结核感染T细胞检测(斑点法)说明书

结核感染T细胞检测试剂盒（免疫斑点法）说明书

【产品名称】

通用名称：结核感染T细胞检测试剂盒（免疫斑点法）

英文名称：T-SPOT.TB

【包装规格】

24人份/盒。

【预期用途】

该产品用于检测人外周抗凝全血中的结核特异抗原刺激活化的效应T细胞，仅适用于临床疑似结核病的辅助诊断。

结核感染的免疫应答反应以细胞免疫为主，作为免疫应答的一部分，T细胞受结核抗原刺激致敏，形成活化的效应T细胞，包括CD4和CD8，从全血中单独被分离出来，在体外受特异抗原刺激并被记数。从结核分枝杆菌复合群（人型、牛型、非洲型）中选择有用的抗原降低与BCG（卡介苗）和环境分枝杆菌的交叉反应提高特异性。两个单独的抗原模仿ESAT-6和CFP 10，联合应用提高检测灵敏度。

T-SPOT.TB是一种更简单的酶联免疫斑点（ELISPOT）检测方法。ELISPOT检测是高灵敏度的，在细胞分泌的细胞因子扩散稀释前，其能够立即捕获细胞周围所分泌的细胞因子。这使得ELISPOT检测更加的灵敏，超过传统的ELISA实验。T-SPOT.TB 被设计出来用于检测结核特异抗原刺激活化的效应T细胞。T-SPOT.TB记数每个活化的结核特异效应T细胞。

【检验原理】

外周血单个核细胞（PBMCs）从全血样本中被分离，通过洗涤排除本底干扰因素。记数PBMCs，保证有标准的细胞数量用于检测。这可以保证因为免疫系统削弱（免疫力低下和免疫抑制）而导致T细胞浓度低的样本也有足够的细胞数加入反应孔检测。与ELISPOT技术一样的洗涤和记数过程，提高了检测结核病和结核感染的性能（图1）。

抗原和PBMCs一起孵育，刺激所有的致敏T细胞。分泌的细胞因子被预包被在反应孔膜上的特异抗体捕获，然后细胞和其它不必要的物质通过洗涤被去除。标记二抗，碱性磷酸酶配对的与细胞因子上不同的抗原决定簇结合，在反应孔膜上捕获细胞因子。通过洗涤去除任何未标记的抗体。可溶的底物溶液加入到每个检测孔中，在反应部位被酶分解形成不溶性色素沉淀斑点。每一个斑点代表一个分泌细胞因子的T细胞，记数斑点数量可以获得外周血中结核致敏的T细胞数量。

【主要组成成份】

2. 不同批号试剂盒中各组分不得混用或互换。

3. 产品不包含，但对试验必须的试剂组分

· 8孔反应板条架

· II级生物安全柜

·水平离心机（温控（18-25℃），离心力不低于1800g）

· PBMCs记数设备和试剂：使用台盼蓝肉眼显微镜手工记数或自动血细胞记数仪记数

· 37℃(±1),5% CO2培养箱（保持湿润）

·移液器及消毒的加样枪头

· ELISPOT读板仪或显微镜，放大镜

【储存条件及有效期】

储存条件及有效期：2～8℃、避光、密封保存。试剂盒自检定合格之日起有效期为12个月。

【样本要求】

⒈样本采集：无菌注射器抽取足量的外周静脉血，加至含有肝素或柠檬酸钠抗凝剂的采血管中；或使用肝素或柠檬酸钠抗凝的真空采血管直接进行采集；或使用BD公司的CPT真空采集管，采集外周静脉血；不推荐EDTA抗凝管。样本采集后应尽快进行外周血单个核细胞（PBMCs）的分离，室温保存时间不应超过4小时，不得冷藏或冷冻。

免疫力正常的患者，根据以下标准从静脉血样本中获得足够数量的PBMCs用于实验：

·成年人或10岁以上儿童：8ml静脉血

·2-9岁儿童：4ml静脉血

·2岁以下儿童：2ml静脉血

⒉外周血单个核细胞（PBMCs）的分离：

注意：细胞培养液使用前需预温至37℃

⒊外周血单个核细胞（PBMCs）的收集与计数：

T-SPOT.TB实验要求每个检测孔含有25万个细胞。每个样本检测需要4个孔。每个检测孔都必须加入足够的细胞。错误的做法会导致结果的不正确。

【检验方法】

1. 检验步骤：

·试剂准备

(1) 微孔培养板。取出够数的8孔反应板条恢复至室温待用，其余板条与干燥剂一起放回铝箔袋中。

(2) 取出结核特异抗原ESAT-6（抗原A）待用

(3) 取出结核特异抗原CFP 10（抗原B）待用

(4) 取出阳性质控待用

(5) 准备1:200稀释的标记抗体工作液，计算足够用的浓缩标记抗体工作液在使用之前配制

(6) 取出底物显色溶液恢复至室温待用

·按每个测定样本需微孔培养板4孔（空白对照、测试孔A和测试孔B、阳性质控对照）从铝箔包装中取出测试所需的微孔板条，推荐按以下方式排列：

Ο空白对照

Ο抗原A

Ο抗原B

Ο植物血凝素PHA对照

2.斑点记数

在培养板的洗涤和斑点形成阶段，不要让移液枪枪头或洗板仪枪头触碰反应孔底部的膜。移液枪枪头或洗板仪枪头产生的凹

⒋结果判断

根据抗原A或/和抗原B孔的反应判断结果:

检测结果为“有反应性”，参照以下标准：

●空白对照孔斑点数为0-5个时且（抗原A或抗原B孔的斑点数）-（空白对照孔斑点数）≥6

●空白对照孔斑点数为6-10个时且（抗原A或抗原B孔的斑点数）≥2×（空白对照孔斑点数）

如果上述标准不符合且阳性质控对照孔正常时检测结果为“无反应性”

【参考值（参考范围）】

“有反应性”结果表明样本中存在针对结核杆菌特异的效应T细胞

“无反应性”结果表明样本中可能不存在针对结核杆菌特异的效应T细胞

【检验结果的解释】

(1) 通常正常结果，空白对照孔没有或有很少的斑点而阳性质控对照孔斑点数超过20个。

(2) 空白对照孔斑点数超过10个时结果被认为是“不确定”。此类样本的结果难以判断查阅T-SPOT.TB技术手册分析原因（下栽https://www.wendangku.net/doc/2216250467.html,）。重新复查是必要的。

(3) 阳性质控对照孔斑点数应当超过20个或遍布整个反应孔（斑点数量太多）。当阳性质控对照孔斑点数少于20个时，检测结果被认为是“不确定”，除非抗原A或抗原B孔根据结果解释和判断标准确定为“有反应性”，此检测结果有效。

(4) 基于生物学和反应体系的原因，当空白对照孔斑点数为0-5个并且（抗原A或抗原B斑点数）减去（空白对照孔斑点数）等于5-7时，此结果被认为是“灰区”，应当利用所有可利用相关的的临床信息进行判断。必要时可进行复查。

(5) 虽然在卡介苗和大部分环境分枝杆菌中都缺失ESAT-6和CFP 10抗原，当感染M.kansasii, M.szulgai, M.marinum or M.gordonae时，T-SPOT.TB检测有可能出现“有反应性”结果。当怀疑上述细菌感染时有必要进行鉴别诊断。

【检验方法的局限性】

·仅用于体外诊断

·仅供专业人员使用

· T-SPOT.TB结果需结合临床和其它检测进行判断

·阴性结果不能排除感染结核杆菌的可能性

· ESAT-6和CFP 10抗原在卡介苗（BCG）和大多数环境分枝杆菌中都缺失，除了M.kansasii、M.szulgai、M.marinum和M.gordonae

【产品性能指标】

国外数据

特异性分析评估93例志愿者样本，通过病史和个人信息认为来自于结核感染低风险地区。T-SPOT.TB的特异性为100%。灵敏度分析评估87例经培养证实的结核感染者样本，包括免疫力受抑制人群样本，T-SPOT.TB的灵敏度为98.8%（86/87）。重复性用批内差作为一个替代指标，对同一样本进行分析检测。来自140位志愿者的145例样本进行重复实验（抗原A和

抗原B各做两次）142/145（97.9%）临床符合，2例样本结果在临界值上，只有1例重复实验结果不一致。

重复精度用批间差指标替代，分析评估在2块不同的培养板上进行。全部208例志愿者样本进行重复实验（抗原A和抗原B各做两遍，每块培养板上各做1遍）206/208（99%）临床符合率。

国内数据

特异性分析评估非结核临床样本508例，T-SPOT.TB特异性为94.1%（478/508）。

灵敏度分析评估结核病临床样本655例，T-SPOT.TB灵敏度为95.3%（624/655）。

结核高危人群（医务工作者和结核病患者家属）阳性率 28.7%（31/108）。

检测呼吸道常见细菌、真菌、病毒感染的临床样本143例，无明显交叉反应。

【注意事项】

1、使用前仔细阅读说明书，不同试剂盒批号的试剂不能混用

2、未开瓶试剂盒保存在2-8℃环境下，在试剂盒标签上的有效期内使用，开瓶有效期为8周。

3、注意无菌操作避免试剂、检测孔、细胞悬液和细胞培养液的污染

4、不同的分离和洗涤技术、培养时间和/或温度将会影响实际的操作结果，应当避免

5、室温保存和运输血液样本（18-25℃），不能冷冻或冷藏，从采集到检测不超过4小时

6、当操作人源性样本时应当注意，所有血液样本都有潜在的传染性。

7、处理血液样本和试验组分时，它们的使用，储存和处理应当与当地的国家生物安全指导指南或规章相一致。

8、在使用化学试剂时应当注意所有的化学试剂都有潜在的危害

【参考文献】

1. Janeway and Travers (1996) Immunobiology 2nd Ed.

2. Staines et al (1999) Introducing Immunology 2nd Ed.

3. Chapman et al (2002) AIDS, 16 (17): 2285-2293.

4. Ewer et al (2003) Lancet, 361: 1168-1173.

5. See www.elispot-analyzers.de/english/science-elispot-assays.html

6. Pathan et al (2001) J. Immunol., 167: 5217-5225.

7. Lalvani et al (2001) Lancet, 357: 2017-2021.

8. Lalvani et al (2001) Am. J. Resp. Crit. Care Med., 163: 824-828.

9. Lalvani et al (2001) J. Infect. Dis., 183: 469-477.

10. Meier et al (2005) Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis., 24: 529-536.

11. Zellweger et al (2005) Int. J. Tuberculosis and Lung Dis., 9(11): 1242-1247.

12. NCCLS Approved Guideline. Performance of single Cell Immune Response Assays, I/LA26-A

13. Koller et al (2003) Clin. Exp. Immunol., 132(2): 225-231.

14. Apollonj et al (1975) Immunol. Commum., 4(5): 453-463.

【生产企业】

Oxford Immunotec Ltd..（英国，牛津）

地址：94C Milton Park,Abingdon，Oxfordshire,OX14 4RY,UK

网址：https://www.wendangku.net/doc/2216250467.html,

国内售后服务机构

上海复星长征医学科学有限公司

地址：上海市宝山区城银路830号邮政编码：200444

售后服务电话：800-820-6063；邮箱：TSPOT@https://www.wendangku.net/doc/2216250467.html,

上海信长医疗器械有限公司

上海市杨浦区平凉路1128弄1号204室邮政编码：200092

售后服务电话：021-********；传真：021-********

【医疗器械注册证书编号】

国食药监械（进）字2010第3402556

【产品标准编号】

YZB/ENG 1702-2010

【说明书批准日期及修改日期】

批准日期：2010年7月30日