藻蓝素测定方法
进出口螺旋藻粉中藻蓝蛋白、叶绿素含量的测定方法
Method for determination of phycocyanin and chlorophyiis in spirulina powder for import and export
SN／T 1113—2002 前言
本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。
本标准由中华人民共和国海南出入境检验检疫局负责起草。
本标准主要起草人：张薇君、郝纯彦、李高兰、云昌浩。
本标准系首次发布的检验检疫行业标准。
1 范围
本标准规定了进出口螺旋藻粉中藻蓝蛋白及叶绿素含量检验的抽样、制样和分光光度测定方法。
本标准适用于进出口螺旋藻粉中藻蓝蛋白及叶绿素含量的测定。
2 规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。
GB／T 16919食用螺旋藻粉
3 抽样和制样
按GB／T 16919规定的方法执行。
4 测定方法
4.1 藻蓝蛋白含量测定
4.1.1 方法原理
样品用磷酸盐缓冲液溶解，置冰箱中冷冻、融解，使色素蛋白析出，分离后的提取液用分光光度法测定。
4.1.2 试剂
磷酸盐缓冲溶液：将0.1 mol／L磷酸二氢钾溶液与0.1 mol／L磷酸氢二钾溶液(45+55，V／V)混合，溶液pH值为7.0。
4.1.3 仪器设备
4.1.3.1 分光光度计。
4.1.3.2 超声波振荡器。
4.1.3.3 离心机：3 000 r／min。
4.1.3.4 低温冰箱：-20℃。
4.1.3.5 离心管：50 mL。
4.1.4 样品测定
称取试样0.25 g～0.5 g(精确至0.000 1 g)，用缓冲液(4.1.2)溶解，超声振荡5 min，定容于250 mL容量瓶中，摇匀。将溶液全部转入250 mL广口塑料瓶，置于-20℃冰箱内冷冻12 h(或放置过夜)，取出解冻，摇匀。取部分溶液于离心管中，在3 000 r／min转速下离心15 min。取上层清液，1 cm比色皿，在分光光度计上分别测定620 nm、652 nm、562 nm处的吸光度，用缓冲液(4.1.2)做空白。
4.1.5果计算
根据下式(1)、式(2)、式(3)、式(4)计算出试样中藻蓝蛋白的质量分数含量。
X 1=0.187A 620—0.089A 652 (1)
X 2=0.196A 652—0.041A 620 (2)
X 3=0.104A 562—0.251X 1—0.088X 2 (3)
(4)
式中：
X 1——测试液中藻蓝素的含量，单位为毫克每毫升(mg ／mL)；
X 2——测试液中异藻蓝素的含量，单位为毫克每毫升(mg ／mL)；
X 3——测试液中藻红素的含量，单位为毫克每毫升(rag ／mL)；
A——相应波长处(620 nm ，652 nm ，562 nm)测得吸光值。
X 4——试样中藻蓝蛋白的质量分数，单位为克每100克(g ／100 g)；
V——样品定容体积，单位为毫升(mL)。
m——试样质量，单位为克(g)。
测定结果取平行试验结果的算术平均值，保留小数点后第二位。
平行试验允许误差(相对)不大于4％。
注：整个操作过程须注意避光，分光光度测定应在15 min 内完成。
4.2 叶绿素含量测定
4.2.1 方法原理
以丙酮提取试样中的叶绿紊，用乙醚分层，硫酸钠溶液洗涤净化，于642 nm 及660 nm 波长下比色法定量。
4.2.2 试剂
除另有规定外，所用试剂均为分析纯，水为蒸馏水。
4.2.2.1 碳酸钙。
4.2.2.2 石英砂：试剂级。
4.2.2.3 丙酮。
4.2.2.4 无水硫酸钠：(650℃灼烧4 h)。
4.2.2.5 乙醚
4.2.2.6 丙酮-水溶液：(85+15，V ／V)。
4.2.2.7 硫酸钠水溶液：(2％，m ／V)。
4.2.3 仪器设备。
4.2.3.1 分光光度计。
4.2.3.2 玻璃研钵：100 mL 。
4.2.3.3 G 3玻璃砂芯漏斗。
4.2.3.4 分液漏斗：250 mL
。
4.2.3.5 棕色容量瓶：50 mL。
4.2.3.6 移液管：10 mL、20 mL。
4.2.4 分析步骤
4.2.4.1 提取
称取试样约0.2 g(精确到0.000 1 g)，置于100 mL玻璃研钵中，加碳酸钙约0.2 g及石英砂约0.5 g，小心研磨5 min，加入2 mL丙酮-水溶液(4.2.2.6)继续研磨至干粉状；将研磨物全部转入G3玻璃漏斗，缓缓抽滤，继续用丙酮-水溶液(4.2.2.6)少量反复洗涤研钵并转移至漏斗内，至近无色，抽干；将漏斗内残渣重新倒回研钵中，加少量丙酮继续研磨1 min，再转入漏斗中，抽滤，至滤液接近无色(约需30 mL～35 mL丙酮-水溶液)。
4.2.4.2 分离净化
将滤液全部转入内盛50 mL 2％硫酸钠溶液的250 mL分液漏斗中，用20 mL乙醚分次洗涤抽滤瓶，并入分液漏斗中，振摇1 min，使分层；水层放入另一分液漏斗中，加10 mL乙醚萃取，弃去水层；有机层并入第一个分液漏斗中，用水洗涤两次，每次20 mL，弃去水层。将乙醚层通过一装有5 g 无水硫酸钠的小漏斗滤入50 mL棕色容量瓶中，用少量乙醚洗涤分液漏斗，并洗去无水硫酸钠层中的色素，定容、摇匀，待用。
4.2.4.3 测定
取上述溶液10 mL～20 mL到50 mL棕色容量瓶中，用乙醚定容，摇匀，立即于分光光度计上测定642 nm及660 nm处的吸光值，1 cm比色皿，用乙醚作空白。
4.2.5 结果计算
按下式(5)、式(6)计算试样中的总叶绿素质量分数含量：
X5=7.12A660+16.8A642 (5)
(6)
式中：
X5——样液中总叶绿素的含量，单位为毫克每升(mg／L)；
A——相应波长处(660 nm，642 nm)测得吸光值；
X6——试样中总叶绿素的质量分数，单位为毫克每100克(mg／100 g)；
V——提取液的总体积，单位为毫升(mL)；
F——试样稀释倍数；
m——试样质量，单位为克(g)。
测定结果取平行试验结果的算术平均值，保留小数点后第一位。
平行试验允许误差(相对)不大于3％。
植物激素免疫测定指南
植物激素的酶联免疫吸附测定法（ELISA） 免疫测定是利用抗原、抗体特异性反应而建立的，根据可视化方法的不同可分为：酶联免疫、放射免疫、荧光免疫、化学发光免疫测定、生物发光免疫测定、浊度免疫测定法等。由于酶联免疫吸附分析法（Enzyme-linked Immunosorbent Assays, 简称ELISA）具有灵敏性、特异性高，且方便、快速、安全、成本低廉的特点，而日益被广泛应用于植物激素测定。目前，几大类植物激素IAA,ABA, GA3、GA4、iPA、ZR、DHZR等都建立了相应的ELISA方法并有试剂盒出售。 植物激素的酶联免疫检测方法有两种形式（见下图），一种是在固相载体上直接包被抗体（直接法，先包被二抗，再加一抗），另一种是包被抗原（间接法）。 直接法利用游离抗原和酶标抗原与吸附的抗体进行竞争。间接法利用游离抗原和吸附抗原与游离抗体进行竞争。间接法的原理可用下式表示： Ab+H+HP=AbH+AbHP 其中Ab表示抗体，H表示游离激素，HP表示吸附在板上的激素－蛋白质复合物。根据质量作用定律，当该反应体系中Ab及HP的量确定时，游离H越多，结合物AbH形成的就越多，而AbHP形成的就越少，即结合在板上的抗体就越少，通过酶标二抗检测结合物AbHP的多少，就可以确定游离H 量的多少。 材料、试剂及设备 1 材料 各种新鲜植物材料 2 仪器设备 研钵，冷冻离心机，台式快速离心浓缩干燥器或氮气吹干装置，酶联免疫分光光度计，吸水纸，恒温箱，冰箱，酶标板（40孔或96孔），可调微量液体加样器（10μl，40μl,200μl,1000μl），带盖瓷盘（内铺湿纱布）。 3 试剂 (1) 包被缓冲液：称取１.５g Na2CO3, 2.93g NaHCO3, 0.2g NaN3（可不加）, 用量筒加1 000 ml蒸馏水，pH为9.6. (2) 磷酸盐缓冲液（PBS）：称取8.0g NaCl, 0.2g KH2PO4 , 2.96g Na2HPO4 ·12H2O，用量筒加1 000 ml蒸馏水，pH为7.5。 (3) 样品稀释液：100 ml PBS中加0.1 ml Tween-20，0.1g明胶（稍加热溶解）。 (4) 底物缓冲液：称取5.10g C6H8O7·H2O（柠檬酸）， 18.43g Na2HPO4·12H2O，溶解定容至1 000ml，再加1 ml Tween-20，pH为5.0。 (5) 洗涤液：1000ml PBS加1mlTween-20。 (6) 终止液：2mol/L H2SO4。 （7）提取液：80％甲醇，内含1 mmol/L BHT(二叔丁基对甲苯酚，为抗氧化剂，先用甲醇溶解BHT，在配成80%的浓度))。 （8）激素包被抗原、各激素抗体和标准物。 （9）酶标二抗：辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗兔抗体。
藻蓝蛋白的提取
藻蓝蛋白的提取方法 1.PBS 缓冲液直接提取法 (1)配制pH=6.0 的PBS 缓冲溶液。 (2)称取20 g 螺旋藻粉, 加入步骤( 1) 配制的缓冲溶液200 mL, 然后将其放 在磁力搅拌器上搅拌 4 h, 将搅拌后的溶液置于离心机中10 000 g 离心10 min, 收集蓝色上清液。 (3) 将离心得到的上清液加洗涤剂洗涤, 再将洗涤后溶液进行过滤。 (4)将滤液用旋转真空蒸发仪蒸干, 可得蓝色固体,将固体置于干燥器中 1 h, 待完全干燥后取出, 将其研磨成蓝色粉末样品。 2藻蓝蛋白的富集分离 2 .1螺旋藻细胞的破碎 准确称取0 .5 g 螺旋藻粉, 加入100 mL 的pH =7 .0 、0 .01 mol/L 的H3PO4 缓冲液, 采用反复冻融(3 次)的方法对藻体细胞进行破碎, 在显微镜下观察计数细胞破碎率在90%以上即可.将破碎的螺旋藻细胞悬浊液于4 000 r/min 离心20min , 倾倒上清液可得到含藻蛋白的粗提液.在568 、620 和650 nm处测粗提液的吸光度, 计算藻蓝蛋白的含量. 2.2 盐析法沉淀藻蓝蛋白 在装有固定体积藻蛋白粗提液的烧杯中加入一定量的(N H4)2SO4 溶液, 边加边搅拌, 以防溶液局部过浓使蛋白质发生变性, 最终(NH4)2 SO4 溶液的质量浓度分别为20 %、40 %、50 %和60 %, 然后分别在20 ℃和40 ℃下对(NH4)2 SO4 盐析法沉淀藻蓝蛋白进行实验研究.在设置的温度和盐浓度下静置过夜, 再于-4 ℃离心机中以10 000 r/min 离心20 min , 将离心得到的沉淀用1/4 上清液体积的 H3PO4 缓冲液(pH =7 .0)溶解, 并倾倒于透析袋中, 再置于去离子水中透析24 h(每隔4 h 更换一次去离子水);透析结束后, 再于-4 ℃离心机中以10 000 r/min离心25 min ;用移液管抽取上清液,在568 、620 和650 nm 下测吸光度, 计算藻蓝蛋白的含量. 2 . 3 等电点法沉淀藻蓝蛋白 在装有固定体积藻蛋白粗提液的烧杯中加入0 .1 mo l/L 稀H2 SO4 溶液, 边加边搅拌,
土壤纤维素酶测定方法
纤维素酶 一、试剂： 1）醋酸缓冲液（pH 5.5）：164.08 g无水醋酸钠（C2H3O2Na）溶于700 ml去离子水，用醋酸（C2H4O2）调节pH至5.5，用去离子水稀释至1 L。 2）CMC溶液（0.7%，w:v）：7 g羧甲基纤维素钠盐溶于1 L醋酸缓冲液，45℃下搅拌2 h，此溶液在4℃下可存放7天。 3）还原糖试剂： 试剂A：16 g无水碳酸钠（Na2CO3）和0.9 g氰化钾（KCN）溶于去离子水并稀释至1 L。试剂B：0.5 g六氰铁钾（K4Fe（CN）6）溶于去离子水并稀释至1 L，贮于棕色瓶中。 试剂C：1.5 g 硫酸铁铵（NH4SO4Fe2(SO4)2·H2O）、1 g十二烷基硫酸钠（C12H25O4SNa）和4.2 ml浓硫酸溶于50℃去离子水，冷却后稀释至1 L。 4）水合葡萄糖溶液：28 mg水合葡萄糖溶于少量去离子水中，并定容至1 L。 二、仪器设备 恒温培养箱，水浴锅，分光光度计，搅拌器，三角瓶 三、操作步骤 取10.00 g（耕地）或5.00 g（林地）新鲜土壤（＜2 mm）于100 ml三角瓶中，加15 ml 醋酸缓冲液和15 ml CMC溶液，盖上塞子，于50℃下培养24 h，过滤。同时做空白对照，但在培养结束时才加入15 ml CMC溶液，并迅速过滤。 取2.00 ml滤液于50 ml容量瓶中，并用去离子水定容至刻度。吸取2.00 ml稀释液于20 ml试管中，加2.00 ml还原糖试剂A和2.00 ml还原糖试剂B，盖紧混匀，在100℃水浴中加热15 min 后，立即至于20℃水中冷却5 min。加10.00 ml还原糖试剂C，混匀，20℃下静置显色60 min，于690 nm波长处比色测定（要求在30 min内完成）。 标准曲线：吸取0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1.0 ml水合葡萄糖溶液，用去离子水稀释至2 ml，同上加入还原糖试剂A、B、C后，比色测定还原糖含量。c) 空白： 无土空白：不加土样，其余操作与样品试验相同，整个试验设置一个，重复一次。 无基质空白：以等体积水代替基质，每个土样设置一个。 四、结果计算 土壤纤维素酶活性（μg·g-1·(24 h)-1）＝(C*V*f)/ dwt 式中C为样品的葡萄糖含量（μg·ml-1）；V为土壤溶液体积（30 ml）；f为稀释倍数（25）；
螺旋藻中藻蓝蛋白提取的工艺流程
螺旋藻中藻蓝蛋白提取的工艺流程 王艺生物技术二班2010040407 1、预处理 将螺旋藻洗净晾干 2、细胞破碎 利用超声波破碎发破碎细胞，藻胆蛋白属于胞内蛋白质，要提取分离藻胆蛋。首先必须要破坏藻类细胞的细胞壁、细胞膜，使藻胆蛋白以溶解的状态释放出来，并保持其活性。超声波细胞粉碎仪破碎鱼腥藻细胞的最佳处理条件是超声仪的功率为600 W，超声时间为9min，固液比为1：8，破壁容量为20 mL。也可与其他方法合用最大限度的破碎细胞。 3、提取（初步分离） （1）用超滤膜过滤藻胆蛋白提取液，获得藻胆蛋白粗制品。用NaNO3，高渗一超滤法分离提纯藻胆蛋白，超滤时选用聚砜膜，在超滤过程中，无机盐和小分子蛋白质，包括小分子的藻毒素透过滤膜而去掉，特别适用于易产生水华的微囊藻脱毒，提高产品的安全性。NaNO3高渗．超滤法是提取藻胆蛋白的简单易行的方法，用此法提取的藻胆蛋白是安全无毒的，且易于纯化，脱水方便，产品易于干燥。 （2）也可利用沉淀法将大量盐加到蛋白质溶液中，蛋白质胶粒凝结并沉淀析出，因此向细胞破碎液中加入盐溶液使蛋白质沉淀析出。用25％硫酸铵可将藻红蛋白沉淀出，用30％硫酸铵可将藻蓝蛋白沉淀出，再用50％硫酸铵可将蓝藻蛋白沉淀出。 4、精制（高度纯化） 离子交换层析法，用 DEAE一步纯化藻蓝蛋白；改变传统以离子强度作梯度洗脱的方法，根据藻红蛋白的等电点进行pH梯度洗脱，仅用DEAE一步层析，就将藻红蛋白纯度从1.042提高至5.6，回收率达67.33％。用硅藻土545柱分级洗脱，再用该法纯化，从螺旋藻中获得初度为4.1的藻蓝蛋白和纯度为4.6的别藻蓝蛋白；将提取液上DE。AE一52纤维素柱，提取纯度只有1.9，在上葡聚糖凝胶柱，则得到了纯度较高的蓝藻蛋白。 5、成品制作 随着藻蓝蛋白制品的应用范围的不断扩大，对提取分离工艺的要求也逐渐提高。不仅要有高的提取率、好的产品质量，而且要考虑省时、省力、自动化程度高。利用缓慢冷却加晶种的方法使藻蓝蛋白结晶，干燥后进行保存。 藻蓝蛋白具有较高的促红细胞生成素(EPO)活性，它能直接刺激CFU—E的形成，对骨髓造血具有刺激作用，有很好的抗病毒活性，在细胞受感染前用APC处理的抗病毒效果比感染后处理效果更好，并且还有抗氧化和消炎活性。 因此，可以利用藻蓝蛋白的这些特点把蓝藻蛋白制作成治疗药物或者是保健食品。
范式法测定纤维素
原理 采用范氏（Van Soest）的洗涤纤维分析法测定中性洗涤纤维（NDF）和酸性洗涤纤维（ADF）原理: 植物性饲料经中性洗涤剂煮沸处理，不溶解的残渣为中性洗涤纤维，主要为细胞壁成分，其中包括半纤维素、纤维素、木质素和硅酸盐。植物性饲料经酸性洗涤剂处理，剩余的残渣为酸性洗涤纤维，其中包括纤维素、木质素和硅酸盐。酸性洗涤纤维经72%硫酸处理后的残渣为木质素和硅酸盐，从酸性洗涤纤维值中减去72%硫酸处理后的残渣为饲料的纤维素含量。将72%硫酸处理后的残渣灰化，在 灰化过程中逸出的部分为酸性洗涤木质素（ADL）的含量。 试剂的配制 中性洗涤剂（3%十二烷基硫酸钠）：准确称取18.6g乙二胺四乙酸二钠（EDTA，C10H14O8Na2?2H2O，分析纯）和6.8g硼酸钠（Na2B4O7?10H2O，分析纯）放入烧杯中，加入少量蒸馏水，加热溶解后， 再加入30g十二烷基硫酸钠（C12H25NaO4S，分析纯）和 10ml乙二醇乙醚（C4H10O2，分析纯）；再称取4.56 g无水磷酸氢二钠（Na2HPO4，分析纯）置于另一烧杯中，加入少量蒸馏水微微加热溶解后，倒入前一个烧杯中，在容量瓶中稀释至1000ml，其中pH 值约为6.9~7.1（pH值一般勿需调整）； 1N 硫酸：量取约27.87 ml浓硫酸（分析纯，比重1.84，98%），徐徐加入已装有500ml蒸馏水的烧杯中，冷却后注入1000ml容量瓶定容，标定；酸性洗涤剂（2%十六烷三甲基溴化铵）：称取20g十六烷三甲基溴化铵（CTAB，分析纯）溶于1000ml1N硫酸，必要时过滤； 中性洗涤纤维测定 准确称取1.0000g样品（通过40目筛）置于直筒烧杯中，加入100ml中性洗涤剂和数滴十氢化萘及0.5g无水亚硫酸钠。将烧杯套上冷凝装置于电炉上，在5~10min内煮沸，并持续保持微沸60min。煮沸完毕后，取下直筒烧杯，将烧杯中溶液倒入安装在抽滤瓶上的已知重量的玻璃坩埚中进行过滤，将烧杯中的残渣全部移入，并用沸水冲洗玻璃坩埚与残渣，直洗至滤液呈中性为止。用20ml丙酮冲洗二次，抽滤。将玻璃坩埚置于105℃烘箱中烘2h后，在干燥器中冷却30 min称重，直称至恒重。 酸性洗涤纤维测定 准确称取1.0000g样品（通过40目筛）置于直筒烧杯中，加入100 ml酸性洗涤剂和数滴十氢化萘及0.5g无水亚硫酸钠。将烧杯套上冷凝装置于电炉上，在5~10min内煮沸，并持续保持微沸60min。趁热用已知重量的玻璃坩埚抽滤，并用沸水反复冲洗玻璃坩埚及残渣至滤液呈中性为止。用少量丙酮冲洗残渣至抽下的丙酮液呈无色为止，并抽净丙酮。将玻璃坩埚置于105℃烘箱中烘2h后，在干燥器中冷却30 min称重，直称至恒重。 酸性洗涤木质素和酸不溶灰分（AIA）测定将酸性洗涤纤维加入72%硫酸，在20℃消化 3h后过滤，并冲洗至中性。消化过程中溶解部分为纤维素，不溶解的残渣为酸性洗涤木质素和酸不溶灰分，将残渣烘干并灼烧灰化后即可得出酸性洗涤木质素和酸不溶灰分的含量。 结果计算 中性洗涤纤维含量的计算：NDF（%）=（W1－W2）/ W×100 式中： W1—玻璃坩埚和NDF重（gW2—玻璃坩埚重（g） W—试样重（g） 酸性洗涤纤维含量的计算：ADF（%）=（G1－G2）/G×100 式中： G1—玻璃坩埚和ADF重（g） G2—玻璃坩埚重（g） W—试样重（g） 半纤维素含量的计算：半纤维素（%）=NDF（%）－ADF（%） 纤维素含量的计算：纤维素=ADF（%）－经72%硫酸处理后的残渣（%）
藻蓝蛋白的分离与纯化 实验报告 开放性试验
藻蓝蛋白的分离与纯化 实验报告 食品与生物工程学院
一、实验目的和要求 1、了解藻蓝蛋白的生理意义及功能，藻蓝蛋白一般的提取和 纯化的方法； 2、掌握蛋白含量测定方法； 3、掌握盐析和离子交换层析纯化蛋白的实验技术。 二、实验原理 藻蓝蛋白（PC）是一类普通存在于蓝藻细胞中的光合辅助色素，也是一种天然色素蛋白，具有水溶性，可用作食品着色剂。 此外，它具有强烈的荧光，在分子生物学上被制成荧光探针，是一种无毒、无副作用的理想光敏剂。藻蓝蛋白还具有重要的医疗价值，不但能提高机体细胞的非特异性免疫功能，而且对特异性免疫功能有促进作用。另外，它还具有清除自由基的能力，可以抗疲劳，延缓衰老，对人体的生理功能有重要的生物学意义。 利用盐析沉淀蛋白质的基本原理：盐在水溶液中电离所形成的正负离子ＮＨ可吸引水分子，从而夺取蛋白质分子上的水化膜，还可中和部分电荷，致使蛋白质聚集，从而达到盐析沉淀蛋白质的目的。由于各种蛋白质颗粒大小、所带电荷的多少及亲水程度不同，当使用某种中性盐对其进行盐析时，所需的最低盐浓度各不相同研究表明可用25%(NH4)2SO4 饱和度沉淀除去杂质，55%(NH4)2SO4沉淀藻蓝蛋白。盐析出来的蛋白质，需通过脱盐以除去硫酸铵等盐类物质。最常用的脱盐方法是透析。蛋白质是大
分子物质，它不能透过半透膜，而小分子物质可以自由透过半透膜，顾不断更换蒸馏水或缓冲液可将盐类等小分子杂质透析掉。 蛋白含量的测定有紫外分光光度计法和显色法（Folin-酚法、考马斯亮蓝法等），本实验采用考马斯亮蓝法测定提取藻蓝蛋白的含量，考马斯亮蓝G-250在酸性溶液中为棕红色，当它与蛋白质通过疏水作用后变为蓝色，最大光吸收由465nm变为595nm，在一定范围内，蛋白质的含量与595nm处吸光值成正比。 离子交换层析法纯化蛋白质，常用的阳离子交换剂有弱酸性的羧甲基纤维素（CM-纤维素），阴离子交换剂有弱酸性的二乙氨基乙基纤维素（DEAE-纤维素）。蛋白质的混合物与纤维素离子交换剂的酸性基团或碱性基团结合，结合力的大小取决于彼此间相反电荷基团的静电引力。因此，被吸附的蛋白质的洗脱通过改变PH或离子强度来实现，与离子交换剂结合力小的蛋白质首先从层析柱中被洗脱下来。 本实验以蓝藻为材料，采用反复冻融、分步盐析法对藻蓝蛋白进行提取和初步纯化，采用考马斯亮蓝法测定提取藻蓝蛋白的含量，然后使用DEAE-纤维素柱层析对提取的藻蓝蛋白进一步纯化（由于来源不同和种类的差别，目前研究报道的藻蓝蛋白等电点尚无一致结论，但都在3.4-4.8之间，其中钝顶螺旋藻藻蓝蛋白的等电点为 4.3，在PH6.5磷酸盐缓冲液中带负电，所以选择DEAE-纤维素阴离子交换柱）。预期得到纯度较高的藻蓝蛋白。 三、试剂与仪器
纤维的种类
一、植物纤维 主要组成物质是纤维素，又称为天然纤维素纤维。是由植物上种籽、果实、茎、叶等处获得的纤维。根据在植物上成长的部位的不同，分为种子纤维、叶纤维和茎纤维。 1.种子纤维：棉、木棉等； 2.叶纤维：剑麻、蕉麻等； 3.茎纤维：苎麻、亚麻、大麻、黄麻等。 二、动物纤维 主要组成物质是蛋白质，又称为天然蛋白质纤维，分为毛和腺分泌物两类。 1.毛发类：绵羊毛、山羊毛、骆驼毛、兔毛、牦牛毛等； 2.腺分泌物：桑蚕丝、柞蚕丝等。 三、矿物纤维 主要成分是无机物，又称为天然无机纤维，为无机金属硅酸盐类，如石棉纤维。 四、化学纤维 用天然的或人工合成的高分子化合物为原料经化学纺丝而制成的纤维。可分为人造纤维、合成纤维、无机纤维。 五、人造纤维 用纤维素、蛋白质等天然高分子物质为原料，经化学加工、纺丝、后处理而制得的纺织纤维。用失去纺织加工价值的纤维原料，经人工溶解或熔融再抽丝而制成，其原始的化学结构不变，纤维成分仍分别为纤维素和蛋白质，而形成的物理结构、化学结构变化的衍生物，组成成分为纤维素醋酸酯纤维。 1.再生纤维素纤维：粘胶纤维、富强纤维、铜氨纤维等；（其区别为用烧碱、 二氧化硫不同的溶液溶解） 2.纤维素酯纤维：醋酯纤维； 3.再生蛋白质纤维：大豆纤维、花生纤维等。 六、合成纤维 用人工合成的高分子化合物为原料经纺丝加工制得的纤维。 1.普通合成纤维：涤纶、锦纶、晴纶、丙纶、维纶、氯纶等； 2.特种合成纤维：芳纶、氨纶、碳纤维等。 七、无机纤维 以矿物质为原料制成的纤维，如：玻璃纤维、金属纤维等。 人们通常喜欢天然纤维而不喜欢化学纤维是因为天然纤维的柔韧性和光滑性比合成纤维好。
纤维素含量的测定
纤维素的测定------比色法 纤维素由葡萄糖基组成，它是组成植物细胞壁的基本成分。其含量的多少关系到植物的机械组织是否发达，作物抗倒伏、抗病虫害的能力是否较强，并且影响到粮食作物、纤维作物和蔬菜作物等的产量和品质。 在各种粮食中纤维素的含量各不相同，与籽粒皮层厚薄成正比。同种粮食中，原粮纤维素 维素含量最高，加工粗加工精度越高，纤维素含呈越少，如小麦标准粉约O．7％．稻谷约9.0％，糙米约1.0％，白米约0 4％。因此，根据纤维素的含量的测定，可以判别籽粒皮层的厚薄，粮食加工精度高低和营养价值评估。 纤维素的测定方法有酸碱醇醚法、酸性洗涤剂法、碘量法及比色法。第一个是国标法，但比较繁琐，后者操作比较简单。 一、方法原理 纤维素是由葡萄糖基组成的多糖，在酸性条件下加热使其水解成葡萄糖。然后在浓硫酸作用下，使单糖脱水生成糠醛类化合物。利用蒽酮试剂与糠醛类化合物的蓝绿色反应即可进行比色测定。 二、仪器和试剂 1．主要仪器恒温水浴、冰罐、电炉、玻璃坩埚、漏斗、定时钟、分光光度计等。 2．试剂60％H2SO4溶液、浓H2SO4。 2％蒽酮试剂：2g蒽酮溶解于100rnl乙酸乙酯中，贮置于棕色试剂瓶中。 纤维素标准液：准确称取100mg纯纤维素，放入100Inl量瓶中，将量瓶放入冰浴中，然后加冷的60％H2SO4 60—70ml，在冷的条件下消化处理20—30min，然后用60％H2SO4稀释至刻度，摇匀。吸取此液5．0ml放入另一50ml量瓶中，将量瓶放入冰浴中，加蒸馏水稀释刻度，则每毫升含100μg纤维素。 三、操作步骤 1．绘制纤维素标准曲线 （1）取6支小试管，分别放入0、0.40、0.80、1.20、1.60、2.00ml纤维素标准液。然后分别加入2.00、1.60、1.20、0.80、0.40、0ml蒸馏，摇匀。则每管依次含纤维素0、40、80、120、160、200μg。 （2）向每管加0．5ml％蒽酮试剂，再沿管壁加5．0ml浓H2SO4，塞上塞子，微微摇动，促使乙酸乙酯水解，当管内出现蒽酮絮状物时，再剧烈摇动促进蒽酮溶解，然后立即放入沸水浴中加热10min ，取出冷却。 （3）在分光光度计上620urn波长下比色，测出各管消光值。 （4）以所测得的消光值为纵坐标，以纤维素含量为横坐标，绘制纤维素标准曲线。 2.样品的测定 （1）准确称取风干的样品100mg，放入100rnl量瓶中，将量瓶放入冰浴中，加冷的60％H2SO4。60—70ml，在冷的条件下消化处理半小时，然后用60％H2SO4。稀释至刻度，摇匀，用玻璃坩埚漏斗过滤。 （2）吸取上述滤液5．0ml，放入5ml量瓶中，将量瓶置于冰浴中，加蒸馏水释至刻度，摇匀。 （3）吸取上液2.0ml，加0.5ml 2％蒽酮试剂，再沿管壁加5．0ml浓H2SO4，盖上塞子，以后操
植物激素检测方法
植物激素检测方法 一、什么是植物激素？ 植物激素是植物体内合成的一系列痕量有机化合物，它在植物的某一部位产生，运输到另一个或一些部位，在极低的浓度下便可引发生理反应，几乎参与了调控植物从种子休眠、萌发、营养、生长和分化到生殖、成熟和衰老的每个生命过程，既可调控植物自身的生长发育，又通过与植物所生存的外部环境互相作用调节其对环境的适应。通过调控如细胞分裂素、油菜素内酯和生长素等植物激素的代谢可显著地改良作物的株型结构和产量构成，从而大幅度提高作物产量和品质。 植物激素主要包括生长素(auxin)、赤霉素(gibberellin，GA)、细胞分裂素(cytokinin，CTK)、脱落酸(abscisic acid，ABA)、油菜素甾醇类(brassinosteroids，BRs)、茉莉酸(jasmonic acid，JA)及其甲酯(MeJA)、水杨酸类(salicylic acids，SA)、乙烯(ethylene)和多肽激素(peptide hormones)等。 二、检测方法 科标生物检测中心可以提供各种植物样品检测服务，中心是通过权威认证的第三方机构，检测后出具权威检测报告。 三、主要分析技术 1、生物鉴定法是一类经典的植物激素检测方法，它利用激素作用于植物的组织或器官时产生的特异性反应对植物激素进行测定。 2、免疫检测技术是测定植物激素的常用方法。该方法是基于抗原和抗体的特异性结合，因此有较好的专一性。采用放射性元素标记的方法，即放射免疫分析(radioimmunoassay，RIA)，其检测灵敏度高，重复性好，但对实验条件的要求较高。 3、气相色谱火焰离子化检测法(GC-FID)和气相色谱质谱法(GC-MS)能够对所分析样品进行准确、高灵敏度测量，但由于气相色谱对样品的特殊要求，使得待测组分需具有一定挥发性，因此在植物激素样品的前处理过程中需对样品进行衍生化。 4、高效液相色谱紫外检测法(HPLC-UV)、高效液相色谱荧光检测法(HPLC-FL)和高效
藻类保健品中藻蓝蛋白的盐析提取技术研究
学校代码：11059 学号：0802012040 Hefei University 本科毕业论文BACH ELO R DI SSERTATIO N 论文题目：藻类保健品中藻蓝蛋白的盐析提取技术研究学位类别：工学学士 学科专业：生物工程 作者姓名： 导师姓名：夏潇潇 完成时间：二零一二年五月
目录 摘要 (Ⅰ) Abstract (Ⅱ) 1 引言 (1) 1.1 螺旋藻的简介 (1) 1.2 藻蓝蛋白介绍 (2) 1.3 藻蓝蛋白的提取方法 (2) 1.4 研究的意义、目的和内容 (3) 1.4.1 研究的意义 (3) 1.4.2 研究的目的 (3) 1.4.3 研究的内容 (3) 2 材料与方法 (4) 2.1 原料和仪器 (4) 2.1.1 原料 (4) 2.1.2 主要仪器 (4) 2.1.3 主要试剂 (4) 2.2 实验方法 (5) 2.2.1 原料中总蛋白质含量的测定 (5) 2.2.2 螺旋藻的前处理及藻蓝蛋白计算 (5) 2.2.3不同盐的提取实验 (6) 2.2.4 冻融次数实验 (6) 2.2.5 盐浓度实验 (6) 2.2.6 提取次数实验 (7) 3 结果与分析 (8) 3.1 原料中总蛋白质含量结果与分析 (8) 3.2 不同盐的提取实验结果与分析 (8) 3.3 盐浓度实验结果与分析 (9) 3.4 冻融次数实验结果与分析 (13)
3.5 提取次数实验结果与分析 (18) 3.6 总结 (22) 5 结论 (23) 参考文献 (24) 致谢 (26)
摘要 本文对螺旋藻精片中藻蓝蛋白的提取工艺进行研究，考察不同盐、不同浓度、冻融次数、提取次数对藻蓝蛋白提取率的影响。可知：针对不同盐的最佳提取条件分别为：氯化钠：浓度30%，冻融次数6次，提取次数3次；磷酸钾：浓度50%，冻融次数6次，提取次数4次；硫酸铵：浓度40%，冻融次数6次，提取次数6次；硝酸钾：浓度40%，冻融次数8次，提取次数6次。在最优提取条件下，氯化钠、磷酸钾、硫酸铵和硝酸钾的提取率分别为11.00%、10.87%、11.767%和10.837%，其中硫酸铵的提取率最高，可将约98%的藻蓝蛋白提取出来。 关键词：藻蓝蛋白；盐析；冻融；提取；得率
淀粉和纤维素含量的测定
一、淀粉含量的测定(旋光法) (一)实验目的 1.熟习旋光仪的使用方法。 2.了解旋光仪测定淀粉的原理并掌握其具体方法。 (二)实验原理 淀粉(starch)是植物的主要能量贮藏物质，主要存在于种子、块根和块茎中。淀粉不仅是重要的营养物质，并且在工业上的应用也很广泛。 将磨细的含淀粉样品与酸性氯化钙溶液共煮，可使样品中淀粉轻度水解，同时由于钙离子与淀粉分子上的羟基络合，使淀粉分子充分地分散到溶液中，成为淀粉溶液。淀粉分子具有不对称碳原子，因而具有旋光性，利用旋光仪测定淀粉溶胶的旋光度(α)，旋光度的大小与淀粉的浓度成正比，据此可以求出淀粉含量。 应注意的是，酸性氯化钙溶液必须保持pH 值2.30，密度1.30，加时间的长短也要控制在一定范围，以保证各种不同来源的淀粉溶液的比旋度［α］恒定不变(20℃)。样品中其他旋光性物质(如糖分)必须预先除去。 (三)仪器、原料和试剂 仪器 植物样品粉碎机、离心机、分析天平；粗天平、旋光仪及附件、三角瓶、分样筛(100目)、布氏漏斗、抽滤瓶及真空泵、离心管、小电炉。 原料 面粉或其他风干样品 试剂 1. 醋酸—氯化钙溶液： 500g 氯化钙溶于600mL 蒸馏水中，过滤至澄清，用比重计在20℃条件下调节比重 1.3左右，再滴加冰乙酸调pH 为 2.3。 2. 30％ZnSO4溶液 3. 15％K4Fe(CN)溶液 (四)操作步骤 1.样品准备 (1)称样脱脂：将样品风干、研磨，通过100目筛，精确称取约2.5g 样品细粉(要求含 淀粉约2g)，置于离心管内，加乙醚数mL 到离心管内，用细玻棒充分搅拌，离心，倾出上清液，再加入乙醚如此操作数次，以去除样品的大部分油脂、色素等成分(因油脂的的存在会使以后淀粉溶液的过滤困难)。 收集上清液以备回收乙醚。大多数谷物样品含脂肪较少，可免去这个脱脂手续。 (2)抑制酶活性：加含有氯化高汞的乙醇溶液10mL 到离心管内，充分搅拌，然后离心， 倾去上清液，得到沉淀物。 (3)脱糖：加80％乙醇10mL 到离心管中，充分搅拌以洗涤沉淀物(每次都用同一玻棒)， 离心，倾去下清液。重复洗涤数次以去除可溶性糖分。 2. 溶提淀粉 (1)加醋酸－氯化钙：先用醋酸氯化钙溶液约10mL 加到装有脱脂样品的离心管中，搅 拌后全部倾入250mL 三角瓶内，再用醋酸氯化钙溶液50mL 分数次洗涤离心管，洗涤液并入三角瓶内，搅拌玻棒也转移到三角瓶内。 (2)煮沸溶解：先用蜡笔标记液面高度，直接置于加有石棉网的小电炉上，在5min 内 快速煮沸，保持沸腾15～17min，立即取下三角瓶，置流水中冷却。煮沸过程中要时加搅拌并调节温度，防止烧焦或泡沫涌出瓶外，必要时加水保持液面高度。
藻蓝蛋白的提取、纯化及紫外可见光谱仪检测藻蓝蛋白纯度
藻蓝蛋白的提取、纯化及紫外可见光谱仪检测藻蓝蛋白纯度 作者：邱李莉来源：藻蓝蛋白提取纯化测定专题资源时间：2007-11-18 一、实验目的 学习并掌握提取、纯化藻蓝蛋白及紫外可见光谱仪检测蛋白纯度的方法 二、实验材料 螺旋藻藻粉 三、实验设备 天平，量筒，塑料杯，药匙，小烧杯（5个），铁架台，铁夹，玻棒（若干），胶头滴管（若干），滤纸，收集器，树脂柱，梯度洗脱器，蠕动，磁力搅拌器，高速离心机 四、实验原理 1.冻融法：将细胞置低温下冰冻一定时间，然后取出置室温下(或40℃左右)迅速融化。如此重复冻融多次，细胞可在形成冰粒和增高剩余胞液盐浓度的同时，发生溶胀破碎。 2.盐析法：蛋白质在稀盐溶液中，溶解度会随盐浓度的增高而上升(盐溶)，但当盐浓度增高到一定数值时，其溶解度又逐渐下降，直至蛋白质析出(盐析)。盐析的发生在于盐浓度增高到一定数值时，使水活度降低，进而导致蛋白质分子表面电荷逐渐被中和，水化膜逐渐被破坏，最终引起蛋白质分子间相互聚集，并从溶液中析出。 （生物秀实验频道——专心专注！ https://www.wendangku.net/doc/2211445282.html,） 3.DEAE－纤维素：英文名称DEAE－Cellulose，二乙基胺乙基纤维素，总交换量0.9meq/g 功能基：二乙基胺乙基.弱碱性阴离子交换剂。 原理：含有某些功能基团，可以进行离子交换。性能比一般离子交换树脂温和，适用于分离具有生物活性的大分子，可以将性质相近的大分子物质分开。 4.葡萄聚糖凝胶：商品名称Sephadex，是效果较好的分子筛凝胶层析。 原理：分子筛指多孔介质。小分子能进入介质内部空隙，大分子物质排阻在介质之外，从而达到分离目的，这种作用为“分子筛效应”。 5.装柱：装柱前先将层析柱垂直固定在支架上。装柱的方法分干装和湿装两种。干装法是直接加吸附剂到柱中，然后倒入溶剂，此法不易将气泡排尽。湿装法是先加适量溶剂到柱中，排走其中的空气，然后把预先用溶剂浸泡好的吸附剂搅匀，随机将此悬浮液连续倾入柱中，打开柱下端出口，让溶液慢慢流出，使柱上端悬浮液缓缓下降至需要的高度，吸附剂表面要平整，应使其一直浸没在溶剂中，以防气泡产生。 6.加样：经过平衡的层析柱当平衡液流到与固定相表面一致位置时，用滴管轻轻地把分离样品的溶液加到固定相表面，要尽量避免冲动基质。加入样品液的体积一般应小于床体积的1/2(体积越小越有利于提高分辨率)。 7.洗脱：待样品液的液面流到固体相表面时，用滴管加入洗脱剂(5cm)，并在柱上端与装有洗脱剂的储液瓶连接开始洗脱。同时在柱下端与部分收集器接通，立即进行分级收集(按体积或时间分管收集)。 洗脱流速：如果太快，洗脱物在两相中的平衡过程不完全，如果太慢，洗脱物会扩散。 8.测定：随后将收集的每管溶液进行浓度或活性测定。根据测定结果，即可绘制出洗脱曲
纤维素含量的测定
纤维素的测定比色法 纤维素由葡萄糖基组成，它是组成植物细胞壁的基本成分。其含量的多少关系到植物的机械组织是否发达，作物抗倒伏、抗病虫害的能力是否较强，并且影响到粮食作物、纤维作物和蔬菜作物等的产量和品质。 在各种粮食中纤维素的含量各不相同，与籽粒皮层厚薄成正比。同种粮食中，原粮纤维素 维素含量最高，加工粗加工精度越高，纤维素含呈越少，如小麦标准粉约0. 7% .稻谷约9.0%，糙米 约 1.0％，白米约0 4％。因此，根据纤维素的含量的测定，可以判别籽粒皮层的厚薄，粮食加工精度高低和营养价值评估。 纤维素的测定方法有酸碱醇醚法、酸性洗涤剂法、碘量法及比色法。第一个是国标法，但比较繁琐，后者操作比较简单。 一、方法原理纤维素是由葡萄糖基组成的多糖，在酸性条件下加热使其水解成葡萄糖。然后在浓硫酸作用下，使单糖脱水生成糠醛类化合物。利用蒽酮试剂与糠醛类化合物的蓝绿色反应即可进行比色测定。 二、仪器和试剂 1. 主要仪器恒温水浴、冰罐、电炉、玻璃坩埚、漏斗、定时钟、分光光度计等。 2. 试剂60% H2S04 溶液、浓H2S04。 2%蒽酮试剂：2g蒽酮溶解于100rnl乙酸乙酯中，贮置于棕色试剂瓶中。 纤维素标准液：准确称取100mg 纯纤维素，放入100Inl 量瓶中，将量瓶放入冰浴中，然后加冷的 60% H2SO4 60—70ml,在冷的条件下消化处理20—30min,然后用60% H2SO4稀释至刻度，摇匀。吸取此液 5.0ml放入另一50ml量瓶中，将量瓶放入冰浴中，加蒸馏水稀释刻度，则每毫升含100⑷纤维素。 三、操作步骤 1 .绘制纤维素标准曲线 (1)取6支小试管，分别放入0、0.40、0.80 1.20 1.60、2.00ml纤维素标准液。然后分别加入 2.00 1.60 1.20、0.80 0.40、0ml 蒸馏，摇匀。则每管依次含纤维素0、40、80、120、160、200? (2)向每管加0. 5ml%蒽酮试剂，再沿管壁加5. 0ml浓H2SO4，塞上塞子，微微摇动，促使乙酸乙酯水解,当管内出现蒽酮絮状物时,再剧烈摇动促进蒽酮溶解,然后立即放入沸水浴中加热10min , 取出冷却。 ( 3)在分光光度计上620urn 波长下比色,测出各管消光值。 (4)以所测得的消光值为纵坐标,以纤维素含量为横坐标,绘制纤维素标准曲线。 2.样品的测定 (1)准确称取风干的样品100mg,放入 100rnl量瓶中，将量瓶放入冰浴中，加冷的60% H2SO4。60—70ml，在冷的条件下消化处理半小时，然后用60% H2SO4。稀释至刻度，摇匀，用玻璃坩埚漏斗过 滤。
人教版必修3 第3章 植物的激素调节章节检测
必修三第3章植物的激素调节 一、单项选择题 1、向光性实验中在纸盒上打一个小孔的目的是 A．便于观察胚芽鞘生长 B．通风 C．形成单侧光 D．测量胚芽鞘的高度 2、植物产生向光性的原因是 A．茎的向光一侧生长素分布多，生长快 B．茎的背光一侧生长素分布多，生长快 C．茎的向光一侧温度高，生长快 D．茎的背光一侧温度高，生长快 3、正确反映一株白玉兰树上各部分生长素浓度大小的是 A．顶芽＞侧芽老根＞分生区B．顶芽＜侧芽老根＜分生区 C．顶芽＜侧芽老根＞分生区D．顶芽＞侧芽老根＜分生区 4、用燕麦胚芽鞘做向光性实验，发现植物生长素产生的部位、感光刺激的部位、向光弯 曲的部位分别是 A．胚芽鞘尖端；尖端下面一段；向光一面 B．胚芽鞘；胚芽鞘尖端；尖端下面一段C．胚芽鞘尖端；胚芽鞘尖端；尖端下面一段 D．胚芽鞘尖端；胚芽鞘；尖端下面一段5、飞行于太空中的宇宙飞船里，放置一株水平方向的幼苗，培养若干天后，根茎生长方 向是 A．根向下生长，茎向上生长 B．根向上生长，茎向下生长 C．根水平方向生长，茎向上生长 D．根和茎都向水平方向生长 6、关于植物激素的叙述，正确的是 A．植物激素是由植物体内的内分泌腺合成、分泌的微量有机物 B．植物的向光性可以说明生长素能促进植物的生长 C．乙烯能促进果实的成熟，所以在幼嫩的果实中含量较多 D．细胞分裂素能促进细胞的分裂和细胞的伸长，所以在茎尖、根尖含量较多 7、如右图所示，用燕麦胚芽鞘进行实验，一段 时间后，会引起弯曲现象的是 A．④⑤ B．①②③ C．①③④ D．①④ 8、将植物横放，测量根和茎生长素浓度与其生长状况的关系如甲图所示，则曲线上P点最可能对应于乙图中的位置是 A．a B．b C．c D．d
藻蓝蛋白的提取与纯化
螺旋藻粉提取藻蓝蛋白 摘要：藻蓝蛋白是一种可用于配制化妆品及各种天然食品或荧光探针标记的多用途蛋白。本实验旨在找出最适螺旋藻粉中提取藻蓝蛋白的工业提取工艺。对藻蓝蛋白的提取，本课题组采用了反复冻融法、水提法、缓冲液法，以找出提取效率高，成本低的方法。实验结果显示，反复冻融三次的藻蓝蛋白浓度A620/A280分别为：0.819/1.871、0.597/1.676、0.245/0.629;水提法三次的A620/280分别为： 0.842/1.768、0.650/1.136、0.177/0.737;缓冲液提取三次的A620/A280分别为： 1.040/ 2.102、0.260/0.630、0.052/0.247。在蛋白质的分离时，采用两步盐析法，盐析前A620=1.143，A280=1.983；两步盐析后，A620=2.203，A280=1.492。最后在纯化方法上选择了羟基磷灰石柱分离，得到蛋白样品A620=1.379，A280=0.528。 关键词：螺旋藻；藻蓝蛋白；二次盐析；柱分离 介绍：藻蓝蛋白既是一种蛋白质，又是一种很好的天然食用色素，同时又是极好的保健食品。藻蓝蛋白是自然界中少见的色素蛋白之一，不仅颜色鲜艳，而且本身是一种营养丰富的蛋白质，其氨基酸组成齐全，必需氨基酸含量高。藻蓝蛋白具有抗癌、促进血细胞再生、养护卵巢、促使人体内合成弹力蛋白等功效。21世纪初，在欧美、日本等国，藻蓝蛋白广泛用作食品和化妆品的高级天然色素，并被制成生化药品。 因为藻蓝蛋白为胞内蛋白，所以细胞破碎技术是直接影响蛋白提取得率的关键因素之一。藻蓝蛋白的提取一般有超声波、高压均质、反复冻融、水提法、缓冲液提法等【1】。本实验通过反复冻融、水提法和缓冲液法对螺旋藻细胞进行破碎提取藻蓝蛋白，对各条件下得到的蛋白溶出率进行了比较分析，确定了各条件下蛋白提取的最佳条件。在藻蓝蛋白的分离时，主要是把蛋白质与提取液中其他物质分离。可利用蛋白质的盐析【2】，和调节PH使蛋白变性等，使蛋白质从提取液中分离出来；最后，再把藻蓝蛋白从杂蛋白中分离出来，常用的方法有柱分离法等【3】。 1 藻蓝蛋白的提取 1.1 反复冻融法
常用食品及水果营养成分表每(100g中含量)(精)
常用食品及水果营养成分表每（100g中含量）食物种类食部% 水分g 蛋白质g 脂肪g 碳水化合物g 热量cal 米100 13.0 8.2 1.8 75.5 351 面粉100 12.0 9.9 1.8 74.5 354 麦片100 7.9 14.0 7.0 68.0 391 小米100 11.1 9.7 3.5 72.8 362 黄豆100 10.2 36.3 18.4 25.3 412 红豆100 9.0 21.7 0.8 60.7 337 绿豆100 9.5 23.8 0.5 58.8 335 四季豆95 92.0 1.7 0.5 3.8 27 豆浆100 5.2 2.5 3.7 58 豆腐100 90.0 4.7 1.3 2.8 60 黄豆芽100 77.0 11.5 2.0 7.1 92 绿豆芽100 91.9 3.2 0.1 3.1 29 马铃薯88 79.9 2.3 0.1 16.8 77 芋头85 78.8 2.2 0.1 17.5 80 花生仁99 8.0 26.2 39.2 22.1 546 胡萝卜79 89.3 0.6 0.3 8.3 38 白萝卜78 91.7 0.6 0 5.7 25 大白菜89 96.0 0.9 0.1 1.7 11 油菜100 95.2 1.2 0.2 1.6 13 菠菜89 91.8 2.4 0.5 3.1 27 菜花53 92.6 2.4 0.4 3.0 25 番茄97 95.9 0.8 0.3 2.2 15 蜜橘80 88.3 0.7 0.1 10.0 44 苹果81 84.6 0.4 0.5 13.0 58 梨76 83.6 香蕉56 77.1 1.2 0.6 19.5 88 猪肉100 29.3 9.5 59.8 0.9 580 牛肉100 68.6 20.1 10.2 0 172 鸡肉34 74.2 21.5 2.5 0.7 111 鸭肉24 74.6 16.5 7.5 0.5 136 牛乳100 87.0 3.3 4.0 5.0 69 猪油100 1.0 0 99.0 0 891 鸡蛋85 71.0 14.7 11.6 1.6 170 鸡蛋黄100 53.5 13.6 30.0 1.3 330 鸭蛋87 70.0 8.7 9.8 10.3 164 小黄鱼63 79.2 16.7 3.6 99 鲤鱼62 77.4 17.3 5.1 0 155 青虾16.4 0.1 1.3 78 糖99 400
植物组织中纤维素含量的测定
植物组织中纤维素含量的测定 纤维素是植物细胞壁的主要成分之一，纤维素含量的多少，关系到植物细胞机械组织发达与否。因而影响作物的抗倒伏，抗病虫害能力的强弱。测定粮食、蔬菜及纤维作物产品中纤维素含量是鉴定其品质好坏的重要指标。 一、原理 纤维素（cellulose）为β－葡萄糖残基组成的多糖，在酸性条件下加热能分解成β－葡萄糖。β－葡萄糖在强酸作用下，可脱水生成β－糠醛类化合物。β－糠醛类化合物与蒽酮脱水缩合，生成黄色的糠醛衍生物。颜色的深浅可间接定量测定纤维素含量。 二．材料、仪器设备及试剂 （一）材料：烘干的米、面粉或风干的棉、麻纤维。 （二）仪器设备：1. 小试管；2. 量筒；3. 烧杯；4. 移液管；5. 容量瓶；6. 布氏漏斗；7. 分析天平；8. 水浴锅；9. 电炉；10. 分光光度计。 （三）试剂：1. 60％H2SO4溶液；2. 浓H2SO4（AR）；3. 2％蒽酮试剂：将2g蒽酮溶解于100ml乙酸乙酯中，贮放于棕色试剂瓶中；4. 纤维素标准液：准确称取100mg纯纤维素，放入100ml量瓶中，将量瓶放入冰浴中，然后加冷的60％H2SO460～70ml，在冷的条件下消化处理20～30min；然后用60％H2SO4稀释至刻度，摇匀。吸取此液5.0ml放入另一50ml 量瓶中，将量瓶放入冰浴中，加蒸馏水稀释至刻度，则每ml含100μg纤维素。 三.实验步骤 （一）求测纤维素标准回归方程 1. 6支小试管，分别放入0，0.40，0.80，1.20，1.60， 2.00ml纤维素标准液，然后分别加入2.00，1.60，1.20，0.80，0.40，0ml 蒸馏水，摇匀，则每管依次含纤维素0，40，80，120，160，200μg。 2. 向每管加0.5ml 2％蒽酮，再沿管壁加5.0ml浓H2SO4，塞上塞子、摇匀，静置1min。然后在620nm下，求测不同含量纤维素溶液的吸光度。 3. 以测得的吸光度为Y值，对应的纤维素含量为X值，求得Y 随X而变的回归方程。 （二）样品纤维素含量的测定 1. 称取风干的棉花纤维0.2g于烧杯中，将烧杯置冷水浴中，加入60％H2SO460ml，并消化30min，然后将消化好的纤维素溶液转入100ml容量瓶，并用60％H2SO4定容至刻度，摇匀后用布氏漏斗过滤于另一烧杯中。 2. 取上述滤液5ml放入100ml容量瓶中，在冷水浴上加蒸馏水稀释至刻度，摇匀后用。
【CN110272486A】一种蓝藻中藻蓝蛋白的提取方法【专利】
(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910176199.6 (22)申请日 2019.03.08 (71)申请人 北海生巴达生物科技有限公司 地址 536000 广西壮族自治区北海市创源 路1号科技创业基地401室（北海高新 区） (72)发明人 薛命雄 张玮瑲 李玉芬 梁振秀 陈国珍 (74)专利代理机构 贵阳睿腾知识产权代理有限 公司 52114 代理人 谷庆红 (51)Int.Cl. C07K 14/795(2006.01) C07K 1/34(2006.01) C07K 1/14(2006.01) C12N 1/06(2006.01) (54)发明名称 一种蓝藻中藻蓝蛋白的提取方法 (57)摘要 本发明涉及蛋白提取技术领域；具体涉及一 种蓝藻中藻蓝蛋白的提取方法，包括：破壁、粗过 滤、纯化；所述粗过滤是将破壁所得物用0.5-1μ m的微滤膜过滤后，依次加入油脂、去离子水进行 混合，经水油分离去除油脂后，再用0.5-1μm的 微滤膜过滤；本发明具有产率高、纯度高、蛋白稳 定性强、提取周期短，成本低，操作简单，资源利 用率好的特点。权利要求书1页 说明书6页CN 110272486 A 2019.09.24 C N 110272486 A
权 利 要 求 书1/1页CN 110272486 A 1.一种蓝藻中藻蓝蛋白的提取方法，包括：破壁、粗过滤、纯化；其特征在于，所述粗过滤是将破壁所得物用0.5-1μm的微滤膜过滤后，依次加入油脂、去离子水进行混合，经水油分离去除油脂后，再用0.5-1μm的微滤膜过滤。 2.如权利要求1所述蓝藻中藻蓝蛋白的提取方法，其特征在于，所述油脂的用量为蓝藻质量15-20％，混合时间为5-10min。 3.如权利要求1所述蓝藻中藻蓝蛋白的提取方法，其特征在于，所述去离子的用量为蓝藻质量50-60％，混合时间为5-10min。 4.如权利要求1所述蓝藻中藻蓝蛋白的提取方法，其特征在于，所述破壁的方法为：将蓝藻与食盐按1：(0.1-0.2)的质量比混合后，置于真空冷冻至温度为零下20-零下10℃后研磨至过50-80目，再加热至温度为30-35℃，然后加入等温的提取液进行恒温浸泡15-20min。 5.如权利要求4所述蓝藻中藻蓝蛋白的提取方法，其特征在于，所述提取液由如下质量份物质组成：5-8份柠檬酸钠、13-17份十二烷基硫酸钠、2-6份酒石酸钠、10-12份磷酸二氢钠、80-90份去离子水。 6.如权利要求1所述蓝藻中藻蓝蛋白的提取方法，其特征在于，所述纯化的方法为： (1)将粗过滤液与吸附填料混合搅拌10-15min后，固液分离，洗脱固形物，收集洗脱液； (2)将洗脱液以10-20mL/min的流速，通过树脂进行脱色纯化，收集二次洗脱液； (3)将二次洗脱液用中空纤维膜进行超滤。 7.如权利要求6所述蓝藻中藻蓝蛋白的提取方法，其特征在于，所述吸附填料为羟基磷灰石、改性牡蛎壳按质量比为1：(0.05-0.07)。 8.如权利要求7所述蓝藻中藻蓝蛋白的提取方法，其特征在于，所述改性牡蛎壳是将牡蛎壳研磨至过100目筛后，然后加入羧甲基纤维素钠及聚乙二醇进行改性；羧甲基纤维素钠的用量为牡蛎壳质量5-8％，聚乙二醇的用量为牡蛎壳质量20-25％。 9.如权利要求6所述蓝藻中藻蓝蛋白的提取方法，其特征在于，所述混合搅拌中粗过滤液与吸附填料按照1：(1.2-1.6)的质量比，温度为50-70℃。 10.如权利要求1所述蓝藻中藻蓝蛋白的提取方法，其特征在于，所述中空纤维膜的截留分子量为60-80KDa。 2