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醋蛋中ACE抑制肽的酶法制备、分离纯化及其活性保护

常见蛋白酶抑制剂

当前位置：生物帮 > 实验技巧 > 生物化学技术 > 正文蛋白酶及蛋白酶抑制剂大全日期：2012-06-13 来源：互联网标签：相关专题：解析蛋白酶活性测定聚焦蛋白酶研究新进展摘要: 破碎细胞提取蛋白质的同时可释放出蛋白酶，这些蛋白酶需要迅速的被抑制以保持蛋白质不被降解。在蛋白质提取过程中，需要加入蛋白酶抑制剂以防止蛋白水解。以下列举了5种常用的蛋白酶抑制剂和他们各自的作用特点，因为各种蛋白酶对不同蛋白质的敏感性各不相同，因此需要调整各种蛋白酶的浓度恩必美生物新一轮2-5折生物试剂大促销！ Ibidi细胞灌流培养系统-模拟血管血液流动状态下的细胞培养系统广州赛诚生物基因表达调控专题蛋白酶抑制剂破碎细胞提取蛋白质的同时可释放出蛋白酶，这些蛋白酶需要迅速的被抑制以保持蛋白质不被降解。在蛋白质提取过程中，需要加入蛋白酶抑制剂以防止蛋白水解。以下列举了5种常用的蛋白酶抑制剂和他们各自的作用特点，因为各种蛋白酶对不同蛋白质的敏感性各不相同，因此需要调整各种蛋白酶的浓度。由于蛋白酶抑制剂在液体中的溶解度极低，尤其应注意在缓冲液中加人蛋白酶抑制剂时应充分混匀以减少蛋白酶抑制剂的沉淀。在宝灵曼公司的目录上可查到更完整的蛋白酶和蛋白酶抑制剂表。常用抑制剂 PMSF 1)抑制丝氨酸蛋白酶(如胰凝乳蛋白酶，胰蛋白酶，凝血酶)和巯基蛋白酶(如木瓜蛋白酶); 2)10mg/ml溶于异丙醇中; 3)在室温下可保存一年; 4)工作浓度:17~174ug/ml(0.1~1.0mmol/L); 5)在水液体溶液中不稳定，必须在每一分离和纯化步骤中加入新鲜的PMSF。 EDTA 1)抑制金属蛋白水解酶; 2)0.5mol/L水溶液，pH8~9;

酶法制备D-氨基酸

酶法制备D-氨基酸进展姓名施绘程学号 3100104825 课程名称生物有机化学指导老师徐刚专业生物工程

酶法制备D-氨基酸进展摘要：酶法制备D-氨基酸具有其他方法所不可比拟的优势。目前应用最广泛的是N-乙酰-氨基酰化酶和D-海因酶手性拆分途径。氨基酰化酶可以用于生产多种不同氨基酸，海因酶途径副产物可以自发消旋化。对于这两种途径，目前的研究主要集中在通过改变反应条件提高酶的活性和选择性，以及通过固定化技术提高酶的生产率。 1.概述在自然界中已经发现了300种氨基酸中，虽然其中约有90%为L-型氨基酸，只有约10%为D-型氨基酸或其它氨基酸，而且D-型氨基酸不能构成重要的生物分子——蛋白质，但是近年来，随着科学研究的深入，人们发现许多植物、微生物和高等植物中都有D-氨基酸的存在，D-型氨基酸虽然不是构成蛋白质的基本结构单元，但D-氨基酸同样具有非常重要的作用，D-型氨基酸所具有的特殊性质和功效是L-氨基酸不可代替的[1，2]。 D-型氨基酸在食品行业中主要用作甜味剂。D-苯丙氨酸、D-天冬氨酸和D-丙氨酸都是合成甜味剂的重要原料，其中D-丙氨酸本身就是一种强甜味剂。由于D-氨基酸及二肽在人体内几乎不发生代谢作用，而且没有毒性，可以作为非营养性甜味剂，适于肥胖症、高血压以及糖尿病患者食用[3]。在农业上，D-缬氨酸可用于合成新型高效农药拟除虫菊酯和氯氟戊菊酯，由D-缬氨酸与相应的醇经酯化而制得缬氨酸杀虫菊酯是一类广谱的很有发展前景的杀虫杀螨剂，能有效她防治棉花、果树、蔬菜等作物的包括鳞翅目和双翅目等在内的主要害虫。D-色氨酸可以作为6-苯基腺嘌呤的合成前体，6-苯基腺嘌呤能够很好的刺激植物细胞和组织的生长，促进花芽的分化，提高作物的产量[2]。多种D-氨基酸是合成成抗生素、抗糖尿病、抗癌、镇定、抗心血管疾病等多种药物的重要中间体。图1列出了目前医药市场上部分含有D-型氨基酸的药物及其临床应用。[1] 另外，D-氨基酸还可以应用于化妆品添加剂、染发剂等日用化学品中。 2.D-氨基酸制备方法化学法生产D-氨基酸反应条件相对比较剧烈、污染大，产率低并且费用高，因此不适合大规模生产；由于D-型氨基酸属于非天然氨基酸，因此用发酵法制备D-氨基酸比较困难，得到的氨基酸光学纯度和产率都比较低。而于酶法具有拆分效率高、立体选择性高、反应条件温和、专一性强、操作简单和有利于环保等优点，从而使得它在工业生产中具有很好的应用前景。

在有机介质中酶法合成小肽的研究进展

在有机介质中酶法合成小肽的研究进展张学忠① (吉林大学酶工程实验室　长春130023) 提要:就利用蛋白酶在有机介质中合成小肽研究所涉及的几个关键问题以及方法学上的研究进展情况作了讨论和评述,目的在于探讨如何构建一个理想的肽键合成体系。一、引言近20年来,随着非水酶学研究的深入与发展,酶在有机合成中的应用已日趋成熟,酶促合成法较化学合成法显示了许多优越性。在有机介质中酶促肽键的合成,其中包括较大肽段间的缩合,尤其是合成只含几个氨基酸的小肽片段,较传统的化学合成法占有明显的优势。它的主要优点表现在反应条件温和,立体专一性强,不用侧链保护基和几无副反应等。最近几年,利用各种来源的蛋白水解酶,在非水介质中合成了各种功能短肽或其前体,其中包括一些具有营养功能的二肽和三肽,低热量高甜度的甜味剂二肽以及具有镇静作用的脑啡肽五肽等。利用酶反应器,连续合成某些功能短肽已接近生产规模[1]。目前,国际上,酶法合成疏水二肽的最高收率已接近100%。然而,在有些情况下,一些天然的或人工设计的具有特定生理功能的短肽含有亲水性的氨基酸残基或D2型氨基酸残基。由于亲水氨基酸在疏水性有机溶剂中几乎不溶,以及大多数蛋白酶仅能利用L2型氨基酸,因而用酶法合成含亲水性氨基酸或D2型氨基酸残基的短肽,在方法学上需要有所突破。近年来,国际上都在致力于方法学的改进,本文将就利用蛋白水解酶在有机介质中合成短肽的研究所涉及的几个关键性问题进行讨论,目的在于说明如何构建一个理想的反应体系,从而提高肽产物的收率。二、方法原理 K libanov[2]对在有机介质中酶促有机合成的原理进行过详细的讨论。对于肽合成来说,肽键的生成反应可以用下式表示: A+B K C+D(1) (1)式中C代表产物,即肽,D代表水。在反应达到平衡时,有 [C]=K[A][B] [D](2) (2)式中K为平衡常数。由(2)式可知,通过从平衡中移去产物D,可以使平衡向生成产物的方向移动。另外,通过改变有效平衡常数,也可以使反应向生成产物C的方向移动。假定(1)式在水中反应的平衡常数为Kw,那么,在水2有机溶剂双相体系中,有效平衡常数K与Kw的关系有下面形式[3]: K=Kw (1+Α?P c)(1+Α?P d) (1+Α?P a)(1+Α?P b) (3) (3)式中Α为有机相对水相的体积比,P a,P b, P c和P d为相应组分在有机相和水相间的分配系数。假如A和B在有机相中的溶解度小,例如,P a≈P b≈100,又假定Α≈100,那么,由(3)式可知K>2500Kw。因此,在有机双相体系中的平衡常数要比在水中的平衡常数大三个数量级。在有蛋白酶存在时,生成肽键的反应可以加速达到平衡。这是在有机介质中酶促合成肽键的理论依据。利用蛋白水解酶,在有机介质中合成小肽的一个关键问题是在实践中如何提高肽产物的收率。目前,比较有效的方法 — 5 5 — ①男,1942年生,大学,教授;研究方向:极端环境酶催化;联系人。

关于基质金属蛋白酶

相关资料关于基质金属蛋白酶【关键词】肠肿瘤；基质金属蛋白酶；肿瘤坏死因子受体【摘要】目的：研究基质金属蛋白酶9（MMP9）对大肠癌细胞肿瘤坏死因子受体1（TNFR1）表达的影响以及促进大肠癌侵袭和转移的可能途径. 方法：通过免疫荧光法研究TNFR1在大肠癌细胞SW1116中的表达；用MMP9干预培养的大肠癌SW1116细胞，用流式细胞术检测MMP9不同剂量和不同作用时间时TNFR1表达变化. 结果：①SW1116细胞表达TNFR1; ②MMP9对SW1116细胞表面TNFR1表达有下调作用，但有剂量和时间依赖性. 结论： MMP9下调大肠癌细胞表面TNFR1的表达，可能与大肠癌侵袭转移密切相关. 【关键词】肠肿瘤；基质金属蛋白酶；肿瘤坏死因子受体 0引言肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor, TNF)是一种主要由单核巨噬细胞产生的多肽细胞因子，因其在内毒素处理后具有杀伤肿瘤细胞的作用而被命名为肿瘤坏死因子. TNF的生物学活性是通过存在于细胞表面的膜受体,即肿瘤坏死因子受体1(tumor necrosis factor receptor 1, TNFR1)和肿瘤坏死因子受体2(tumor necrosis factor receptor 2, TNFR2)介导. 体内外实验已证实肿瘤坏死因子受体（tumor necrosis factor receptor, TNFR）介导肿瘤坏死因子的肿瘤杀伤作用，体内有多种免疫活性因子（干扰素、白介素等）即通过激活上调TNFR以达到清除肿瘤的目的［1］,因而诱导并稳定肿瘤细胞膜TNFR对机体抗肿瘤起非常重要的作用. 其他研究还证实大肠癌组织中存在基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMPs）高表达或活性增强现象. 某些活

酶的分离纯化方法介绍

酶的分离纯化方法介绍酶的分离纯化一般包括三个基本步骤：即抽提、纯化、结晶或制剂。首先将所需的酶从原料中引入溶液，此时不可避免地夹带着一些杂质，然后再将此酶从溶液中选择性地分离出来，或者从此溶液中选择性地除去杂质，然后制成纯化的酶。关键词：酶抽提纯化结晶制剂细胞破碎cell disruption 盐析亲和沉淀有机溶剂沉淀生物细胞产生的酶有两类：一类由细胞内产生后分泌到细胞外进行作用的酶，称为细胞外酶。这类酶大都是水解酶，如酶法生产葡萄糖所用的两种淀粉酶，就是由枯草杆菌和根酶发酵过程中分泌的。这类酶一般含量较高，容易得到；另一类酶在细胞内产生后并不分泌到细胞外，而在细胞内起催化作用，称为细胞内酶，如柠檬酸、肌苷酸、味精的发酵生产所进行的一系列化学反应，就是在多种酶催化下在细胞内进行的，在类酶在细胞内往往与细胞结构结合，有一定的分布区域，催化的反应具有一定的顺序性，使许多反应能有条不紊地进行。酶的来源多为生物细胞。生物细胞内产生的总的酶量虽然是很高的，但每一种酶的含量却很低，如胰脏中期消化作用的水解酶种类很多，但各种酶的含量却差别很大。因此，在提取某一种酶时，首先应当根据需要，选择含此酶最丰富的材料，如胰脏是提取胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、淀粉酶和脂酶的好材料。由于从动物内脏或植物果实中提取酶制剂受到原料的限制，如不能综合利用，成本又很大。目前工业上大多采用培养微生物的方法来获得大量的酶制剂。从微生物中来生产酶制剂的优点有很多，既不受气候地理条件限制，而且动植物体内酶大都可以在微生物中找到，微生物繁殖快，产酶量又丰富，还可以通过选育菌种来提高产量，用廉价原料可以大量生产。由于在生物组织中，除了我们所需要的某一种酶之外，往往还有许多其它酶和一般蛋白质以及其他杂质，因此为制取某酶制剂时，必须经过分纯化的手续。酶是具有催化活性的蛋白质，蛋白质很容易变性，所以在酶的提纯过程中应避免用强酸强碱，保持在较低的温度下操作。在提纯的过程中通过测定酶的催化活性可以比较容易跟踪酶在分离提纯过程中的去向。酶的催化活性又可以作为选择分离纯化方法和操作条件的指标，在整个酶的分离纯化过程中的每一步骤，始终要测定酶的总活力和比活力，这样才能知道经过某一步骤回收到多少酶，纯度提高了多少，从而决定着一步骤的取舍。酶的分离纯化一般包括三个基本步骤：即抽提、纯化、结晶或制剂。首先将所需的酶从原料中引入溶液，此时不可避免地夹带着一些杂质，然后再将此酶从溶液中选择性地分离出来，或者从此溶液中选择性地除去杂质，然后制成纯化的酶制剂。下面就酶的分离纯化的常用方法作一综合介绍：一、预处理及固液分离技术 1.细胞破碎（cell disruption）高压均质器法：此法可用于破碎酵母菌、大肠菌、假单胞菌、杆菌甚至黑曲霉菌。将细胞悬浮液在高压下通入一个孔径可调的排放孔中，菌体从高压环境转到低压环境，细胞就容易破碎。菌悬液一次通过均质器的细胞破碎率在12%-67%。细胞破碎率与细胞的种类有关。

组织金属蛋白酶及其抑制因子与肝纤维化

组织金属蛋白酶及其抑制因子与肝纤维化 (作者：__________ 单位：___________ 邮编：___________ ) 【摘要】基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase ，MMP) 是体内重要的水解酶之一，几乎能降解细胞外基质(extracellular matrix ，ECM的所有成分；基质金属蛋白酶组织抑制因子(tissue in hibitor of metalloprote in asas ，TIMPs )是MMP 啲内源性抑制系统。近年来发现，MMPs/TIMPs调节失衡与肝纤维化的关系密切，可从多方面影响肝纤维化的形成。通过干扰MMP与TIMPs基因的表达，研究肝纤维化的发病机制和药物治疗是有希望的途径。【关键词】MMPs ;TIMPs;肝纤维化肝纤维化是许多慢性肝病的共同病理过程，是细胞外基质(ECM)的合成与降解失衡，导致在细胞间质的过度沉积［1-4 ］，肝组织结构改建。许多细胞因子参与了这一过程，但是MMP是最重要的一种［5］。MMPs 几乎能降解细胞外基质(ECM)的所有成分，而其天然抑制剂-基质金属蛋白酶抑制剂(TIMPs)能与MMPs成员结合成复合物抑制其活性⑹。二者的调节异常将引起ECM合成或降解的失衡，与各种器官纤维化疾病密切相关。研究发现，通过调节MMP与TIMPs基因的表达

来治疗肝纤维化是肝纤维化治疗的新途径。本文就MMPs/TIMPs与肝纤维化的关系及治疗前景作一综述。 1 MMPs分类、功能、结构及活性的调控 MMPs是一组基质金属蛋白酶。M MPs在肝内主要由肝星状细胞（HSC）和Kupffer细胞表达分泌，参与细胞外基质降解的一类锌-钙离子依赖的内源性蛋白水解酶家族，因其需要Ca2+ Zn 2+等金属离子作为辅助因子而得名，是迄今为止发现的唯一能分解纤维类胶原的酶，几乎能降解除多糖以外的所有ECM成分，在生理病理过程中发挥着重要的作用。MMP家族由24种成员组成，其中有23种存在于人体中。 1. 1 MMPs可被分成六类［7］（1）胶原酶类。主要包括MMP-1 MMP-8 MMP-13和MMP-18它们能够降解间质胶原（I、H、皿型胶原），也能消化许多别的ECM及可溶性蛋白［5］。 MMP-1又称成纤维细胞型，是人类主要的间质胶原酶，结缔组织细胞、肝内HSC肝细胞、枯否氏细胞均有分泌，分解底物为胶原蛋白（皿I II）。而MMP-13 是鼠类主要的间质胶原酶。MMP-取称中性粒细胞胶原酶，主要降解I型胶原。（2）明胶酶类（gelatinases）。包括MMP-2阴胶酶A）及MMP-9明胶酶B）。它们可降解明胶（变性胶原）和W、V和幻型胶原、层粘连蛋白、蛋白聚糖等。MMP-2和胶原酶类以相似的方式可以降解I, I,和皿型胶原，但其活性较MMP-1弱［8］。（3）基质分解素（strogylisin）。主要包括MMP-3 MMP-1（和MMP-11 仅有MMP-3在肝脏中存在。底物广泛，包括蛋白多糖、层粘蛋白、纤维连接蛋白、

一步酶法生产 7-ACA

一步酶法生产7-ACA的优点 7-氨基头孢烷酸（7-ACA）是生产头孢菌素类抗生素的重要母核，头孢菌素分子中由于都含有β-内酰胺结构。它能抑制肽转肽酶所催化的转肽反应，使线性高聚物不能交联成网状结构，抑制粘肽的台成，从而阻止细胞壁的形成，导致细胞的死亡。目前7-ACA生产采用新型酶法工艺，国内已成功开发出新型酶法7-ACA生产技术，打破国外对一步酶法生产7-ACA 技术的垄断。而目前国内的生产厂家采用的双酶大多数是从国外进口的，成本与化学法不相上下。通过本项目技术的使用大大降低7-ACA的成本，从而获得成本优势。新型酶法较好解决了旧酶法技术生产7-ACA在质量、色泽上劣于化学法的问题，同时在生产上的使用批次也大幅度增加，从而也降低了生产成本。 7-ACA和头孢菌素的合成工艺主要有化学法和酶法两种。化学半合成技术主要包括酰氯法和混酐法，化学法合成存在着活化、缩合、保护和去保护的过程；合成过程长、步骤多反应条件苛刻产生大量的三废等弊端，而酶法合成工艺与化学法相比，由于具有许多优点，如：生产工艺简单，周期短；反应条件温和，pH接近中性；高度的区域和立体选择性以及无需保护和去保护过程，割除了化学合成中所需的毒害物质；劳动环境得到改善，减少了三废的排放。因此，用

酶法实现7-ACA及头孢菌素的半合成体现了绿色环保工艺的各种优势。

一步酶法和两步酶法制备7-ACA优势对比分析对比项一步酶法（CPCA）两步酶法（DAO 与GAC）生物酶NRB—103 D—氨基酸氧化酶 GL—7ACA酰化酶设备投资减少30% 较大操作步骤4步6步操作周期每批90min 每批150min 同等设备条件产量增大一倍较小 7-ACA转化率/% ≥95 ≥93 收率/% 46—50 44—45 7-ACA含量/% ≥98.5 ≥97 技术安全特性优优技术环保特性优优技术发展空间非常大有优点高转化率,高纯度,高经济性,环境保护。生产成本低, 减少有机溶媒用量，利于环保。缺点转化率低,酶解路线长、氧化条件控制难度大、设备条件高。一步酶法工艺技术指标: 底物浓度:2.0-3.0% 转化率:不低于98% 得率:不低于95% 反应时间: 90 分钟固定化头孢菌素酰化酶( immoblized CPC acylase) 酶活:80-100U/g 使用寿命:100 次

蛋白质和酶的分离与纯化培训讲学

蛋白质和酶的分离与纯化

蛋白质和酶的分离纯化及鉴定蛋白质是生命体中的重要物质基础之一。从分子水平上认识生命现象，已成为现代生物学发展的主要方向。要研究蛋白质，首先要得到高度纯化的目的蛋白。蛋白质在组织或细胞中一般都是以复杂的混合物形式存在，每种类型的细胞都含有上千种不同的蛋白质。要想从成千上万种蛋白质混合物中纯化出目的蛋白，就要根据蛋白质的理化性质不同设计出合理的分离方法。目前研究为止酶除核酶外本质都是蛋白质，因此酶的分离纯化方法基本是采用蛋白质的分离纯化方法，但是酶的活性受到多种因素的影响，因此酶的分离纯化比一般的蛋白质要求更高。一、质分离纯化的一般原则 1. 原料的选择原则：来源方便，成本低，易操作、安全的原料。蛋白分布：体液、组织、细胞定位 2. 破碎方法： (1) 机械方法：通过机械运动产生的剪切力的作用，使细胞或组织破碎的方法。如：捣碎法、研磨、匀桨法 (2) 物理方法：通过温度、压力、声波等各种物理因素的作用，使组织细胞破碎的方法。如：反复冻融、渗透压、超声破碎 (3) 化学方法：通过各种化学试剂对细胞膜的作用，使细胞破碎的方法. 如：甲苯、丙酮、氯仿和非离子型的表面活性剂（Triton和Tween） (4) 酶促法：溶菌酶、蜗牛酶等 3. 目的蛋白或酶的特异、快速、精确的定性或定量方法 4. 先粗后细，分级分离粗分：将得到的蛋白溶液先利用简单、快速、易处理的方法除去大部分杂蛋白。如: 盐析、离心、有机溶剂沉淀等。精制：利用蛋白质性质的差异，采用不同的方法，如:离子交换层析、分子筛、吸附层析、亲和层析、电泳、离心、结晶等方法进一步纯化。 5. 避免蛋白质的变性（pH、适合的温度和缓冲体系等）二、常用的蛋白质的分离纯化技术

生物酶法制备生物柴油研究综述.

生物酶法制备生物柴油研究综述分数低于0.0005 %，十六烷值高达73.6，在0#柴油中添加了 20%的生物柴油后，尾气排放中 CO 降低了28%，未燃烧的碳氢化合物降低了 36 %，NOx降低了24 %，全负荷烟度下降幅度达到 0.2～0.9 Rb。蔡志强等 [10]探究了固定化脂肪酶分别催化酯化与醇解两种方法合成生物柴油的最佳工艺条件。研究发现，酯化工艺的最佳工艺条件是：2%固定化脂肪酶，温度为30 ℃，油酸∶甲醇=1∶1（摩尔比），分 2 次等摩尔流加甲醇，反应时间 24 h，或分 3 次等摩尔流加甲醇，反应时间 36 h，酯化率都可以达到 95%以上；醇解的最佳工艺条件是：4%固定化脂肪酶，温度为30 ℃，菜籽油∶甲醇=1∶3（摩尔比），分 3 次等摩尔流加甲醇，反应时间为 48 h，酯化率可以达到 95%以上，去除下层甘油后，菜籽油甲酯纯度可达 98%。安永磊等 [11]利用固定化脂肪酶催化餐饮废油与乙醇反应制备生物柴油。通过实验获得了酯化反应的最佳条件：反应温度47 ℃，有机溶剂为正己烷，醇油比3∶1，5 次投加乙醇，酶用量为 0.3 g，反应时间 32 h 时，生物柴油产率可达 81%。徐桂转等 [12]利用固定化脂肪酶 Novozym 435，在无有机溶剂存在的情况下，催化菜籽油与甲醇酯交换反应制取生物柴油。研究得到了菜籽油间歇酯交换反应的适宜工艺条件：转速200 r/min，反应温度：50 ℃，甲醇∶菜籽油=1∶5 （摩尔比），酶用量 10%（与菜籽油的质量比）。反应分两次加入等量甲醇，即先加入总量一半的甲醇，反应 10 h（菜籽油的酯交换率达到 47%）；再加入剩下全部甲醇，反应26 h（酯交换率达到80%）。唐凤仙等 [13]以戊二醛交联壳聚糖固定的 A.niger Li-38脂肪酶催化棉籽毛油合成生物柴油取得了不错的效果。研究发现该固定化酶的贮藏稳定性较好，室温放置 12 d, 酶活性仍能保持 80%以上。固定化酶在30~70 ℃，pH=5.5~6.5 之间较稳定，其热稳定性和 pH 稳定性较游离酶有所提高。固定化酶可重复使用 7 次，转化率保持在80%以上。洪鲲等 [14]研究了两种脂酶顺序催化制备生物柴油的生产工艺。结果表明：固相化细菌 A007 脂酶催化甘油三酯（TAG）水解的最适条件为：含水量 40%、脂酶用量100 U/g、反应温度30 ℃、反应时间 12 h，此时 TAG水解率和游离脂肪酸（FFA）含量分别为 93.3%和90.1%；在催化 FFA 甲酯化过程中，固相化 Candidaantarctica 脂酶在FFA∶甲醇=1∶5 时可达到最佳效果；在第二次甲酯化时，加入甘油有利于提高FFA 酯化率，经过 24 h 反应，可将总酯化率

基质金属蛋白酶_

基质金属蛋白酶_ 基质金属蛋白酶细胞外基质和基底膜重塑是癌细胞侵袭转移过程中的关键环节，需借助于蛋白降解酶的表达和激活。基质蛋白酶主要有以下数种：丝氨酸蛋白酶类，包括血浆酶原激活剂；半胱氨酸蛋白酶类，包括组织蛋白酶0在内的溶酶体酶；金属蛋白酶类0^1&110^^0^611^565) [1]。金属蛋白酶类在肿瘤侵袭过程中的作用近年来倍受关注，大量证据表明基质金属蛋白酶，特别是基质金属蛋白酶- 2 (matrix metalloproteinase-2, MMP-2)在肿瘤细胞介导的细胞外基质降解中起关键作用，临床研究表明，順?_2活性和表达的增加与人类多种恶性肿瘤侵袭转移潜能及预后密切相关[2?4]。一.嫩识-2基因及其表达和激活的调节 MMP-2基因位于人类染色体16q21,由13个外显子和12个内含子所组成，结构基因总长度为27此，与其他金属蛋白酶不同，_-2基因5'旁侧序列促进子区域含有2个60盒而不是1414盒[5]。_-2以前酶原的形式由多种细胞分泌，如成纤维细胞、巨噬细胞、内皮细胞和恶性肿瘤细胞等。与其他金属蛋白酶相似，嫩1?-2分子含有氨基末端片段、金属结合片段及竣基末端片段，其中带有高度保守序列PRCGV/NPD的氨基末端具有一个不配对的半胱氨酸残基，该残基与激活位点的锌原子相互作用介导着—_2的前体状态；金属结合片段是公认的锌结合部位，其含旁侧有2个组氨酸的保守序列册4出羧基末端具有类似凝血酶的片段，该片段的具体功能尚未明确。此外，_-2还具有一个 58个氨基酸残基组成的明胶结合片段，此片段与纤维连接素的明胶结合11型基元相似[6]。目前认为，_-2表达和功能的调节发生于转录、分泌、前酶原的激活、细胞表面的结合以及与来源于肿瘤或宿主细胞的MMP抑制剂的相互作用等多个不同的水平。 MMP-2的转录调节与其他金属蛋白酶相比具有一定的独特性，如佛波醇酯 (phorbol 6316：^通过仙-1位点的介导增加腿?-9和间质胶原酶的表达，而

酶法合成研究进展

β-内酰胺抗生素的酶法合成研究进展β-内酰胺抗生素经过多年的发展，己成为抗生素中的最主要类型之一。由于具有良好的抗菌效力，较低的毒副作用，在临床上广泛应用，其发展非常迅速。现全世界耗用量已过万吨，预计今后还会增长。其中，青霉素和头孢菌素为最重要的两大类β-内酰胺抗生素。酶法合成技术始于20世纪60年代末70年代初，经过 30多年的发展，现在酶缩合反应技术、产品分离以及固定化酶技术等方面取得很大的发展，配套技术日益完善，具备了大规模工业化生产的条件。全球著名的β-内酰胺抗生素生产厂家如荷兰DSM公司已有酶法合成的商品头孢氨苄、阿莫西林等产品面世。由于酶法应用于β-内酰胺抗生素合成，不仅可减少反应步骤，而且还可减少废弃物的产生，有利于保护环境，降低生产成本，产品质量优异，所含杂质极少。因此，21世纪β-内酰胺抗生素的酶法合成将是发展的必然趋势。我国酶法合成研究起步并不晚，但至今仍未形成大规模工业化生产，与国外先进厂家差距较大。随着我国经济快速发展，人们对自身居住环境的要求，政府对环保的重视，政府和越来越多的企业加大“绿色化学制药”的研究开发，特别是加快工业化生产的推进进程。现将近年来β-内酰胺抗生素合成研究、产品的分离纯化、酶反应器研究进行概述。 1 现状青霉素中如氨苄西林、阿莫西林等，头孢菌素中如头孢氨苄、头孢羟氨苄、头孢克洛、头孢丙烯、头孢唑林等，这些产品有化学半合成法（简称化学法）和酶半合成法（简称酶法）。化学法是将母核与侧链以化学法缩合，现在世界上绝大多数生产这些产品的企业使用的是化学法，常用的方法有酰氯法、混合酸酐法、Vilsmeier法及活性醋法。酶法则是将母核与侧链通过酶催化缩合。化学法需要较多的有机化学原料（如溶剂二氯甲烷、吡啶、二甲苯胺），反应条件苛刻，如需无水条件，反应温度低（有的需低至零下90℃），反应步骤多，产生大量的三废需处理。这些产品酶法合成技术自1969年开始报道，但由于当时酶的性能较差，分离纯化技术也一直未能很好的解决，因此多年来酶法合成技术仍处于研究和试生产阶段。近年来，随着生物工程技术和固定化酶技术的快速发展，酶法制备β-内酰胺抗生素的技术也不断得到提高。 2 酶催化合成研究进展 2.1 酶催化酰胺化缩合反应酶法制备β-内酰胺抗生素酰胺化缩合反应的研究涉及的品种有氨苄西林、阿莫西林、头孢氨苄、头孢拉定、头孢羟氨苄、头孢唑林、头孢丙烯、头孢克洛等。酶催化缩合反应类型一般有两类，一类为热力学控制的酶催化缩合反应，另一类为动力学控制的酶催化缩合反应。 (1)热力学控制的酶催化缩合反应其特点是不必活化酰基配体，废物产生少。Schroen等研究了不同pH、溶剂浓度和温度条件下，热力学控制的头孢氨苄酶法合成。pH 5－8，酶的稳定性

蛋白酶抑制分类和应用

蛋白酶抑制剂分类和应用在分离蛋白时，组织或细胞裂解液中充满了来自溶酶体的酶,并且原来无活性的蛋白酶原被充分激火,开始消化其周围的蛋白质. 为避免此因素，蛋白酶抑制剂必须被加入在缓冲液内以阻止蛋白酶对细胞组织的消化作用. 来自哺乳类动物，植物, 霉菌或细菌的组织，蛋白酶成分是不同的, 并根据机体状态的发展蛋白酶也可以发生变化. 哺乳类动物组织分离时比细菌或其它组织分离时更需要应用蛋白酶抑制剂使组织细胞受到完全的保护. 因此，在各种蛋白分离时，在各种蛋白电泳时蛋白酶抑制剂的适当选用就成了很重要的因素。蛋白酶功能 : 涉及到许多细胞内和细胞外的过程: o食物蛋白在消化道的消化 o激活无活性酶原和多肽激素/神经转移介质的释放 o调节血凝物质和纤维素 o内源性和外源性蛋白的细胞内消化 o跨膜的蛋白转移 o微生物对生物体攻击,通过释放蛋白酶的导致毒性增加蛋白酶分类 : 根据催化中心结构的不同蛋白酶可分为4类 : 1. 丝氨酸蛋白酶在其活性中心含有丝氨酸和组氨酸，如: 糜蛋白酶, 弹性蛋白酶，血纤维蛋白溶酶，凝血酶，枯草杆菌蛋白酶，胰酶Chymotrypsin, Elastase, Plasmin, Subtilisin, Thrombin, Trypsin 2. 半胱氨酸蛋白酶（别名 :硫醇或SH 蛋白酶）在其催化中心含有半胱氨酸，如 : Calpain, 组织蛋白酶 B,C 和L，和木瓜蛋白酶 3 天(门)冬氨酸蛋白酶（羧基蛋白酶）在其活化中心含有天(门)冬氨酸，如 : 组织蛋白酶D, 木瓜蛋白酶, 肾素 4. 金属蛋白酶含有金属离子，即 : 锌2+在其催化中心，如氨基肽酶，羧基蛋白酶A 和 B，嗜热菌蛋白酶机体防止蛋白酶破坏作用几种可能性 : ?酶在特殊囊性小泡的分配 (溶酶体，包涵体) ?内源性蛋白酶抑制剂（如 : Aprotinin，抗凝血酶，抗胰酶） SERVA 6种蛋白酶抑制剂鸡尾酒的作用: ?SERVA提供6种不同的蛋白酶抑制剂鸡尾酒，用于分离纯化各种组织的蛋白，多肽的最佳选择?蛋白酶抑制剂混合物G含有5种水溶性的抑制剂用于抗丝氨酸- , 半胱氨酸- 和金属蛋白酶作用，并且是常用选择的鸡尾酒，应当避免同时使用有机体溶剂 ?蛋白酶抑制剂混合物H P含有4种水溶性抑制剂用于抗丝氨酸- , 半胱氨酸蛋白酶作用，并且有效地用于分离和提取重组蛋白，岳阳家政避免金属螯合物。 ?蛋白酶抑制剂混合物M含有6种不同的抑制剂用于抗丝氨酸- , 半胱氨酸和天(门)冬氨酸酶以及金属蛋白酶作用，并用于哺乳动物组织的蛋白分离。 ?蛋白酶抑制剂混合物P含有6种不同的抑制剂用于抗丝氨酸- , 半胱氨酸和天(门)冬氨酸酶以及金属蛋白酶作用。此被推荐用于从植物来源的蛋白分离 ?蛋白酶抑制剂混合物FY含有4种不同的抑制剂用于抗丝氨酸- , 半胱氨酸, 天(门)冬氨酸蛋和金属蛋白酶作用。用于从酵母和其它真菌来源的蛋白制备。

谷胱甘肽化学与酶法合成

谷胱甘肽化学法和酶法合成 1 化学性质谷胱甘肽（glutathione，GSH）是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸结合而成的三肽，半胱氨酸上的巯基为其活性基团（故谷胱甘肽常简写为G-SH）分子式为C10H17N3O6S，分子量为307.32348，熔点为189~193℃，晶体呈无色透明细长拉状，等电点为5.93。GSH有还原型（G-SH）和氧化型（G-S-S-G）两种形式，在生理条件下以还原型GSH占绝大多数。谷胱甘肽还原酶催化两型间的互变。该酶的辅酶为磷酸糖旁路代谢提供的NADPH。图1 GSH的结构式 2 药理作用 GSH可促进糖、脂肪及蛋白质代谢，加速自由基排泄，保护肝脏的合成、解毒、灭活激素等功能。 3 谷胱甘肽的生产方法 1888年，GSH首先从酵母中分离出来。日本1983年进行了含量较多的GSH 酵母的生产，其后又研究了GSH提取、分离技术及分析检测方法。目前国外实现了GSH规模生产。世界主要的氨基酸制造商Kyowa，Aji-nomoto和Degussa 等都相继投巨资于氨基酸的研究与开发，仅Kyowa 1998年氨基酸的研究与开发就耗费达1.9亿美元，而GSH是其重点之一，Kyowa目前是GSH主要的供应商。目前GSH的主要生产方法有：萃取法、发酵法、酶法和化学合成法。 3.1萃取法萃取法主要是通过萃取和沉淀的方法从GSH含量比较高的动植物组织中将GSH分离提取的一种方法，GSH的早期生产都是采用萃取法，是生产GSH的经典方法，也是发酵法生产流程中的下游过程基础。其工艺路线如下图：

图2 GSH发酵法工艺路线图该方法的不足：由于GSH在组织中含量极低，可用原料少，制备的纯度和收率都不高，故在实际生产中应用不广泛。 3.2酶法在酶催化合成GSH中，几种关键的化合物和条件包括：GS HⅠ和GS HⅡ、氨基酸原料(L-谷氨酸、甘氨酸和L-半胱氨酸)、ATP、保持GS HⅠ和GSHⅡ活性所必需的辅因子(Mg2+)和一个适当的pH值环境。合成中，需求大量ATP，给GSH的工业化生产带来麻烦，大大提高了GSH生物合成的成本，所以只能寻求一个ATP生成系统来藕联ATP消耗系统。两种系统同在一种生物体内的称为自藕联系统，在多种生物体内的称为共藕联系统。自藕联系统研究的比较少，因为很难找到一种生物体同时含有ATP生成系统和ATP消耗系统。 Murata等人发现酒酵解菌(s.cerevisae)中的葡萄糖是最简单的ATP生产系统之一，可以提供足量的ATP用来GSH的生物合成。酶催化法合成GSH的浓度可以达到99/l，但是所用的氨基酸原料比较贵，提高了GSH生物合成的成本。 3.3发酵法生物发酵法是利用廉价的糖作为原料，利用微生物体内物质的代谢途径来合成GSH的方法。由于发酵法所使用的细菌或酵母容易培养，加之生产方法及工艺的不断改进和完善，因此微生物发酵法已成为目前GSH工业化生产的最普遍方法。在工业上，生物发酵法一般都选用s.eerevisae和Candidautilis为原料进行发酵。一般情况下，微生物细胞中GSH含量不高，仅为细胞干重的0.1~1.0%。过高含量的GSH容易破坏体内业已平衡的氧化还原环境，GSH是胞内产物，实际生产过程中需要进行提取，较低的含量无疑会大大提高生产成本。因此，发酵法生产GSH的关键问题在于如何提高细胞密度以及细胞内的GSH含量。二者的有机结合将有利于GSH产量的大幅度提高。

酶的分离纯化.

酶的分离纯化提取原则 a. 相似相溶。酶提取时首先应根据酶的结构和溶解性质，选择适当的溶剂。一般说来，极性物质易溶于极性溶剂中，非极性物质易溶于非极性的有机溶剂中，酸性物质易溶于碱性溶剂中，碱性物质易溶于酸性溶剂中。酶都能溶解于水，通常可用水或稀酸、稀碱、稀盐溶液等进行提取，有些酶与脂质结合或含有较多的非极性基团，则可用有机溶剂提取。 b. 远离等电点的pH值，溶解度增加。酶的提取方法酶的分离方法 1沉淀分离沉淀分离是通过改变某些条件或添加某种物质，使酶的溶解度降低，而从溶液中沉淀析出，与其它溶质分离的技术过程。在蛋白质的盐析中，通常采用的中性盐有硫酸铵、硫酸钠、硫酸钾、硫酸镁、氯化钠和磷酸钠等。其中以硫酸铵最为常用。在盐浓度达到某一界限后，酶的溶解度随盐浓度升高而降低，这称为盐析现象。有机溶剂之所以能使酶沉淀析出。主要是由于有机溶剂的存在会使溶液的介电常数降低。溶液的介电常数降低，就使溶质分子间的静电引力增大，互相吸引而易于凝集，同时，对于具有水膜的分子来说，有机溶剂与水互相作用，使溶质分子表面的水膜破坏，也使其溶解度降低而沉淀析出。常用于酶的沉淀分离的有机溶剂有乙醇、丙酮、异丙醇、甲醇等 2离心分离离心分离是借助于离心机旋转所产生的离心力，使不同大小、不同密度的物质分离的技术过程。在离心分离时，要根据欲分离物质以及杂质的颗粒大小、密度和特性的不同，选择适当的离心机、离心方法和离心条件。蛋白质分子在离心時，其分子量、分子密度、组成、形状等，均会影响其沉降速率，沉降係系数即用來描述此沉降性质；其单位为S (Svedberg unit)。每一种的沉降系数与其分子密度或分子量成正比。不同沉降系数的蛋白质，可利用超高速离心法，在密度梯度中作分離。 3、过滤与膜分离过滤是借助于过滤介质将不同大小、不同形状的物质分离的技术过程。

蛋白质和酶的分离与纯化

酶的分离纯化过程中要注意什么问题

酶分离纯化过程中的问题以及进行酶活力等测定的意义班级:生物技术133 组别：第六组姓名：董冰夏学号：2013013906 酶的分离纯化一般包括三个基本步骤：即抽提、纯化、结晶或制剂。首先将所需的酶从原料中引入溶液，此时不可避免地夹带着一些杂质，然后再将此酶从溶液中选择性地分离出来，或者从此溶液中选择性地除去杂质，然后制成纯化的酶制剂。酶的来源多为生物细胞。生物细胞内产生的总的酶量虽然是很高的，但每一种酶的含量却很低，如胰脏中期消化作用的水解酶种类很多，但各种酶的含量却差别很大。因此，在提取某一种酶时，首先应当根据需要，选择含此酶最丰富的材料，如胰脏是提取胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、淀粉酶和脂酶的好材料。由于从动物内脏或植物果实中提取酶制剂受到原料的限制，如不能综合利用，成本又很大。目前工业上大多采用培养微生物的方法来获得大量的酶制剂。从微生物中来生产酶制剂的优点有很多，既不受气候地理条件限制，而且动植物体内酶大都可以在微生物中找到，微生物繁殖快，产酶量又丰富，还可以通过选育菌种来提高产量，用廉价原料可以大量生产。生物细胞产生的酶有两类：一类由细胞内产生后分泌到细胞外进行作用的酶，称为细胞外酶。这类酶大都是水解酶，如酶法生产葡萄糖所用的两种淀粉酶，就是由枯草杆菌和根酶发酵过程中分泌的。这类酶一般含量较高，容易得到；另一类酶在细胞内产生后并不分泌到细胞外，而在细胞内起催化作用，称为细胞内酶，如柠檬酸、肌苷酸、味精的发酵生产所进行的一系列化学反应，就是在多种酶催化下在细胞内进行的，在类酶在细胞内往往与细胞结构结合，有一定的分布区域，催化的反应具有一定的顺序性，使许多反应能有条不紊地进行。由于在生物组织中，除了我们所需要的某一种酶之外，往往还有许多其它酶和一般蛋白质以及其他杂质，因此为制取某酶制剂时，必须经过分纯化的手续。因为酶是具有催化活性的蛋白质，蛋白质很容易变性，所以在酶的提纯过程中应避免用强酸强碱，保持在较低的温度下操作。酶是一种特殊的蛋白质，在分离纯化过程中需要注意温度以及PH值等的控制，注意在纯化过程中所使用的缓冲溶液的离子强度的控制(常用PBS缓冲溶液)，在实际纯化过程中，一般要在低温冰箱中进行，缓冲溶液中注意加入EDTA二钠盐(1-5mM)螯和重金属离子一般避免酶失活。常用分离步骤包括分子筛层析、离子交换、疏水层析等步骤。同时要注意防止酶的变性失活。酶的分离纯化的目的是将酶以外的所有杂质尽可能的除去，因此，在不破坏所需酶的条件下，可使用各种“激烈”的手段。此外，由于酶和它的底物、抑制剂等具有亲和性，当这些物质存在时．酶的理化性质和稳定性发生了一定变化，从而提供了更多条件和方法可供采用。酶具有催化活性。检测酶活性，跟踪酶的来龙去脉，为选择适当方法和条件提供直接依据。在工作过程中，从原料开始每步都必须检测酶活性．一个好的方法和措施会使酶的纯度提高倍数大，活力回收高，同时重复性好。酶活力也称为酶活性，是指酶催化一定化学反应的能力。酶活力的大小可用在一定条件下，酶催化某一化学反应的速度来表示，酶催化反应速度愈大，酶活力愈高，反之活力愈低。测定酶活力实际就是测定酶促反应的速度。酶促反应速度可用单位时间内、单位体积中底物的减少量或产物的增加量来表示。在一般的酶促反应体系中，底物往往是过量的，测定初速度时，底物减少量占总量的极少部分，不易准确检测，而产物则是从无到有，只要测定方法灵敏，就可准确测定。酶比活力为每毫克蛋白质所具有的酶活力单位数，一般用酶活力单位/mg蛋白质表示。酶的比活力在酶学研究中用来衡量酶的纯度，对于同一种酶来说，比活力越大，酶的纯度越高。利用比活力的大小可以用来比较酶制剂中单位质量蛋白质的催化能力，是表示酶的纯度

胃蛋白酶提取的分离纯化

胃蛋白酶提取的分离纯化文稿归稿存档编号：[KKUY-KKIO69-OTM243-OLUI129-G00I-FDQS58-

胃蛋白酶提取法中分离纯化技术的研究进展摘要：本文就胃蛋白酶的生物提取法，对其在生产过程中的分离、纯化技术展开综述。其中，分离技术主要介绍了：盐析法、有机溶剂沉淀法、底物亲和法、透析法。纯化技术主要介绍了：凝胶过滤法、透析离子交换法。综合比较各分离纯化方法的特点，得到最优的分离纯化方法有机溶剂与盐析共沉淀法、膜分离技术、等电点沉淀法与底物亲和法。关键词：胃蛋白酶分离纯化应用．生物提取法生产胃蛋白酶 1．1 工艺路线（自溶、过滤）（脱脂、去杂质）猪胃黏膜→自溶液→上清液（浓缩、干燥） →胃蛋白酶成品 1.2工艺过程（1）原材料的选择和预处理：胃蛋白酶原主要存在于胃粘膜基底部，采集原料时剥取的粘膜直径大小与收率有关。一般取直径10cm、深2-3mm的胃基底部粘膜最适宜，每头猪胃平均剥取粘膜100g左右。（2）自溶、过滤：在夹套锅内预先加水100升及盐酸3.6-4升，加热至50度时，在搅拌下加入200千克猪胃黏膜，快速搅拌使酸度均匀，保持45—48度，消化3-4小时，得自溶液。用纱布过滤除去未消化的组织尿蛋白，收集滤液。（3）脱脂、去杂质：将滤液降温至30℃以下，加入15-20％氯仿或乙醚，搅匀后转入沉淀脱脂器内，静置24-48小时，使杂质沉淀，分出弃去，得脱脂酶液。（4）浓缩、干燥：取清酶液，在40℃以下减压浓缩至原体积的1／4左右，再将浓缩液真空干燥。球磨过80-100目筛，即得胃蛋白酶粉。 2胃蛋白酶的分离技术

2.1有机溶剂法可用于胃蛋白酶的初步提取浓缩。通常使用的有机溶剂有甲醇、乙醇、丙酮、异丙酮，其沉淀蛋白质的能力为：丙酮＞异丙酮＞乙醇＞甲醇。当然此顺序也不是一成不变的，因为还要受温度、pH、离子强度等因素的影响。丙酮沉淀能力最好，但挥发损失多，价格较昂贵，所以工业上常采用乙醇作为沉淀剂。 2．2盐析法盐析法是酶制剂工业中常用方法之一，硫酸镁、硫酸铵、硫酸钠是常用的盐析剂，其中用的最多的是硫酸铵。美国专利（2，701,228）改进后，用锌盐沉淀胃酶。当母液含醇（或酮）在50%--55%、pH在5.0—5.2时几乎全部胃酶可以用醋酸锌沉淀，沉淀物为胃酶的锌盐，然后用金属螯合剂除去锌盐，得15000—16000倍活力的酶，收集率为5.0%--5.5%。此法较上述有机溶剂沉淀所得的胃酶活力和得率都高。 2.3底物亲和法底物亲和法是利用酶（胃蛋白酶）与其底物（酪蛋白）的亲和性，从胃粘膜中提取得到胃蛋白酶。使底物和酶在pH2.5的乳酸缓冲液中充分结合，然后调pH至4（底物的等电点）沉淀底物和酶的结合物，随后让沉淀物再溶解于乳酸缓冲液中，添加低浓度的SDS将底物和酶分离，得到酶—SDS复合物，再进一步分离纯化。陈躬瑞（2001）成功的应用此法对蛇胃蛋白酶进行了实验室分离，得率大约为30%。与传统的分离方法比较，此法具有简单高效的优点，为后续的纯化工艺避免了昂贵的活化试剂和配基的使用，同时具有较高的特异性。【2】 2.4透析法胃蛋白酶的分离过程中还经常用到透析法。该法是利用蛋白质大分子对半透膜的不可透过性而与小分子物质及盐分开的。由于透析主要是扩散过程，如果袋内外的盐浓度相等，