接用以动物免疫。免疫3?4只小鼠，间隔一般2?3周，末次免疫后3?4天，分离脾细胞。 2、骨髓瘤细胞及饲养细胞的制备 选择Sp2/0细胞株，将昆明鼠的腹腔细胞作为饲养细胞 3、细胞融合 将两种细胞混合后加入PEG（融合剂）使细胞彼此融合。其后用培养液稀释PEG 消除PEG的作用。注意：细胞比例、培养液成分、反应时间 4、有限稀释法筛选阳性株 筛选阳性株一般选用的骨髓瘤细胞为HAT敏感细胞株（一般稀释至0.8个细胞/孔）细胞培养至覆盖0 %?20%孔底时，吸取培养上清用ELISA检测抗体含量。首先依抗体的分泌情况筛选出高抗体分泌孔，将孔中细胞再行克隆化，尔后进行抗原特异的ELISA 测定，选高分泌特异性细胞株扩大培养或冻存。 5、单克隆抗体的制备与保存 筛选出的阳性细胞株应及早进行抗体制备，最普遍采用的是小鼠腹腔接种法。选用BALB/c小鼠，先用液体石蜡进行小鼠腹腔注射，一周后将杂交瘤细胞接种到小鼠腹腔中去。通常在接种一周后即有明显的腹水产生，每只小鼠可收集5?10ml的腹水，冻存。6、单克隆抗体的纯化 硫酸铵沉淀法

细胞工程知识点填空(附答案)

专题2 细胞工程 （一）植物细胞工程 1.理论基础（原理）： 全能性表达的难易程度： 2.植物组织培养技术 （1）过程：离体的植物器官、组织或细胞―→愈伤组织―→试管苗―→植物体 （2）用途：。（3）地位：是培育、培育植物新品种的最后一道工序。 3.植物体细胞杂交技术 （1）过程： （2）诱导融合的方法：物理法包括等。化学法一般是用 作为诱导剂。（3）意义： （二）动物细胞工程 1. 动物细胞培养 （1）概念：动物细胞培养就是从动物机体中取出相关的，将它分散成，然后放在适宜的中，让这些细胞。 （2）动物细胞培养的流程：取动物组织块（动物胚胎或幼龄动物的器官或组织）→剪碎→用 处理分散成→制成→转入培养瓶中进行培养→贴满瓶壁的细胞重新用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理分散成单个细胞继续培养。（3）细胞贴壁和接触抑制：悬液中分散的细胞很快就，称为。细胞数目不断增多，当贴壁细胞分裂生长到表面时，细胞就会，这种现象称为。 （4）动物细胞培养需要满足以下条件 ①：培养液应进行处理。通常还要在培养液中添加一 定量的，以防培养过程中的污染。此外，应定期更换培养液，防 止。 ②：合成培养基成分：糖、氨基酸、促生长因子、无机盐、微量元素等。通常需加入 等天然成分。 ③：适宜温度：哺乳动物多是；pH：。 ④：95%＋5%。O2是所必需的，CO2的主要作用 是。 （5）动物细胞培养技术的应用： 2.动物体细胞核移植技术和克隆动物 （1）哺乳动物核移植可以分为核移植（比较容易）和核移植（比较难）。

（2）选用去核卵(母)细胞的原因：卵(母)细胞； 卵(母)细胞。 （3）体细胞核移植的大致过程是：（下图） （4）体细胞核移植技术的应用： ①② ③④ ⑤ （5）体细胞核移植技术存在的问题： 克隆动物存在着问题、表现出缺陷等。 3.动物细胞融合 （1）动物细胞融合也称，是指两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的过程。融合后形成的具有原来细胞遗传信息的单核细胞，称为。（2）动物细胞融合与植物原生质体融合的原理基本相同，诱导动物细胞融合的方法与植物原生质体融合的方法类似，常用的诱导因素有等。 （3）动物细胞融合的意义：克服了，成为研究 的重要手段。 （4）动物细胞融合与植物体细胞杂交的比较： 比较项目细胞融合的原理细胞融合的方法诱导手段用法 植物体细 胞杂交 细胞膜的流动性去除细胞壁后诱 导原生质体融合 离心、电刺激、 振动，聚乙二醇 等试剂诱导 克服了远缘杂交 的不亲和性，获得 杂种植株 动物细胞 融合 细胞膜的流动性使细胞分散后诱 导细胞融合 除应用植物细胞 杂交手段外，再加 灭活的病毒诱导 制备单克隆抗体 的技术之一 4.单克隆抗体 （1）抗体：一个B淋巴细胞只分泌一种。从血清中分离出的抗体 。 （2）单克隆抗体的制备过程： 注入小鼠 细胞融合 分离 抗原注入小鼠体内 B淋巴细胞骨髓瘤细胞 杂交瘤细胞 细胞培养 选择培养细胞 培养基 体内培养体外培养 从腹水提取从培养液提取 单克隆抗体 核移植 胚胎移植

单克隆抗体制备的技术原理

单克隆抗体制备的技术原理 单克隆抗体是由一个杂交瘤细胞及其后代所产生的抗体，具有单一、特异与纯化的特性。该抗体在医学临床诊断及治疗上具有极其重要的作用。因此它的问世在现代免疫学上具有划时代的意义。 大家知道，当外源性物质在人体或动物血液中出现时，机体中有一些淋巴细胞便会做出反应，产生一些特殊的免疫球蛋白，叫做抗体。而那些外源性物质则称为抗原。抗体与抗原能发生特异结合，从而清除异物，达到保护肌体的作用。抗原不同，它所诱发的抗体也不一样。如细菌或病毒表面存在着几种抗原，因此它们就会对应地诱发出几种不同的抗体。过去人们为了获得抗体，就根据上述原理，反复注射某种抗原到动物（如兔、羊、马等）体内，然后从其血清中分离出所需的抗体。长期以来，用这种经典方法得到的抗体，往往存在着两个严重的缺点：第一，这些抗体不是均质的，而是一种抗体的混合物，特异性差，效价低；第二，抗体的产生是有限量的，因为分泌抗体的成熟淋巴细胞寿命很短，一般只能存活几天，无法大量生产。 为了克服上述缺点，许多免疫学家曾进行了长期的研究与探索，这一难题终于在1975年被国外两名免疫学家考勒和米尔斯坦解决了。他们利用自己创立的杂交瘤技术，使产生抗体的淋巴细胞能在体外长期存活，并源源不断地分泌抗体。这就是有高特异性和非常均质的单克隆抗体。 单克隆抗体的技术原理并不十分复杂。它是把能产生单一抗体的淋巴细胞与有增殖能力的骨髓瘤细胞进行融合，形成杂交瘤细胞，又称杂交瘤。由于这些杂种细胞继承了双亲细胞的遗传物质，因此它们不仅能表现出淋巴细胞分泌单一抗体的能力，而且还能表现出骨髓瘤细胞在体外大量繁殖的本领。就这样，取长补短，使杂交瘤变成了一座制造单克隆抗体的理想“工厂”。 目前制备单克隆抗体的具体方法，主要有以下三步（图2－9）。 第一步：将抗原注射到小鼠体内进行免疫，取出受免脾细胞，与小鼠骨髓瘤细胞融合。 第二步：用选择培养基，选出杂交瘤细胞，逐一克隆或扩增，从中挑出能产生抗体的杂交瘤细胞。 第三步：将杂交瘤细胞接种在培养瓶中扩大培养或注射到动物的体液中作为腹水癌生长，然后再分离纯化单克隆抗体。