实验三 等电聚焦电泳法测定蛋白质的等电点

实验三等电聚焦电泳法测定蛋白质的等电点

一、实验目的

了解等电聚焦的原理。通过蛋白质等电点的测定，掌握聚丙烯酰胺凝胶垂直管式等电聚焦电泳技术。

二、实验原理

等电聚焦（Isoelectric focusing，简称IEF）是六十年代中期出现的新技术。近年来等电聚焦技术有了新的进展，已迅速发展成为一门成熟的近代生化实验技术。目前等电聚焦技术已可以分辨等电点（pI）只差0.001pH单位的生物分子。由于其分辨力高，重复性好，样品容量大，操作简便迅速，在生物化学、分子生物学及临床医学研究中得到广泛的应用。

蛋白质分子是典型的两性电解质分子。它在大于其等电点的pH环境中解离成带负电荷的阴离子，向电场的正极泳动，在小于其等电点的pH环境中解离成带正由荷的阳离子，向电场的负极泳动。这种泳动只有在等于其等电点的pH环境中，即蛋白质所带的净电荷为零时才能停止。如果在一个有pH梯度的环境中，对各种不同等电点的蛋白质混合样品进行电泳，则在电场作用下，不管这些蛋白质分子的原始分布如何，各种蛋白质分子将按照它们各自的等电点大小在pH梯度中相对应的位置处进行聚焦，经过一定时间的电泳以后，不同等电点的蛋白质分子便分别聚焦于不同的位置。这种按等电点的大小，生物分子在pH梯度的某一相应位置上进行聚焦的行为就称为“等电聚焦”。等电聚焦的特点就在于它利用了一种称为两性电解质载体的物质在电场中构成连续的pH梯度，使蛋白质或其他具有两性电解质性质的样品进行聚焦，从而达到分离、测定和鉴定的目的。

两性电解质载体，实际上是许多异构和同系物的混合物，它们是一系列多羧基多氨基脂肪族化合物，分子量在300~1000之间。常用的进口两性电解质为瑞典Pharmacia-LKB公司生产的Ampholine 和Pharmalyte，价格昂贵。国产的有中国军事医学科学院放射医学研究所和上海生化所生产的两性电解质，价格便宜，质量尚佳。两性电解质在直流电场的作用下，能形成一个从正极到负极的pH值逐渐升高的平滑连续的pH梯度。若不同的pH值的两性电解质的含量与pI值的分布越均匀，则pH梯度的线性就越好。对Ampholine两性电解质的要求是缓冲能力强，有良好的导电性，分子量要小，不干扰被分析的样品等。

在聚焦过程中和聚焦结束取消了外加电场后，如保持pH梯度的稳定是极为重要的。为了防止扩散，稳定pH梯度，就必须加入一种抗对流和扩散的支持介质，最常用的这种支持介质就是聚丙烯酰胺凝胶。当进行聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳时，凝胶柱内即产生pH梯度，当蛋白质样品电泳到凝胶柱内某一部位，而此部位的pH值正好等于该蛋白质的等电点时，该蛋白质即聚焦形成一条区带，只要测出此区带所处部位的pH值，即为其等电点。电泳时间越长，蛋白质聚焦的区带就越集中，越狭窄，因而提高了分辨率。这是等电聚焦的一大优点，不像一般的其他电泳，电泳时间过长则区带扩散。所以等电聚焦电泳法不仅可以测定等电点，而且能将不同等电点的混合的生物大分子进行分184

离和鉴定。

早期的等电聚焦电泳是垂直管式的，其特点是体系是封闭的，不与空气接触，可防止样品氧化。近年来，又发展了超薄层水平板式等电聚焦电泳。此法的优点是加样数量多，节省两性电解质，电泳后固定、染色、干燥都十分迅速简便，其最大优点是防止了电极液的电渗作用而引起正负两极pH梯度的漂变。

测定pH梯度的方法有四种：

1. 将胶条切成小块，用水浸泡后，用精密pH试纸或进口的细长pH复合电极测定pH值，然后作图。

2. 用表面pH微电极直接测定胶条各部分的pH值，然后作图。

3. 用一套已知不同的pI值的蛋白质作为标准，测定pH梯度的标准曲线。

4. 将胶条于－70℃冰冻后切成1mm的薄片，加入0.5ml 0.01M KCl，用微电极

测其pH。

三、仪器和用具

1. 电泳仪

2. 垂直管式园盘电泳槽一套

3. 注射器与针头

4. 移液管：10ml、5ml、2ml、1ml、0.1ml

5. 小烧杯若干

6. 培养皿一套

7. 直尺

8. 小刀

9. 精密pH试纸和带细长复合pH电极的pH计

10. 塑料薄膜和橡皮筋

四、试剂

1. 丙烯酰胺

2. 甲叉双丙烯酰胺

3. 两性电解质Ampholine（40%，pH3.5~9.5）

4. 过硫酸胺（催化剂）

5. TEMED（四甲基乙二胺）（加速剂）

6. 磷酸

7. NaOH

8. 三氯乙酸（TCA）

五、溶液配制

1. 丙烯酰胺贮液（30%丙烯酰胺，交联度

2.6%）：，30g丙烯酰胺和0.8g甲叉双丙烯酰胺溶于H2O，定容至100ml，滤去不溶物后存于棕色瓶，4℃可保存数月。（全班公用）（另一配方为29.1g 丙烯酰胺和0.9g 甲叉双丙烯酰胺溶于H2O，定容至100ml，交联度为

3.0%）。

2. 两性电解质Amphline（40%）的加入量为：50 l /ml 胶液。

3. 过硫酸胺：配成1mg/ml的浓度，当天配制，配100ml全班公用。胶液中的加入

185

186 量为0.5mg/ml 胶液。

4. TEMED ：胶液中的加入量为1μl/ml 胶液。

5. 蛋白质样品：选用两种等电点相差较大的蛋白质，每根垂直管中每种蛋白质的加样量控制在<100μg 。蛋白质样品配制成各为5mg/ml 的浓度。配2.5ml 全班公用。

6. 固定液：10%的三氯乙酸，每组配50ml 。

7. 阳极电极液：0.1M H 3PO 4

3.4ml 浓磷酸（85%）加H 2O 至500ml ，每个电泳槽用500ml 。 8. 阴极电极液：0.5M NaOH

2g NaOH 加H 2O 溶解至500ml ，每个电泳槽用500ml 。

六、操作步骤

1. 配胶

过硫酸铵是胶聚合的催化剂，因此最后加入，加毕，立即摇匀，因胶很快就会聚合，必须立即装管。通常化学聚合的胶液，需在过硫酸铵加入前进行减压抽气处理，本实验将此抽气步骤省略并不影响实验结果。 2. 装管

每个学生装两支管，每组装四支。先用肥皂洗手，然后将圆盘电泳槽的玻璃管洗净，底端用塑料薄膜和橡皮筋封口，垂直放在试管架上，用移液管将配好的胶液移入管内，（每根玻璃管的容量约为1.5~1.8ml ）,液面加至距管口1mm 处，用注射器轻轻加入少许

%

100??=

胶液总体积

贮液加入量

丙烯酰胺贮液浓度胶浓度T %

100?+=

b a b

C 甲叉双丙烯酰胺的量胶液中丙烯酰胺的量的量胶液中甲叉双丙烯酰胺交联度%

6.2%1008

.0308

.0=?+=

C 交联度

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H 2O ，进行水封，以消除弯月面使胶柱顶端平坦。胶管垂直聚合约30分钟，聚合完成时可观察到水封下的折光面。

3. 装槽和电泳

用滤纸条吸去胶管上端的水封，除去下端的薄膜，水封端向上，将胶管垂直插入圆盘电泳槽内，调节好各管的高度，记下管号。每支管约1/3在上槽，2/3在下槽。上槽加入500ml 0.1M H 3PO 4，下槽加入500ml 0.1M NaOH ，淹没各管口和电极，用注射器或滴管吸去管口的气泡。上槽接正极，下槽接负极，开启电泳仪，恒压160V ，聚焦2至3小时，至电流近于零不再降低时，停止电泳。

4. 剥胶

取下胶管，用H 2O 将胶管和两端洗2次，用注射器沿管壁轻轻插入针头，在转动胶管和内插针头的同时分别向胶管两端注入H 2O 少许，胶条即自行滑出，若不滑出可用洗耳球轻轻挤出。胶条置于小培养皿内，记住正极端为“头”，负极端为“尾”，若分不清时，可用pH 试纸鉴定，酸性端为正，碱性端为负。 5. 固定

取2支胶条置于一个小培养皿内，倒入10%三氯乙酸溶液至没过胶条，进行固定，约半小时后，即可看到胶条内蛋白质的白色沉淀带。固定完毕，倒出固定液，用直尺量出胶条长度“L 2”和正极端到蛋白质白色沉淀带中心（即聚焦部位）的长度“L ’”。 固定后的胶条可在康强860紫外/可见分光光度计上用280nm 或238nm 波长作凝胶扫描，然后用扫描图作相应的测量和计算。

6. 测定pH 梯度

将放在另一个培养皿内未固定的胶条，用直尺量出待测pH 胶条的长度“L 1”。按照由正极至负极的顺序，用镊子和小刀依次将胶条切成10mm 长的小段，分别置于小试管中，加入1ml H 2O ，浸泡半小时以上或过夜，用仔细校正后的带细长pH 复合电极的pH 计测出每管浸出液的pH 值。

七、数据处理

1. 以胶条长度（mm ）为横座标，pH 值为纵座标作图，得到一条pH 梯度曲线。所测每管的pH 值为10mm 胶条的pH 的混合平均值。作图时将此pH 值取为10mm 小段中心即5mm 处的pH 值。

2. 用下式计算蛋白质聚焦部位至胶条正极端的实际长度L ：

上式中： L’——量出蛋白质的白色沉淀带中心至胶条正极端的长度。 L 1——测pH 的胶条的长度 L 2——固定后胶条的长度

3. 根据计算出的L ，由pH 梯度曲线上查出相应的pH 值，即为该蛋白质的等电点。

4. 画出固定后所测胶条的示意图。

八、附注

2

1'L L L L ?

=

1.对两性电解质的要求

两性电解质是等电聚焦的关键试剂，所以对两性电解质的质和量都要特别注意。两性电解质含量以2%～3%较适合，能形成好的pH梯度。由于载体两性电解质是由多乙烯多胺与丙烯酸进行加成反应生成的混合物，防止时间过长会分菌，分解变质，不能使用。

2.指教注意的问题

（1）丙烯酰胺最好是重结晶的。

（2）过硫酸铵一定要新配制。

（3）所有水要用双蒸水。

（4）制胶时，玻璃板和模板必须水平放置。

（5）模板要平直光滑，不然灌胶时易溅漏。

3、防止烧胶

（1）平板等点聚焦电泳的胶很薄（0.6mm），当问柳在8mA时，电压可上升到550V以上，由于阴极飘移，造成局部电流过大，胶承受不了而被烧断。

（2）防止烧胶的办法：注意观察，稳流8mA，电压上升到550V时，立即关电源。用恒功率电泳仪，控制输出功率在指定范围。在一定功率范围内，改进冷却条件，使因电流产生的热量及时散去。

（3）如果胶被烧了，可在烧断的位置换上一条宽的电极条压过断缝或在电源电极条内侧加一电极条，以此补救。

4.搅拌制作注意事项

固定液可使蛋白质变性，不再扩散，故一定要多换一次；在电泳后取胶、固定、染色直至制干胶板都必须仔细，防止胶被损坏。

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蛋白质等电点测定

离表面越远，过剩的反离子越少， 直至在溶液内部反离子 蛋白质等电点测定 及性质实验 、目的： 了解等电点的意义及其与蛋白质分子聚沉能力的关系。 初步学会测定蛋白质等电点的基本方法，了解蛋白质的性质。 、原理: 固体颗粒在液体中为什么能够带电? 当固体与液体接触时，固体可以从溶液中选择性吸附某种离子，也可以是固体分子本 身发生电离作用而使离子进入溶液， 以致使固液两相分别带有不同符号的电荷， 由于电中性 的要求，带电表面附近的液体中必有与固体 表面电荷 数量相等但符号相反的多余的反离子。 在界面上 带电表面和反离子 形成了双电层的结构。 在两种不同物质的 界面上，正负电荷分 别排列成的面层。 对于双电层的具体结构，一百多年来不同学者提出了不同的看法。最早于 1879年 Helmholz 提出平板型模型；1910年Gouy 和1913年Chap man 修正了平板型模型， 提出了扩 散双电层模型；后来 Stern 又提出了 Stern 模型。 根据O.斯特恩的观点，一部分反离子由于电性吸引或非电性的特性吸引作用（例如范 德华力）而和表面紧密结合，构成 吸附层（或称紧密层、斯特恩层）。其余的离子则扩散地 分布在溶液中，构成双电层的 扩散层（或称滑移面）。由于带电表面的吸引作用，在 扩散层 中反离子的浓度远大于同号离子。 紧密层（Stern 层〉 +++++^+++ 9 反号离子溶剂分子 扩散层

紧密层：溶液中反离子及溶剂分子受到足够大的静电力，范德华力或特性吸附力，而紧 密吸附在固体表面上。其余反离子则构成扩散层。 滑动面：指固液两相发生相对移动的界面，是凹凸不平的曲面。滑动面至溶液本体间的 电势差称为Z电势。 固体颗粒带电量的大小及测量方式？ Z电势只有在固液两相发生相对移动时才能呈现出来。Z电势的大小由Zeta电位表示， 其数值的大小反映了胶粒带电的程度，其数值越高表明胶粒带电越多，扩散层越厚。一般来说，以pH值为横坐标，Zeta电位为纵坐标作图，Zeta电位为零对应的pH值即为等电点。 对于蛋白质分子来说： 蛋白质分子的大小在胶粒范围内，约1?100微米。大部分蛋白质分子的表面都有很多 亲水集团，这些集团以氢键形式与水分子进行水合作用，使水分子吸附在蛋白质分子表面而 形成一层水合膜，具有亲水性；又由于蛋白质分子表面的亲水集团都带有电荷，会与极性水分子中的异性电荷吸引形成双电层。而水合膜和双电层的存在，使蛋白质的分子与分子之间 不会相互凝聚，成为比较稳定的胶体溶液。如果消除水合膜或双电层其中一个因素，蛋白质溶液就会变得不稳定，两种因素都消除时，蛋白质分子就会互相凝聚成较大的分子而产生沉淀。在生活实践中，常利用蛋白质的胶体性质沉淀或分离蛋白质。如做豆腐、肉皮冻就是利 用蛋白质的胶凝作用。 蛋白质分子所带的电荷与溶液的pH值有很大关系，蛋白质是两性电解质，在酸性溶液 在碱性溶液中羧基形成-C00-而带负电 中的氨基酸分子氨基形成-NH3+而带正 电， COO-COO J p\+ 0H- NH2 兼性痒孑 pH>pI pK = pl pl 电殛申：拓向配覆不暮动 蛋白质分子所带净电荷为零时的pH值称为蛋白质的等电点（PI）。其定义为：在某一 pH的溶液中，蛋白质解离成阳离子和阴离子的趋势或程度相等时，呈电中性，此时溶液的pH称为该蛋白质的等电点。 等电点的应用：主要用于蛋白质等两性电解质的分离、提纯和电泳。 蛋白质等电点的测量方式：溶解度最低时的溶液pH。

发酵实验报告三、乳酸菌的分离和酸奶的制作

发酵工程学实验报告实验三、乳酸菌的分离和酸奶的制作 学院生命科学学院 专业应用生物教育 班级12应生A班 姓名李顺昌 学号124120218 实验课程乳酸菌的分离和酸奶的制作 指导教师许波 开课学期2014—2015学年下学期

实验三、乳酸菌的分离和酸奶的制作小组合作：是小组成员：李顺昌、李媛媛、方淑萍、周玉坤 一、实验目的 1.掌握分离纯化微生物的基本方法 2.掌握酸奶制作的基本原理 3.学会酸奶的制作方法 二、实验设备与材料 1、仪器设备：三角瓶、平皿、试管、移液管、玻璃涂布棒、灭菌锅、超净工作台、培养箱、恒温摇床、冰箱等。 2、材料：市售酸奶、奶粉、白糖、棉花、酸奶瓶（自备，1个/人）等。 3、培养基：乳酸菌分离用 乳酸菌分离用培养基：牛肉膏：0.5％；酵母膏：0.5％；蛋白胨：1％；葡萄糖：1％；乳糖：0.5％；NaCl：0.5％；琼脂：2.5％；pH6.8。 配制250mL/组，装于2个三角瓶 三、实验原理 1、酸奶制作的基本原理 （1）酸奶：以牛奶为主要原料，接入一定量乳酸菌，经发酵后制成的一种乳制品饮料。 （2）生理生化原理 牛奶（乳糖）→接种乳酸菌→β-D-半乳糖苷酶→乳糖（半乳糖和葡萄糖）→乳酸发酵（葡萄糖）→乳酸→破坏钙-酪蛋白-磷酸复合物的稳定性→蛋白质凝结→酸奶 2、提供适宜的生长条件、采用一定的微生物分离纯化方法，就能够从酸奶中分离出乳酸菌。 3、酸奶中含有乳酸菌的菌体及代谢产物，因而对人体的肠胃消化道疾病有良好的治疗效果。 四、实验方法步骤

（一）乳酸菌的分离纯化——稀释涂布平板法 1、倒平板（约6块/100ml） 2、制备酸奶稀释液 （1）将0.5mL酸奶吸入4.5mL无菌水（自备）中，摇动5min； （2）用无菌吸管吸出0.5mL酸奶悬液，加入盛有4.5mL无菌水的试管中，充分混匀，制备得到10-2稀释液； （3）再从中吸出0.5mL加入盛有4.5mL无菌水的大试管中，混匀后得到10-3稀释液； （4）以此类推，分别制备得到10-4、10-5、10-6酸奶稀释液。 3、涂布 用无菌吸管分别吸取10-3、10-4和10-5稀释液各0.1mL，对号放入已经写好记号的平板中央，用无菌玻璃涂棒涂匀（每个稀释度涂2块平板）。 4、培养：37℃倒置培养2-3d 5、观察菌落特征（周二中午） 扁平型菌落：大小为2-3mm，边缘不整齐，很薄，近似透明状，染色镜检为细杆状； 半球状隆起菌落：大小为1-2mm隆起成半球状，高约0.5mm，边缘整齐且四周可见酪蛋白水解透明圈，染色镜检为链球状； 礼帽形突起菌落：大小为1-2mm，边缘基本整齐，菌落中央呈隆起状，四周较薄，有酪蛋白水解透明圈，染色镜检亦为链球状。 6、分离纯化：（周二）挑取符合上述特征的单菌落，划线于平板，37℃倒置培养约2d（下周四中午）；如发现杂菌需重复上述步骤（纯化）直到获得纯培养。 （二）酸奶的制作 1、菌种的制备 （1）将分离纯化所得到的乳酸菌分别接种于LB培养基中（30ml/瓶）（下周4早上）； （2）37℃、200r/min摇瓶培养约48h （下周5晚）。 2、牛奶的配制

蛋白质的等电点测定

蛋白质的等电点测定 一、蛋白质等电点的测定 1．目的 （1）了解蛋白质的两性解离性质。 （2）学习测定蛋白质等电点的一种方法。 2．原理 蛋白质是两性电解质。在蛋白质溶液中存在下列平衡： 蛋白质分子的解离状态和解离程度受溶液的酸碱度影响。当溶液的pH达到一定数值时，蛋白质颗粒上正负电荷的数目相等，在电场中，蛋白质既不向阴极移动，也不向阳极移动，此时溶液的pH值称为此种蛋白质的等电点。不同蛋白质各有其特异的等电点。在等电点时，蛋白质的理化性质都有变化，可利用此种性质的变化测定各种蛋白质的等电点。最常用的方法是测其溶解度最低时的溶液pH值。 本实验借观察在不同pH溶液中的溶解度以测定酪蛋白的等电点。用醋酸与醋酸钠（醋酸钠混合在酪蛋白溶液中）配制成各种不同pH值的缓冲液。向诸缓冲溶液中加入酪蛋白后，沉淀出现最多的缓冲液的pH值即为酪蛋白的等电点。 3．器材 （1）水浴锅（2）温度计 （3）200mL锥形瓶4）100mL容量瓶 （5）吸管（6）试管 （7）试管架（8）乳钵 4．试剂 （1）0.4％酪蛋白醋酸钠溶液200mL 取0.4g酪蛋白，加少量水在乳钵中仔细地研磨，将所得的蛋白质悬胶液移入200mL锥形瓶内，用少量40—50℃的温水洗涤乳钵，将洗涤液也移入锥形瓶内。加入10mL1mol／L 醋酸钠溶液。把锥形瓶放到50 C水浴中，并小心地旋转锥形瓶，直到酪蛋白完全溶解为止。

将锥形瓶内的溶液全部移至100mL容量瓶内，加水至刻度，塞紧玻塞，混匀。 （2）1.00mol／L醋酸溶液100mL （3）0.10mol／L醋酸溶液100mL （4）0.01 mol／L醋酸溶液 50mL 5．操作 取同样规格的试管4支，按下表顺序分别精确地加入各试剂，然后混匀。 （2）向以上试管中各加酪蛋白的醋酸钠溶液1mL，加一管，摇匀——管。此时1、2、3、4管的pH依次为5.9、5.3、4.7、3.5。观察其混浊度。静置10分钟后，再观察其混浊度。最 混浊的一管的pH即为酪蛋白的等电点。

牛奶中提取酪蛋白

牛奶中提取酪蛋白 [目的与要求] 1、了解等电点沉淀法 2、学习从牛奶中制备酪蛋白的方法 3、加深对蛋白质等电点性质的理解 [原理] 蛋白质是一种亲水胶体，在水溶液中蛋白质分子表面形成一个水化层。另外，蛋白质又是一种两性离子，在一定pH溶液能够维持一个稳定的状态。但是调节蛋白质溶液的pH值至等电点时，蛋白质会因失去电荷而变得不稳定，此时若再加脱水剂或加热，水化层被破坏，蛋白质分子就相互凝聚而析出。等电点沉淀法主要利用两性电解质分子在等电点时溶解度最低的原理，而多种两性电解质具有不同等电点而进行分离的一种方法。 牛乳中主要的蛋白质是酪蛋白含量约为35g/L。酪蛋白是一些含磷蛋白质的混合物，等电点为4.7。将牛乳的pH调至4.7时，酪蛋白就沉淀出来。用乙醇洗涤沉淀，除去脂类杂质后便可得到较纯的酪蛋白。 但单独利用等电点沉淀法来分离生化产品效果并不太理想，因为即使在等电点时，有些两性物质仍有一定的溶解度，并不是所有的蛋白质在等电点时都能沉淀下来，特别是同一类两性物质的等电点十分接近时。生产中常与有机溶剂沉淀法、盐析法并用，这样沉淀的效果较好。 本实验目的是使学生运用等电点沉淀法制备酪蛋白，从中加深对蛋白质等电点性质的理解。 [方法和步骤] 1、取预先放冰箱中冷却的消毒牛奶6mL，3 000r/min离心10min，除去脂肪层的乳液置50毫升烧杯内，加热至40℃左右，在搅拌下慢慢加入10mL左右预热的醋酸-醋酸钠缓冲液，此时混浊液中有大量絮状物沉下。冷至室温，3 000r/min离心10min，弃去上清液，得酪蛋白粗品。 2、用蒸馏水洗沉淀三次（每次5mL左右），3 000r/min离心10min，弃去上清液。 3、将沉淀置研钵中，研碎后，渐加5mL 95%乙醇，静置片刻，将全部悬浮液转移至布氏漏斗抽滤，抽干后的制品，用乙醇-乙醚混合液洗沉淀二次（每次5mL），最后用无水乙醚洗沉淀二次（每次5mL），抽干。 4、将沉淀摊开在表面皿上，风干，得酪蛋白制品（称重，记录）。 5、酪蛋白溶液的配制：称取酪蛋白0.1g，置10毫升烧杯中，加5mL 0.2mol/L氢氧化钠溶液，搅匀，隔水加热，溶解后转移至10毫升容量瓶中，用少量蒸馏水洗烧杯数次，洗液并入容量瓶中，最后加水至刻度处，摇匀，置冰箱中保存备用。 [结果与计算] 计算酪蛋白含量和得率： 1、含量：酪蛋白克数/100mL牛奶 2、 100 %? = 理论含量 测得含量 得率 式中理论含量3.5g/100mL牛奶

实验三 蛋白质的两性反应和等电点的测定

实验三蛋白质的两性反应和等电点的测定 一、目的和要求 1.了解蛋白质的两性解离性质。 2.初步学会测定蛋白质等电点的方法。 二、原理 蛋白质由许多氨基酸组成，虽然绝大多数的氨基与羧基成肽键结合，但是总有一定数量自由的氨基与羧基，以及酚基等酸碱基团，因此蛋白质和氨基酸一样时两性电解质。调节溶液的酸碱度达到一定的氢离子浓度时，蛋白质分子所带的正电荷和负电荷相等，以兼性离子状态存在，在电场内该蛋白质分子既不向阴极移动，也不向阳极移动，这时溶液的PH值称为该蛋白质的等电点（PI）。当溶液的PH低于蛋白质等电点时，即在氢离子较多的条件下，蛋白质分子带正电荷成为阳离子；当溶液的PH高于蛋白质等电点时，即在氢氧根离子较多的条件下，蛋白质分子带负电荷成为阴离子。 在等电点时蛋白质溶解度最小，容易沉淀析出。 三、试剂和器材 1.试剂 0.5%酪蛋白溶液；酪蛋白醋酸钠溶液；0.04%溴甲酚绿指示剂；0.02N盐酸； 0.1N醋酸溶液；0.01N醋酸溶液；1N醋酸溶液；0.02N氢氧化钠溶液 2.器材 试管及试管架；滴管；吸量管（1、5ml） 四、操作方法 1.蛋白质的两性反应

（1）取1支试管，加0.5%酪蛋白溶液20滴和0.04%溴甲酚绿指示剂5-7滴，混匀。观察溶液呈观的颜色，并说明原因。 （2）用细滴管缓慢加入0.02N盐酸溶液，随滴随摇，直至有明显的大量沉淀发生，此时溶液的PH接近与酪蛋白的等电点。观察溶液颜色的变化。（3）继续滴入0.02N盐酸溶液，观察沉淀和溶液颜色的变化，并说明原因。（4）再滴入0.02N氢氧化钠溶液进行中和，观察是否出现沉淀，解释其原因。 继续滴入0.02N氢氧化钠溶液，为什么沉淀又会溶液？溶液的颜色如何 变化？说明了什么问题？ 2.酪蛋白等电点的测定 （1）取9支粗细相近的干燥试管，编号后按下表的顺序准确地加入各种试剂。 加入每种试剂后应混合均匀。 （2）静置约20分钟，观察每支试管内溶液的混浊度，以—，+，++，+++，++++符号表示沉淀的多少。根据观察结果，指出哪一个PH是酪蛋白的 等电点？

蛋白质等电点测定

蛋白质等电点测定及性质实验 一、目的： 了解等电点的意义及其与蛋白质分子聚沉能力的关系。 初步学会测定蛋白质等电点的基本方法，了解蛋白质的性质。 二、原理： 固体颗粒在液体中为什么能够带电 当固体与液体接触时，固体可以从溶液中选择性吸附某种离子，也可以是固体分子本身发生电离作用而使离子进入溶液，以致使固液两相分别带有不同符号的电荷，由于电中性的要求，带电表面附近的液体中必有与固体表面电荷数量相等但符号相反的多余的反离子。在界面上带电表面和反离子形成了双电层的结构。在两种不同物质的界面上，正负电荷分别排列成的面层。 对于双电层的具体结构，一百多年来不同学者提出了不同的看法。最早于1879年Helmholz提出平板型模型；1910年Gouy和1913年Chapman修正了平板型模型，提出了扩散双电层模型；后来Stern又提出了Stern模型。 根据O.斯特恩的观点，一部分反离子由于电性吸引或非电性的特性吸引作用（例如范德华力）而和表面紧密结合，构成吸附层（或称紧密层、斯特恩层）。其余的离子则扩散地分布在溶液中，构成双电层的扩散层（或称滑移面）。由于带电表面的吸引作用，在扩散层中反离子的浓度远大于同号离子。离表面越远，过剩的反离子越少，直至在溶液内部反离子的浓度与同号离子相等。

紧密层：溶液中反离子及溶剂分子受到足够大的静电力，范德华力或特性吸附力，而紧密吸附在固体表面上。其余反离子则构成扩散层。 滑动面：指固液两相发生相对移动的界面，是凹凸不平的曲面。滑动面至溶液本体间的电势差称为ζ电势。 固体颗粒带电量的大小及测量方式 ζ电势只有在固液两相发生相对移动时才能呈现出来。ζ电势的大小由Zeta电位表示，其数值的大小反映了胶粒带电的程度，其数值越高表明胶粒带电越多，扩散层越厚。一般来说，以pH值为横坐标，Zeta电位为纵坐标作图，Zeta电位为零对应的pH值即为等电点。 对于蛋白质分子来说： 蛋白质分子的大小在胶粒范围内，约1～100微米。大部分蛋白质分子的表面都有很多亲水集团，这些集团以氢键形式与水分子进行水合作用，使水分子吸附在蛋白质分子表面而形成一层水合膜，具有亲水性；又由于蛋白质分子表面的亲水集团都带有电荷，会与极性水分子中的异性电荷吸引形成双电层。而水合膜和双电层的存在，使蛋白质的分子与分子之间不会相互凝聚，成为比较稳定的胶体溶液。如果消除水合膜或双电层其中一个因素，蛋白质溶液就会变得不稳定，两种因素都消除时，蛋白质分子就会互相凝聚成较大的分子而产生沉淀。在生活实践中，常利用蛋白质的胶体性质沉淀或分离蛋白质。如做豆腐、肉皮冻就是利用蛋白质的胶凝作用。 蛋白质分子所带的电荷与溶液的pH值有很大关系，蛋白质是两性电解质，在酸性溶液中的氨基酸分子氨基形成-NH3+而带正电，在碱性溶液中羧基形成-COO-而带负电： 蛋白质分子所带净电荷为零时的pH值称为蛋白质的等电点（PI）。其定义为：在某一pH的溶液中，蛋白质解离成阳离子和阴离子的趋势或程度相等时，呈电中性，此时溶液的pH称为该蛋白质的等电点。 等电点的应用：主要用于蛋白质等两性电解质的分离、提纯和电泳。 蛋白质等电点的测量方式：溶解度最低时的溶液pH。

生物化学实验四 酪蛋白的制备

实验四酪蛋白的制备 一、目的要求 学习和掌握从牛乳中制备蛋白的原理和方法；掌握等电点沉淀法提取蛋白质的原理和方法；掌握离心方法。 二、实验原理 牛乳中主要的蛋白质是酪蛋白，含量约为3.5g/L。酪蛋白是一些含磷蛋白质的混合物，等电点为4.7.利用等电点时溶解度最低的原理，将牛乳的pH调至4.7时，酪蛋白就沉淀出来。用乙醇洗涤沉淀物，除去脂类杂质后便可得到纯的酪蛋白。 三、材料、器材与试剂 1〉材料 鲜牛奶。 2〉器材 离心机、抽滤装置、精密pH试纸、电炉、烧杯、温度计、玻棒、漏斗、滤纸、滴管。3〉试剂 (1) 95%乙醇。 (2) 无水乙醚。 (3) 0.2mol/L pH4.7醋酸-醋酸钠缓冲液。 A液：0.2mol/L醋酸钠溶液，称取CH3COON a·3H2O 54.44g，用蒸馏水定容至2000ml。 B液：0.2mol/L醋酸溶液，称取优级纯醋酸(含量大于99.8%)24.0g，定容至2000ml。 取A液1770ml，B液1230ml混合即可得pH4.7的醋酸-醋酸钠缓冲液3000ml。 (4)乙醇-乙醚混合液的配制：乙醇-乙醚=1:1(体积分数)。 四、实验步骤 (1)将20ml牛奶加热至40°C，在搅拌下慢慢加入预热至40°C、pH4.7的醋酸缓冲液20ml。用精密pH试纸调pH至4.7，将上述悬浮液冷却至室温，离心15min(3000r/min)，弃去上清液，得到酪蛋白粗制品。 (2)用水洗1次，离心10min，弃去上清液。 (3)在沉淀中加30ml乙醇，搅拌片刻，将全部悬浮液转移至布氏漏斗中离心10min，弃上清液，用乙醇-乙醚混合液洗1次。最后用乙醚洗沉淀1次，抽干或滤纸过滤得到湿的酪蛋白。 (4)将沉淀摊开，风干；得到酪蛋白纯品。 五、结果及处理 准确称重，得20ml牛乳中酪蛋白含量(g)，按下式计算酪蛋白的得率： 测得含量 得率(%)= 理论含量×100 式中，理论含量为3.5g/100ml牛乳。 实验结果： (1.426-0.795) ×5 得率(%)= 3.5 ×100=90.14%

常见蛋白质等电点参考值

常见蛋白质等电点参考值 常见蛋白质等电点参考值 蛋白质等电点蛋白质等电点 鲑精蛋白［salmｉne]鲱精蛋白［clｕpein ｅ］ 血清白蛋白［seruｍａｌｂumiｎ] 鲟精蛋白［stｕrline］胸腺组蛋白[ｔｈymohistone] 珠蛋白（人）［globin （hｕmaｎ）] 卵白蛋白［ｏｖaｌbu ｉn］ 伴清蛋白［ｃoｎaｌ1２。1 12。１ ４。７—4。 9 １１。71 1０．8 7.5 ４.７ 1;4.59 ６。8,7。1 ３.5 6.3 5。1—５.3 肌红蛋白［myｏgｌobｉｎ］ 血红蛋白（人）［heｍｏgｌ obin(human）］ 血红蛋白(鸡）[hemoglobiｎ（ｈ en）] 血红蛋白（马）［hemoｇlｏbi ｎ(horse）] 血蓝蛋白［ｈemｅryｔhｒin］ 蚯蚓血红蛋白［cｈlorｏcruｏ ｒin］ 血绿蛋白[cｈlorｏｃrｕｏrｉ n] 无脊椎血红蛋白[eｒyｔ 7．０7 7。２3 6.92 4.6－ ６.4 5。6 ４。3－ 4.5 4。6— 6．2 9.8— 10.1 4.47—

ｂumin］ 肌清蛋白[ｍｙoａl bｕmｉn] 肌浆蛋白［mｙoｇen A］β－乳球蛋白［β—lactoｇlｏbuliｎ] 卵黄蛋白［liｖeｔin]γ1—球蛋白（人）[γ１-ｇｌｏｂuliｎ（ｈumaｎ)] γ2-球蛋白（人）[γ2—glｏbulin(hｕｍa ｎ）］ 肌球蛋白A［myosin A] 原肌球蛋白［ｍyosｉn Ａ]４。８－5。 ５.8，6.6， 7。３,８.2 ５.2-5.5 5.1 5。9 ３.４－3。 5 5．5－5.8 ４.８ 6．0 5．1 3.9 3.7－5．０ ４。6-4。 ７ hrocruoriｎs] 细胞色素Ｃ［cｙｔochromｅ Ｃ] 视紫质［rhodopsiｎ］ 促凝血酶原激酶[ｔｈ romboplastｉｎ] α1－脂蛋白［α1-lｉpoprot ｅｉn］ β1－脂蛋白[β１-lｉｐ oproteiｎ］ β—卵黄脂磷蛋白［β－ｌｉｐ oｖitｅｌlin］ 芜菁黄花病毒［turnip yeｌｌ ow vvｉrus] 牛痘病毒[vaｃｃｉnｉa virｕ s] 生长激素［ｓomａtｏｔroｐin] 4.57 5。2 ５．5 5．4 ５.9 ３。75 5。3 6.85 5。７3 5。35 1.0 ８。1 4。9 7．８ ４．5８ 4 3．８3

蛋白质的等电点测定与沉淀实验

实验项目一、蛋白质的等电点测定及沉淀反应 姓名：指导教师：实验室： 组员：成绩： 第三部分：实验记录与分析 实验现象记录及分析： （一）蛋白质等电点测定 （二）蛋白质的盐析 1．蛋白质的盐析

2．重金属离子沉淀蛋白质 3．有机酸沉淀蛋白质

4．有机溶剂沉淀蛋白质 5．乙醇引起的变性与沉淀

第四部分：课后研讨题 1.通过本次合作实验后，有否对该项目改进的合理建议。 适当增加对照组和空白组，使实验数据更加科学可信。 2.鸡蛋清为何可做铅、汞中毒的解素剂？ 铅、汞是重金属离子，与蛋白质结合能使蛋白质分子内部结构发生重大改变，发生变性而沉淀，不再溶于原来的溶剂中。 3.氯化汞为何能做为杀菌剂？ 细菌由蛋白质构成，氧化汞是重金属盐，与蛋白质结合能使蛋白质分子内部结构发生重大改变，发生变性而沉淀，不再溶于原来的溶剂中。 4.在等电点时，蛋白质溶液为什么容易发生沉淀？ 蛋白质颗粒上正负电荷的数目相等，在水溶液中的蛋白质分子由于表面生产水化层和双电层而成为稳定的亲水胶体颗粒，在一定的理化因素影响下，蛋白质颗粒可因失去电荷和脱水而沉淀。

5.将本实验中所涉及到的几种蛋白质沉淀方法各举一应用实例加以说明。 （1）盐析：硫酸铵的浓溶液能析出蛋白质。 （2）乙醇引起的变性与沉淀：低温下用乙醇或丙酮短时间作用于蛋白质，用于提纯蛋白质。 （3）重金属离子沉淀蛋白质：取一支离心管，加入2ml的蛋白质溶液，再加入3%硝酸银溶液1-2滴，振荡试管，观察现象。 （4）某些有机酸沉淀蛋白质：取一支离心管，加入2ml蛋白质溶液，再加入1ml 5%三氯乙酸溶液，振荡试管，观察现象。 （5）有机溶剂沉淀蛋白质：取一支离心管，加入2ml蛋白质溶液，再加入2ml 95%乙醇，观察现象。 教师评阅： 签名

《生物化学》实验指导(8个实验)

生物化学实验指导 吕杰编著 新疆大学资源与环境科学学院生态学教研室

内容介绍 《生物化学实验指导》是新疆大学资源与环境科学学院《生物化学》课程组的教师在参考国内重点院校、科研院所的生物化学实验与实习教材的基础上，结合教师的教学经验汇编而成。该实习指导围绕教学大纲设计了8个实验内容。

目录 实验一氨基酸纸层析 (4) 实验二DNS-CL法测定N末端氨基酸 (5) 实验三考马斯亮蓝法测定蛋白质的浓度 (7) 实验四酪蛋白的制备 (8) 实验五葡萄糖标准曲线的绘制 (10) 实验六酵母蔗糖酶的提取及活力测定 (12) 实验七酵母RNA的分离及组分鉴定 (14) 实验八维生素C的定量测定 (16)

实验一氨基酸纸层析 一、实验目的 1、通过氨基酸的纸层析分离，学习纸层析的基本原理和操作方法。 二、实验原理 纸层析：是以滤纸作为支持物的分配层析法，是20世纪40年代发展起来的一种生化分离技术。由于设备简单，操作方便，所需样品量少，分辨力较高等优点而广泛的用于物质的分离，并可进行定性和定量的分析。缺点是展开时间较长。 分配层析法：是利用物质在两种或两种以上不同的混合溶剂中的分配系数不同，而达到分离的目的的一种实验方法。 在一定条件下，一种物质在某种溶剂系统中的分配系数是一个常数即α=溶质在固定相的浓度/溶质在流动相的浓度。溶剂系统：由有机溶剂和水组成，水和滤纸纤维素有较强的亲和力，因而其扩散作用降低形成固定相，有机溶剂和滤纸亲和力弱，所以在滤纸毛细管中自由流动，形成流动相，由于混合液中各种氨基酸的分配系数值不同，其在两相中的分配数量及移动速率（即迁移率Rf值）就不同，从而达到分离的目的。 三、实验材料、仪器和试剂： 1、实验材料：标准氨基酸溶液 2、仪器: 层析缸，层析纸，毛细管，天平，吹风机等。 3、试剂： （1）氨基酸标准溶液：0.1M丙氨酸和0.1M谷氨酸标准溶液。 （2）溶剂系统：正丁醇：甲酸：水=15：3：2（体积比）摇匀； （3）0. 1%的茚三酮丙酮溶液；茚三酮1—5克，丙酮100毫升 四、实验步骤： 纸层析 (1) 取一长方形滤纸，在滤纸纵向对应的两边距边沿2cm 处，用铅笔轻轻的各画两条平行线，一条作前沿标志，一条作点样线，在点线上每隔2cm 画一个“+”作为点样位置，共5个点。 (2) 点样：用毛细管点样，其中2个点用毛细管点上氨基酸的标准溶液；中间间隔一点，另2点点上未知氨基酸的溶液。每个点样点重复点5次，每点一次用电吹风吹干后再点下次，点样点的直径应控制在2mm左右，点样完毕用大头针将滤纸做成筒形，点样面向外，注意纸的两边不要接触。 (3) 展层：向层析缸中加入层析溶剂，液层不要超过点样线（高约1.5cm，约50－60ml 溶剂），将滤纸点样点朝下放入层析溶剂中，将层析缸密闭，待溶剂到达标志线后取出，吹干。 (4)显色：用喷雾器将茚三酮显色剂均匀喷在滤纸上，吹风机热风吹干显色。 五.结果分析： (1)用铅笔将层析色谱轮廓和中心点描出来； (2) 测量原点至色谱中心和至溶剂前沿的距离，计算各种氨基酸色谱的Rf 值。 Rf=组分移动的距离/溶剂前沿移动的距离 =原点至组分斑点中心的距离/原点致溶剂前沿的距离 六、思考题： 1、何谓分配层析法和分配系数？

实验三 等电聚焦电泳法测定蛋白质的等电点

实验三等电聚焦电泳法测定蛋白质的等电点 一、实验目的 了解等电聚焦的原理。通过蛋白质等电点的测定，掌握聚丙烯酰胺凝胶垂直管式等电聚焦电泳技术。 二、实验原理 等电聚焦（Isoelectric focusing，简称IEF）是六十年代中期出现的新技术。近年来等电聚焦技术有了新的进展，已迅速发展成为一门成熟的近代生化实验技术。目前等电聚焦技术已可以分辨等电点（pI）只差0.001pH单位的生物分子。由于其分辨力高，重复性好，样品容量大，操作简便迅速，在生物化学、分子生物学及临床医学研究中得到广泛的应用。 蛋白质分子是典型的两性电解质分子。它在大于其等电点的pH环境中解离成带负电荷的阴离子，向电场的正极泳动，在小于其等电点的pH环境中解离成带正由荷的阳离子，向电场的负极泳动。这种泳动只有在等于其等电点的pH环境中，即蛋白质所带的净电荷为零时才能停止。如果在一个有pH梯度的环境中，对各种不同等电点的蛋白质混合样品进行电泳，则在电场作用下，不管这些蛋白质分子的原始分布如何，各种蛋白质分子将按照它们各自的等电点大小在pH梯度中相对应的位置处进行聚焦，经过一定时间的电泳以后，不同等电点的蛋白质分子便分别聚焦于不同的位置。这种按等电点的大小，生物分子在pH梯度的某一相应位置上进行聚焦的行为就称为“等电聚焦”。等电聚焦的特点就在于它利用了一种称为两性电解质载体的物质在电场中构成连续的pH梯度，使蛋白质或其他具有两性电解质性质的样品进行聚焦，从而达到分离、测定和鉴定的目的。 两性电解质载体，实际上是许多异构和同系物的混合物，它们是一系列多羧基多氨基脂肪族化合物，分子量在300~1000之间。常用的进口两性电解质为瑞典Pharmacia-LKB公司生产的Ampholine 和Pharmalyte，价格昂贵。国产的有中国军事医学科学院放射医学研究所和上海生化所生产的两性电解质，价格便宜，质量尚佳。两性电解质在直流电场的作用下，能形成一个从正极到负极的pH值逐渐升高的平滑连续的pH梯度。若不同的pH值的两性电解质的含量与pI值的分布越均匀，则pH梯度的线性就越好。对Ampholine两性电解质的要求是缓冲能力强，有良好的导电性，分子量要小，不干扰被分析的样品等。 在聚焦过程中和聚焦结束取消了外加电场后，如保持pH梯度的稳定是极为重要的。为了防止扩散，稳定pH梯度，就必须加入一种抗对流和扩散的支持介质，最常用的这种支持介质就是聚丙烯酰胺凝胶。当进行聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳时，凝胶柱内即产生pH梯度，当蛋白质样品电泳到凝胶柱内某一部位，而此部位的pH值正好等于该蛋白质的等电点时，该蛋白质即聚焦形成一条区带，只要测出此区带所处部位的pH值，即为其等电点。电泳时间越长，蛋白质聚焦的区带就越集中，越狭窄，因而提高了分辨率。这是等电聚焦的一大优点，不像一般的其他电泳，电泳时间过长则区带扩散。所以等电聚焦电泳法不仅可以测定等电点，而且能将不同等电点的混合的生物大分子进行分184

1蛋白质的等电点是指教学提纲

1蛋白质的等电点是指( ) 蛋白质分子的正电荷与负电荷相等时溶液的pH值 2 蛋白质高分子溶液的特性有( ) 黏度大、 3维持蛋白质三级结构的主要键是( )次级键 4 DNA水解后可得下列哪组产物( ) 胞嘧啶、胸腺嘧啶 5 蛋白质的主要特点是( ) . 生物学活性丧失 6 肽类激素诱导cAMP生成的过程是( ) 激素受体复合物使G蛋白结合GTP而活化，后者再激活腺苷酸环化酶 7 芳香族氨基酸是( ) 苯丙氨酸 8 蛋白质分子中主要的化学键是( ) 肽键 9对酶来说，下列不正确的有( ) 酶可加速化学反应速度，因而改变反应的平衡常数 10盐析沉淀蛋白质的原理是( ) 中和电荷，破坏水化膜 11 酶化学修饰调节的主要方式是( ) 磷酸化与去磷酸化 12 关于蛋白质的二级结构正确的是( ) 是多肽链本身折叠盘曲而形成 13 DNA复制的叙述错误的是( ) 两条子链均连续合成 14 关于酶的叙述正确的一项是( ) 所有酶的本质都是蛋白质 15下列脱氧核苷酸不存在于DNA中的是, . dUMP 16 关于组成蛋白质的氨基酸结构，正确的说法是( ) 在α-碳原子上都结合有氨基或亚氨基 17 核酸对紫外线的最大吸收峰在( ) 260nm 18关于酶的非竞争性抑制作用正确的说法是( ) Km值不变 19非竞争性抑制作用与竞争性抑制作用的不同点在于前者的( ) 提高底物浓度，Vm仍然降低 20 下列影响细胞内cAMP含量的酶是( ) 腺苷酸环化酶 21. 关于酶与温度的关系，错误的论述是（）D. 酶的最适温度与反应时间有关 22变性蛋白质的特性有( ) B. 生物学活性丧失 4. 逆转录时碱基的配对原则是( ) B. U－A 5. 分子病主要是哪种结构异常（） A. 一级结构 6. DNA分子中的碱基组成是( ) A. A＋C＝G＋T 7. 蛋白质的一级结构和空间结构决定于( ) C. 氨基酸组成和顺序 8. 关于碱基配对，下列错误的是( ) E. A-G，C-T相配对 9. 参加DNA复制的是( ) D. DNA指导的DNA聚合酶 10. DNA分子杂交的基础是( ) A. DNA变性后在一定条件下可复性 11. 酶的活性中心是指( ) A. 由必需基团组成的具有一定空间构象的区域 13. 关于肽键与肽，正确的是( ) A. 肽键具有部分双键性质 14. 酶原所以没有活性是因为( ) B. 活性中心未形成或未暴露 15. 有关cAMP的叙述是( C. cAMP是激素作用的第二信使 16. 下列具有四级结构的蛋白质是( ) D. 乳酸脱氢酶H型和M型两种亚基组成的四聚体 17 关于酶的竞争性抑制作用的说法正确的是( ) D. 增加底物浓度可减弱抑制剂的影响 19. 蛋白质变性和DNA变性的共同点是( ) A. 生物学活性丧失 20. 在核酸中占9%-11%，且可用于计算核酸含量的元素是( ) E. 磷 21. 维持DNA双螺旋结构稳定的因素有( ) B. 碱基对之间的氢键 22. DNA分子中的碱基组成是( ) A. A＋C＝G＋T 1. 嘌呤环中的氮原子来自( ) C. 谷氨酰胺 2. 关于尿糖，哪项说法是正确的B. 尿糖阳性是肾小管不能将尿糖全部重吸收 3. 激素敏感脂肪酶是指( ) D. 脂肪细胞中的甘油三酯脂肪酶 4. 正常人摄入糖过多后，不可能发生的反应是E. 糖转变为蛋白质

实验报告-从牛奶中分离酪蛋白

实验报告 一、实验名称：从牛奶中分离酪蛋白 二、实验目的： 1.学习从胶体中提取某一类物质的方法。 2.学习蛋白质的各种颜色反应及其原理。 三、实验原理： 1.蛋白质是两性化合物，溶液的酸碱性直接影响蛋白质分子所带的电荷。当调节牛奶 的pH值达到酪蛋白的等电点（pl）4.8左右时，蛋白质所带正、负电荷相等，呈电 中性，此时酪蛋白的溶解度最小，会以沉淀形式从牛奶中析出。 2.缩二脲反应原理：具有两个或两个以上肽键的化合物在碱性条件下与Cu2+反应,生 成红紫色的络合物。所有的蛋白质均有此显色反应。 3.蛋白黄色反应原理：硝酸将蛋白质分子中的苯环硝化，在加热状态下产生了黄色硝 基苯衍生物，再加碱颜色加深呈橙黄色。这是含有芳香族氨基酸特别是含有酪氨酸 和色氨酸的蛋白质所特有的颜色反应。 4.茚三酮反应原理：蛋白质与茚三酮共热，产生蓝紫色的还原茚三酮、茚三酮和氨的 缩合物。此反应为一切氨基酸及α-氨基酸所共有。 四、实验步骤及现象： 1.取50mL脱脂牛奶于150mL烧杯中，用热水浴加热至40℃，维持此温度，边搅拌 边加稀醋酸（1：9）溶液约2mL——有白色沉淀析出。 2.继续搅拌并使悬浊液冷却至室温，然后将混合物转入离心杯中，于3000r/min离心 15min。 3.离心完毕后，上清液倒入乳糖回收瓶中，沉淀用95%的乙醇（20ml）搅匀，然后用 布氏漏斗减压过滤，用乙醇-乙醚（1：1）混合液洗涤沉淀2次，每次约10ml，最 后用5ml乙醚洗涤沉淀一次，减压过滤至干——得到干燥的白色固体。 4.将干粉铺于表面皿上，称量并计算牛奶中酪蛋白含量。 5.称取0.5g酪蛋白，溶解于0.4M氢氧化钠溶液的生理盐水（5mL）中，然后滴加3-4 滴1%硫酸铜溶液，振荡试管——溶液变成紫色。 五、实验数据： 空表面皿的质量m0 =28.15g 表面皿与酪蛋白的总质量m1 =31.78g 牛奶中酪蛋白的质量m= m1 - m0 =3.63g 六、讨论与感想： 1.牛奶是一种胶体，在正常情况下是均一稳定的，要想分离出其中的某一成分，就应 该想办法使这种成分变成沉淀析出。通过本次实验，我知道了可以通过调节胶体的 酸碱性，来改变蛋白质分子所带电荷，使其达到等电点。此时蛋白质分子间的电荷 作用力最小，分子间没有了间隙，浮力减小，蛋白质就会沉淀。而实验中50ml牛 奶和2ml稀醋酸（1：9）所配成的混合液的pH恰好在4.8左右，正好是蛋白质的

酪蛋白的制备

上海大学生命科学实验中心 实验预习报告 课程：姓名：日期： 学号：同组者：指导老师： 实验时间：温度：湿度： （一律用A4纸、钢笔书写或打印，不得涂改，经教师签字后方为有效，附在实验报告中一并交。 如无此原始记录或丢失，报告不批示成绩） 实验名称：酪蛋白的制备 1.目的：学习从牛乳中制备酪蛋白的原理和方法，并依此加深对等电点概念的印象。 2.原理、仪器设备、材料和试剂： 原理：牛乳中主要含有酪蛋白和乳清蛋白两种蛋白质。其中酪蛋白占了牛乳蛋白质的80%。酪蛋白是白色、无味的物质。不溶于水、乙醇及有机溶剂，但溶于碱溶液。牛乳在pH4.7时酪蛋白等电聚沉后剩余的蛋白质统称乳清蛋白。乳清蛋白不同于酪蛋白，其粒子的水合能力强、分散性高，在乳中呈高分子状态。 在处于其等电点时，兼性离子/粒子在溶液中的溶解度降低；如果我们将牛奶的pH 调到4.7，就可获得酪蛋白沉淀；下一步，用乙醇、乙醇-乙醚混合物、乙醚来洗涤沉淀物，以去除脂溶性杂质，就可得到较纯的酪蛋白。 试剂：95%乙醇；无水乙醚；乙醇—乙醚混合液(V/V=1∶1) 。 0.2mol/L pH4.7醋酸—醋酸钠缓冲液3000mL： A液：称取NaAc 3H2O 54.44g，定容至2000mL。 B液：称取优级纯醋酸（含量大于99.8%）12.0g定容至1000mL。 取A液1770mL，B液1230mL混合即得pH4.7的醋酸—醋酸钠缓冲液3000mL。 仪器：离心机；抽滤装置；研钵；布氏漏斗；容量瓶。 3.操作步骤及现象记录 1．将20mL pH4.7的醋酸-醋酸钠缓冲液预热至40℃。将20mL牛奶加热至40℃，在搅拌下缓慢地加入20mL预热的pH4.7的醋酸-醋酸钠缓冲液。 2．用精密pH试纸调pH至4.7，可见溶液变为乳白色悬浮液。待悬浮液冷却至室温，3000rpm离心

酪蛋白的制备实验报告

竭诚为您提供优质文档/双击可除酪蛋白的制备实验报告 篇一：酪蛋白的制备----生化实验 酪蛋白的制备 一、目的 1、学习从牛奶中制备酪蛋白的原理和方法。 2、掌握等电点沉淀法提取蛋白质的方法。 二、原理 牛乳中的主要的蛋白质是酪蛋白，含量约为35g/L。酪蛋白是一些含磷蛋白质的混合物，等电点为4.7。利用等电点时溶解度最低的原理，将牛乳的ph调至4.7时，酪蛋白就沉淀出来。用乙醇洗涤沉淀物，除去脂类杂质后便可得到纯酪蛋白。 三、材料、试剂与器具 （一）材料 新鲜牛奶 （一）试剂 1、95%乙醇1200mL

2、无水乙醚1200mL 3、0.2mol/Lph4.7醋酸——醋酸钠缓冲液300ml先配A液与b液 A液：0.2mol/L醋酸钠溶液称naAc·3h2o54.44g，定容至2000ml。b液：0.2mol/L醋酸溶液，称优纯醋酸（含量大于99.8%）12.0g定容至1000ml。 取A液1770ml，b液1230ml混合即得ph4.7的醋酸——醋酸钠缓冲液3000ml。 4、乙醇——乙醚混合液 乙醇：乙醚=1：1（V/V） （二）器具 1、离心机 2、抽滤装置 3、精密ph试纸或酸度计 4、电炉 5、烧杯 6、温度计 四、操作步骤 （一）酪蛋白的粗提 100mL牛奶加热至40℃。在搅拌下慢慢加入预热至40℃、ph4.7的醋酸缓冲液100mL.用精密ph试纸或酸度计调ph至4.7。 将上述悬浮液冷却至室温。离心15分钟（3000r/min）。弃去清液，得酪蛋白粗制品。 （二）酪蛋白的纯化 1、用水洗涤沉淀3次，离心10分钟（3000r/min），弃

去上清液。 2、在沉淀中加入30mL乙醇，搅拌片刻，将全部悬浊液转移至布氏漏斗中抽滤。用乙醇—乙醚混合液洗沉淀2次。最后用乙醚洗沉淀2次，抽干。 3、将沉淀摊开在表面上，风干；得酪蛋白纯品。 （三）准确称重，计算含量和得率。 含量：酪蛋白g/100mL牛乳（g%） 式中理论含量为3.5g/100mL牛乳。 五、注意事项 1、由于本法是应用等电点沉淀法来制备蛋白质，故调节牛奶液的等电点一定要准确。最好用酸度计测定。 2、精制过程用乙醚是挥发性、有毒的有机溶剂，最好在通风橱内操作。 3、目前市面上出售的牛奶是经加工的奶制品，不是纯净牛奶，所以计算时应按产品的相应指标计算。 六、实验报告 1、根据实际操作，以流程图形式总结酪蛋的制备方法。 2、合理分析实验所得率 七、思考题 1、制备高产率纯酪蛋白的关键是什么？ 2、试设计另一种提取酪蛋白的方法？ 篇二：实验四、酪蛋白的制备

何谓蛋白质的等电点其大小和什么有关系经氨基酸

第一章 1．何谓蛋白质的等电点？其大小和什么有关系？ 2．经氨基酸分析测知1mg某蛋白中含有45ug的亮氨酸（MW131．2），23.2ug的酪氨酸(MW204.2)，问该蛋白质的最低分子量是多少？ 3．一四肽与FDNB反应后，用6mol/L盐酸水解得DNP－Val．及三种其他氨基酸。当这种四肽用胰蛋白酶水解，可得到两个二肽，其中一个肽可发生坂口反应，另一个肽用LiBH4还原后再进行水解，水解液中发现有氨基乙醇和一种与茚三酮反应生成棕褐色产物的氨基酸，试问在原来的四肽中可能存在哪几种氨基酸，它们的排列顺序如何？ 4．一大肠杆菌细胞中含 10个蛋白质分子，每个蛋白质分子的平均分子量为40 000，假定所有的分子都处于a螺旋构象。计算其所含的多肽链长度？ 5．某蛋白质分子中有一40个氨基酸残基组成的肽段，折叠形成了由2条肽段组成的反平行?折叠结构，并含有一?转角结构，后者由4个氨基酸残基组成。问此结构花式的长度约是多少？ 6．某一蛋白样品在聚丙烯酸胺凝胶电泳（PAGE）上呈现一条分离带，用十二烷基硫酸钠(SDS)和硫基乙醇处理后再进行SDS－PAGE电泳时得到等浓度的两条分离带，问该蛋白质样品是否纯？ 7．“一Gly－Pro－Lys－Gly－Pro－Pro－Gly－Ala－Ser－Gly－Lys－Asn一”是新合成的胶原蛋白多肽链的一部分结构，问： 1）哪个脯氨酸残基可被羟化为4一羟基脯氨酸？ 2）哪个脯氨酸残基可被羟化为3一羟基脯氨酸？ 3）哪个赖氨酸残基可被羟化？ 4）哪个氨基酸残基可与糖残基连接？ 8．一五肽用胰蛋白酶水解得到两个肽段和一个游离的氨基酸，其中一个肽段在280nm有吸收，且 Panly反应、坂口反应都呈阳性；另一肽段用汉化氰处理释放出一个可与茚三酮反应产生棕褐色产物的氨基酸，此肽的氨基酸排列顺序如何？ 9．研究发现，多聚一L－Lys在pH7.0呈随机螺旋结构，但在pH10为a螺旋构象，为什么？预测多聚一L－Glu在什么pH条件下为随机螺旋，在什么pH下为a螺旋构象？为什么？10．Tropomyosin是由两条a螺旋肽链相互缠绕构成的超螺旋结构。其分子量为 70 000，假设氨基酸残基的平均分子量为110，问其分子的长度是多少？ 11．某肽经 CNBr水解得到三个肽段，这三个肽的结构分别是：Asn－Trp－Gly-Met，Gly-Ala －Leu，Ala－Arg－Tyr－Asn－Met；用胰凝乳蛋白酶水解此肽也得到三个肽段，其中一个为四肽，用 6mol/L盐酸水解此四肽只得到（Asp）2和 Met三个氨基酸，问此肽的氨基酸排列顺序如何？ 12．列举蛋白质主链构象的单元及它们的主要结构特征。 13．试比较蛋白质的变性作用与沉淀作用。 14．将一小肽（pI=8.5）和 Asp溶于 pH7．0的缓冲液中，通过阴离子交换树脂柱后，再进行分子排阻层析，那么Asp和小肽哪一个先从凝胶柱上被洗脱下来，为什么？ 15．从理论和应用上说明有机溶剂、盐类、SDS、有机酸等对蛋白质的影响。 16．血红蛋白和肌红蛋白都具有氧合功能，但它们的氧合曲线不同，为什么？ 17．为什么无水肼可用于鉴定C-端氨基酸？ 18．Anfinsen用核糖核酸酶进行的变性一复性实验，在蛋白质结构方面得出的重要结论是什么？ 19．蛋白质分离纯化技术中哪些与它的等电点有关？试述这些技术分离提纯蛋白质的原理。20．根据下列资料推出某肽的氨基酸排列顺序。

酪蛋白的初步鉴定

酪蛋白 内容提要：蛋白质是由氨基酸构成的高分子化合物。蛋白质同氨基酸一样是两性电解质，调节蛋白质溶液的pH值可使蛋白质分子所带的正负电荷数目相等，即溶液中的蛋白质以兼性离子形式存在，在外加电场中既不向阴极也不向阳极移动。这时溶液的pH值称为该蛋白质的等电点。在等电点条件下，蛋白质溶解度最小，因此就会有沉淀析出。牛乳中主要含有酪蛋白和乳清蛋白两种蛋白质，其中酪蛋白占了牛乳蛋白质的80%。酪蛋白是白色、无味的物质。不溶于水、乙醇及有机溶剂，但溶于碱溶液。牛乳在pH 4.7时酪蛋白等电聚沉后剩余的蛋白质统称乳清蛋白。乳清蛋白不同于酪蛋白，其粒子的水合能力强、分散性高，在乳中呈高分子状态。提取到酪蛋白后，可以用双缩脲反应、茚三酮反应、黄色反应来鉴定分析。 关键词：酪蛋白制备定性分析鉴定 1、实验目的 （1）学习从牛乳中制备酪蛋白的原理和方法。 （2）对酪蛋白进行分析鉴定。 2、实验原理 牛乳中主要的蛋白质是酪蛋白，含量约为35g/L。酪蛋白食一些含磷蛋白质的混合物，等电点为4.7。利用等电点时溶解度最低的原理，将牛乳的pH调至4.7时，酪蛋白就沉淀出来。用乙醇洗涤沉淀物，除去脂类杂质后便可得到纯的酪蛋白。 双缩脲：尿素加热至180℃左右，生成双缩脲并放出一分子氨。双缩脲在碱性环境中能与铜离子结合生成紫红色化合物，此反应称为双缩脲反应。蛋白质分子中有肽键，其结构与双缩脲相似，也能发生此反应。可用于蛋白质的定性或定量测定。 茚三酮反应：一切蛋白质都能和茚三酮反应生成蓝紫色物质，但能与茚三酮呈阳性反应的不一定就是蛋白质或氨基酸。在定性、定量测定中，应严防干扰物存在。反应分为两步，第一步是氨基酸被氧化形成二氧化碳、氨分子和醛，水合茚三酮被还原成还原型茚三酮；第二步是所形成的还原型茚三酮同另一个水合茚三酮分子和氨缩合生成有色物质。反应的适宜ｐＨ为５－７，同一浓度的蛋白质或氨基酸在不同ｐＨ条件下的颜色深浅不同，酸度过大时甚至不显色。 3、实验试剂、材料与器材 3、1试剂与材料