细胞色素氧化酶染色液(联苯胺法)使用说明
细胞色素氧化酶染色液(联苯胺法)使用说明
货号：G2410
有效期：6个月。
产品组成：
产品名称规格保存
试剂(A):CO清除液2×50ml4℃避光
试剂(B):DAB 孵育液B1:DAB染色液45ml-20℃避光B2:DAB增强剂5ml RT
B3:DAB反应液100μl RT
按B1:B2:B3=9000:1000:3混合，即为DAB孵育液，即配即用。
试剂(C):苏木素染色液50ml4℃避光
试剂(D):CO对照液1ml RT
产品说明：
细胞色素氧化酶(Cytochrome Oxidase，CO)被认为是线粒体膜固有的酶，在含有大量线粒体的细胞(如心肌、肾小管上皮以及胃壁细胞、肝细胞)内都具有高度活性。此酶活性往往作为细胞内氧化代谢的指标，亦作为线粒体的标志酶之一。
细胞色素氧化酶染色液(联苯胺法)染色原理是细胞色素氧化酶催化3,3-二氨基联苯胺(DAB)使其侧链的氨基氧化，进行反复的氧化性聚合和氧化性环化形成不溶性的棕色Phenazine 聚合物。此酶对固定剂敏感，故须用新鲜切片。
自备材料：
1、恒温培养箱
2、光学显微镜
操作步骤(仅供参考)：
1、冰冻切片，厚6μm，不固定。
2、滴加CO清除液于切片上，铺满整个样品表面。
3、切片入DAB孵育液中，37℃避光孵育45～60min。
4、移去切片上的染色液，滴加CO清除液于切片上，铺满整个样品表面。
5、蒸馏水稍洗3～5s。
6、(可选)滴加苏木素染色液浅染细胞核3～5min。
7、流水冲洗10min。常规脱蜡透明，中性树胶封固。
染色结果：
CO酶活性部位棕色
心肌、肾小管上皮内颗粒(线粒体)蓝色
阴性对照(可选)：取新鲜配制好的DAB孵育液，按DAB孵育液:CO对照液=50:1的比例混合，即为CO对照工作液。相同切片入CO对照工作液，室温孵育30～60min，其余同上，呈阴性反应。
注意事项：
1、本染色液适用于冰冻切片，同时应减少切片在室温暴露的时间。
2、CO孵育液孵育时间因组织而异，心肌、肾孵育约20～30min，肝脏约50～60min，甲状腺滤泡上皮约2h。
3、为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
免疫荧光操作步骤及注意事项
免疫荧光操作步骤及注意事项 免疫荧光技术是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。它是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光基团，再用这种荧光抗体(或抗原)作为探针检查细胞或组织内的相应抗原(或抗体)。利用荧光显微镜可以看见荧光所在的细胞或组织，从而确定抗原或抗体的性质和定位，以及利用定量技术(比如流式细胞仪)测定含量。 紫外光激发荧光物质放射荧光示意图 免疫荧光实验的主要步骤包括细胞片制备、固定及通透(或称为透化)、封闭、抗体孵育及荧光检测等。细胞片制备(通俗的说法是细胞爬片)是免疫荧光实验的第一步，细胞片的质量对实验的成败至关重要，原因很简单，如果发生细胞掉片，一切都无从谈起。这一步关键的是玻片(Slides or Coverslips)的处理以及细胞的活力，有人根据成功经验总结出许多有益的细节或小窍门，非常值得借鉴。固定和通透步骤最重要的是根据所研究抗原的性质选择适当的固定方法，合适的固定剂和固定程序对于获得好的实验结果是非常重要的。免疫荧光中的封闭和抗体孵育与其它方法(如ELISA或Western Blot)中的相同步骤是类似的，最重要的区别在于免疫荧光实验中要用到荧光抗体，因此必须谨记避光操作，此外抗体浓度的选择可能更加关键。最后需要注意的是，标记好荧光的细胞片应尽早观察，或者用封片剂封片后在4?或-20?避光保存，以免因标记蛋白解离或荧光减弱而影响实验结果。
由于操作步骤比较多，同时在分析结果时无法像WB那样可以根据分子量的大小区分非特异性识别，所以要得到一个完美的免疫荧光实验结果，除了需要高质量的抗体，以及对实验条件进行反复优化外，还必须设立严谨的实验对照。总之，免疫荧光实验从细胞样品处理、固定、封闭、抗体孵育到最后的封片及观察拍照，每步都非常关键，需要严格控制实验流程中每个步骤的质量，才能最终达到你的实验目的。 基本实验步骤: (1) 细胞准备。对单层生长细胞，在传代培养时，将细胞接种到预先放置有处理过的盖玻片的培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片，PBS洗两次;对悬浮生长细胞，取对数生长细胞，用PBS离心洗涤(1000rpm,5min)2次，用细胞离心甩片机制备细胞片或直接制备细胞涂片。 (2) 固定。根据需要选择适当的固定剂固定细胞。固定完毕后的细胞可置于含叠氮纳的PBS中4?保存3个月。PBS洗涤3×5 min. (3) 通透。使用交联剂(如多聚甲醛)固定后的细胞，一般需要在加入抗体孵育前，对细胞进行通透处理，以保证抗体能够到达抗原部位。选择通透剂应充分考虑抗原蛋白的性质。通透的时间一般在5-15min.通透后用PBS洗涤3×5 min. (4) 封闭。使用封闭液对细胞进行封闭，时间一般为30min. (5) 一抗结合。室温孵育1h或者4?过夜。PBST漂洗3次，每次冲洗5min. (6) 二抗结合。间接免疫荧光需要使用二抗。室温避光孵育1h.PBST漂洗3次，每次冲洗5min后，再用蒸馏水漂洗一次。 (7) 封片及检测。滴加封片剂一滴，封片，荧光显微镜检查。 (一)细胞准备 用于免疫荧光实验的细胞可以是直接生长在盖玻片上的贴壁细胞，也可以是经过离心后涂片的悬浮细胞或者是将取自体内的组织细胞悬液离心后涂片。贴壁良好
细胞免疫荧光步骤
细胞免疫荧光步骤集团文件发布号：（9816-UATWW-MWUB-WUNN-INNUL-DQQTY-
方法一： 1.首先需要把细胞养在玻璃片上（悬浮细胞需要用多聚赖氨酸包被过的玻 璃片） 2.然后在4％PFA里面室温下固定30分钟，PBS洗两次，0.1% TX-100室 温下作用1－2分钟使细胞膜通透。 3.接下来进行荧光标记，需要在一个大的容器（面积大，扁平状的，比如 大的培养皿）里面，放一张用水打湿的滤纸，以保持湿度。 4.剪一片合适大小的parafilm，在上面滴上稀释在1％BSA/TBS中的一抗 （稀释倍数依具体抗体而定），每个玻璃片30ul足够，把玻璃片盖在上面（细胞面朝下），室温下孵育30分钟，然后在PBS里洗三次。 5.接下来二抗孵育步骤同上。 6.最后，在载玻片加上mounting medium（大约每个玻璃片加10ul），把 玻璃片放上去（细胞面朝下），37度30分钟，然后就可以在荧光显微镜下观察了。 7.抗体很重要，不能有非特异性结合。你可以先做WB检测一下你的抗 体，看看有没有杂带。 8.双标的话，可以把两个一抗一起加或者分别标记两次（可以都试一下看 看那种方法合适）。如果一个抗体需要二抗，一个是直接荧光标记的，可以把荧光标记的那个和另外一个的二抗一起加。 方法二： 1.选取一抗时要来源于两种不同的动物，我用的是来源于rabbit和rat 的抗体，二抗则是不同荧光信号标记的，我用的是donkey anti- rabbit-FITC（绿）和donkey anti-rat-Tex-Red（红）。 2.我的做法是两种一抗同时孵育，然后两种二抗同时孵育。抗体浓度、孵 育时间要仔细摸索，我感觉一抗4度孵育过夜比较好，背景比较清晰。 3.我的阳性对照用的是阳性组织切片，阴性对照则分别是家兔和大鼠的 IgG，荧光标记物对照是PBS+荧光标记物。 4.封闭血清与二抗来源动物一致，我用的是10%的正常donkey血清。 5.其余步骤同一般免疫荧光单标操作。 方法三：
细胞色素氧化酶染色液(联苯胺法)使用说明
细胞色素氧化酶染色液(联苯胺法)使用说明 货号：G2410 有效期：6个月。 产品组成： 产品名称规格保存 试剂(A):CO清除液2×50ml4℃避光 试剂(B):DAB 孵育液B1:DAB染色液45ml-20℃避光B2:DAB增强剂5ml RT B3:DAB反应液100μl RT 按B1:B2:B3=9000:1000:3混合，即为DAB孵育液，即配即用。 试剂(C):苏木素染色液50ml4℃避光 试剂(D):CO对照液1ml RT 产品说明： 细胞色素氧化酶(Cytochrome Oxidase，CO)被认为是线粒体膜固有的酶，在含有大量线粒体的细胞(如心肌、肾小管上皮以及胃壁细胞、肝细胞)内都具有高度活性。此酶活性往往作为细胞内氧化代谢的指标，亦作为线粒体的标志酶之一。 细胞色素氧化酶染色液(联苯胺法)染色原理是细胞色素氧化酶催化3,3-二氨基联苯胺(DAB)使其侧链的氨基氧化，进行反复的氧化性聚合和氧化性环化形成不溶性的棕色Phenazine 聚合物。此酶对固定剂敏感，故须用新鲜切片。 自备材料： 1、恒温培养箱
2、光学显微镜 操作步骤(仅供参考)： 1、冰冻切片，厚6μm，不固定。 2、滴加CO清除液于切片上，铺满整个样品表面。 3、切片入DAB孵育液中，37℃避光孵育45～60min。 4、移去切片上的染色液，滴加CO清除液于切片上，铺满整个样品表面。 5、蒸馏水稍洗3～5s。 6、(可选)滴加苏木素染色液浅染细胞核3～5min。 7、流水冲洗10min。常规脱蜡透明，中性树胶封固。 染色结果： CO酶活性部位棕色 心肌、肾小管上皮内颗粒(线粒体)蓝色 阴性对照(可选)：取新鲜配制好的DAB孵育液，按DAB孵育液:CO对照液=50:1的比例混合，即为CO对照工作液。相同切片入CO对照工作液，室温孵育30～60min，其余同上，呈阴性反应。 注意事项： 1、本染色液适用于冰冻切片，同时应减少切片在室温暴露的时间。 2、CO孵育液孵育时间因组织而异，心肌、肾孵育约20～30min，肝脏约50～60min，甲状腺滤泡上皮约2h。 3、为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
细胞免疫荧光步骤
方法一： 1.首先需要把细胞养在玻璃片上（悬浮细胞需要用多聚赖氨酸包被过的玻璃片） 2.然后在4％PFA里面室温下固定30分钟，PBS洗两次，0.1% TX-100室温下作用1－2分钟 使细胞膜通透。 3.接下来进行荧光标记，需要在一个大的容器（面积大，扁平状的，比如大的培养皿）里面， 放一张用水打湿的滤纸，以保持湿度。 4.剪一片合适大小的parafilm，在上面滴上稀释在1％BSA/TBS中的一抗（稀释倍数依具体 抗体而定），每个玻璃片30ul足够，把玻璃片盖在上面（细胞面朝下），室温下孵育30分钟，然后在PBS里洗三次。 5.接下来二抗孵育步骤同上。 6.最后，在载玻片加上mounting medium（大约每个玻璃片加10ul），把玻璃片放上去（细 胞面朝下），37度30分钟，然后就可以在荧光显微镜下观察了。 7.抗体很重要，不能有非特异性结合。你可以先做WB检测一下你的抗体，看看有没有杂带。 8.双标的话，可以把两个一抗一起加或者分别标记两次（可以都试一下看看那种方法合适）。 如果一个抗体需要二抗，一个是直接荧光标记的，可以把荧光标记的那个和另外一个的二抗一起加。 方法二： 1.选取一抗时要来源于两种不同的动物，我用的是来源于rabbit和rat的抗体，二抗则是不 同荧光信号标记的，我用的是donkey anti-rabbit-FITC（绿）和donkey anti-rat-Tex-Red（红）。 2.我的做法是两种一抗同时孵育，然后两种二抗同时孵育。抗体浓度、孵育时间要仔细摸索， 我感觉一抗4度孵育过夜比较好，背景比较清晰。 3.我的阳性对照用的是阳性组织切片，阴性对照则分别是家兔和大鼠的IgG，荧光标记物对 照是PBS+荧光标记物。 4.封闭血清与二抗来源动物一致，我用的是10%的正常donkey血清。 5.其余步骤同一般免疫荧光单标操作。 方法三： 1.片子的制作：可以做细胞爬片，细胞甩片，还有直接在24well/12well/96well中直接染色 2.细胞爬片的制作：直接购买公司的已经处理过的细胞爬片，要是自己制作的话，就用无菌 的盖玻片用多聚赖氨酸处理后让细胞自己爬片
细胞色素氧化酶染色液(DAB法)使用说明书
细胞色素氧化酶染色液(DAB法)使用说明书 货号：G2410 规格：4×50ml 有效期：-20℃，6个月。 产品组成： 产品名称规格保存 试剂(A):CO清除液2×50ml4℃避光 试剂(B):DAB 孵育液B1:DAB染色液45ml-20℃避光B2:DAB增强剂5ml-20℃避光B3:DAB反应液100μl-20℃避光 按B1:B2:B3=9000:1000:3混合，即为DAB孵育液，即配即用。 试剂(C):苏木素染色液50ml4℃避光 试剂(D):CO对照液1ml RT 产品说明： 细胞色素氧化酶(Cytochrome Oxidase，CO)被认为是线粒体膜固有的酶，在含有大量线粒体的细胞(如心肌、肾小管上皮以及胃壁细胞、肝细胞)内都具有高度活性。此酶活性往往作为细胞内氧化代谢的指标，亦作为线粒体的标志酶之一。 细胞色素氧化酶染色液(DAB法)染色原理是细胞色素氧化酶催化DAB使其侧链的氨基氧化，进行反复的氧化性聚合和氧化性环化形成不溶性的棕色Phenazine聚合物。此酶对固定剂敏感，故须用新鲜切片。自备材料： 1、恒温培养箱 2、光学显微镜 操作步骤(仅供参考)： 1、冰冻切片，厚6μm，不固定。 2、滴加CO清除液于切片上，铺满整个样品表面。 3、切片入DAB孵育液中，37℃避光孵育45～60min。 第1页，共2页
4、移去切片上的染色液，滴加CO清除液于切片上，铺满整个样品表面。 5、蒸馏水稍洗3～5s。 6、(可选)滴加苏木素染色液浅染细胞核3～5min。 7、流水冲洗10min。常规脱蜡透明，中性树胶封固。 染色结果： CO酶活性部位棕色 心肌、肾小管上皮内颗粒(线粒体)蓝色 阴性对照(可选)：取新鲜配制好的DAB孵育液，按DAB孵育液:CO对照液=50:1的比例混合，即为CO对照工作液。相同切片入CO对照工作液，室温孵育30～60min，其余同上，呈阴性反应。 注意事项： 1、本染色液适用于冰冻切片，同时应减少切片在室温暴露的时间。 2、CO孵育液孵育时间因组织而异，心肌、肾孵育约20～30min，肝脏约50～60min，甲状腺滤泡上皮约2h。 3、为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。 第2页，共2页
细胞免疫荧光实验步骤
细胞免疫荧光实验步骤 细胞免疫荧光实验步骤 简单实验步骤如下: 1.漂洗血清蛋白H7.2-7.4 37度 PBS 2小时. 2.-20度甲醇固定20分钟后,自然、干燥 10分钟 3.PBS洗净:3min＊3 4.1%Triton:25min-30min.配成50ultriton+5mlpBS 5.PBS洗净:2＊5min 6.羊血清封闭：３７度，２０分钟 ７.一抗，４度过夜，一般要大于１８小时或者３７度１－２小时 ８.４度PBS洗净，３min＊５次 ９.二抗３７度小于一小时 １０.３７度PBS洗净，３＊５min 凉干封片（封闭液ＰＨ８.５） 活细胞免疫荧光技术－流式细胞仪标本的制备 （一）制备活性高的细胞悬液(培养细胞系、外周血单个核细胞、 胸腺细胞、脾细胞等均可用于本法) ↓ 用10％FCS RPMI1640调整细胞浓度为 5×10６～１×10７／ml ↓ 取40μl细胞悬液加入预先有特异性McAb(5～50μl) 的小玻璃管或塑料离心管，再加50μl 1∶20(用DPBS 稀释)灭活正常兔血清 ↓4℃ 30min 用洗涤液洗涤2次，每次加洗涤液2ml左右 1000rpm×5min
↓ 弃上清，加入50μl工作浓度的羊抗鼠 (或兔抗鼠)荧光标记物，充分振摇 ↓4℃ 30min 用洗涤液洗涤2次，每次加液2ml左右 1000rpm×5min ↓ 加适量固定液(如为FCM制备标本，一般加入 1ml固定液，如制片后在荧光显微镜下观察， 视细胞浓度加入100～500μl固定液) ↓ FCM检测或制片后荧光显微镜下观察 (标本在试管中可保存5～7天) （二）试剂和器材 1. 各种特异性单克隆抗体。 2. 荧光标记的羊抗鼠或兔抗鼠第二抗体，灭活正常兔血清。 3. 10％ FCS RPMI1640, DPBS、洗涤液、固定液(见附录)。 4. 玻璃管、塑料管、离心机、荧光显微镜等。 （三）注意事项 1. 整个操作在4℃下进行，洗涤液中加有比常规防腐剂量高10倍的NaN ３，上述实验条件是防止一抗结合细胞膜抗原后发生交联、脱落。 2. 洗涤要充分，以避免游离抗体封闭二抗与细胞膜上一抗相结合，出现假阴性。 3. 加适量正常兔血清可封闭某些细胞表面免疫球蛋白Fc受体，降低和防止非特异性染色。 4. 细胞活性要好，否则易发生非特异性荧光染色。 附: 1. DPBS (×10, 贮存液)
植物细胞色素C氧化酶活性测定试剂盒产品说明书中文版
植物细胞色素C氧化酶活性测定试剂盒产品说明书（中文版） 主要用途 植物细胞色素C氧化酶活性测定试剂是一种旨在通过细胞色素C氧化酶反应系统中还原性细胞色素C氧化后吸光峰值的降低，即采用比色法测定样品中酶活性的权威而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适用于各种植物组织，包括种子（seed）、叶片（leaf）、根（root）等裂解悬液中细胞色素C氧化酶的活性检测。产品不含污染性蛋白酶，严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定，反应优化，检测敏感。 技术背景 细胞色素C氧化酶（Cytochrome c oxidase）存在于真核生物的细胞线粒体上（包括植物细胞），主要通过氧化磷酸化为细胞提供能量。基于底物还原型细胞色素C（reduced cytochrome c），受到细胞色素C氧化酶的催化，转化为氧化型细胞色素C（oxidized cytochrome c），在分光光度仪下，出现吸光值的变化（550nm 波长），由此定量测定细胞色素C氧化酶的活性。细胞色素C氧化酶反应系统为： 产品内容 清理液（Reagent A）毫升 裂解液（Reagent B）毫升 缓冲液（Reagent C）毫升 反应液（Reagent D）毫升 稳定液（Reagent E）微升 稀释液（Reagent F）微升 产品说明书1份 保存方式 保存清理液（Reagent A）和缓冲液（Reagent C）在4℃冰箱里，其余的保存在－20℃冰箱里；反应液（Reagent D）避免光照；有效保证6月 用户自备 15毫升锥形离心管：用于样品制备的容器 1.5毫升离心管：用于样品制备和保存的容器 DOUNCE匀浆器：用于组织匀化 微型台式离心机：用于样品制备 培养箱：用于反应孵育 比色皿：用于比色分析的容器 分光光度仪：用于比色分析
细胞色素C氧化酶与慢性阻塞性肺疾病
·１４３６· 细胞色素Ｃ氧化酶与慢性阻塞性肺疾病 刘彩虹陈平 【摘要】慢性阻塞性肺疾病（ｃｈｒｏｎｉｃｏｂｓｔｒｕｃｔｉｖｅｐｕｌｍｏｎａｒｙｄｉｓｅａｓｅ，ＣＯＰＤ）是以气流的不完全可逆为特征。且星进行性加重，多与吸烟有关，但其发病与加重的确切机制并未完全阐明。细胞色素Ｃ氧化酶（ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅＣ ｏｘｉｄａｓｅ，ＣＯＸ）是线粒体内膜呼吸链的末端复合物，广泛的存在于真核细胞，在细胞能量代谢、氧化应激、衰老、神经元功能障碍和肿瘤发生等多种生理、病理过程中发挥了重要作用。近年来发现ＣＯＸ在ＣＯＰＤ的发生中也起着十分重要的作用。本文主要阐述ＣＯＸ在ＣＯＰＤ中的研究进展。 【关键词】细胞色素Ｃ氧化酶；慢性阻塞性肺疾病；氧化应激；细胞凋亡 ＣｙｔｏｃｈｒｏｍｅＣｏｘｉｄａｓｅａｎｄｃｈｒｏｎｉｃｏｂｓｔｒｕｃｔｉｖｅｐｕｌｍｏｎａｒｙｄｉｓｅａｓｅＬ儿，Ｃ口ｉ—ｈｏｎｇ。ＣＨＥＮＰｉｎｇ．ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＲｅｓｐｉｒａｔｏｒｙＭｅｄｉｃｉｎｅ，ｔｈｅＳｅｃｏｎｄＡｆｆｉｌｉａｔｅｄＨｏｓｐｉｔａｌ，Ｃｅｎｔｒａｌ—ＳｏｕｔｈＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，ＸｉａｎｇｙａＭｅｄｉｃａｌＳｃｈｏｏｌ，Ｃｈａｎｇｓｈａ４１００１１，Ｃｈｉｎａ Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇａｕｔｈｏｒ：ＣＨＥＮＰｉｎｇ ［Ａｂｓｔｒａｃｔ］ＣｙｔｏｃｈｒｏｍｅＣｏｘｉｄａｓｅ（ＣＯＸ）ｉｇａｋｅｙｏｘｉｄａｔｉｖｅｅｎｚｙｍｅｂｅｃａｕｓｅ，ａｓｔｈｅｔｅｒｍｉｎａｌｃｏｍｐｌｅｘｏｆｔｈｅｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌｅｌｅｃｔｒｏｎｔｒａｎｓｐｏｒｔｃｈａｉｎ，ｉｔｃａｔａｌｙｚｅｓｔｈｅｏｘｉｄａｔｉｏｎｏｆｒｅｄｕｃｅｄｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅＣｂｙｏｘｙｇｅｎ．Ｔｈｕｓ，ａｂｅｔｔｅｒｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇｏｆｔｈｅｒｏｌｅｏｆＣＯＸｉｎｃｈｒｏｎｉｃｏｂｓｔｒｕｃｔｉｖｅｐｕｌｍｏｎａｒｙｄｉｓｅａｓｅ（ＣＯＰＤ）ｐａｔｉｅｎｔｓａｎｄｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓｏｆＣＯＰＤｃａｎｐｒｏｖｉｄｅａｍｏｒｅｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅｋｎｏｗｌｅｄｇｅｏｆＣＯＰＤ． ［Ｋｅｙｗｏｒｄｓ】ＣｙｔｏｃｈｒｏｍｅＣｏｘｉｄａｓｅ；Ｃｈｒｏｎｉｃｏｂｓｔｒｕｃｔｉｖｅｐｕｌｍｏｎａｒｙｄｉｓｅａｓｅ；Ｏｘｉｄａｔｉｖｅｓｔｒｅｓｓ；Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ 慢性阻塞性肺疾病（ｃｈｒｏｍｅｏｂｓｔｒｕｃｔｉｖｅ ｐｕｌｍｏｎａｒｙｄｉｓｅａｓｅ，ＣＯＰＤ）是一种具有气流受限特 征的可预防和治疗的疾病，主要累及肺，但也可引起 全身（或称肺外）的不良效应，气流受限不完全可逆、 呈进行性发展，与肺部对香烟烟雾等有害气体或有 害颗粒的异常炎症反应有关Ⅲ。由于其患病人数 多，死亡率高，社会经济负担重，已成为一个重要的 公共卫生问题口］。目前关于其发病机制主要涉及以 下几个方面：气道的慢性炎症、蛋白酶／抗蛋自酶失 衡、氧化应激，并且细胞凋亡学说也越来越受到人们 的关注。细胞色素Ｃ氧化酶（ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅＣ ｏｘｉｄａｓｅ，ＣｏＸ）又称为线粒体呼吸链复合体Ⅳ，是线 粒体呼吸酶系的关键酶，是唯一能将电子传递给氧 分子的递电子复合物，与活性氧的生成，ＡＴＰ的合 成有关，其活性的改变在细胞的凋亡和氧化应激过 程中起着重要的作用。目前对ＣＯＸ的结构，生物 学功能有了较全面的了毹，对ＣＯＸ活性在ＣＯＰＤ 中也有～定的探讨。 作者单位：４１００１１长沙，中南大学湘雅二医院呼吸内科 通讯作者：陈乎．综述． １ＣＯＸ的结构和生物学特性 １．１ＣＯＸ的分子结构ＣＯＸ是细胞核ＤＮＡ （ｎＤＮＡ）基因组和线粒体ＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）基因组分 别编码的亚基共同组成的复杂的复合物，位于线粒 体内膜，相对分子质量约为２０００００，所有哺乳动物 真核细胞的ＣＯＸ由１３个亚基组成，其中构成级联 反应核心的最大３个亚基（ＣＯＸＩ，Ⅱ，ＩｌＩ）由 ｍｔＤＮＡ编码，具有酶催化活性，其余１０个亚基 （ＣｏＸⅣ，Ｖａ，Ｖｂ，Ｖ１ａ，Ⅵｂ，ＶＩＣ，Ⅶａ，Ⅶｂ，ⅦＣ和 Ⅷ）均由ｎＤＮＡ编码，对催化亚基具有调节作用∞Ｊ。 同时每个ＣｏＸ分子含有一个双铜原子组成的ＧｕＡ 中心，一个血红素ａ，一个血红索ａ。和ＧｕＢ中心。 其中ＣＯＸｌ中含有血红素ａ，血红素ａ。和ＧｕＢ，三 者均位于线粒体内膜的同一深度。亚基Ⅱ中含有 ＧｕＡ中心Ｈ］。且两亚基中含有该酶所有的氧化还 原中心，用单克隆抗体封闭结合位点的方法证明 ＣＯＸⅡ是ＣＯＸ和细胞色素Ｃ的结合部位，两结合 位点位置接近，至少一个将电子从细胞色素ｃ递给 ＣＯＸ，另一个则起调控作用，或兼有传递电子的活 性。ＣＯＸⅢ与质子泵移位有关，但主要起辅助 作用。 万方数据
免疫荧光实验步骤大全(精华版)
免疫荧光染色大全（精华版） 组织免疫荧光法 （1）将待染组织切片置于65摄氏度恒温箱烤片1h，脱蜡 （2）1×PBS 洗涤 3 次，每次 5min。 （3）0.5%Triton X-100（PBS 配制）室温通透 10min （4）1×PBS 洗涤 3 次，每次 5min。 注意：步骤（3）和（4）用于检测细胞核抗原，细胞膜抗原直接跳过此步骤（5）抗原修复：使用柠檬酸盐缓冲液进行抗原修复，微波炉微波高火3min，后转成低火 15min。 （6）1×PBS 洗涤 3 次，每次 5min。 （7）3% H2O2，室温孵育30min，目的是灭活内源性过氧化物酶。 （8）1×PBS 洗涤 3 次，每次 5min。 （9）使用1% BSA进行室温封闭 30min，用于封闭非特异性抗原表位。 （10）按抗体推荐使用说明书孵育特异性一抗，4°C 湿盒中静置过夜。（11）次日取出切片，室温下复温 30min。 （12）1×PBS 洗涤 3 次，每次 5min。 （13）选取相应的免疫荧光二抗滴加于血管组织上，37°C避光孵育30min。（14）1×PBS洗涤 3 次，每次 5min。 （15）避光条件下，DAPI 染液染细胞核，浓度和时间根据试剂说明书使用（16）1×PBS洗涤 3 次，每次5min。 （17）在血管组织上滴加抗荧光淬灭剂进行封片。 （18）使用荧光显微镜进行观察拍照。 贴壁细胞免疫荧光法 （1）在培养板中接种的带染色的细胞爬片用PBS泡洗3次×3min （2）4%多聚甲醛固定细胞爬片15min （3）1×PBS洗涤 3 次，每次5min。 （4）0.5%Triton X-100（PBS配制）室温通透10min （5）1×PBS洗涤 3 次，每次5min。 （6）1%BSA室温封闭30min （7）弃掉封闭液，细胞爬片滴加适量稀释至适当比例的一抗，4℃孵育过夜（8）1×PBS洗涤 3 次，每次5min。 （9）细胞爬片滴加稀释至适当比例的荧光二抗 （10）1×PBS洗涤 3 次，每次5min。 （11）DAPI染细胞核，浓度和时间根据试剂说明书使用 （12）1×PBS洗涤 3 次，每次5min。 （13）用抗荧光淬灭剂封片 （14）荧光显微镜下观察采集图像 细胞免疫荧光（悬浮细胞方法一） （1）收集悬浮细胞，细胞在冰浴中冷却，然后用台式离心机于4℃以800 g 离心5 min，吸去培养液并以4℃ 1×PBS重悬细胞。
细胞免疫荧光步骤
创作编号： GB8878185555334563BT9125XW 创作者：凤呜大王* 方法一： 1.首先需要把细胞养在玻璃片上（悬浮细胞需要用多聚赖氨酸包被过的玻璃片） 2.然后在4％PFA里面室温下固定30分钟，PBS洗两次，0.1% TX-100室温下作用1 －2分钟使细胞膜通透。 3.接下来进行荧光标记，需要在一个大的容器（面积大，扁平状的，比如大的培养皿） 里面，放一张用水打湿的滤纸，以保持湿度。 4.剪一片合适大小的parafilm，在上面滴上稀释在1％BSA/TBS中的一抗（稀释倍数 依具体抗体而定），每个玻璃片30ul足够，把玻璃片盖在上面（细胞面朝下），室温下孵育30分钟，然后在PBS里洗三次。 5.接下来二抗孵育步骤同上。 6.最后，在载玻片加上mounting medium（大约每个玻璃片加10ul），把玻璃片放上 去（细胞面朝下），37度30分钟，然后就可以在荧光显微镜下观察了。 7.抗体很重要，不能有非特异性结合。你可以先做WB检测一下你的抗体，看看有没 有杂带。 8.双标的话，可以把两个一抗一起加或者分别标记两次（可以都试一下看看那种方法 合适）。如果一个抗体需要二抗，一个是直接荧光标记的，可以把荧光标记的那个和另外一个的二抗一起加。 方法二： 1.选取一抗时要来源于两种不同的动物，我用的是来源于rabbit和rat的抗体，二抗则 是不同荧光信号标记的，我用的是donkey anti-rabbit-FITC（绿）和donkey anti-rat-Tex-Red（红）。 2.我的做法是两种一抗同时孵育，然后两种二抗同时孵育。抗体浓度、孵育时间要仔 细摸索，我感觉一抗4度孵育过夜比较好，背景比较清晰。
石蜡切片免疫荧光染色方法
石蜡切片免疫荧光染色方 法 Prepared on 22 November 2020
对于石蜡切片： 1、烤片：60℃ 60分钟 2、脱蜡：二甲苯中Ⅰ脱蜡15分钟→二甲苯Ⅱ脱蜡15分钟→无水乙醇Ⅰ5分钟→无水乙醇Ⅱ5分钟→90%乙醇Ⅰ5分钟→90%乙醇Ⅱ5分钟→70％乙醇5分钟 →蒸馏水5分钟→蒸馏水5分钟。 3、抗原修复：高压修复，事先烧开锅中的水，修复盒中加入l柠檬酸钠，(柠檬酸三钠 3g,柠檬酸 0.4g加入1000ml蒸馏水中)，上汽后加热10分钟，关火。修复盒取出，放入装有自来水的瓷缸中缓慢冷却至室温。 2. 去除内源性酶：玻片取出放入湿盒，加3%H 2O2 2 (2ml H 2 O2 2 加入18ml蒸馏 水中，现配现用，避光)，室温孵育10分钟，PBS洗3次，每次5分钟。（也可不用去除内源性酶）。 3. 封闭(Blocking) 加10%正常驴血清（原液100ul+900ulPBS,1ml够用30张片子），室温孵育封闭30分钟。如果背景较高，可以4℃封闭过夜。不用洗，用滤纸吸干周边水分。从封闭开始所有的步骤，一定要注意样品的保湿，避免样品的干燥，否则极易产生较高的背景。 4. 一抗孵育(Primary antibody incubation) 参考一抗的说明书，按照适当比例用（10%山羊血清PBS或1%BSA-PBS）稀释一抗。 立即加入稀释好的一抗， 4℃过夜，第二天取出复温45分钟。PBS洗3次，每次5分钟。 5. 二抗孵育(Secondary antibody inucubation) 按照适当比例用稀释荧光标记的二抗，立即加入稀释好的二抗，室温或4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时。
肌肉活检细胞色素C氧化酶染色方法
NY: PFI 3499 CYTOCHROME OXIDASE PROTOCOL PRINCIPLE: Cytochrome oxidase (COX) is the collective name for Complex IV of the oxidative respiratory chain of enzymes located in mitochondria. This method is a modification of the "Nadi" reaction. The use of 3,3' diaminobenzidine (DAB) results in a brown insoluble compound at the site of cytochrome oxidase activity. SPECIMEN REQUIRED: Snap frozen human striated muscle Controls: Stain several different muscles simultaneously. There is normally always enzyme activity present in muscle. The degree and location is interpreted. METHOD None, use snap frozen tissue. Fixation: Technique: Cut 10 - 16 micron (12 μm) sections in cryostat from snap frozen biopsy. Attach one or more sections to a No.1?, 22 mm square coverslip. Equipment: Ceramic staining rack - Thomas Scientific #8542-E40 Columbia staining dish - Thomas Scientific #8542-C12 - Thomas Scientific #8542-E30 dish(jar) staining Columbia gloves Forceps Latex Reagents: C-10) Catalase (Sigma Cytochrome C (Sigma C-2506 water deionized 3, 3' Diaminobenzidine tetrahydrochloride (Sigma D-5637) CARCINOGENIC, store at -20o C Permount - Fisher SP15-100, FLAMMABLE HEALTH HAZARD Reagent alcohol, ACS histochemical Fisher A962-4,or HPLC A995 FLAMMABLE, TOXIC, store at room temp. in flammable cabinet Sodium dibasic phosphate (Na2HPO4) anhydrous ACS (FW 141.96)-Sigma S9763, Fisher S374, or Mallinckrodt 7917 Store at room temperature Sodium monobasic phosphate (Na2HPO4) monohydrate (FW 137.99) Store at room temperature Sucrose -Sigma S7903, Store at room temperature Xylenes - Fisher #HC700-1GAL, FLAMMABLE, Store at room temperature in flammable cabinet)
免疫荧光通用操作规程
免疫荧光通用操作规程 冰冻切片的免疫荧光 1，动物组织直接OCT包埋，或灌流后的组织30%蔗糖溶液4℃过夜后，OCT包埋。-20℃保存3月，-80℃长期保存。请勿保存于液氮。2，冰冻切片机切片至少10um，空气干燥2分钟后，-20℃储存 3，切片从-20取出后，在通风橱放10-30分钟以去除水汽，4%PFA 固定15分钟，或-20℃丙酮固定15分钟置通风橱2小时 4, 1XPBS清洗玻片，3X5min 从此请保持玻片湿润 5，有时，抗原修复3小时会得到更好的结果。为此请：选用稳定的抗原修复方式（真空负压.微波修复.高压修复.隔水加热.电炉加热）…关注修复的温度，时间（抗原修复时在有效的温度范围内所持续的时间），抗原修复液必须遵循自然降温规律，使用足量的抗原修复液…选择不同PH值的修复液（A液枸盐酸缓冲液PH6.0，B液EDTA-Na缓冲液PH8.0，C液枸盐酸缓冲液PH4.5） 6，室温封闭1小时 封闭液：5%BSA+10%二抗种属来源的正常血清in 1xPBS 条件封闭液：1%BSA+3%二抗种属来源的正常血清in 1xPBS（细胞因子，无需封闭的蛋白
7，一抗4℃过夜 请用封闭液稀释一抗 8, 第二天Wash,1XPBS, 2x1min 9,二抗，1:1000 （alexa系列）1:300（dyelight )in封闭液，避光室温1小时 10, Wash,1XPBS, 3x5min 11, DAPI 染核5min， 12，DDW Rinse 13，抗淬灭剂封片，（避免气泡）避光置于通风橱过夜 14，干片后4℃保存 石蜡切片的免疫荧光 1，动物组织取出后经固定-脱水-包埋（见随后操作步骤)，制成石蜡包块 2，组织学染色切片厚度2um，免疫荧光染色切片厚度至少6um，切片复水：58℃20min- xylene 2x10min- 100%EtoH2x10min 95%EtoH2x10min- 70%EtoH10min-，DDW5min
免疫荧光染色
荧光免疫染色和DAPI染色实验 1．实验原理 免疫染色的实验原理类似于Western Blotting，两者都是运用抗体的特异性识别作用来显示目的蛋白，但是由于免疫染色需要在原位进行，而且蛋白没有经过富集，因此其实验难度较高。 实验的基本原理是：利用固定剂（通常是甲醛或多聚甲醛）将细胞固定，使得细胞膜的通透性大大增加，并且利用Triton-X-100使得一部分膜蛋白变性，从而使通透性进一步加强。利用正常羊血清封闭，可以令许多蛋白先与血清内的非特异性抗体结合，而特异性的抗体由于动力学的关系可以通过竞争性的反应与目的蛋白结合，这一过程可以保证抗体识别的特异性。二抗可以特异性识别一抗的Fc区域，利用二抗连接不同的荧光基团，就可以在荧光显微镜下观察到不同的荧光，从而显示目的基因的表达情况。 另外，免疫荧光实验由于其较高的敏感性可以显示出基因表达的亚细胞情况(核内，核外，膜上以及一些较大的细胞器上)，所以通常被用来作为基因定位的方法。 DAPI的中文名称是4，6-联脒-2-苯基吲哚，是一种常用的荧光染料，其作用机理与溴化乙锭（EB）等染色剂的机理类似：它们与DNA双螺旋的凹槽部分可以发生相互作用，从而与DNA 的双链紧密结合。结合后产生的荧光基团的吸收峰是358nm而散射峰是461nm，正好UV （紫外光）的激发波长是356nm，使得DAPI成为了一种常用的荧光检测信号。 Jagielski M. et. Al在1976年首次运用该技术检测细胞培养中的支原体感染。后来随着技术的进步，该技术被运用于各种微生物的检测、生长监测，胚胎发育过程的检测，细胞周期的检测和各种核定位的实验。 本实验就是利用DAPI染色标记细胞核的位置。 免疫染色实验方法和步骤 免疫染色(immunol staining)包括免疫荧光(immunol fluorescence)、免疫组化(immunol histochemistry)、免疫细胞化学(immunol cytochemistry)等，可以参考如下步骤进行操作。 1. 样品准备(Sample preparation) 对于贴壁细胞： 可以直接用多孔板，例如6孔板、24孔板等，培养细胞，然后到预定时间时进行固定等后续操作。 也可以用洁净的盖玻片，70%乙醇中浸泡后，用无菌的镊子放置到6孔板内，然后用无菌的生理盐水、PBS或培养液洗去残留的乙醇。这时就可以种入细胞进行培养，待细胞贴在盖玻片上生长良好后，即可进行固定等后续操作。 对于悬浮细胞： 把细胞先在固定液中固定，然后把细胞滴加在载玻片上，干燥后细胞会紧贴在载玻片上。然后就可以进行后续操作。如果细胞的粘附能力不佳，可以在载玻片上用PDL等物质进行处理，以增强载玻片的粘附能力。 对于冷冻切片： 切片放置在载玻片上后，可以直接进行固定等后续操作。 对于石蜡切片：
Gn1a - Cytokinin Oxidase Regulates Rice Grain Production(细胞色素氧化酶对水稻产量的调控)
细胞色素氧化酶对水稻产量的调控 调控绝大部分重要农艺性状的基因都是数量性状基因，这些基因一般起源于等位基因的自然变异。本文介绍的一个水稻增产QTL Gn1a是能产生细胞色素氧化/脱氢酶（OsCKX2）的基因，后则能使细胞分裂素降解。OsCKX2表达量的减少导致细胞分裂素在花序分生组织中积累，进而导致生殖器官的增加，最终使产量增加。聚合了控制粒数和株高位点的具有相同遗传背景的株系都表现出了有利性状。 食物短缺是本世纪最严重的全球问题之一。联合国粮农组织（FAO）估计2000-2002年有8.52亿人营养不良。64亿全球人口仍在快速增长，预计到2050年将达到89亿。无论直接食用还是饲养动物，谷物都是人类主要的能量来源。人类消耗的50%的热量来自于3种谷物：水稻（23%）、麦（17%）、玉米（10%）。为了满足人口快速增长对食物的需求，谷物产量在2025年必须增加50%。 包括产量在内的大多数主要的农艺性状都表现为连续的变异。这些复杂的性状大多受到起源于自然变异的QTLs的控制。QTL分析已经成为发掘有益农艺性状基因的有效途径。 水稻是一种主要的粮食作物。由于水稻基因组在主要的几种谷物中是最小的（390Mb），且其基因组与其他谷物的基因组有同源性，还容易转化，所以水稻成了单子叶植物的模式植物。因此，人们发掘了许多水稻突变体和分子标记，并对水稻进行了测序和作图。这些成果有利于进行水稻QTL分析。粒数和株高是直接影响产量的重要农艺性状。水稻和小麦矮化育种是导致60年代绿色革命的经典育种方法。这些矮化作物能获得高产是由于这些作物在暴风雨中能抗倒伏。近十年里有许多产量和株高QTLs方面的研究，然而这些QTL中的基因还没有被鉴定出来，它们在染色体上的位置也还不可知。我们的目标就是鉴定出这些控制粒数和株高的数量性状基因，阐明其分子机理，并将其应用于育种实践。 QTL analysis：选择表型差异大的双亲进行QTL分析是必要的，因为QTL的检测就是基于双亲自然等位基因的差异。我们选择了籼稻Habataki和粳稻Koshihikari作为研究材料，因为两者之间的农艺性状有巨大差异，还有许多可用的分子标记。Habataki的平均株高要比Koshihikari矮，但主穗谷粒数较多(Fig.1,A to D)。 我们构建了96个Habataki和Koshihikari的回交自交系(BILs)作为初级作图群体。作图群体的粒数和株高近似呈正态分布，表明这两个性状都受QTl控制(fig.S1)。QTL分析检测到了5个增加粒数(Gn)的QTLs和4个控制株高(Ph)的QTLs(Table1and Fig.1E)。效应最大的株高QTL Ph1定位于编码赤霉素20氧化酶的矮秆基因sd1的附近。比较Habataki和Koshihikari 的SD1基因发现Habataki在赤霉素20氧化酶的编码区有383bp的缺失，这个功能缺失基因导致Habataki株高降低。Habataki在赤霉素20氧化酶编码区的缺失跟曾经引导了绿色革命的IR8中发现的变异是一样的。 效应最大的增加穗粒数的QTL Gn1位于第一号染色体上，它被进一步研究。Habataki的Gn1等位基因比Koshihikari的等位基因每穗多产生约92颗谷粒，Gn1能解释两者在主穗谷粒数上44%的差异(Table1)。迄今为止，已经有许多水稻产量相关的QTL被报道。其中一些QTLs位于1号染色体短臂上的Gn1附近，这表明它们可能是同一个QTL。虽然这些QTLs还
免疫荧光细胞化学染色方法
免疫荧光细胞化学染色方法 一、标本制作 可制作涂片、印片、细胞单层培养物、组织切片，经适当固定或不固定，作免疫荧光染色用。 二、荧光抗体染色方法 （一）直接法 1．染色切片经固定后，滴加经稀释至染色效价如1：8或1：16的荧光抗体（如兔抗人γ-球蛋白荧光抗体或兔抗人IgG或IgA荧光抗体等），在室温或37℃染色30min，切片置入能保持潮湿的染色盒内，防止干燥。 2．洗片倾去存留的荧光抗体，将切片浸入pH7.4或 pH7.2PBS中洗两次，搅拌，每次5min，再用蒸馏水洗1min，除去盐结晶。 3．用50%缓冲（0.5mol/L碳酸盐缓冲液pH9.0～9.5）甘油封固、镜检 4．对照染色 ①正常免荧光血清染色，如上法处理切片，结果应为阴性。 ②染色抑制试验（一步法）：将荧光抗体和未标记的抗体球蛋白或血清（相同）等量混合，如上法处理切片。结果应为阴性。为证明此种染色抑制不是由于荧光抗体被稀释所致，可用盐水代替
未标记抗血清，染色结果应为阳性。此法结果较二步法稳定。③类属抗原染色试验，前面已作叙述。 直接法比较简单，适合做细菌、螺旋体、原虫、真菌及浓度较高的蛋白质抗原如肾、皮肤的检查和研究。此法每种荧光抗体只能检查一种相应的抗原，特异性高而敏感性较低。 （二）间接法 （1）切片固定后用毛细滴管吸取经适当稀释的免疫血清滴加在其上，置于染色盒中保持一定的湿度，37℃作用30min。然后用0.01mol/l pH7.2PBS洗两次，10min，用吸水吸去或吹干余留的液体。 （2）再滴加间接荧光抗体（如兔抗人γ-球蛋白荧光抗体等），同上步骤，染色30min，37℃，缓冲盐水洗两次10min，搅拌，缓冲甘油封固，镜检。 对照染色：①抗体对照：用正常兔血清或人血清代替免疫血清，再用上法进行染色，结果应为阴性。②抗原对照：即类属抗原染色，亦应为阴性。③阳性对照。 间接法中上述方法称双层法（Double Layer Method）。另一种称夹心法，即用未标记的特异性抗原加在切片上先与组织中之相应抗体结合，再用该抗原之荧光抗体重叠结合其上，而间接地显示出组织和细胞中抗体的存在，方法步骤如下： ①切片或涂片固定后，置于染色湿盒内。 ②滴加未标记的特异性抗原作用切片于37℃，30min。
实验四 细胞色素氧化酶的组织定位
实验四植物体内细胞色素氧化酶的组织定位 一、实验目的 掌握植物体内细胞色素氧化酶的组织定位的原理与技术 二、实验原理 以α-萘酚为底物催化的反应产物与对氨基二甲基苯胺的重氮基结合，在细胞色素氧化酶存在的条件下产生偶联偶氮反应，生成蓝色靛酚产物吲哚酚蓝。 三、实验材料、试剂与仪器 1、实验材料：施肥的白菜和未施肥的小白菜根系。 2、实验试剂： (1)1% α-萘酚溶液：称取1g α-蔡酚溶于100ml蒸馏水中，加热煮沸，然后逐滴加入25%KOH，直至蔡酚完全溶解为止，过滤后保存于冷暗处。 (2)1%对氨基二甲基苯胺溶液：称取1g对氨基二甲基苯胺盐酸，放入100ml 蒸馏水中加热煮沸，然后保存在冰箱中，但只能保存一星期。 (3)0.1mol/L磷酸缓冲液，pH5.8。 3、实验仪器：刀片、镊子、托盘等。 四、实验步骤 1. 取小白菜根系，蒸馏水冲洗干净后，用刀片将根系分开，一份作为实验组，一分作为空白对照。 2. 将切开的根材料放入pH5.8的磷酸缓冲液内，在室温下（约25℃）放置10分钟，然后将材料移入含有1% α－萘酚和1%对氨基二甲基苯胺的等量混合液中，约30分钟后，取出后，用蒸馏水反复冲洗后，将染色的材料放在有蒸馏水托盘中，观察染色结果。 五、实验结果 图1 施肥的小白菜根系细胞色素氧化酶的组织染色图
注：上为对照组，下为实验组。 六、实验讨论 由实验结果可以看出，小白菜根系染色后变蓝，且对照组与实验组均被染色。其原因可能是对照组高温处理的时间不够，没能使细胞色素氧化酶完全失活，因此对照也出现染色的情况。另外，侧根可明显观察到染色变蓝的情况，而在主根观察到染色的结果不明显，可能的原因是染色时间短，染液没能完全进入根内部，因此观察到主根染色较浅，不明显。