耐高浓度酒精的酵母筛选及发酵工艺研究[开题报告]

毕业论文开题报告

生物工程

耐高浓度酒精的酵母筛选及发酵工艺研究

1 选题的背景和意义

石油作为国民经济发展的战略物资在经过人类近二百年的开采后，面临全球桔竭的局面。特别是近年来，随着经济的持续增长和石油需求迅速膨胀，我国已成为继美国之后的第二大能源消费国。针对我国人多地少、粮食紧缺和石油短缺的国情，依据不与人争粮、不与粮争地，能源原料多元化，实现持续发展的原则，开发非粮燃料乙醇生物能源，降低生产成本，提高转化效率，确保现代社会发展的需求，已成为国家新能源战略发展最紧迫的任务。传统酿酒酵母的酒精发酵最适温度不高，一般为25℃一30℃；耐酒性较差，耐酒精浓度在10％左右。一方面，在杂菌污染严重的情况下，生产上不仅要求无菌条件严格，操作难度较大，而且为了控制因发酵热所引起的温度上升，需要加入大量冷却水(甚至在部分气温较高地区，因发酵过程中过热，根本无法进行正常生产)，导致乙醇生产成本增加[1-2]；另一方面，酵母的耐酒精度较低，产物的抑制作用降低乙醇酵母的产乙醇潜力。因此，耐受性酒精高温酵母的选育研究已成为国内外酒精行业的研究热点[3-4]。

乙醇酵母对生活条件的变化有迅速的适应能力，并且随着外界环境的变化，其群体能迅速产生变种，这为耐酒精酵母的筛选提供了可能[1]。耐高温酵母不是微生物分类学上的名词，而是从生态方面表达此类酵母对温度的忍耐性与普通酵母的差异。筛选耐高温的乙醇酵母菌株，其生产上的优势主要体现在：①具有较高的发酵能力，即能快速并完全将糖分转化成乙醇，能够解决糖化温度和发酵温度不协调的矛盾，实现真正意义上的边糖化边发酵，从而减少葡萄糖对纤维素酶的抑制作用，提高纤维素酶的糖化率，进而提高纤维素发酵生产燃料乙醇的得率[2-3]；②繁殖速度快，即具有高的比生长速度，高温发酵还能够提高发酵效率，降低发酵时的冷却成本[4]；③具有高的耐酒精能力，即对本身代谢产物的稳定性高．因而可以进行浓醪发酵；④抗杂菌能力强，即对杂菌代谢产物的稳定性高．耐有机酸能力强；⑤对培养基的适应性强。耐温、耐盐和耐干物质浓度的性能强。

2 相关研究的最新成果及动态

2.1 传统的酵母菌育种技术

2.1.1 自然界筛选和高温驯化

长期以来，高温菌株的选育主要集中在利用自然界筛选和高温驯化。驯化就是通过破坏微生物正常的生活条件，积累定向变异而实现的。相比较于诱变育种和利用细胞原生质体融合，进而发生细胞核染色体基因间的重组获得新种。驯化具有培育条件温和、操作简单、投入少、易掌握等优点。通过对菌株的驯化、筛选。获得优良菌株，不失为是一种改良菌种的好方法[5]。

2.1.2 杂交育种

杂交育种是依靠酵母的生活史,利用其具有不同遗传特性和相反交配型的细胞能产生新的双倍体的特性，通过杂交获取满足生产需要的某些特有性能,从而获得优良菌株的育种方法。杂交后的新菌株应具有稳定的遗传特性,否则就没有实用价值。利用杂交育种，选育耐乙醇酵母,可以利用不同特性的乙醇酵母菌株进行生孢培养、孢子分离试验等，得到酵母菌单倍体，然后利用酒精发酵试验进行复筛，得到性能最优良的单倍体，作为杂交试验的亲本。杂交试验后,经过性能测定,得到理想的乙醇酵母菌株[6]。

2.1.3 诱变育种技术

诱变育种是指利用物理或化学诱变剂处理微生物细胞。显著提高变异的频率，使人们可以简便、快速地筛选出各种类型的突变菌株．作生产和研究之用[7]。微生物的自发突变几率是很低的．一般在10-6～10-9间，变异程度轻微，育种成功率相对较低；而通过诱变剂的作用进行的诱变育种则可以大大提高育种的成功率。物理诱变剂包括紫外线、X-射线、γ-射线、β-射线、快中子、激光、离子束等，其中常用于酵母菌的诱变选育的是紫外线。

紫外诱变效应主要是指紫外线照射引起菌株DNA结构的改变，阻碍DNA的复制或引起碱基排列次序的变化，从而引起基因突变[8]。使用方便、不需要专人操作、经济、危险性小、适用范围广泛等优点，使得紫外线成为工业微生物诱变育种的首选诱变剂，并且已经在多种工业微生物中均被证明诱变效果良好[9]。由于在一般的微生物中都存在着光复活作用．所以在进行紫外线处理时，只能在红光下或黑暗中进行照射及处理照射后的菌液，以免发生光复活作用。申玉香等[10]将APV菌株经紫外线诱变后筛出苯黄隆抗性菌株2#菌株，发酵双乙酰峰值为0.36 mg／L，真正发酵度为65.8％。Walid A Lotfy等[11]用紫外线柠檬酸产生菌Aspergillus niger UMIP2564获得成品收率达到60.25％的变异菌株W5。石一珺等[12]采用紫外线2次复合诱变处理内生真菌哈茨木霉，获得了突变株UV-5-3，大大提高了原始菌株发酵液的活性，其抗生素含量远远超出出发菌株。

化学诱变技术是指利用一些化学物质提高生物的自然突变率，这些化学物质就叫做“化学诱变剂”。化学诱变育种是人为地利用化学诱变剂,诱发作物发生突变,再通过多世代对突变体进行选择和鉴定，直接或间接地培育成生产上能利用的作物新品种。其特点：可操作性强，简单易行；特异性较强，能诱变定位到DNA上的某些碱基；后代较易稳定遗传，一般到F3代就可稳定；应用于遗传标记，是细胞融合技术的基础[13]。化学诱变剂种类很多，包括亚硝酸、乙基磺酸甲烷(EMS)、硫酸二乙酯(DES)、N-甲基-N’-硝基、N-亚硝基胍(MNNG)、亚硝基乙基脲(NEW)、碱基类似物等,其中EMS较为有效,称为超诱变剂。王璋等[14]使用亚硝基胍处理萌发状态的链霉菌WZFF孢子悬浮液，结果得到l株转谷氨酰胺酶活比出发菌株提高

1.2倍的突变菌株WZFF.W-1

2.varMN一35。

2.2 新兴的酵母茵育种技术

2.2.1 新兴的诱变源——低能重离子束

离子注入诱变技术是近些年发展起来的物理诱变技术。是一种新兴的诱变方法和途径。离子在注入过程中不断与生物分子键合，置换或填充空位形成新的分子基团，可引起DNA 键断裂，导致大量受体原子移位、重组，形成新的分子结构和基团。从而能够使酵母菌产生丰富的基因突变，从而获得高突变率。离子注入既存在着电荷交换、能量交换、动量交换等过程，和稳定性能试验等证明为稳定的融合子，并在45℃下又存在着入射离子沉积过程，动量、能量、电荷、质量4种作用均可引发不同的生物学效应[13]。

离子注入技术与其他的诱变源相比，作为一种新的辐射源，在生命科学研究中占有重要的独特地位，因为它具有常规辐射源所没有的优势：①传能线密度大：②相对生物效率高；

③损伤后修复效应小；④能量沉积的空间分辨性好；⑤氧效应小；⑥细胞在不同时相内对重离子束敏感性的差异不大等[15]。

卫军等采用N离子束对谷氨酸棒杆菌进行诱变处理，筛选磺胺胍抗性突变菌株，选育出1株L一精氨酸产量较高和产酸性能比较稳定的突变菌株，比出发菌株提高了24.8％。蒋世春等将抗肿瘤抗生素柔红霉素产生菌——天兰淡红链霉菌激光株经N等离子体诱变处理后再经摇瓶筛选，获得1株高产柔红霉素突变株，其柔红霉素效价较亲株提高了25.8％。[16] 2.2.2 原生质体融合技术

原生质体融合作为一种更为广泛随机的基因重组方式，能够克服细胞壁这一层天然屏障，排除接合型的限制。实现多基因重组：还可直接采用生产性状好的菌株作为亲本，加速工业酵母菌种改良进程，为优良工业酵母的选育提供了一个崭新的途径。原生质体融合通常是以2亲株的细胞膜的融合为起点，经细胞质的完全融合，直至基因组的交换重组，产生众

多的重组子，从中筛选出理想的重组子。原生质体融合也可以和其他育种方法相结合，将多种优良性状组合到一个单株中，大大缩短育种周期[17]。

高玉荣，李大鹏，GAO Yu-Rong等[18]筛选出初始富硒能力相对较高的酵母菌株As2.16l 作为出发菌株。用溶壁酶对AS2.161菌进行酶解破壁，酶的最适添加量为1 g／100 mL，最适酶解时间为120 min，菌体原生质体的形成率为95.2％，再生率为21.8％。用紫外线进行原质体诱变育种，并进行初筛和复筛，最终获得一株菌体富硒量为821 mg／kg，菌体收获量为0.88 g／100 mL。

文铁桥等利用酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)A001和克鲁维酵母(KluyVer-omyces sp.)Y034属间原生质体融合构建高温酵母菌株，对制备高再生活性原生质体及融合子细胞形态、生理化特征、同工酶性质、遗传稳定性和高温发酵等方面进行了研究。结果表明，融合子AY023和AY680遗传性能稳定。表达了双亲优良性状，获得了在45℃培养条件下产酒率7.4％的属间融合菌株[19]。蒋岳等利用原生质体电诱导融合构建了l株耐高温菌株，可在38℃条件下浓醪发酵，酒精度为12.3％vol；在40℃条件下浓醪发酵，酒精度为10.7％vol的融合株[20]。

2.2.3 基因工程技术

基因工程，也称为DNA重组技术[21]。利用基因工程技术改造酵母菌种，是指将外源基因转入乙醇酵母，给予菌种新的发酵性能，达到增强菌种发酵性能和应用价值的目的。基因工程的一般步骤是对已经清楚的基因进行克隆诱变，再通过基因操作将其整合入受体菌株，并保持重组菌株的遗传稳定性。

Ymashita等人[22]成功地将嗜杀酵母的基因转到啤酒酵母中，嗜杀啤酒酵母能抑制发酵过程中野生酵母的生长，净化发酵系统。

T.Fuji[23]等入网从S.eerevisiae和S.uvarum品系中克隆编码此酶的基因，转导到酵母细胞中，结果乙醇乙酰转移酶表现出高活性，强化了啤酒的香味。

2.2.4 超高压

超高压。高压导致细胞体积减小，胞内物质浓缩，使得先前互不接触的各种酶、蛋白质及核酸类物质接触，这种接触必然会导致一些不可预测的反应发生，如DNA在高压下会与切割DNA的核酸内切酶接触而使得DNA发生变化。研究发现，DNA在高压长时间处理下，DNA合成对压力敏感。高压可以影响到DNA的超螺旋结构，甚至影响DNA母链的解旋，还使得DNA失去紧急修复的应急反应(SOS)机制。在传统的诱变剂反复使用、诱变产量提高到极限易发生退化的情况下，超高压可望作为1种新型的物理诱变育种手段，而且具有操作简

便、无污染等优点。

高翔等[24]用220 MPa高压处理大肠杆菌TG1、DH5a和HBIOI，得到了耐压的突变株TGIP、DH5 cxP 和HBIO1P。

2.2.5 空间诱变

自空间探索以来，人们一直致力于研究空间特殊环境中，诸如微重力、高能粒子辐射等诱变因素对微生物的复合影响，其中微重力和空间辐射是主要的诱变因素。在空间特殊条件中，微生物的变异频率较高。DNA和生物膜是射线作用的靶子，DNA结构的损伤主要有单、双链断裂，碱基和糖的损伤，DNA与DNA、DNA与蛋白质交联等。其中单、双链断裂较多见，富含胸腺嘧啶的区域最易受到破坏，膜损伤有膜结构的改变、膜结合酶活性和膜受体功能降低等。白骅等通过空间诱变选育毒三素链霉菌，正变率达到39％，产量提高19.2％。王璋等[25]利用“神舟”4号无人飞船搭载生产微生物转谷氨酰胺酶的链霉菌进行空间诱变，得到1株高产酶菌株，酶活性提高了40％以上，达到3.62 U／mL。

3 课题的研究内容及拟采取的研究方法（技术路线）、难点及预期达到的目标

研究内容：

1）高酒精度耐受出发菌株筛选；

2）耐高酒精度酿酒酵母的诱变选育。

采取的技术路线：

1）酵母菌种的活化：用酵母膏蛋白胨培养基活化黄酒酵母。用1%的酵母膏，2%的蛋白胨，2%的葡萄糖配置成培养液，将PH调节到4左右，无菌操作下将黄酒酵母菌

接种到液体培养基里，进行摇瓶培养活化。

2）选择性能好的菌株为出发株：活化之后，选择最高浓度下生长的酵母菌为出发菌株。

在试管中用浓度梯度接种活化后的菌株，选择最高生长浓度下的菌株作为出发菌

株。

3）对菌株进行诱变：使用物理诱变，如紫外诱变，或者化学诱变，如TTC，也可以使用复合诱变进行诱变育种。对筛选出来的菌株在更高的浓度下培养，看是否能够生

长，如果能则表示诱变成功。

4）筛选诱变株：用一系列的方法，如96平板法，筛选经过诱变后的菌株。而且对筛

选出来的菌株进行培养，看传代后的菌株是否还有母代的高性能，如果有则表示诱

变的菌株有效，如果没有则表示诱变不能传代，得重新诱变育种。

5）发酵培养：对得到的高性能的诱变菌株进行发酵培养，看是否产酒，以及产酒的效果是否理想。

6）发酵工艺的研究：根据实验过程及实验结果，对得到的酵母菌株的发酵工艺进行研究，并得出结论。

难点：

耐高酒精度酵母菌种的正向诱变和酵母菌株诱变之后的稳定传代。

预期达到的目标：

通过对不同来源的酿酒酵母进行高酒精度耐受性比较，利用性能较好菌株为出发菌株，进行诱变筛选，获得耐受性能有显著提高的酿酒酵母突变株。

4 论文工作进度和安排

2010.10.30 选题

2010.11.5 布置论文任务

2010.11.5－2010.12.30 查阅文献资料，翻译英文文献，完成文献综述和开题报告

2011.1.10 文献综述、开题报告和翻译文章定稿并上交

2010.11.5-2011.1.10 熟悉实验室环境和基本实验操作，准备实验所需基本材料2011.4月前在学校指定时间完成开题答辩

2010.11.5－2011.5.12 毕业论文实验阶段

2011.5.13 完成并提交毕业论文

2011.5 在学校指定时间进行毕业论文答辩

2011.6 完成并提交答辩后的修改论文

5 参考文献

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耐酒精酵母的筛选

摘要：从野外葡萄园土壤中采集土壤样品，在实验室中通过微生物培养，微生物的富集，菌种的分离、纯化，筛选出纯的酵母菌。将筛选出的纯的酵母菌分组分别进行培养，进行耐酒精能力的比较。培养到最佳时期的时候，分别测定各组酵母菌株培养基中酒精含量，筛选出耐酒精性能最好的菌株。该超强耐酒精能力的优良菌株的成功筛选为酵母菌能高效利用发酵培养液提供了菌种来源，同时也为发酵后的酒精分离降低了难度和成本。 关键词：微生物；耐酒精；酵母；筛选；性能测定 前言：随着化石能源的日趋匮乏及环境污染的加剧，开发一种绿色能源势在必行。乙醇作为一种生产工艺成熟、生产原料来源广的替代能源日益受到人们关注。尤其是燃料酒精作为清洁能源，原料资源可以再生，大大的刺激了酒精行业的发展。用微生物法生产酒精的历史由来已久，并且生产工艺早已成熟。目前乙醇的生产原料为玉米、小麦等粮食产品为主。尽管用粮食生产酒精成本昂贵，但由于用纤维素作原料生产酒精的方法还不成熟，工艺过程很不完善，所以怎样提高粮食生产酒精过程中原料的利用率，是目前酒精发酵过程研究的一个重要方向，也是降低发酵生产酒精的重要措施。因为酒精是酵母菌糖代谢产物，对酵母菌的发酵有一定抑制作用，当酒精成分达到10%左右时，酵母菌就停止繁殖，发酵过程也随之放慢。在酒精发酵过程中，由于一般酒精酵母的耐酒精能力不强（耐酒精度一般为10%），导致酵母菌不能充分利用发酵原料，造成了原料的浪费，同时由于发酵液中酒精含量低，使得酒精后期的分离纯化过程复杂，从而大大增加了

生产成本。因此，耐高酒精度的酒精酵母的筛选具有非常重要的意义。耐高酒精度的酒精酵母能够减缓产物的抑制作用，提升酒精酵母产酒精的潜力【1】。耐酒精酵母可以在发酵液中较高浓度的酒精中不会死亡，并且仍然具有利用培养液发酵酒精的能力，从而提高酒精原料的利用率。同时和一般酵母发酵相比，发酵产物中酒精的含量能达到18%左右，产物中原料和杂质的含量下降，产物中酒精的纯度增加，也使得酒精的分离提纯更加容易进行，从而使粮食生产酒精成本降低。因此高耐性酒精酵母这一领域的研究工作一直在深入的进行，并且有了可喜的成果【2】。耐酒精酵母的应用，使相同原料的酒精产量大大提高，从而使我国的酒精生产总量增加，改善我国酒精产品供应不足的状况，更好的为我国的国民经济服务。酒精成本的降低，使得酒精能源能够得以广泛使用，缓解能源的危机，降低化石燃料的使用，减少日益严重的环境污染，改善我国恶劣的环境状况。对我国经济的可持续发展有着深远的影响。在查阅了大量文献资料的前提下，本文拟从自然界分离筛选一株耐酒精产酒精能力强的酵母菌株，使其应用于工业酒精发酵，提高酒精发酵的产率和质量，降低酒精生产的成本。实验部分： 1材料与试验方法： 1.1材料： 1.1.1样品来源：野外葡萄园中的土壤样品。 1.1.2菌株来源：从葡萄园中土壤样品中分离酵母菌株。 1.1.3培养基：

酵母菌酒精发酵实验报告

实验方案 酵母菌酒精发酵的条件研究 学院（部）：生物与化学工程学院 专业：生物工程 学生姓名：鑫 学号：11018150 班级：生物工程二班 指导教师：肖

一、实验目的 1、学会实验的设计和操作过程 2、找到酵母菌发酵时的最优条件 二、培养基和实验方法及材料的确定 1、玉米粉的糖化方法 玉米粉的糖化采用双酶法，其工艺流程如下 玉米粉→加水→液化→糖化→发酵→蒸馏→成品酒精 试验中，发酵培养按照三角瓶100ml培养。本次工做20组是要，共需发酵液20*100=2000ml。培养液按照100g玉米粉、300ml水。所以共需玉米粉700g。 液化：取１００ｇ玉米粉，加入３００ｍＬ的水，液化温度为９０℃，ｐＨ值为５．５，液化时间为３．５ｈ，液化酶的添加量为０．０３５ｇ／１００ ｇ玉米粉 糖化：糖化时的工艺条件为：糖化温度为５８℃，ｐＨ值为４．５，糖化时间为３．５ｈ，糖化酶的添加量为０．３ｇ／１００ｇ玉米粉。 2、活化培养基 本实验在进行实验时采用察氏(czapck)培养基的配制，配方如下表一： 表一 3、扩大培养基 扩大培养仍然用察氏(czapck)培养基，由于要用液体的，所 以将其中的琼脂配料去掉。 4、发酵培养基

糖化液稀释至l0%浓度，添加辅料（硫酸铵0.4%），pH5.5 灭菌 三、培养基的制备及酵母的活化 1、准备酵母母菌一支常温下存放一天，增加菌种的活力。在母菌存放期间制作各时期培养基 2、准备固体培养基（察氏培养基）50ml，做成8支试管斜面，扩大培养基800ml（做扩大培养时使用）。做成8个三角瓶，每瓶200ml。120℃灭菌30min。 3、发酵液的制备 （1）玉米粉的筛选 实验前准备粉碎后的玉米粉700g。 （2）玉米粉的液化 按照100g玉米粉、300ml水的配比对玉米粉进行液化，液化方案上文已经交代。在1000ml烧杯里，或者500ml烧杯分两次，水浴液化。 器材：烧杯500ml两个，玻璃棒一个，水浴锅一个，糖化酶0.225g 步骤：1、将糖化酶，玉米粉，水按照比例配置好在烧杯里。2、将配好的玉米液放于水浴锅中90℃液化3.5h。边液化边搅拌。 （3）玉米粉的糖化 将液化后的玉米液中按照0.3g/100ml加入液化液中。再在水浴锅中，58℃糖化3.5h。 （4）过滤 糖化后的糖化液有可能有没有彻底液化的玉米颗粒，会造成浑浊，这时需要对糖化液进行过滤操作。 操作步骤： 最后与以上培养基一起进行灭菌处理。灭菌时，清洗16支移液管，与培养基一起灭菌。 （5）活化步骤 器材：酒精灯，接种针，母菌，斜面培养基，消毒酒精。 步骤：1、将器材放于实验台上。对双手合桌面进行灭菌。对接种针进行灼烧灭菌。2、在酒精灯旁按照无菌操作步骤在酒精灯火焰旁取

木薯为原料的酒精酿造工艺

木薯为原料的酒精酿造 工艺 Company Document number：WUUT-WUUY-WBBGB-BWYTT-1982GT

以木薯为原料的酒精酿造工艺木薯具有良好的加工性能，也不与粮食作物争地，是一种有很大发展潜力的酒精生产再生资源，将其应用到发酵工业，具有广阔的发展前景。据相关资料显示广西的木薯产量较大，全国60%的木薯淀粉是由广西生产，广西对于生产木薯酒精具有独特的优势。以木薯为原料进行酒精发酵的工艺较成熟。本文简述了木薯原料预处理、液化、酶糖化、发酵酒精生产工艺。木薯是热带和亚热带广泛种植的粮食和经济作物，适应性很强，耐旱、耐瘠、耐水，对土地的质量要求不高，是可在任何土质中生长的作物。我国南方盛产木薯，产量高，淀粉含量高。木薯的块根淀粉含量达25%-30%左右，木薯干淀粉含量达70%左右，是被誉为“淀粉之王”。木薯已被世界公认是具有很大发展潜力、很有前途的酒精生产的可再生资源。近年来，随着木薯原料用于生产酒精渐渐收到人民的重视，国内外学者都致力于木薯生产酒精工艺的研究。下面就木薯原料预处理、液化、酶糖化、发酵酒精生产工艺这四个方面进行简单的介绍。 一、原料的预处理 原料在进行正式生产之前，必须预处理，以保证生产的正常进行和提高生产的效益，预处理包括除杂和粉碎两个工序。木薯在收获和干燥过程中，经常会惨夹进泥土、沙石、粗纤维，金属杂质等杂质，这些杂质如果没有在正式投入生产之前清除，将严重影响生产的正常进行。石块和金属杂质会使粉碎机的筛板磨损或损坏，造成生产的中断；机械设备运转部位，会因泥沙的存在而加速磨损，泥沙等杂质也会影响正常的发酵过程。所以用木薯原料生产酒精前，必须进行除杂，以保证生产的正常进行和提高生产的效益。 2、原料的粉碎木薯原料粉碎可以使原料的颗粒变小，原料的细胞组织部分破坏，淀粉颗粒部分外泄，增加原理的表面积，在进行水热处理时，加快原料的吸水速度，降低水

耐高浓度酒精的酵母筛选及发酵工艺研究[开题报告]

毕业论文开题报告 生物工程 耐高浓度酒精的酵母筛选及发酵工艺研究 1 选题的背景和意义 石油作为国民经济发展的战略物资在经过人类近二百年的开采后，面临全球桔竭的局面。特别是近年来，随着经济的持续增长和石油需求迅速膨胀，我国已成为继美国之后的第二大能源消费国。针对我国人多地少、粮食紧缺和石油短缺的国情，依据不与人争粮、不与粮争地，能源原料多元化，实现持续发展的原则，开发非粮燃料乙醇生物能源，降低生产成本，提高转化效率，确保现代社会发展的需求，已成为国家新能源战略发展最紧迫的任务。传统酿酒酵母的酒精发酵最适温度不高，一般为25℃一30℃；耐酒性较差，耐酒精浓度在10％左右。一方面，在杂菌污染严重的情况下，生产上不仅要求无菌条件严格，操作难度较大，而且为了控制因发酵热所引起的温度上升，需要加入大量冷却水(甚至在部分气温较高地区，因发酵过程中过热，根本无法进行正常生产)，导致乙醇生产成本增加[1-2]；另一方面，酵母的耐酒精度较低，产物的抑制作用降低乙醇酵母的产乙醇潜力。因此，耐受性酒精高温酵母的选育研究已成为国内外酒精行业的研究热点[3-4]。 乙醇酵母对生活条件的变化有迅速的适应能力，并且随着外界环境的变化，其群体能迅速产生变种，这为耐酒精酵母的筛选提供了可能[1]。耐高温酵母不是微生物分类学上的名词，而是从生态方面表达此类酵母对温度的忍耐性与普通酵母的差异。筛选耐高温的乙醇酵母菌株，其生产上的优势主要体现在：①具有较高的发酵能力，即能快速并完全将糖分转化成乙醇，能够解决糖化温度和发酵温度不协调的矛盾，实现真正意义上的边糖化边发酵，从而减少葡萄糖对纤维素酶的抑制作用，提高纤维素酶的糖化率，进而提高纤维素发酵生产燃料乙醇的得率[2-3]；②繁殖速度快，即具有高的比生长速度，高温发酵还能够提高发酵效率，降低发酵时的冷却成本[4]；③具有高的耐酒精能力，即对本身代谢产物的稳定性高．因而可以进行浓醪发酵；④抗杂菌能力强，即对杂菌代谢产物的稳定性高．耐有机酸能力强；⑤对培养基的适应性强。耐温、耐盐和耐干物质浓度的性能强。 2 相关研究的最新成果及动态

酵母菌分类

酵母菌分類 根據荷蘭Lodder & Kreger-van Rij 所著“The Yeasts, A Taxonomy Study” 分類主要依據是 1. 形態 2. 對硝酸鹽或碳源的利用 3. 對糖的發酵性 形態與大小：因酵母種類不同而不同，同一種也會因培養條件或發育時期不同而有異，一般直徑約在5 μm，顯微鏡40X及100X接物鏡下皆可觀察到。 cerevisiae型：球形與卵形(如啤酒酵母Saccharomyces cereviisiae) ellipsoideus型：橢圓形(如葡萄酒酵母Saccharomyces ellipsoideus) pastorianus型：香腸形 apiculatus型：檸檬形 trigonopsis型：三角形 增殖法：主要為營養增殖(即出芽生殖(budding))，偶而發生有性生殖時則行子囊胞子來增殖。 母細胞(mother cell)：原來的細胞 子細胞daughter cell)：增殖後的細胞 多極出芽(multilateral budding)：同一個細胞上數個地方可以出芽者 兩極出芽(bipolar budding)：只有細胞兩端才會出芽者(如Kloeckera spp.) 偽菌絲(pseudomycelium)：出芽後的細胞一直連成很長，呈菌絲狀者(如Candida spp.) 真菌絲(true mycelium)：有些酵母會形成如同黴菌具有隔膜(septum)的真菌絲(如Endomycopsis spp., Trichosporum spp.) 分裂酵母(fission yeast)：非出芽，而是在細胞中央形成隔膜再分裂成兩個細胞者(如Schizosaccharomyces spp.)

耐高温酒精酵母的筛选

文章编号 1004 6410(2009)03 0026 04 耐高温酒精酵母的筛选 易 弋1a ,黎 娅1b ,容元平1a ,李 凯2 (1.广西工学院a.生物与化学工程系b.科技处,广西柳州 545006; 2.四川省中医药高等专科学校,四川绵阳 621000) 摘 要:从酒精厂废液、糖厂废糖蜜、土壤及淤泥等七种不同样品中,经富集、分离、纯化,筛选得到3株耐高温酵母菌T M 6、T M 10和T M 20.实验结果表明,3株菌都能在50 的高温下生长,但高温会明显影响酵母菌的发酵能力.30 下,T M 10的发酵酒精终浓度最高,达到了7.82%(v/v).而在40 下T M 20的发酵能力要高于T M 6和T M 10,且发酵酒精终浓度仅比30 时降低了约6%.关 键 词:耐高温;酒精发酵;酵母;筛选中图分类号:T S262.2 文献标识码:A 收稿日期:2009-06-05 基金项目:广西工学院博士基金项目(0818001),广西工学院科学基金项目(0840202)资助.作者简介:易弋(1979-),男,四川都江堰人,广西工学院生物与化学工程系副教授,博士. 0 引言 自20世纪70年代发生石油危机以来,能源短缺已成为我国乃至世界各国经济发展的主要障碍.发展可 再生资源以解决我国经济持续发展中的能源问题,已成为全社会的共识.燃料乙醇由于其可再生性,被认为是最有可能代替石油的液体燃料,市场潜力十分巨大. 目前工业化生产酒精的发酵温度一般在30~33 左右,在这种温度下发酵需要大量的冷却水.若能使发酵在高温下进行,不但可以减少冷却水的用量,节约生产成本,而且可以从根本上解决糖化与发酵不同步的问题,缩短发酵周期,提高发酵效率[1] .同时高温发酵能有效的抑制杂菌生长,减少醪液受污染的机会.但过高的温度会引起酵母细胞内脂肪酸、磷脂等成分的变化,甚至会导致蛋白质变性,这样一来就会影响细胞正常的生理活动,表现出高温对酵母细胞的毒性[2].因此,对于耐高温酒精酵母菌的选育问题一直是酒精酵母研究者的重要研究方向之一. 针对这一问题,本文拟从自然界中分离出有较强温度耐受性的酵母菌,并初步研究其发酵及相关性能,为下一步的选育工作打下基础. 1 材料与方法 1.1 培养基 酵母培养基:葡萄糖50g,酵母膏8.5g,NH 4Cl 1.0g,MgSO 4 7H 2O 0.6g ,CaCl 20.6g ,加水溶解至1000mL,调pH =4.5,115 灭菌20m in.固体培养基在液体培养基的基础上添加1.5%的琼脂. 发酵培养基:葡萄糖150g ,酵母膏5g,蛋白胨5g,NH 4Cl 1.0g,M gSO 4 7H 2O 0.6g,CaCl 20.6g ,加水溶解至1000mL,调节pH= 4.5,115 灭菌20min. T TC 上层培养基[3] :葡萄糖0.5g,琼脂1.5g,加水至100mL,115 灭菌20min,待冷却至55 左右时,加入TTC(2,3,5!氯化三苯基四氮唑)0.05g. 第20卷 第3期 广西工学院学报 Vol 20 No 3 2009年9月 JO U RNAL OF G UA NG XI U N IV ERSIT Y OF T ECHN OL OGY Sep 2009

酒精发酵工艺

酒精发酵工艺 李洋41116115 摘要 酒精是一种可再生能源，酒精发酵原料来源广泛，供应充足，推行乙醇汽油清洁燃料，可以解决国家石油短缺，粮食过剩及环境恶化三大热点问题。 正文 一．背景（全球能源短缺） 能源是人类社会发展的重要基础资源。特别是随着世界经济的发展、世界人口的剧增和人民生活水平的不断提高，世界能源需求量持续增大，由此导致对能源资源的争夺日趋激烈、环境污染加重和环保压力加大。促使我们更加关注世界能源的供需现状和趋势，也更加关注中国的能源供应安全问题。 根据美国能源信息署（EIA）最新预测结果，随着世界经济、社会的发展，未来世界能源需求量将继续增加。预计，2010年世界能源需求量将达到105.99亿吨油当量，2020年达到128.89亿吨油当量，2025年达到136.50亿吨油当量，年均增长率为1.2%。欧洲和北美洲两个发达地区能源消费占世界总量的比例将继续呈下降的趋势，而亚洲、中东、中南美洲等地区将保持增长态势。伴随着世界能源储量分布集中度的日益

增大，对能源资源的争夺将日趋激烈，争夺的方式也更加复杂，由能源争夺而引发冲突或战争的可能性依然存在。 未来世界能源供应和消费将向多元化、清洁化、高效化、全球化和市场向发展。酒精就是一种良好的清洁能源。 近年来，世界酒精产量一直处在高速攀升中，2006年产量达4063万t，较2005年的3655万t，增加了408万t，增幅达11.16%。2006年世界酒精产量最大的三个国家，美国.巴西.中国，分别占世界份额38.37%. 33.55%. 13.54%。2007年中国酒精产量达到620万t，2008年超过700万t。（最新数据无法获取） 二．发展意义 酒精化学名称为乙醇，分子式为C2H5OH,相对分子质量为46.07。无水乙醇是无色透明，易挥发，具有特殊芳香和强烈刺激味的易燃液体。酒精的用途主要有三个方面：燃料酒精，食用品酒精，化工医药用酒精，而前者是酒精的主要用途。 燃料酒精作为一种清洁能源，是指向汽油或柴油中加入一定比例的无水乙醇作为燃料使用。酒精作为一种新能源，其优势在于发酵酒精是源于太阳能的一种生物质能转化能源，属于可再生能源。燃料酒精被认

酵母的筛选 (1)

．葡萄果表酵母的分离: 葡萄的采集：葡萄成熟时，在葡萄果皮、果梗上都有大量的酵母菌存在，因此在采收葡萄时，将果梗与葡萄一起采收。由于酵母菌在稍微破裂的葡萄果实中大量存在，采收时可以选取有裂纹的葡萄，但是，将完整无损的葡萄与有裂纹的分开装袋。运回实验室置于冰箱中保存，备用。2. 菌种分离步骤：将腐败变质的葡萄及杂质从果实中挑选出来。随机选取并称量约10g成熟葡萄，放入盛有90ml 无菌水的三角瓶，分别按30ug/ml添加链霉素，然后振荡培养30min后静置，制成菌悬液，吸取50μl 放入YEPD固体培养基，三个重复，以无菌刮铲刮匀，25℃培养24～48h。观察菌落的大小及生长状况。然后将静置后的菌悬液进行梯度稀释（10-3、10-4、10-5、10-6、10-7），再用移液枪分别从每一稀释度各取0.1ml稀释液，注入平板上，利用涂布棒将样品均匀的涂在培养基表面（注意不能使培养基表面破裂），将培养皿盖好，再把培养皿倒置，于适宜温度（一般为25℃或28℃）的恒温箱中培养，每个稀释度做三个重复。为了在筛选过程中排除细菌的干扰，在培养基中加30ug/ml 的链霉素或者100mg/L 的氯霉素。观察并记录菌落颜色与形态，然后在显微观察记录细胞大小、形态，进行分析和初步的归类。 自然发酵过程中酵母菌的分离: 将腐败变质的葡萄及杂质从果实中挑选出来。称量约100g 新鲜成熟度好的各品种葡萄，手工破碎，放入无菌的500ml 三角瓶，接着分别按30ug/ml添加链霉素，置于28℃培养，每隔24h 取发酵液1ml，加入9 ml无菌水中，然后进行梯度稀释至10-3、10-4、10-5、10-6、10-7，取样时期分别为：I，葡萄浆果破碎压榨后（添加SO2）；II，发酵旺盛期，葡萄汁含糖量下降20%时；III，发酵后期，葡萄汁含糖量下降70%时；IV，发酵结束前，残糖10%以下时。取0.1ml 稀释后各菌液放入固体培养基，涂布均匀（注意不能使培养基表面破裂），将培养皿盖好，再把培养皿倒置，28℃条件下使其自然发酵24～48h，每个稀释度做三个重复。为了在筛选过程中排除细菌的干扰，在培养基中加30ug/ml 的链霉素或者100mg/L的氯霉素。观察培养基，直到菌种形成清晰易辩的菌落为止。观察每一个菌落，编号并作详细描述。如：菌落颜色、表面结构、边缘、颜色等，进行分析和初步的归类。 酿酒酵母筛选及其鉴定一筛选 1 酿酒酵母的无性繁殖方式筛选对液体培养基培养48h的酵母菌株，在16×40倍显微镜镜检，筛选出以多端出芽繁殖的菌株。 2 WL琼脂培养基筛选酿酒酵母WL琼脂培养基(%质量分数)：酵母浸粉0.5，胰蛋白胨0.5，葡萄糖5，琼脂2，磷酸二氢钾0.055，氯化钾0.0425，氯化钙0.0125，氯化铁0.00025，硫酸镁0.0125，硫酸锰0.00025，溴甲酚绿0.0022，pH 6.5，121℃灭菌20 min；将分离出来的酵母菌株，接种液体培养基活化24h后接种到WL琼脂培养基，27℃培养5d后观察，筛选出菌落颜色为奶油色（浅黄色）至绿色，表面为球形突起，光滑，不透明，奶油状的菌株。 3 赖氨酸培养基筛选赖氨酸培养基成分（L-1）：D-葡萄糖10g，L-组氨酸1mg，DL-蛋氨酸2mg，DL-色氨酸2mg，对－氨基苯甲酸200μg，生物素20μg，叶酸2μg，肌醇10mg，烟酸400μg，泛酸2mg，盐酸吡哆醇400μg，核黄素200μg，盐酸硫胺素400μg，硼酸500μg，结晶氯化铜40μg，碘化钾100μg，结晶氯化铁200μg，结晶硫酸锰400μg，结晶钼酸钠200μg，结晶硫酸锌400μg，磷酸二氢钾850mg，磷酸氢二钾150mg，结

酵母发酵酒精的研究进展

酵母发酵酒精的研究进展 （生命科学与技术学院微生物专业） 前言 人类利用酵母菌的历史已有几千年了。值得提出来的是，早在我国宋代的酿酒著作中，中国人已经明确记载了从发酵旺盛的酿酒缸内液体表面撇取酵母菌（当然不是纯粹的酵母菌）的方法，并把它们称为“酵”，风干以后制成的“干酵”可以长期保存。这种制造干酵母的原始方法说明，早在800年前，中国人已经意识到酒精发酵是由“酵”，即某种能生长的物质引起的。这种推断直到19世纪巴斯德才证明是酵母菌。明代末年出版的词书中记载有“以酒母起面曰发酵”，“发酵，浮起者是也”等解释。这说明至少在那时，一引起细心观察自然现象和注意比较的学者，已经认识到发面和酿酒有某种相同的因素在起作用。当时在欧洲虽然已经发现了酵母菌，但在200年后才知道酵母菌的作用。今天我们把这类微生物称酵母菌，正是以此为根据的。 酵母菌能够把糖变成酒精，是因为它的细胞里有催化剂，这些存在于生物细胞的催化剂在科学上叫做酶。虽然现在知道所有的生物都是靠酶催化的化学反应来生活的，但最早发现的酶，就是酵母菌的酶。酵母菌中最早发现的酶，是把糖变成酒精的一群酶，当时自然数酒化酶。由于这种酶的作用，使糖分解成酒精和二氧化碳，这就是利用酵母菌酿酒和发面包的原理。使面团产生许多空隙的就是二氧化碳。酵母细胞大小为2.5-10μm×4.5-21μm, 在加盖的玉米琼脂上不产生假菌丝或有不典型的假菌丝, 营养细胞可直接变为子囊, 每囊有1-4个圆形光面的子囊孢子, 在麦芽汁25℃培养3d, 细胞为圆形、卵形、椭圆形和香肠形。其菌落在麦芽汁琼脂上为乳白色, 有光泽, 平坦, 边缘整齐。菌体维生素、蛋白质含量高, 既可食用又可提取细胞色素C、核酸、麦角固醇、谷胱甘肽、凝血质、辅酶A、三磷酸腺苷等。该菌种能发酵葡萄糖、麦芽糖、半乳糖及蔗糖, 但不能发酵乳糖和蜜二糖, 不同化硝酸盐。 酵母菌的繁殖方式既可进行无性繁殖，如芽殖，又可进行有性生殖；酵母菌既可进行有氧呼吸，又可进行无氧呼吸，是一种兼性厌氧呼吸的真核微生物。单细胞真核生物酿酒酵母基因组为12,068kb，比单细胞的原核生物和古细菌大一个数量级。酿酒酵母基因组共有5887个ORF，这比原核生物和古细菌要多很多。酿酒酵母的基因密度为1个基因/2kb，密度小于原核生物流感嗜血杆菌和尿殖道支原体等。酿酒酵母是最小的真核基因组，裂殖酵母其次，其密度是1/2.3kb，简单多细胞生物线虫的基因密度为1/30kb。第二、酿酒酵母只有4%的编码基因有内含子，而裂殖酵母则有40%编码基因有内含子。 1、酵母的生长条件 1.1 无机盐

酒精发酵实验报告课件

生物工程专业综合（设计）性大实验 报告书 (酒精发酵实验) 学生姓名：吴丁柱 学号：3102106216 班级：生工2102 专业：生物工程 指导教师：魏胜华

生物工程专业设计（综合）实验 安徽工程大学实验报告书 学生姓名：吴丁柱学号：3102106216 专业班级：生工2102 实验类型：□验证■综合□设计□创新实验日期：2013.12.17 实验成绩： 一、当前酒精生产工艺的技术进展及现状 1.1现状 酒精是广泛应用在食品、化工、医药、国防和科研等各个领域的重要有机工业原料。 中国工业化生产酒精始于1900年俄国人在哈尔滨建的酒精厂，但发展非常缓慢，新中国成立时，我国酒精产量不到1万吨，专业性酒精厂生产规模大都是千吨小厂，基础十分薄弱。 五十多年来，特别是改革开放以来，随着国民经济的发展，我国酒精生产取得了巨大的发展。现有酒精生产企业450多家，产量在3万吨以上的共26家，其中30万吨以上的3家、10～20万吨7家、3～5万吨9家。2005年酒精产量达368.13万千升（按年销售收入500万元以上的企业计）（不包括自产自用的酒精），比2004年增长33.6%，居世界第三位。 2004年出口酒精74.44万吨比2003年增2.28倍，每吨酒精创汇418.73美元。进口3433吨，其中变性酒精1802.18吨，用汇686.03美元/吨。酒精生产实现了连续化、使用专用酶制作和商品酒精酵母，固定化酒精酵母，淀粉利用率达到90%以上，淀粉出酒率好的企业可以达到55~56%，（96°V/V）原料出酒率可到40~40.88%。随着食用酒精和工业酒精国家标准的4次制订、修订和实施，高纯度特级酒精企业的日益增多，标志着我国酒精生产技术和产品质量水平得到了很大的提高。但是，国外酒精生产技术自石油危机和美国大力发展汽油醇以来，有了更快的进步，特别是在节能、综合利用和自动化等方面，与我国拉开了差距。我国每吨酒精平均能耗酒精800公斤以上，世界水平为300~400公斤。随着我国燃料乙醇的发展，引进、消化、吸收、创新，我国酒精生产技术正在得到飞跃发展和提高，深信21世纪初期一定可以赶上世界先进水平。 1.2国内酒精蒸馏流程的进展 淀粉质原料→ 蒸煮→ 发酵→ 蒸馏→ 酒精 （糖质含糖蜜）（糖质原料无需蒸煮） 1.2.1两塔 （1）50年代初，天津、地方国营哈尔滨（顾乡屯）等酒精厂采用的两塔间断蒸馏流程。 （2）50年代初间歇流程生产能力低、消耗大，相继改为连续蒸馏。上海新亚酒精厂采用的两塔液相过塔流程。 （3）山东黄台酒精厂采用的两塔半液相过塔流程。 （4）1953年南阳酒精厂为降低煤耗采用了两塔气相过塔蒸馏流程生产95%（V）酒精。 （5）1956年部颁医药用酒精标准实施后，上海酒精厂、资中糖厂采用的两塔气相 1

酵母菌的分离筛选方法

酵母菌的分离筛选方法 酵母菌多数为腐生，一般生长在含糖较高，偏酸的环境中，在通气条 件下，液体培养比霉菌快。菌落与细菌相似，较大而厚，多数不透明， 菌落光滑湿润粘稠，乳白色，少数干皱，边缘整齐，呈红色或粉红色， 圆形椭圆卵形，液体培养基生长会生成沉淀或菌膜。 含高糖浓度（45%），分离蜂蜜酵母，球拟酵母属等嗜高渗透压的酵母。 1.培养基： 1.1葡萄糖50g/L 尿素1g/L （NH4）2SO41g/L KH2PO4 2.5g/L Na2HPO40.5g/L MgSO41g/L FeSO4 0.1g/L 酵母膏 0.5g/L 孟加 拉红 0.03g/L PH4.5-5.0 （富集用） ★1.2乳酸-马铃薯-葡萄糖培养基：马铃薯200g/L 葡萄糖（霉菌用 蔗糖）20g/L 乳酸5ml马铃薯去皮切片200g，加水煮沸30min，纱 布过滤，补足蒸馏水1L，PH自然。（去掉乳酸可用于酵母菌和霉菌培 养用）（富集用） ★1.3麦芽汁培养基：1：4水60-65℃水浴3-4小时，4-6层纱布过 滤，可加一个蛋清加水20mL调均生泡沫，倒入糖化液中，煮沸过滤， 10-15波林，氯霉素0.1g/L PH6.0-6.4 121℃ 20min （分离保存用）灭菌后加入300u/ml硫酸链霉素（集菌用） ★1.4虎红（孟加拉红）培养基：蛋白胨5.0g/L 葡萄糖10g/L KH2PO41.0g/L MgSO40.5g/L 孟加拉红0.033g/L 氯霉素0.1g/L 琼 脂15g/L PH自然

（分离纯化用） ★1.5 豆芽汁培养基：黄豆芽100g/L 葡萄糖50g/L PH自然。100g 黄豆芽，加水煮沸30min，纱布过滤，补足蒸馏水1L 1.6察氏培养基：主要培养霉菌观察形态用 蔗糖30g/L 硝酸钠3g/L 磷酸氢二钾1g/L 氯化钾0.5g/L 硫酸镁0.5g/L 硫酸亚铁0.01g/L 琼脂15-20g/L 121℃ 20min PH自然一般分离黄酒酵母酒精酵母使用曲汁培养基，啤酒酵母用酒花麦汁培养基，葡萄酒酵母用葡萄汁培养基。 2.集菌：研究酵母菌生态和某种基物或样品中的酵母菌区系，一般不进行集菌，以免改变其中不同种类数量间的对比，将样品制成菌悬液按常规法分离。若从样品中分离特定种类时先集菌。集菌发酵力强菌株，加酸性含糖的培养基，酸性豆汁，必要时注入高浓度的酒精（13-17%），霉菌在液体中形成菌丝体，酵母不形成菌丝，25-28℃2-3d，遇到菌丝体用接种环挑去烧掉，去掉上清液，取沉淀酵母一至两环移植另一液体培养基中，集菌连续两至三次才能完成，要配合镜检。 实例：将待分离的样品10g（ml）放入90ml无菌水或生理盐水/150ml 三角瓶（玻璃珠），摇床振荡20-30min，取上清液接种于酸性培养液（乳酸-马铃薯-葡萄糖培养基酸性麦芽汁或酸性豆芽汁）25-28℃2-3d，培养过程中若出现菌丝体跳出烧掉，集菌连续两至三次，培养液变成混浊，产生菌膜和沉淀物。镜检：美兰染液染色，活菌可还原美兰染液，菌体无色。

酒精生产工艺

新疆农业大学 《酶与酶工程》 专题讨论综述 题目: 酒精生产工艺 姓名: 学院: 班级: 学号: 成绩：

2013 年4月 酒精生产工艺 摘要我国酒精生产以发酵法为主，大多数工厂是采用薯干和玉米为原料。为了进一步提高酒精生产水平，各国的工程技术人员都在研究新型的酒精发酵方法，如目前已在工业生产上应用的固定化细胞酒精发酵法，耐高温活性干酵母发酵法等新的发酵工艺。在设备方面也有不少新型生物反应器出现，如单罐连续搅拌反应器、酵母回用连续搅拌反应器、塔式反应器、细胞固定化反应器等。酒精蒸馏工艺也在不断改进和完善。进一步改造了蒸馏塔板结构，并研究新的蒸馏工艺。目前研究较多的蒸馏工艺有高效节能的差压式蒸馏，膜分离酒精等。随着乙醇传感器和微机控制系统的应用，酒精工业的生产水平将有新的突破。 关键词：霉菌，废糖蜜，糊化，醪液。 原料及其处理 1.淀粉质原料的选择 （1）原料资源要丰富，容易收集。酒精生产需要大量原料，要有一定的库存量。（2）原料要容易贮藏。水分高的原料不易贮藏，含水量低于13%为宜。 （3）原料含杂质要少，并在生产中不产生有害、有毒物质。 （4）原料价格低廉，可降低产品成本。尽量采用野生植物原料。 2.糖质原料的选择 糖质原料主要指糖蜜。根据糖蜜的含糖糖量分为三个等级：一级糖蜜：含全糖(总糖）高于50%，不溶物和胶体物质等杂质含量较少；二级糖蜜：含全糖45%~50%;三级糖蜜：含全糖低于45%。所有等级糖蜜浓度均不得低于80`~900 ,相对密度为1.41~1.50（20℃）。 原料的种类 用于生产酒精的淀粉原料主要有：薯类；粮谷类；糖质原料；野生植物；农产品加工副产品；纤维质原料。 常用原料的化学组成 1.糖类葡萄糖、果糖、麦芽糖、蔗糖等，这些物质都可以发酵生成酒精，同时也是霉菌和酵母的营养及能源，原料中含这些物质越多，生成酒精也就越多，所以它和产量有着密切的关系。 2.蛋白质在酒精生产中，原料所含的蛋白质的主要作用是经蛋白酶降解后作为生产菌种所必需的氮源，而参与菌体细胞的合成，因此其含量以满足菌体正常生长繁殖为宜。 3.无机盐及生长素其功能是作为酶活性基的组成部分或调解酶的活性。生产原料中无机盐和生长素的含量均足够满足微生物的生长和代谢。 4.脂肪脂肪对发酵有影响，如玉米、高粱糠、米糠等油脂较多，则生酸较快。一些酒精厂如采用玉米作为原料，总是先把玉米胚芽除去。 5.单宁单宁具有涩味和收敛性，遇铁呈蓝黑色，有凝固蛋白质的作用。而糖

小议高产酒精酵母菌的紫外线诱变选育

聂世现，王钰，黄文静，季必霞 0 引言 石油是世界经济与发展的基本能源之一，其储备有限。20世纪70年代世界范围发生石油危机，使利用可再生的资源（如高淀粉作物）发酵生产酒精作为生物能源的研究成为人们关注的焦点。生物能源与石油相比具有可再生、污染小、减少温室效应等优点，能部分或全部代替汽油。目前，燃料酒精的生产占世界酒精总产量的66%，并且还有进一步增加的趋势。发酵法是酒精生产的重要方法，发酵法生产酒精的关键是酵母菌株，酒精酵母的优劣不仅直接影响发酵率的高低，而且会影响酒精的产量和质量。我国酒精生产行业中普遍存在亟待解决的问题是发酵强度低,生产成本高,能耗大。因此，高产酒精酵母的选育是提高酒精产率，节约生产能源的关键。 为了开展非粮作物甘薯等转化酒精的研究，本论文探讨了酵母菌A4原生质体制备和再生的适宜条件，并用紫外线作诱变剂，对酵母菌原生质体进行诱变处理，旨在筛选出发酵力强、酒精产量高的优良酵母菌株，为下一步以高产淀粉品种甘薯为原材料生产酒精的研究工作奠定基础。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 菌种 酵母菌（A4）为本实验室保藏菌种。 1.1.2 培养基 麦芽汁液体培养基：将麦芽汁（购于合肥市华润雪花啤酒厂）糖度调至12°Brix，过滤后121℃灭菌20min。 YPD培养基(g/L)： 液体培养基：酵母提取物10，蛋白胨20，葡萄糖20。 固体培养基：在YPD液体培养基中加入琼脂20，NaOH0.1。 原生质体再生培养基：在YPD固体培养基中分别添加KCl至0.7mol/L，山梨醇至0.8mol/L，甘露醇至0.8mol/L，17%的蔗糖。 以上培养基于115℃灭菌20min。 TTC上层培养基(g/L)：TTC（三苯基四氮唑盐酸盐）0.5，葡萄糖5，琼脂15。 TTC下层培养基(g/L)：葡萄糖10，蛋白胨2，酵母膏1.5，K2HPO41，MgSO4·7H2O4，琼脂20，pH5.5。 1.1.3 试剂 缓冲液：pH6.8的柠檬酸-磷酸缓冲液。 预处理剂：0.1%β-巯基乙醇，其中含0.1mol/L的EDTA-Na2。 稳渗剂：KC1高渗缓冲液：缓冲液中添加KC1至0.7mol/L；山梨醇高渗缓冲液：缓冲液中添加山梨醇至0.8mol/L；甘露醇高渗缓冲液：缓冲液中添加甘露醇至0.8mol/L；蔗糖高渗缓冲液：缓冲液中加入17%的蔗糖。 酶液：分别将1%，1.5%，2%，2.5%的蜗牛酶和0.4%蜗牛酶+0.4%纤维素酶溶于高渗缓冲液中，微孔滤膜过滤除菌，制备成不同浓度的酶液。酶购于上海生工。 1.2 方法 1.2.1 出发菌株的原生质体制备与再生 1.2.1.1 出发菌株生长曲线的测定 挑取斜面菌株1～2环接种于50mLYPD液体培养基中，28℃，200r/min摇床培养24h后分别以1:100的量接种于装有10mLYPD液体培养基的大试管中，28℃，200r/min摇床培养，每隔2h取出一支试管，测定其OD600值，绘制其生长曲线。 1.2.1.2 出发菌株原生质体制备与再生 将活化好的菌种接种于盛有50mLYPD液体培养基的锥形瓶中，28℃，200r/min摇床培养，当其进入对数生长期时，取5mL菌液3500r/min离心5min，用磷酸-柠檬酸缓冲液洗2次，无菌加入0.1%β-巯基乙醇，28℃

各种葡萄酒酿造工艺过程概述方案

各种葡萄酒酿造工艺过程 概述

各种葡萄酒酿造工艺过程概述2、

白葡萄酒的酿造过程 1，采收： 白葡萄比较容易被氧化，采收时必需尽量小心保持果粒完整，以免影响品质。 2-1，破皮： 采收后的葡萄必须尽快进行榨汁，白葡萄通常会先进行破皮程序，有时也会去梗。红葡萄就直接榨汁。 2-2，发酵前低温浸皮制造法 葡萄皮中富含香味分子，传统的白酒酿制法直接榨汁，尽量避免释出皮中的物质，大部份存于皮中的香味分子均无法溶入酒中。近来发现发酵前进行短暂的浸皮过程可增进葡萄品种原有的新鲜果香，同时仍可使白酒的口感更浓郁圆润。但为了避免释出太多单宁等多酚类物质，浸皮的过程必须于发酵前低温下短暂进行，同时破皮的程度也要适中。 3，榨汁： 为了不会将葡萄皮、梗和籽中的单宁和油脂榨出，压榨时压力必需温和平均，而且要适当翻动葡萄渣。 4，澄清：

传统沉淀法，约需壹天左右的时间；离心分离器，比较方便，但动力太强，常将酵母菌壹且除去而需添加人工酵母。 5，橡木桶发酵： 传统白酒发酵是于橡木桶中进行，由于容量小散热快，虽无先进的冷却设备，控温效果却相当好。此外，于发酵过程中橡木桶的木香、香草香等气味会溶入葡萄酒中使酒香更丰富。壹般清淡的白酒且不太适合此种方法，而且成本相当高。 6，酒槽发酵： 白酒发酵必须缓慢以保留葡萄原有的香味，而且可使发酵后的香味更加细腻。为了让发酵缓慢进行，温度必须控制于18℃-20℃之间。 7，橡木桶培养： 橡木桶中发酵后死亡的酵母会沉淀于桶底，酿酒工人会定时搅拌让死酵母和酒混合，此法可使酒变得更圆润。由于桶壁会渗入微量的空气，所以经过桶中培养的白酒颜色较为金黄，香味更趋成熟。 8，酒槽培养： 白葡萄酒发酵完之后仍需经过乳酸发酵等程序，使酒变得更稳定。由于白酒比较脆弱，培养的过程必须于密封的酒槽中进行乳酸发酵之后会减弱白酒的新鲜酒香以及酸味，壹些以新鲜果香和高酸度为特性的白葡萄酒会特意以加二氧化硫或低温处理的方式抑止乳酸发酵。

高耐性酿酒酵母的杂交育种

２０ 酿酒科技２００６年第１０期（总第１４８期）?ｍＱｕＯＲ—Ｍ甜烈Ｇｓｃ皿ＮｃＥ＆．Ｉ．Ｅｃ础ｏＬｏＧＹ２００６Ｎｏ．１０ｃ］ｒ０１．１４８） 高耐性酿酒酵母的杂交育种 吴帅，陈叶福，沈楠，肖冬光 （天津科技大学生物工程学院，天津３００２２２） 摘要：利用不同特性的酿酒酵母ＡＹ一１５，Ｍ１进行生孢培养和孢子分离试验，得到１８５株产 酒、１５３株耐渗单倍体。其接合型，ａ型约占１／４，仅型占约１／２，其余为不确定株。经筛选试马骺得到 １３株产酒性能良好的单倍体和１９株耐渗性能良好的单倍体。利用酒精发酵试验进行复筛，得到 两株性能最优良的单倍体，作为杂交试验的亲本。杂交试验后，经耐渗、耐酒精杜氏管试验和发酵 性能测定，得到一株能够在高渗环境中仍然保持较高产酒精能力的酿酒酵母，在含盐５％的培养 基中发酵产酒精能力分别比ＡＹ一１５，Ｍ１提高１９．６％和１５．４％。 关键词：微生物；酿酒酵母；杂交；高耐性；酒精产率 中图分类号：ＴＳ２６１．１；ＴＳ２６２．２文献标识码：Ａ文章编号：１００１—９２８６（２００６）１０—００２０一０３ ＣｏｎｓｔｒＩｌｃｔｉｏｎｏｆ＆ｃｅ，Ｐｌ，豇ｌａＰ、）ｌ，ｉｔｈＧｏｏｄｏｓｍｏ—ｔｏｌｅｒａｎｃｅ 舳ｄＩＩｉｇｈＥｔｈ觚ｏｌ—ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎＣｈａｍｃｔｅｒｉｓｔｉｃ ＷＵＳｈｕａｉ，Ｃ腿ＮＹｅ一如，Ｓ髓ＮＮ蛐趾ｄⅫ～０Ｄｏｎ争ｇＩｌ龃ｇ （ｃｏｕｅｇｃｏｆＢｉ咖ｇｉｍｅ血吕Ｔｉ砌ｉｎｕｎｉｖｅｒｓｉ哆ｏｆｓｃｉｅｎｃｅ衄ｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｔｉ删ｉｎ３００２２２，ｃｈｉｌｌａ） Ａｂｓｔｍｃｔ：１８５ｌｌｉｇｈｅ也孤ｏｌ－ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｈ印ｌｏｉｄｓａｎｄ１５３ｇｏｏｄｏｓｍｏ—ｔｏｌｅｒａｎｔｈ印ｌｏｉｄｓｗｅｒｅｏｂｔａｉｌｌｅｄｔｈｒｏｕ曲ｓｐｏｒｅｓｅｐａｒａ－ｔｉｏｎｔｅｓｔａｎｄｓｐｏｒｅｃｕｌｔⅢｅｏｆ＆ｃｅｒｅ移蠡ｉａｅＡＹ一１５飙ｄＭ１ｏｆ（１ｉｆｒｅｒｅｎｔｐｒｏｐｅｎｉｅｓ．ＡｍｏｎｇａＵｔｈｅｍａｔ血ｇ勺伊ｅｓ，ａ帅ｅａｃ—ｃｏｌＩｎｔｅｄｆｏｒａｂｏｕｔ１／４，仅ｔｙｐｅａｃｃｏｕｎｔｅｄｆｏｒａｂｏｕｔ１／２，ａｎｄｏ也ｅｒｓｗｅｒｅｕｎｃｅｎａｉｌｌｓ自隐ｉｎｓ．Ｂｙｍｅ嬲ｕｒｉＩｌｇ也ｅ ｅｎｄｕ舢ｃｅｏｆｙｅａＳｔｈａｐｌｏｉｄｓ，１３ｈｉｇｈｅｔｈ趾ｏｌ?ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｈ印ｌｏｉｄｓａｎｄ１９ｇｏｏｄｏｓｍｏ—ｔｏｌｅｒ４ｎｔｈ印ｌｏｉｄｓｗｅｒｅ ｓｅｌｅｃｔｅｄ．Ａｆｔｅｒ血ｅ侥ｍｅｎｔａ—ｔｉｏｎ，觚ｏｈａｐｌｏｉｄｓｗｅｒｅｓｅｌｅｃｔｅｄ器ｍｅｐａｒｅｎｔｓｆｏｒｔｈｅｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ．２３６ｄｉｐｌｏｉｄｓｔｒａｉ璐、Ⅳｅｒｅｃｏｎｓ仃ｕｃｔｅｄｂｙｃｒｏｓｓｉｎｇ也ｅ ｐａｒｅｎｔｓ．ＡｔｌａＳｔ，ｏⅡｅｓ缸ａｉｌｌｗ弱ｏｂｔａｉｎｅｄ也ｒｏｕｇｈｔｈｅｍｅａＳｕｒｅｍｅｎｔｏｆｍｅｉｒｏｓｍｏ—ｔ０１ｅ砌ｃｅｃａｐａｃｉｔ），ａｎｄｆｅｒｍｅｎｔｉｌｌｇ ｐｏｗｅｒ 锄ｄａｌｃｏｈｏｌ?ｒｅｓｉｓｔａｎｔｔｅｓｔ，ｗｈｉｃｈｃｏｕｌｄｍａｉｎｔａｉｎｈｉ曲ｅｔｌｌ蛆ｏｌ－ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｃａｐａｃ蚵ｕｎｄｅｒｈｙｐｅｒｏｓｍｏｔｉｃｅ妇ｎｍｅｎｔｓ．Ｉｔｓｅｔｌｌａｎｏｌ－ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｃａｐａｃｉｔ）ｒｉｎｃｌｌ】ｔＩｌｒｅｍｅｄｉｕｍｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ１５％ｓａｈｉｎｃｒｅ弱ｅｄｂｙ１９．６％ｔ１１ａｎＡＹ一１５ａｎｄｂｙ１５．４％也ａｎＭｌｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ． ＫｅｙｗｏｒｄＳ：ｍｉｃｒｏｂｅ；ＳⅡｃｃ，Ⅻ．ｏ，ｎ弘ｅｓｃｅｒｅ秽括云∞；ｈｙｂｒｉｍｚｅ；ｏｓｍｏｔｏｌｅｍｃｅ；ｅｔｌｌ锄ｏｌｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ 随着酒精发酵工业的发展，浓醪发酵技术获得普遍的成功和不断得到认可。浓醪发酵可使企业获得最大产率，提高企业生产能力，同时还可以相应地降低生产成本。目前，浓醪发酵的研究主要集中在高产菌株的选育和发酵工艺两个方面。前者的目的主要是提高菌株的耐性，包括耐渗性和耐酒精性能等。对于淀粉质原料。通常采用边糖化边发酵工艺，如废液不回用则不存在高渗问题。但为了节约生产用水和减少酒精废液的处理量，大多数工厂都采用部分废液回用工艺。而酒精废糟中含有大量对酵母菌的生长和发酵有抑制作用的物质．如无机盐等，随着回用次数的增加，发酵液的渗透压会因为这些物质的多次积累有所增高【”，也会影响酵母的生长和繁殖，这就需要菌株具有较好的耐渗性。另一方面，由于酒精浓醪发酵得到的酒精浓度较高，酵母菌的发酵会受到影响，以往的研究显示，乙醇浓度达８％时对酵母细胞有害，乙醇浓度达１１％左右时，酵母发酵完全受到抑制圆。为了使酵母能够在浓醪发酵中更好地利用可发酵性糖．有必要同时增强其耐渗性和耐酒精性能。 本试验采用杂交育种手段对酵母菌进行改造。１９５０年酵母菌接合系统的遗传控制原理已经得到详细阐述。到目前为止，杂交试验已经取得了不少成果，例如，日本的小田等人用酒精酵母和卡尔斯伯杂交获得的杂交株， 基金项目：天津市重点科技攻关资助项目（０６ＹＦＧｚＳＨ００５００）。 收稿日期：２００６—０７—１８ 作者简介：吴帅（１９７９一），女，山东人，博士研究生，研究方向：现代酿造技术。通讯作者：肖冬光，天津科技大学教授，博导。ｘｄｇ＠ｔｕ８ｔ．ｅｄｕ．ｃｎ．。 　万方数据 万方数据

各种葡萄酒酿造工艺过程概述(doc 9页)

各种葡萄酒酿造工艺过程概述(doc 9页)

各种葡萄酒酿造工艺过程概述 发酵前的准备 制造葡萄酒似乎非常容易，不需人类的操作，只要过熟的葡萄掉落在地上，内含于葡萄的酵母就能将葡萄变成葡萄酒。但是经过数千年经验的累积，现今葡萄酒的种类不仅繁多，且酿造过程复杂，有各种不同的繁琐细节。 筛选： 收采后的葡萄有时挟带葡萄叶及未熟或腐烂的葡萄，特别是不好的年份，比较认真的酒厂会在酿造前做筛选。凡是出产极品酒的名庄，更会用人工一颗一颗地精心挑选最好的葡萄。 去梗： 葡萄梗中的单宁收敛性较强，不完全成熟时常带刺鼻草味，必须全部或部份去除。 破皮： 由于葡萄皮含有单宁、红色素及香味物质等重要成份，所以在发酵之前，特别是红葡萄酒，必须破皮挤出葡萄果肉，让葡萄汁和葡萄

皮接触，以便让这些物质溶解到酒中。破皮的程度必需适中，以避免释出葡萄梗和葡萄籽中的油脂和劣质单宁，影响葡萄酒的品质。 榨汁： 所有的白葡萄酒都在发酵前即进行榨汁（红酒的榨汁则在发酵后），有时不需要经过破皮去梗的过程而直接压榨。榨汁的过程必须特别注意压力不能太大，以避免释出苦味和葡萄梗味。传统采用垂直式的压榨机。气囊式压榨机压力和缓，效果更好。 去泥沙： 压榨后的白葡萄汁通常还混杂有葡萄碎屑、泥沙等异物容易引发白酒的变质，发酵前需用沉淀的方式去除，由于葡萄汁中的酵母随时会开始酒精发酵，所以沉淀的过程需在低温下进行。红酒因浸皮与发酵同时进行，并不需要这个程序。 发酵前低温浸皮； 这个程序是新近发明还未被普遍采用。其功能在增进白葡萄酒的水果香并使味道较浓郁，已有出产红酒的酒厂开始采用这种方法酿造。此法需在发酵前低温进行。 酒精发酵