流式细胞学技术抗体的各种荧光标记颜色及波长及所占用通道

常用抗体标记荧光染料的特性及其应用

常用抗体标记荧光染料的特性及其应用 1、FITC：激发波长488nm，最大发射波长525nm。 1）其标记的抗体适用于所有配备488nm氩离子激光器的流式细胞仪； 2）在流式细胞仪的FL1通道检测； 3）可用于荧光显微镜技术 4）荧光强度易受PH值影响，PH值降低时其荧光强度减弱。 2、Alexa Fluor 488：激发波长488nm，最大发射波长519nm。 1）其标记的抗体适用于所有配备488nm氩离子激光器的流式细胞仪； 2）在流式细胞仪的FL1通道检测； 3）具有超乎寻常的光稳定性，非常适用于荧光显微镜技术； 4）在较宽的PH值范围内保持稳定（PH4～10）。 3、Cy3：激发波长488nm，最大发射波长570nm。 1）其标记的抗体适用于所有配备488nm氩离子激光器的流式细胞仪； 2）在流式细胞仪的FL2通道检测； 3）适用于荧光显微镜技术； 4）为小分子染料，非常适合需小分子染料的流式细胞术，荧光强度低于P E。 4、Cy5：激发波长633/635nm，最大发射波长670nm。 1）其标记的抗体适用于所有配备633nm氩离子激光器的流式细胞仪； 2）在流式细胞仪的FL4通道检测；

3）适用于荧光显微镜技术； 4）同样为小分子染料，非常适合需小分子染料的流式细胞术，荧光强度低于APC。 5）与单核和粒细胞非特异性结合多，易出现假阳性结果。 5、PE：激发波长488nm，最大发射波长575nm。 1）其标记的抗体适用于所有配备488nm氩离子激光器的流式细胞仪； 2）在流式细胞仪的FL2通道检测； 3）其荧光泯灭性强，不适用于传统的荧光显微镜技术，但适用于激光共聚焦显微镜技术。 6、PE-TR：激发波长488nm，最大发射波长615nm。 1）在Beckman Coulter流式细胞仪的FL3通道检测； 2）可适用于小功率激光器的流式细胞仪，也可使用于大功率激光器的大流式细胞仪。 7、PE-Alexa Fluor 610：激发波长488nm，最大发射波长628nm。 1）在Beckman Coulter流式细胞仪的FL3通道检测； 2）荧光强度高； 3）可适用于小功率激光器的流式细胞仪，也可使用于大功率激光器的大流式细胞仪。 8、PE-Alexa Fluor 647：激发波长488nm，最大发射波长668nm。 1）在Beckman Coulter流式细胞仪的FL4通道检测，BD细胞仪FL3通道检测； 2）不易湮灭；

几种常见荧光素极其特性介绍

几种常见荧光素极其特性介绍 荧光素（英语：Fluorescein，又称为荧光黄）是一种合成有机化合物，它是具有光致荧光特性的染料，外观为暗橙色/红色粉末，可溶于乙醇，微溶于水，在蓝光或紫外线照射下，发出绿色荧光。荧光染料种类很多，目前常用于标记抗体的荧光素有以下几种：异硫氰酸荧光素，四乙基罗丹明，四甲基异硫氰酸罗丹明，酶作用后产生荧光的物质。目前荧光素广发应用在免疫荧光、免疫荧光染色实验中。 下面介绍几种常用荧光素及其基本生物学特性： 1、异硫氰酸荧光素，简称“FITC”。是一种小分子荧光素，其效率取决于于溶液的pH 值，因此，在使用FITC时应注意溶液的酸碱度。FITC分子量为389.4，最大吸收光波长为490～495nm，最大发射光波长为520～530nm，呈现明亮的黄绿色荧光。 FITC在冷暗干燥处可保存多年，是目前应用最广泛的荧光素。其主要优点是人眼对黄绿色较为敏感，通常切片标本中的绿色荧光少于红色。 2、藻红蛋白，简称“PE”。相对分子质量较大，约为240kD，最大吸收峰为564nm，当使用488nm激光激发时其发射荧光峰值约为576nm，故可能会对其它大探针产生空间位阻。 但PE的化学结构非常稳定，有很高的荧光效率，并易与抗体分子结合。需要注意的是PE作为天然染料，因来源不同可能造成荧光素结构上的微小差别，导致其特征的不一致。 3、PI和EB。两者都具有嵌入到双链DNA和RNA的碱基对中并与碱基对结合的特异性。为了获得特异的DNA分布，染色前必须用RNA酶处理细胞，排除双链RNA的干扰。 PI和EB不能进入完整的细胞膜，因此，又可以用于检测死活细胞。PI和EB各种理化性质相似，但PI比EB的发射光光谱峰向长波方向移动，因而在做DNA和蛋白质双参数测量时，PI的红色荧光和FITC的绿色荧光更易于区分和测量。另外，PI比EB测得的DNA 分布的变异系统（CV值）低，所以PI得到更广泛的应用。

荧光素标记抗体方法

荧光素标记抗体技术 (一) 原理 目前用于抗体标记的荧光素主要有异硫氰酸荧光素(Fluorescein isothiocy nate,FITC)或罗达明(Lissamine rhodamine B200, RB200)。在硷性条件下FITC 的碳酰胺键可与抗体赖氨酸的ε氨基共价结合，标记后的抗体仍保持与相应抗原结合的能力。在荧光灯源紫外线或兰紫光激发下产生黄绿色荧光，通过在荧光显微镜下观察或流式细胞仪分析可对相应抗原进行定性、定位或定量的检测。 (二) 操作步骤 将纯化的IgG抗体对PH9～9.5碳酸盐缓冲液透析过夜， 透析后抗体液移入小烧杯中 ↓ 称取适量IFTC，加入二甲亚砜(DMSO)(FITC～1mg/1ml DMSO) 使终浓度为1mgFITC／1mlDMSO FITC／IgG比例:如IgG浓度为1mg／ml，FITC／IgG比例约为50μgFI TC／mgIgG； 如IgG为5～10mg／ml，则比例为25μgFITC／ml IgG 在10ml小烧杯中先放入抗体 ↓ 按上述比例将FITC-DMSO溶液逐滴加入透析后的抗体溶液中 ↓ 将标记物用PBS加至2.5ml，磁力搅拌器室温下避光搅拌2h ↓ 用PD10柱(Sephadex G25柱)除去游离荧光素，先用25ml PBS淋洗G2 5柱 ↓

收集PBS洗脱第一个荧光素结合蛋白峰，测定F／P 比值。第二个荧光素峰为游离荧光素 计算: 2.87×A495 F／P＝──────── A280-0.35×A495 合适的F／P值为2～4。 (三) 试剂器材 1. 纯化的多克隆抗体或单克隆抗体。 2. FITC(Fluorescein-5-Lsothiocyanalte)或其它荧光色素。 3. PBS、DMSO 4. PH9～9.5碳酸盐缓冲液: Na 2CO 3 4.3g，NaHCO 3 8.6g加蒸馏水至500ml。 5. PD10柱(Sephadex G25柱) 6.磁力搅拌器，紫外分光光度计等 (四) 注意事项 1. FITC保存于4℃暗处，使用前待试剂瓶升至室温时开盖称取，以避免潮解。 2. FITC-DMSO液要临用时配制。 3. 碳酸盐缓冲液要新鲜配制。 如有侵权请联系告知删除，感谢你们的配合！

标记抗体技术

标记抗体技术 免疫标记技术是将一些既易测定又具有高度敏感性的物质标记到特异性抗原或抗 体分子上，通过这些标记物的增强放大效应来显示反应系统中抗原或抗体的性质与含量。常用的标记物包括荧光素、酶和放射性核素等，用这3种标记物进行标记的免疫检测技术被称为3大免疫标记技术。目前，使用的免疫标记物还有化学发光物质、铁蛋白和胶体金等。 一、辣根过氧化物酶(HRP)标记抗体 a. 辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase, HRP ） HRP广泛分布于植物界，它是由无色的酶蛋白和棕色的铁卟啉结合而成的糖蛋白，糖含量18％。HRP由多个同功酶组成，分子量为40,000,等电点为pH3～9，酶催化的最适PH因供氢体不同而稍有差异，但多在pH5左右。酶溶于水和58％以下的硫酸铵溶液。HRP的辅基和酶蛋白最大吸收光谱分别为403nm和275nm，一般以OD403nm ／OD275nm 的比值RZ(德文Reinheit Zahl)表示酶的纯度。 HRP的催化反应需要底物过氧化氢(H2O2)和供氢体(DH2)。供氢体多为无色的还原型染料，通过反应可生成有色的氧化型染料(D)。 HRP DH2＋H2O2──────→D＋2H2O b. 辣根过氧化物酶标记方法 酶标记抗体的制备方法主要有两种，即戊二醛交联法和过碘酸盐氧化法。 辣根过氧化物酶的标记常用过碘酸盐氧化法，这种方法法只适用于含糖量较高的酶。过碘酸钠将HRP分子表面的多糖氧化为醛基，醛基与抗体分子上的氨基形成Schiff 碱而结合。后者可进一步用NaBH４(或乙醇胺)还原生成稳定的酶标记抗体。 在酶标过程中一般都混有未结合的酶和抗体。游离酶理论上不影响最终的显色。但游离的抗体则不同，它会与酶标抗体竞争固相抗原，从而减少了结合到固相上的酶标抗体的量。因此需要对制备的酶结合物进行纯化，去除游离的酶和抗体。纯化的方法很多，

抗体标记技术汇总

第1章抗体分子标记技术 第一节抗体的I125标记法 基本原理 有多种方法可用于蛋白质的碘标记，如应用化学法或酶促法通过氧化对蛋白质分子进行碘化是常用的方法。当应用化学氧化法时，碘化钠（NaI）遇强氧化剂，碘离子被氧化为碘分子，所生成的自由碘分子可与某些基团进行卤化反应。蛋白质分子可进行卤化反应的基团主要为酪氨酸残基，某些组氨酸残基也可能进行碘化。在应用氯胺T(Chloramine T)法的实验中，所用的氧化剂（1，3，4，6-tetrachloro-3α, 6α -diphenyl-glucoluril）是溶于强挥发性的有机溶剂中。该溶剂加入试管后，先让其挥发（即让氧化剂将试管包被），然后把Na125I和蛋白质液加入包被好的试管中，反应完成即将混合液移入他管，以终止反应。 试剂及仪器 ●经亲和层析纯化的多克隆抗体或单克隆抗体 ●0.5 mol/L磷酸钠缓冲液，pH 7.5 (配法见附录1) ●无载体的Na125I 3.7GBq/ml ( 100 mCi/ml ) 的NaOH液 ●凝胶过滤柱 ●γ-记数器 ●100g/L 三氯醋酸 ●70% 乙醇 ●玻璃纤维滤 ●氯胺T (Chloramine T)反应用 * 新鲜制备的含2mg/ml氯络胺T的 0.5 mol/L磷酸钠缓冲液（pH 7.5）； * 氯胺T 反应终止缓冲液： 2.4mg/ml 偏重亚硫酸， 10mg/ml 酪氨酸, 10%甘油, 1g/L Xyene cyanol 的PBS 液。 操作步骤 *注意：125I 对健康有害，需要保护措施。在应用125I 应先有关同位素知识，及在有关部门的监测下，按放射线同位素的应用及处置要求进行。 （一）氯胺T法 1．用1.5ml Ependof 管，加10μl 抗体及pH 7.5的0.5 mol/L磷酸钠缓冲液总体积至25μl； 2．加500 μCi 的Na125I ，混匀； 3．加25μl 2mg/ml 氯胺T液，混匀； 4．在室温下培养1分钟； 5．加入50μl氯胺T 反应终止缓冲液（以饱和的酪氨酸来捕获游离的 Na125I）； 6．通过凝胶过滤层析分离将碘化抗体与碘化酪氨酸分离。将反应混合液上1ml的凝胶过滤层析柱，分部收集洗脱液100μl/管，碘化抗体在开始的组分排出。应用γ-记数器监测各组分； 7．收集、合并含碘化抗体的各管；

生物素标记抗体的免疫荧光方法

生物素标记抗体的免疫荧光方法 *重要提示：在开始实验前请查阅所用抗体的说明书中第一页应用（APPLICATIONS）部分，确认这支抗体已经验证过可用于你计划采用的本实验方法中的特定方案。 A.所需溶液和试剂 注意：用Milli-Q超纯水或是相当级别的水配制溶液。 1.10 X磷酸盐缓冲液(PBS): 1升水中加入80 g 氯化钠(NaCl), 2 g 氯化钾(KCl), 14.4 g 磷 酸氢二钠(Na2HPO4) and 2.4 g 磷酸二氢钾(KH2PO4)。调整pH到7.4。 2.甲醛溶液，16%，无甲醇的类型，Polysciences, Inc. (cat# 18814) ，现配现用。开封 以后放在4°C避光保存。使用时用PBS稀释。 3.二甲苯 4.无水乙醇，组织学级，100%和95%。 5.蒸馏水(dH2O) 6.封闭缓冲液：配制25ml时，2.5 ml 10X PBS和1.25ml正常血清（来源与二抗相同， 例如正常山羊血清，正常驴血清）兑到21.25ml的蒸馏水中，混匀。边搅拌边加入75μL Triton X-100(100%) 7.抗体稀释缓冲液配置40ml时，取4 ml 10X PBS兑入36 ml蒸馏水，混匀。加入0.4 BSA，使溶解。边搅拌边加入120μL Triton X-100(100%)。 8.10 mM 柠檬酸钠缓冲液配置1L时，称取2.94g二水合柠檬酸三钠(C6H5Na3O7?2H2O) 溶解在1L蒸馏水中。调整pH为6.0。 9.荧光素标记的抗生物素蛋白Avidin/Streptavidin 注意：第一次使用不论是一抗还是荧光素标记的抗生物素蛋白Avidin/Streptavidin时，都需要做滴定分析以判断何种稀释比例能在你的样品上得到最强的特异信号同时背景保持最低 11.Prolong? Gold 抗淬灭试剂(Invitrogen, Eugene, OR, Cat# P36930) B.样品制备 I.细胞系培养物来源(IF-IC) 重要提示：查阅说明书中APPLICATIONS部分，确认所用抗体可用于IF-IC。 注意：细胞应直接在多孔板，腔室玻片或是盖玻片上直接培养，处理，固定和染色。 1.用PBS稍加润洗。 2.吸去PBS，将细胞泡在2-3 mm厚的2-4%甲醛溶液（PBS配制）中。 注意：甲醛有毒，需要在通风橱中操作。 3.室温下固定细胞15分钟。 4.吸去固定剂，用PBS润洗三次，每次五分钟。 5.甲醇打孔步骤（是否需要参考抗体说明首页）在甲醛固定后，将细胞浸泡在冰纯甲 醇中（加入足量甲醇完全盖住细胞，液层厚度在3-5mm，千万别让细胞干掉），–20°C 孵育10分钟。用PBS润洗5分钟。 6.继续C部分的免疫染色。 II.石蜡切片(IF-P) 重要提示：查阅说明书中APPLICATIONS部分，确认所用抗体可用于IF-P。 脱蜡处理/再水化 1.用二甲苯浸洗切片3次，每次5分钟。 2.用无水乙醇浸洗切片2次，每次10分钟。 3.用95%乙醇浸洗切片2次，每次10分钟 4.在蒸馏水中润湿2次，每次5分钟。 抗原暴露：

几种常见的抗体标记方法-酶标记、荧光素标记、同位素标记、生物素标记

几种常见的抗体标记方法-酶标记、荧光素标记、同位素标记、 生物素标记 抗体标记主要有酶标记、荧光素标记、同位素标记、生物素标记等，还有一些其他的标记方法例如金标记，本文主要讲述了这些抗体标记的基本原理、操作步骤。 一、酶标记 1、辣根过氧化物酶(HRP)标记辣根过氧化物酶(HRP)标记单抗和多克隆抗体的常用方法是过碘酸钠法。其原理是HRP的糖基用过碘酸钠氧化成醛基，加入抗体IgG 后该醛基与IgG氨基结合，形成Schiff氏碱。为了防止HRP 中糖的醛基与其自身蛋白氨基发生偶合，在用过碘酸钠氧化前先用二硝基氟苯阻断氨基。氧化反应末了，用硼氢化钠稳定Schiff氏碱。这里介绍两种程序。 程序一： (1)将5mg HRP溶于0.5ml 0.1mol/L NaHCO3溶液中;加0.5ml 10mmol/L NaIO4溶液，混匀，盖紧瓶塞，室温避光作用2小时。 (2)加0.75ml 0.1mol/L Na2CO3混匀。 (3)加入0.75ml小鼠已处理的腹水，或纯化单抗等 (15mg/ml)，混匀。 (4)称取Sephadex

G25干粉0.3g，加入一支下口垫玻璃棉的5ml注射器外筒内;随后将上述交联物移入注射器外套;盖紧，室温作用(避光)3小时或4℃过夜。 (5)用少许PBS将交联物全部洗出，收集洗出液，加 1/20V体积新鲜配制的5mg/ml NaBH4溶液，混匀，室温作用30分钟;再加入3/20V NaBH4溶液，混匀，室温作用1小时(或4℃过夜)。 (6)将交联物过Sephadex g200或Sepharose 6B(2.6×50cm)层析纯化，分管收集第一峰。 (7)酶结合物质量鉴定： 克分子比值测定 酶量(mg/ml)=OD403×0.4 IgG量(mg/ml)=(OD280-OD403×0.3)×0.62 克分子比值(E/P)=酶量×4/IgG量，一般在1-2之间。酶结合率=酶量×体积/抗体，标记率一般为0.3-0.6，即1-2个HRP分子结合在一个抗体分子上，标记率可大于0.6，0.8，0.9;OD403/OD280等于0.4时，E/P约为1。 标记率=OD403/OD280 酶活性和抗体活性的测定可应用ELISA法、免疫扩散、DAB-H2O2显色反应测定酶结合物的酶活性，抗体活性及效

荧光素FITC标记抗体的方法

荧光素FITC标记抗体的方法 当FITC在碱性溶液中与抗体蛋白反应时，主要是蛋白质上赖氨酸的r氨基与荧光素的硫碳胺键(thiocarbmide)结合，形成FITC-蛋白质结合物，即荧光抗体或荧光结合物。一个IgG分子中有86个赖氨酸残基，一般最多能结合15～20个，一个IgG分子可结合2～8个分子的FITC，其反应式如下 FITC-N=C=S + N-H2-蛋白质→ FITC-NS-C-N-H2-蛋白质 常用Marsshall(1958)法标记荧光抗体，也可以根据条件采用Chadwick等标记法或Clark等(1963)的透析标记法。 1．Marsshall法 (1)材料抗体球蛋白溶液、0．5mol／L(pH9．0)碳酸盐缓冲液、无菌生理盐水、异硫氰酸荧光 素、1％硫柳汞水溶液、50ml小烧杯、4℃冰箱、电磁搅拌器、透析袋、玻棒、pH7．2或 3．0的0．01mol／LPBS等。 (2)方法及步骤①抗体的准备取适量已知浓度的球蛋白溶液于烧杯中，再加人生理盐水及碳酸盐缓冲液，使最后免疫球蛋白浓度为

20mg／ml，碳酸盐缓冲液容量为总量的1／10，混匀，将烧瓴置电磁搅拌器上(速度适当以不起泡沫为宜)5～10min。 ②荧光素的准备根据欲标记的蛋白质总量，按每毫克免疫球蛋白加0．01mg荧光色素，用分析天平准确称取所需的异硫氰酸荧光素粉末。也可用下述公式计算出免疫球蛋白、荧光素的量，还可以算出需加缓冲液的量。 a．蛋白溶液：含量Amg／m1；容积Bml。 b．总蛋白量(AXB)＝Crag。 c．C／20～C／10＝Dmg(如蛋白含量低于20mg／ml，用C／10；如高于20mg／ml，用C／20)。 d．荧光素FITC的量：(1／50～2／100)XC＝Emg。 e．巳0．5mol／L(pH9．5)碳酸盐缓冲液D／10＝Fml。 f．PBS量D-(B+F)=Gml。 注：A为蛋白含量，mg／ml；B为蛋白质溶液的容积；C为蛋白总量，mg；D为常数，mg；正为荧光素的量，mg；F为碳酸盐缓冲液的容积，ml；G为PBS的容积，ml。 ③结合(或标记) 边搅拌边将称取的荧光色素渐渐加入球蛋白溶液中，避免将荧光素粘于烧瓶壁(大约在5—10min内加完)，加完后，

荧光微球标记抗体制备的详细步骤及问题分析

荧光微球标记抗体方法及问题分析 很多公司开展了荧光胶乳免疫层析做定量分析及胶乳增强免疫比浊分析项目，关注胶乳标记技术的技术人员越来越多。本人总结了部分胶乳微球标记技术相关主题帖，并加以分类，以便朋友们查阅，希望朋友们继续完善或分享经验。 1. 胶乳大小选择 【求助】免疫胶乳或免疫颗粒（聚苯乙烯）的粒径 免疫胶乳或免疫颗粒（聚苯乙烯）的粒径- 丁香园论坛 【求助】乳胶免疫比浊中的乳胶颗粒大小与抗体 乳胶免疫比浊中的乳胶颗粒大小与抗体- 丁香园论坛 2. 胶乳标记方法 【交流】蛋白如何偶联到聚苯乙烯乳胶颗粒上 蛋白如何偶联到聚苯乙烯乳胶颗粒上- 丁香园论坛 （求助）胶乳标记 （求助）胶乳标记- 丁香园论坛 【求助】抗原或抗体致敏胶乳的缓冲液和pH值 抗原或抗体致敏胶乳的缓冲液和pH值- 丁香园论坛 3. 胶乳标记过程问题 【求助】胶乳偶联出现絮凝 胶乳增强免疫比浊试剂稳定性问题- 丁香园论坛 【求助】胶乳增强免疫比浊中抗体交联的问题 胶乳微球物理吸附 反应微球带磺酸基、羧基、醛基表面的都是疏水微球，都可以用来设计被动吸附蛋白。磺酸基微球表面含带有负电荷的磺酸基团，pka大约为2，因此在酸性pH保持稳定。醛基微球表面也带有磺酸基团，但能和蛋白行程共价键。羧基微球表面含带负电荷的羧基基团，在pH5.0以上时保持稳定。 带有疏水基团的蛋白的吸附和配位结合，是最简单和直接的标记方法。这种方法中，微球溶液和含目标蛋白的溶液混合，反应后，未结合的游离蛋白通过清洗步骤除去，从而获得胶体蛋白复合物。疏水吸附方法只能用于疏水微球（硫酸盐、羧基、醛基表面修饰的微球）。醛

基表面修饰微球是一个特例，其疏水吸附结果取决于后来的共价结合。虽然物理吸附是不依赖pH的，但反应缓冲液的pH对蛋白的结构有非常大的影响，从而影响蛋白吸附到微球上的反应效率。一般，在被吸附蛋白等电点附近pH时，物理吸附效率会很高。 反应步骤： 1. 用反应缓冲液系数蛋白到10mg/ml； 2. 用反应缓冲液系数胶乳微球到1%； 3. 将蛋白溶液加入到胶乳微球溶液中，10ml胶乳中加入1ml蛋白溶液。室温搅拌孵育2hr； 4. 离心或超滤，除去未结合蛋白； 5. 将微球蛋白复合物用储存缓冲液溶解。 注意事项： 1. 最优蛋白标记量影响因素 1）有效比表面积：粒径减小时，比表面积/mg微球值得增加； 2）胶体稳定性：蛋白对胶乳有稳定和去稳定作用； 3）免疫反应：最近标记量由免疫反应需要决定。 2. 胶乳微球中加入蛋白后，快速搅拌混合，利于反应均衡。反应体积是1ml时，可用移液器吸取蛋白加入微球中，并吹打数次。如果反应体积较大时，用烧杯，边搅拌边加入蛋白， 3. 储存缓冲液和反应缓冲液不同时，抗体有脱落的可能； 4. 表面活性剂能使得抗体从胶乳中脱落，所以应避免加入。 微球共价结合抗体方法 一、一步法 1. 准备50mM pH 6.0的reaction buffer，醋酸或MES buffer更合适 2. 用reaction buffer溶解抗体，使其浓度为1mg/mL。 3. 用reaction buffer 悬浮微球，使其浓度为1% w/v 4. 边搅拌边将一倍体积的抗体溶液加入到10倍体积的微球悬液中，室温下持续搅拌20分钟 5. 准备浓度为10mg/ml（52umol/mL）的EDC溶液，用前准备，现配现用。 6. 将计算需求量的EDC溶液加入到上述微球悬液中。(Note 6). 7. 室温下，立即调节pH (Note 7). 8. 移除未结合的蛋白，并将包被微球用storage buffer重悬。(Note 3 and 4) B. 两步法 为了避免EDC将相邻微球之间的蛋白偶联导致微球聚集或者蛋白之间交流，两步法偶联抗体更合适。两步法中，在蛋白加入之前，多余的EDC被移除。两步法中，蛋白也可以使用更高pH的buffer来溶解，从蛋白的稳定性方面和加速蛋白和活化微球之间的交联速度方便考虑，是非常有利的。 B1 简单一步法： 1. 准备50mM pH 6.0的活化buffer，醋酸或MES buffer更合适；用活化buffer 悬浮微球，使其浓度为1% w/v 2. 每ml微球悬液加入20mg的EDC，室温孵育20分钟，然后再次加入20mg/mL的EDC，继续室温孵育20分钟。(Note 7). 3. 离心或超滤，用等体积的包被缓冲液清洗两次微球，最后悬浮在包被缓冲液中。(Note 3). 4. 用包被缓冲液溶解抗体到1mg/mL，包被缓冲液pH7~9，浓度为50mM~100mM。(Note 1)

第十六章 标记抗体技术

第十六章标记抗体技术 1、免疫荧光标记技术的概念/所用荧光素的要求/基本原理/操作步骤/注意事项/实际应用 （一）概念：免疫荧光标记技术是指用荧光素对抗体或抗原进行标记，然后用荧光显微镜观察荧光以分析示踪相应的抗原或抗体的方法（二）荧光素要求：作为蛋白质标记用的荧光素须具备①有与蛋白质分子形成稳定共价键的化学基团，而不形成有害产物②荧光效率高，与蛋白质结合的需要量很小③结合物一般在储存条件下稳定，结合后不影响抗体的免疫活性④作为组织学标记，结合物的荧光必须与组织的自发荧光有良好的反衬，以便能清晰地判断结果⑤结合程序简单，能制成直接应用的商品，可长期保存。可用于标记的荧光素有FITC,RB200,四甲基异硫氰酸罗丹明。 （三）基本原理：将荧光素标记在相应的抗体上，直接与相应抗原反应 （四）操作步骤：

①标本制备： 涂片或压印片：细菌培养物、感染动物的组织或血液、脓汁、粪便、尿沉渣 冰冻切片或低温石蜡切片：组织学、细胞学和感染组织 盖玻片：上面培养单层细胞 首要要求是保持抗原的完整性，并尽可能减少形态变化，抗原位置保持不变。标本要相当薄，有适当的固定处理方法 ②固定：常用丙酮和95%乙醇，室温固定15-30min后，用PBS反复冲洗，干后即可染色。 目的：防止被检材料从玻片上脱落，消除抑制抗原抗体反应的因素。检测细胞内的抗原，用有机溶剂固定可增加细胞膜的通透性而有利于荧光抗体渗入。 ③检测： A、直接法：直接滴加2-4个单位的标记抗体于标本区，置湿盒中，于37度染色30min左右，然后置大量ph7-7.2PBS中漂洗15min，干燥、封载，显微镜镜检 B、间接法：将标本先滴加特异性的抗血清，置湿盒中，于37度作用30min，PBS漂洗5min后，再加入FITC标记的抗抗体，置湿盒中，37度作用30min，PBS漂洗5min，干燥、封载，显微镜观察

FITC标记抗体流程

其中FITC 应用最广，为黄色结晶，最大吸收光波长为490～495nm,最大发射光波长520～530nm ，可呈现明亮的黄绿色荧光。FITC 分子中含有异硫氰基，在碱性(pH9.0～9.5)条件下能与IgG 分子的自由氨基结合，形成FITC-IgG 结合物，从而制成荧光抗体。 抗体经荧光色素标记后，不影响 与抗原的结合能力和特异性。当荧光 抗体与相应的抗原结合时，就形成了 带有荧光性的抗原抗体复合物，从而 可在荧光显微镜下检出抗原的存在。 一,FITC 标记抗体流程 （1） 将待交联的蛋白（浓度 ≥1mg/ml ）对交联反应液透析三次 (4 ℃)，至pH ＝9.0。 交联反应液配制方法：7.56g NaHCO 3，1.06g Na 2CO 3，7.36g NaCl ，加水定 容至1 L 。 （2） 将FITC 溶于DMSO 中，浓度为1mg/ml 。每次交联使用的FITC 均应新鲜配制，避光。 （3） 按P:F （蛋白质：FITC ）=1mg:150μg 的比例将FITC 缓慢加入于抗体溶液中，边加边轻轻晃动使其与抗体混合均匀，暗处4 ℃反应8 hr 。 （4） 加入5mol/L 的NH 4Cl 至终浓度50mmol/L ， 4 ℃终止反应2 hr 。 （5） 将交联物在PBS 中透析四次以上，至透析液清亮。 （6） 交联物的鉴定 蛋白浓度(mg/ml) = [ A 280– 0.31×A 495 ] / 1.4 F/P 比例: 3.1×A 495 / [A 280 – 0.31×A 495 ]，该值应介于2.5 ~ 6.5之间。 （7） FITC 交联的蛋白应置于pH7.4的磷酸盐缓冲液中，加入0.1% NaN 3、1% BSA ， 4℃暗处保存。 二,免疫荧光组织化学染色方法 1.直接法 简便、快速，用已知特异性标记荧光的一抗与组织细胞内抗原结合。 操作流程： (1)冰冻切片经固定，凉干PBS 洗；石蜡切片脱蜡至水，消化30min ，PBS 洗。 (2)适当稀释荧光抗体滴加在组织切片上，湿盒内37℃温育1h ，PBS 洗3×3min。 (3)0.01%伊文氏蓝衬染1～3min ，PBS 洗3×3min，蒸馏水洗2次，除去Nacl 结晶。

第5章 常见免疫学检测技术-荧光、化学发光

第五章 常见免疫学检测技术

第二节 荧光免疫检测
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用荧光素标记抗体或抗原，与相应的抗原或抗 体反应后，测定复合物中的荧光素，这种免疫 技术，称为荧光免疫技术
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包括荧光抗体技术和荧光抗原技术，但在实际 工作中荧光抗原技术很少应用 荧光显微镜技术 常见技术 荧光免疫测定技术

一、荧光的基础知识
（一）荧光 （fluorescence）
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某些物质能吸收外界能量进入激发状态，使处 于基态的电子被激发至激发态，当其再回到稳 定基态时，多余的能量会以电磁辐射的形式释 放，即发出荧光，这类物质被称为荧光素

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由光激发所引起的荧光，为光致荧光 ------荧光免疫技术 由化学反应所引起的荧光，为化学荧光 ------化学发光技术
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荧光免疫技术的标记物一般为光致荧光物质， 当受一定波长光激发后，在极短时间内发出长 于激发光波长的荧光，一旦停止供能，荧光即 消失（约持续10-7～10-8s）

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荧光效率：指荧光物质分子将光能转变成荧光 的百分率 荧光效率= 发射荧光的光量子数/吸收光的光 量子数
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发射光谱：是指固定激发波长，在不同波长下 记录的样品发射荧光的强度 激发光谱：是指固定检测发射波长，用不同波 长的激发光激发样品记录的相应的荧光强度
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荧光寿命：指荧光物质被激发后所产生的荧光 衰减到一定程度时所用的时间 各种荧光物质的荧光寿命不同
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荧光猝灭：荧光物质在某些理化因素作用下， 发射荧光减弱甚至消退称为荧光猝灭 荧光猝灭物质如亚甲基蓝、碱性复红、伊文思 蓝、碘溶液等
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荧光素FITC标记抗体的方法

荧光素FITC标记抗体的方法当FITC在碱性溶液中与抗体蛋白反应时，主要是蛋白质上赖氨酸的r氨基与荧光素的硫碳胺键(thiocarbmide)结合，形成FITC-蛋白质结合物，即荧光抗体或荧光结合物。一个IgG分子中有86个赖氨酸残基，一般最多能结合15～20个，一个IgG分子可结合2～8个分子的FITC，其反应式如下FITC-N=C=S + N-H2-蛋白质→FITC-NS-C-N-H2-蛋白质 常用Marsshall(1958)法标记荧光抗体，也可以根据条件采用Chadwick等标记法或Clark等(1963)的透析标记法。 1．Marsshall法 (1)材料抗体球蛋白溶液、0．5mol／L(pH9．0)碳酸盐缓冲液、无菌生理盐水、异硫氰酸荧光 素、1％硫柳汞水溶液、50ml小烧杯、4℃冰箱、电磁搅拌器、透析袋、玻棒、pH7．2或 3．0的0．01mol／LPBS等。(2)方法及步骤①抗体的准备取适量已知浓度的球蛋白溶液于使最后免疫球蛋白浓度为再加人生理盐水及碳酸盐缓冲液，烧杯中， 20mg／ml，碳酸盐缓冲液容量为总量的1／10，混匀，将烧瓴置电磁搅拌器上(速度适当以不起泡沫为宜)5～10min。 ②荧光素的准备根据欲标记的蛋白质总量，按每毫克免疫球蛋白加0．01mg荧光色素，用分析天平准确称取所需的异硫氰酸荧光素粉末。也可用下述公式计算出免疫球蛋白、荧光素的量，还可以算出

需加缓冲液的量。 a．蛋白溶液：含量Amg／m1；容积Bml。b．总蛋白量(AXB)＝Crag。 c．C／20～C／10＝Dmg(如蛋白含量低于20mg／ml，用C／10；如高于20mg／ml，用C／20)。 d．荧光素FITC的量：(1／50～2／100)XC＝Emg。 e．巳0．5mol／L(pH9．5)碳酸盐缓冲液D／10＝Fml。f．PBS量D-(B+F)=Gml。 注：A为蛋白含量，mg／ml；B为蛋白质溶液的容积；C为蛋白 总量，mg；D为常数，mg；正为荧光素的量，mg；F为碳酸盐缓。ml的容积，PBS为G；ml冲液的容积， ③结合(或标记) 边搅拌边将称取的荧光色素渐渐加入球蛋白溶液中，避免将荧光素粘于烧瓶壁(大约在5—10min内加完)，加完后， 继续避光搅拌12h左右。结合期间应保持蛋白溶液于4℃左右，故需将烧杯和搅拌器一起移人4℃冰箱中。 ④透析结合完毕后，将标记的球蛋白溶液离心(2500r／min)20rain，除去其中少量的沉淀物，装入透析袋中，再置于烧杯中，用pH8．0缓冲盐水透析(0～4~C)过夜。 ⑤过柱取透析过夜的标记物，通过葡聚糖凝胶SephadexG-25或G—50柱，分离游离荧光素，收集标记的荧光抗体进行鉴定。洗脱液：0．01mol／L磷酸盐缓冲液(pH7．2)；过滤量：12ml标记全球蛋白液(过滤前未透析)；收集量：20ml(稀释1．7倍左右)。

荧光标记二抗的选择

荧光标记二抗的选择 来源: 生物耗材网发布日期: 2012-2-28 一般来讲，耦联到二抗上的探针主要有酶（辣根过氧化酶HRP和碱性磷酸酶AP或其衍生物APAAP，PAP），荧光基团（FITC, RRX, TR, PE, Rhodamine）和生物素。选用哪种探针的二抗主要取决于具体的实验。对于Western Blot和ELISA，最常用的二抗是酶标二抗；而细胞或组织标记实验（细胞免疫化学，组织免疫化学，流式细胞术）中通常使用荧光标记的二抗。如果想要更大程度的放大检测信号，可以使用Biotin/Avidin检测系统。其中荧光素是具有光致荧光特性的染料，荧光染料种类很多，目前常用于荧光标记二抗有以下几种： 【异硫氰酸荧光素-Fluorescein Isothiocyanate (FITC)荧光标记二抗】FITC 纯品为黄色或橙黄色结晶粉末，易溶于水和酒精溶剂。FITC分子量为389.4，最大吸收光波长为490～495nm，最大发射光波长为520～530nm，呈现明亮的黄绿色荧光。FITC在冷暗干燥处可保存多年，是目前应用最广泛的荧光素。由于FITC是小分子化合物，每一个抗体可标记几个FITC分子，IgM通常用小分子的荧光素标记，如FITC、Cy3/5、Texas Red等。FITC荧光二抗主要优点是人眼对黄绿色较为敏感，通常切片标本中的绿色荧光少于红色。然而FITC 的最大缺点是淬灭快，因此要和抗淬灭剂一起使用。 【四甲基异硫氰酸罗丹明-Tetramethyl Rhodamin Isothiocyanate(TRITC)，Rhodamine Red-X(RRX), Texas Red(TR)荧光标记二抗】 这些罗丹明的衍生物耦联基团具有不同的吸收波长(550, 570, 596nm)和最大发射波长（570, 590, 620nm）。尽管TRITC经常和FITC一起在双标记实验中使用，使用RRX和TR可以得到更好的颜色区分。在使用装有氪氩灯的激光共聚焦扫描显微镜作三标记的实验时，RRX尤其有用，可以和Cy2(或者FITC)和Cy5一起使用，因为RRX的发射波长在Cy2和Cy5中间，而且和这两者覆盖都很少。氪氩灯激发光为488nm，598nm和647nm，分别是Cy2(FITC), RRX和Cy5的理想激发波长。因为FITC和PE可以被氩灯的488nm波长激发, 在流式细胞仪中用FITC作双标，另一种用藻红蛋白（PE）耦联基团要比罗丹明好。TRITC 为罗丹明的衍生物，呈紫红色粉末，较稳定。最大吸收光波长为550nm，最大发射光波长为620nm，呈现橙红色荧光，与FITC的绿色荧光对比鲜明，可配合用于双重标记或对比染色。因其荧光淬灭慢，也可用于单独标记染色。 【菁类染料-Cyanine dyes(Cy2, Cy3, Cy5)】 Cy2 耦联基团激发波长为492nm，发光为波长510nm的绿色可见光。Cy2和

荧光抗体染色三大方法

荧光抗体染色三大方法 1.直接染色法 将标记的特异荧光抗体直接加在抗原标本上，经一定温度和时间的染色，洗去未参加反应的多余荧光抗体，在荧光显微镜下便可见到被检抗原与荧光抗体形成的特异性结合物而发出的荧光。直接染色法的优点是：特异性高，操作简便，比较快速。缺点是：一种标记抗体只能检查一种抗原，敏感性较差。直接法应设阴、阳性标本对照，抑制试验对照。 2.间接染色法 如果检查未知抗原，先用已知未标记的特异抗体(第一抗体)与抗原标本进行反应，作用一定时间后，洗去未反应的抗体，再用标记的抗抗体即抗球蛋白抗体(第二抗体)与抗原标本反应，如果第一步中的抗原抗体互相发生了反应，则抗体被固定或与荧光素标记的抗抗体结合，形成抗原-抗体-抗抗体复合物，再洗去未反应的标记抗抗体，在荧光显微镜下可见荧光。在间接染色法中，第一步使用的未用荧光素标记的抗体起着双重作用，对抗原来说起抗体的作用，对第二步的抗抗体又起抗原作用。如果检查未知抗体则抗原标本为已知的待检血清

为第一抗体，基他步骤和检查抗原相同。 由于免疫球蛋白有种属特异性，因此标记的抗球蛋白抗体必须用第一抗体同种的动物血清球蛋白免疫其他动物来制备。 间接染色法的优点是既能检查未知抗原，也能检查求知抗体;用一种标记的抗球蛋白抗体，能与在种属上相同的所有动物的抗体结合，检查各种未知抗原或抗体，敏感性高。缺点是：由于参加反应的因素较多，受干扰的可能性也较大，判定结果有时较难，操作繁琐，对照较多，时间长。间接法应设阴、阳性标本对照，还应设有中间层对照(即中间层加阴性血清代替阳性血清)。 3.抗补体染色法 抗补体染色法简称补体法，是间接染色法的一种改良法，首先由Goldwasser等建立。本法利用补体结合反应的原理，用荧光素标记抗补体抗体，鉴定未知抗原或未知抗体(待检血清)。染色程序也分二步：先将未标记的抗体和补体加在抗原标本上，使其发生反应，水洗，然后再加标记的抗补体抗体。如果第一步中抗原抗体发生反应，形成复合物，则补体便被抗原抗体复合物结合，第二步加入的荧光素标记的抗补体抗体便与补体发生特异性反应，使之形成抗原-抗体-补体-抗补

抗体APC荧光素标记操作流程记录学习资料

抗体A P C荧光素标记操作流程记录

1.目的 规范单克隆抗体标记荧光APC (快速标记法）标准操作程序 2.适用范围 适用于本公司抗体标记荧光APC (快速标记法）操作 3.术语和定义 别藻蓝蛋白（allophycocyanin ，APC ）由藻蓝胆素与蛋白质结合而成，APC具有荧光性，伴随着非常高的光吸收和高量子效率。 4.职责和权限 实验员负责实施本规范，主管负责人监督执行。 5.实验试剂. 5.1溶液配制 收集于网络，如有侵权请联系管理员删除

5.2其他试剂 收集于网络，如有侵权请联系管理员删除

6.操作流程 6.1抗体活化 将抗体用0.01mol/L PBS稀释为1mg/mL，加入 mL 活化液(体积比为抗体溶液：反应活化液=10:1），旋涡振荡器混匀后，室温避光反应10min。 6.2与APC反应形成共轭物 将抗体混合液（步骤6.1）加入mg APC荧光素中（加入量：抗体与荧光素质量比为1:1），在室温条件下避光反应3小时，反应开始时间：至结束时间：；（或2-8度条件下避光过夜）。 6.3荧光淬灭 向共轭物（步骤6.2）中加入mL 淬灭剂（淬灭剂添加量按抗体体积：淬灭剂体积=10:1添加）。混匀后，室温孵育30分钟，去除游离的荧光素的荧光效应。淬灭开始时间：至结束时间：。 6.4层析 将共轭物（步骤6.3）层析柱分离，进一步去除游离的荧光素或抗体。 6.5保存 收集得到的标记抗体（步骤6.4），上机测试后根据效价，用Storage Buffer 按比例稀释后，4℃避光保存，有效期一年。 收集于网络，如有侵权请联系管理员删除

荧光素标记抗体方法

荧光素标记抗体技术 (一)原理 目前用于抗体标记的荧光素主要有异硫氰酸荧光素(Fluorescein isothiocy nate,FITC)或罗达明(Lissamine rhodamine B200, RB200)。在硷性条件下FITC 的碳酰胺键可与抗体赖氨酸的ε氨基共价结合，标记后的抗体仍保持与相应抗原结合的能力。在荧光灯源紫外线或兰紫光激发下产生黄绿色荧光，通过在荧光显微镜下观察或流式细胞仪分析可对相应抗原进行定性、定位或定量的检测。 (二) 操作步骤 将纯化的IgG抗体对PH9～9.5碳酸盐缓冲液透析过夜， 透析后抗体液移入小烧杯中 ↓ 称取适量IFTC，加入二甲亚砜(DMSO)(FITC～1mg/1ml DMSO) 使终浓度为1mgFITC／1mlDMSO FITC／IgG比例:如IgG浓度为1mg／ml，FITC／IgG比例约为50μgFI TC／mgIgG； 如IgG为5～10mg／ml，则比例为25μgFITC／ml IgG 在10ml小烧杯中先放入抗体 ↓ 按上述比例将FITC-DMSO溶液逐滴加入透析后的抗体溶液中 ↓ 将标记物用PBS加至2.5ml，磁力搅拌器室温下避光搅拌2h ↓ 用PD10柱(Sephadex G25柱)除去游离荧光素，先用25ml PBS淋洗G2 5柱 ↓ 收集PBS洗脱第一个荧光素结合蛋白峰，测定F／P 比值。第二个荧光素峰为游离荧光素

计算: 2.87×A495 F／P＝──────── A280-0.35×A495 合适的F／P值为2～4。 (三) 试剂器材 1. 纯化的多克隆抗体或单克隆抗体。 2. FITC(Fluorescein-5-Lsothiocyanalte)或其它荧光色素。 3. PBS、DMSO CO34.3g，NaHCO3 8.6g加蒸馏水至500ml。 4. PH9～9.5碳酸盐缓冲液: Na 2 5. PD10柱(Sephadex G25柱) 6.磁力搅拌器，紫外分光光度计等 (四) 注意事项 1. FITC保存于4℃暗处，使用前待试剂瓶升至室温时开盖称取，以避免潮解。 2. FITC-DMSO液要临用时配制。 3. 碳酸盐缓冲液要新鲜配制。

荧光抗体技术

第二节荧光抗体技术 一、荧光抗体的制备 （一）抗体的荧光素标记 用于标记的抗体，要求是高特异性和高亲和力的。所用抗血清中不应含有针对标本中正常组织的抗体。一般需经纯化提取igg后再作标记。作为标记的荧光素应符合以下要求：①应具有能与蛋白质分子形成共价健的化学基团，与蛋白质结合后不易解离，而未结合的色素及其降解产物易于清除。②荧光效率高，与蛋白质结合后，仍能保持较高的荧光效率。③荧光色泽与背景组织的色泽对比鲜明。④与蛋白质结合后不影响蛋白质原有的生化与免疫性质。⑤标记方法简单、安全无毒。⑥与蛋白质的结合物稳定，易于保存。常用的标记蛋白质的方法有搅拌法和透析法两种。以fitc标记为例，搅拌标记法为：先将待标记的蛋白质溶液用0.5ml/lph9.0的碳酸盐缓冲液平衡，随后在磁力搅拌下逐滴加入fitc溶液，在室温持续搅拌4～6h 后，离心，上清即为标记物。此法适用于标记体积较大，蛋白含量较高的抗体溶液。优点是标记时间短，荧光素用量少。但本法的影响因素多，若操作不当会引起较台强的非特异性荧光染色。 透析法适用于标记样品量少，蛋白含量低的抗体溶液。此法标记比较均匀，非特异染色也较低。方法为：先将待标记的蛋白质溶液装入透析袋中，置于含fitc的0.01mol/lph9.4碳酸盐缓冲液中反应过夜，以后再对pbs透析法去除游离色素。低速离心，取上清。 标记完成后，还应对标记抗体进一步纯化以去除未结合的游离荧光素和过多结合荧光素的抗体。纯化方法可采用透析法或层析分离法。 （二）荧光抗体的鉴定

荧光抗体在使用前应加以鉴定。鉴定指标记包括效价及荧光素与蛋白质的结合比率。抗体效价可以用琼脂双扩散法进行滴定，效价大于1:16者较为理想。荧光素与蛋白质结合比率（f/p）的测定和计算的基本方法是：将制备的荧光抗体稀释至a2801≈1.0，分别测读a280（蛋白质特异吸收峰）和标记荧光素的特异吸收峰，按公式计算。 按公式计算。 f/p值越高，说明抗体分子上结合的荧光素越多，反之则越少。一般用于固定标本的荧光抗体以f/p＝1.5为宜，用于活细胞染色的以f/p＝2.4为宜。 抗体工作浓度的确定方法类似elisa间接法中酶标抗体的滴定。将荧光抗体自1:4～1:256倍比稀释，对切片标本作荧光抗体染色。以能清晰显示特异荧光、且非特异染色弱的最高稀释度为荧光抗体工作浓度。 荧光抗体的保存应注意防止抗体失活和防止荧光猝灭。最好小量分装，－20℃冻存，这样就可放置3～4年。在4℃中一般也可存放1～2年。 二、免疫荧光显微技术 免疫荧显微技术的基本原理是：使荧光抗体与标本切片中组织或细胞表面的抗原进行反应，洗涤除去游离的荧光抗体后，于荧光显微镜下观察，在黑暗背景上可见明亮的特异荧光。 （一）标本的制作