小鼠胚胎干细胞培养实验步骤

细胞的原代培养

点击次数：540 作者：佚名发表于：2009-03-06 16:26转载请注明来自丁香园

一、原代细胞培养原理

原代细胞培养是将机体内的某组织取出，分散成单细胞，在人工条件下培养使其生存并不断生长、繁殖的方法。借助这种方法可以观察细胞的分裂繁殖、细胞的接触抑制以及细胞的衰老、死亡等生命现象。

? 幼稚状态的组织和细胞，如：动物的胚胎、幼仔的脏器等更容易进行原代培养

? 掌握无菌操作技术

? 了解小鼠解剖操作技术

? 了解原代细胞培养的一般方法与步骤

?了解培养细胞的消化分散

? 了解倒置显微镜的使用

二、实验材料

? 实验动物：孕鼠或新生小鼠

? 液体：细胞生长液（内含20%小牛血清）

0.25%胰蛋白酶

平衡盐溶液

70%乙醇

?器材：灭菌镊子、剪刀若干把

灭菌培养皿、细胞培养瓶、小瓶、烧杯若干个

吸管若干支

酒精灯

原代细胞培养方法

三、胰酶消化法

（1）胰酶消化法操作步骤——取材

a. 用颈椎脱位法使孕鼠迅速死亡。

b. 把整个孕鼠浸入盛有75%乙醇的烧杯中数秒钟消毒，取出后放在大平皿中携入超净台。

c. 用无菌的镊子和剪子在前腿下作一腹部水平切口，用无菌镊子将皮肤扯向后腿。

d. 用另一无菌的剪刀和镊子切开腹部，取出含有胚胎的子宫，置于无菌的培养皿上。

e. 剔除胚胎周围的包膜（若胚胎较大，应剪去头、爪），将胚胎放于无菌的含有平衡盐溶液的培养皿中。

f. 漂洗胚胎，去掉平衡盐溶液。继续用平衡盐溶液漂洗胚胎直至清洗液清亮为止。

（2）胰酶消化法操作步骤——切割

a. 将部分胚胎转移至一个无菌小瓶中，用平衡盐溶液漂洗。

b. 然后用眼科手术剪刀小心地绞碎胚胎，直到成1mm3左右的小块，再用平衡盐溶液清洗，洗到组织块发白为止。

c. 静置，使组织块自然沉淀到管底，弃去上清。

（3）胰酶消化法操作步骤——消化、接种培养

a. 视组织块量加入5-6倍的0.25%胰酶液，37℃中消化20-40分钟，每隔5分钟振荡一次，或用吸管吹打一次，使细胞分离。

b. 加入3-5ml细胞生长液以终止胰酶消化作用（或加入胰酶抑制剂）。

c. 静置5-10分钟，使未分散的组织块下沉，取悬液加入到离心管中。

d. 1000rpm，离心10分钟，弃上清液。

e. 加入平衡盐溶液5ml，冲散细胞，再离心一次，弃上清液。

f. 加入细胞生长液l-2ml（视细胞量），血球计数板计数。

e. 将细胞调整到5×105/ml左右，转移至25ml细胞培养瓶中，37℃下培养。

（4）胰酶消化法操作步骤——消化、接种培养

a. 视组织块量加入5-6倍的0.25%胰酶液，37℃中消化20-40分钟，每隔5分钟振荡一次。

b.静置，吸去上清，用平衡盐溶液漂洗消化后的组织块，用吸管反复吹打组织块，使细胞分离，静置，使未分散的组织块下沉。

c. 取细胞悬液接种至加了细胞生长液的培养瓶中（调整细胞浓度到5×105/ml左右），37℃下培养。

（注意：省略了离心、计数等步骤）

一、实验器材：手术小直剪刀三把、眼科直镊子三把、眼科弯镊子两把、玻璃平皿三套、200目尼龙滤网、50ML、15ML离心管和手术刀片。以上物品均需要高压灭菌消毒处理。

二、实验试剂：无Ca+2和Mg+2的PBS、0.05%胰酶0.53mmol/L EDTA溶液、小鼠胚成纤维细胞（MEF）生长培养基:高糖DMEM加10%FCS。

`三、实验动物：孕期14至16天的孕鼠

四、实验步骤：

1. 处死孕鼠，置于75%酒精里全身浸泡，然后在超净台中用一把剪刀和一把镊子把孕鼠外皮剪开，用另外一把剪刀和一把镊子把内皮剪开，露出子宫，最后用第三把剪刀和镊子将子宫小心取出放在盛有PBS的玻璃平皿中，冲洗去血。

2.用两把弯镊子将胚胎外的胞膜小心去除，然后夹掉头和内脏，将其余胚胎转移到一个装有30MLPBS的50ML离心管中，轻轻颠倒两次，倒掉PBS，再重复此步骤一次，留少许PBS 将胚胎转移到另一装有PBS的平皿中，用手术刀片将其细细切碎。

3.用200ul的移液枪反复快速吹打平皿中的液体，放在15ML离心管中，4℃1500rpm离心5分钟，倒掉上清，加10ML胰酶，重悬沉淀，放37℃水浴中消化30分钟，且每隔五分钟轻轻晃动，使之充分消化。

4.将上层细胞悬液倒入一装有10MLMEF生长培养基的50ML离心管中，用200目尼龙滤网过滤后，1500rpm离心5分钟收集细胞。30ML MEF生长培养基洗涤两次（此步骤中作者试过用无血清的培养基洗涤，结果无差别）。

5.细胞沉淀用15ML生长培养基悬起，细胞计数（八只14天胎鼠可获得2-3×107细胞）。6细胞悬浮于15ML MEF生长培养基中，接种到200ML的培养瓶中。

7.24小时后更换新鲜的MEF生长培养基。

8 E. n8.细胞长满后，先用PBS冲洗，倒掉，加胰酶消化（此步时间不宜过长，作者一般不超过五分钟），按1：5传代

9.细胞再次长到覆盖率80-90%左右，将其消化后，常规冻存。（冻存液要现配）4

五、实验结果：

六、讨论：1.原代培养，一定要避免污染。" i+ K1 h# d$ i4 S6 y6 o3 F

2. MEF生存能力有限，如果不冻存，体外存活十代左右。

3. 冻存后复苏的细胞只能传代一次，因为这些细胞繁殖能力有限。

4. 消化细胞时间不要过长

小鼠胚胎干细胞培养实验步骤

1、一般培养——保持胚胎干细胞处于未分化状态

培养基

细胞复苏

冻存细胞

明胶包被

细胞传代

2 、体外分化

培养基：包被有多聚鸟氨酸/纤维结合蛋白的培养板（使用或不使用盖玻片）

体外分化方法

注：以下培养针对于小鼠的R1胚胎干细胞系，其它胚胎干细胞的培养可以参考。不过人的胚胎干细胞培养不可以采用下面的protocol，需要用专用的protocol和培养基。

一般培养——维持ES细胞处于未分化状态

ES细胞培养用含有LIF（白血病抑制因子）和Feed细胞的培养基（高糖）来阻止细胞的分化。为细胞提供包被有0.1％明胶的平板作为粘附细胞的基质。建议每2－3天从达到80％－90％融合的平板按1：8的比率传代细胞一次，细胞传代以后，在将细胞接种在0. 1％明胶包被的培养皿之前，通过预先将细胞接种在没有经过包被的组织培养板2个小时，使分化细胞粘附，从而将分化和未分化细胞分开。将细胞全程置于37℃，5％CO2，100％湿度条件下培养。如果在Feed细胞，那么就需要采用MMC进行处理，抑制Feed细胞增殖，但仍然能保持其分泌LIF因子的活*。下文中暂不提及Feed细胞。Feed细胞可以来源于STO细胞或原代胚胎成纤维细胞。

培养基

ES：配制一20×不含DMEM，HS，LIF的溶液（该溶液也能用于EB培养基--见下文）。分装在50ml 离心管中，（稀释为2×，每管42ml），贮存在-20℃。通过将21ml该溶液，HS和LIF加入450ml DMEM中制备培养基，0.22 μm滤膜过滤。贮存于4℃，时间不要超过2周。

贮存液

DMEM（高糖）

马血清（HS）

L-谷氨酰胺（200mM）

MEM NEAA（10mM）

HEPES（1M）

β-巯基乙醇（55Mm）

PEST

LIF

复苏细胞

细胞被冻存在10％二甲基亚砜（DMSO）中防止结晶的形成，结晶的形成会损害细胞。然而，二甲基亚砜对细胞有毒*，快速的进行细胞复苏是很重要的。

步骤：

1、从液氮中取出一管细胞；

2、将冻存管置于37℃水浴中2分钟（或放到管内溶液恰好完全溶解）；

3、将细胞转移到一15ml Falcon管中；

4、加入5ml ES培养基（用培养基冲洗冻存管）；

5、离心3分钟；

6、弃上清，用2ml ES培养基重悬细胞，至少吹打10次；

7、种在明胶包被（见下文）的6孔或6cm组织培养皿；

8、孵育。

冻存细胞

冻存液：90％HS和10％DMSO

步骤：

1、1×PBS洗细胞并留少许PBS在培养皿内；

2、用细胞刮刀收集细胞；

3、将细胞转入15ml 离心管管内并离心3分钟；

4、弃去上清并将细胞重悬于冷的冻存液中（10 cm的培养皿用2ml，15cm的培养皿用6－7ml。）

5、分装于冻存管内，每管1ml；

6、置－80℃过夜，第二天移入液氮。

Geltin（明胶）包被

准备500ml 0.1％geltin溶液

1、将0.5 g明胶溶解在500ml无钙镁的PBS中（50－65℃水浴15～30分钟）。

2、最好在溶液没有冷却的情况下通过0.22 μm滤膜过滤，贮存在4℃。

包被培养板或培养皿

1、加入足量的明胶溶液覆盖培养平面（15 cm培养皿加2ml，10 cm培养皿加0.5～

1 ml，溶液的量并不重要，只要能完全覆盖培养表面就行了。）；

2、置室温30分钟；

3、去除明胶溶液，将培养板贮存在包装袋中室温放置，最好将板子平放或倒扣，以免明胶污染盖子和流出培养板。

细胞传代

建议每2天传代细胞一次，过度生长的细胞会降低细胞的自然分化率，我们建立了一种纯化方法来去除分化细胞，在将细胞接种在明胶包被的培养板上之前，通过将分化细胞黏附在没有包被的组织培养板上去除分化细胞。

纯化步骤包含在下面的方法中。

1、去除培养液；

2、无钙镁PBS（Gibco）洗涤；

3、加入胰酶EDTA（Gibco）。37℃孵育5分钟。

4、加入ES培养基使胰酶失活；

5、将细胞转入15 ml离心管中离心3min；

6、去除上清，将细胞重悬于2 ml ES培养基，至少吹打10－20次。如果加入培养基的量较少会比较容易将细胞团弄散分开。ES细胞有聚集成团的倾向，传代过程中仔细将细胞弄散分开很重要。这样可能会减少细胞的自然分化。

7、将细胞接种在没有包被的组织培养皿中（使用和一开始同样规格的培养皿）放入温箱2小时（分化细胞在该时间内将黏附，而ES细胞仍将保持悬浮）；

8、含有细胞的培养基转入geltin包被的组织培养皿。吹打以确保细胞被分散开（前面已经提到--ES细胞有聚集成团的倾向）

9、建议按1：4－1：10的比率传代(ATCC)

保持细胞的传代比率很重要，以我们的经验，1：8的比率是好的，可以使细胞的自然分化降到最低。当你使用不同规格的培养板进行细胞传代可以使用表1来计算传代比率。

体外分化

胚胎干细胞在体内外可以分化为各种类型的细胞。我们的体外分化方法有利于神经前体细胞通过在最少量的培养基内选择（第3步），在有bFGF存在的情况下扩增（第4步）并最终分化在第5步。细胞全程培养在37℃，5％CO2，100％湿度条件下。一般体外诱导向神经细胞方向分化，也可以采用低浓度的RA进行诱导。

时间线（总时间为27～34天）

第2步；4＋1天第3步；4－10天第4步；4天第5步；10－15天

体外向心肌细胞方向分化

胚胎干细胞在体外去除LIF情况下会自然向心肌细胞方向分化，小鼠的R1系一般在第7-8天自然出现搏动的心肌细胞，与胚胎发育时间线是完全一致的。

培养基

EB

配制一20×不含DMEM，FBS，LIF的溶液（该溶液也能用于ES培养基--见前述）。分装在50ml 离心管中，（稀释为2×，每管42ml），贮存在-20℃。将21ml该溶液和50 ml FBS加入450mlDMEM中制备培养基，0.2μm滤膜过滤。贮存于4℃。

贮存液

DMEM(高糖)

胎牛血清

L-谷氨酰胺（200mM）

MEM NEAA（10mM）

HEPES（1M）

β-巯基乙醇（55Mm）

PEST（P104U/mlS104μg/ml

ITSFn and N3（分化培养基）：

配制一20×不含DMEM/F12的溶液。分装在15ml 离心管中，（稀释为1×，ITSFn 7.

05ml，N3 12.55ml），0.2μm滤膜过滤，贮存在-20℃。将该溶液加入DMEM/F12中制备培养基，贮存于4℃。

贮存液

DMEM(高糖)

转铁蛋白50mg/ml

胰岛素5mg/ml

亚硒酸钠300μM

黄体酮（20μM）

腐胺（100μM）

PEST（P104U/ml S104μg/ml）

层粘连蛋白100μg/ml

纤维连接蛋白250μg/ml

碱*rhFGF, 10μg/ml

*在第4步将bFGF加入N3培养基使终浓度为10ng/ml。

ITSFn and N3培养基贮存液的准备

使用无菌的溶剂和稀释液，在分装之前要对溶液进行过滤，如果因为某些原因溶液在分装之前没有进行过滤，需要在管子上标明以便别人在使用时知道该溶液不能直接用于细胞培养。

贮存液溶剂，贮存液，稀释剂和储存

转铁蛋白50mg/ml

胰岛素5mg/ml

亚硒酸钠300μM

黄体酮（20μM）

腐胺（100μM）

PEST（P104U/ml S104μg/ml）

层粘连蛋白（100μg/ml）

纤维连接蛋白（250μg/ml ）

碱*rhFGF, （10μg/ml）

包被有多聚鸟氨酸/纤维结合蛋白的培养板（使用或不使用盖玻片）

包被液的准备

多聚-L-赖氨酸，15μg/ml

把75ml多聚-L-赖氨酸和425ml 1×PBS混合。贮存在4℃。

纤维结合蛋白，1μg/ml

把0.5ml纤维结合蛋白和500ml 1×PBS混合。

包被过程：

1、加入多聚-L-赖氨酸，至少2－3小时（过夜也行）

2、吸出多聚-L-赖氨酸

3、加入纤维结合蛋白，大约1－2小时

4、吸出纤维结合蛋白，放置30分钟晾干

5、贮存在4℃

24孔板用200μl，6孔板用500μl。震荡培养板确保溶液能够覆盖盖玻片或培养孔。有时需要剧烈震荡培养板。

体外分化方法

第1步：ES培养基

在LIF存在的条件下维持细胞培养

第2步：EB培养基

使用细菌培养皿去除LIF后胚状体的形成需要4天。

1、分散纯化细胞（参见上面的细胞传代部分）

2、纯化2小时后将细胞转入含有ES培养基的50ml Falcon管中，计数细胞取适量体积放入15ml管中离心3分钟。

3、用2mlEB培养基重悬细胞，吹打至少10次制成单细胞悬液

4、一个15cm的细菌培养皿接种4～5×106个细胞（1个完全融合的组织培养皿通常足以接种4个同样规格的细菌培养皿）。

5、2天后更换培养基

将胚状体转入锥形管中放置3～5分钟使细胞沉降。弃去上清，将细胞重悬于新鲜培养基并接种在新的细菌培养皿中。

6、用EB培养基培养的第4天将细胞转入没有包被的组织培养皿中（这即是细胞的移植步骤）。1个组织培养皿之中放置1个细菌培养皿，在进行第3步之前一天将胚状体黏附在同样规格的培养板上。

形成胚状体需要4天时间。在EB培养基中再培养1天使胚状体粘附在组织培养皿的表面。这一天被认为是第2步和第3步的分界。

第3步：ITSFn培养基

在最少量培养基中选择神经前体细胞

1、胚状体接种在组织培养皿一天后将培养基换成ITSFn培养基。

2、并非所有胚状体在这一时期都已经发生粘附，因此在移除培养基时要小心谨慎以使大部分胚状体留在培养皿内。

3、保持细胞在ITSFn中培养大约10天，根据需要更换培养基--大约每隔一天。

观察细胞形态，神经样细胞大约出现在第4到第7天。当神经样细胞能够被鉴别时，转入到第4步。步骤的转换应该在神经前体细胞出现第一个清晰的标志几天以后，通常是在第3步的第6到第10天。

第4步：N3培养基＋bFGF

通过将神经前体细胞培养在含有10ng/ml bFGF的培养基中进行扩增。

1、PBS洗涤，加入1-2ml 胰酶

2、37℃孵育5分钟

3、用4mlEB培养基终止胰酶活*，将细胞转入锥形管中放置3～5分钟移出细胞团，将上清移入一新的离心管离心。

4、将细胞重悬于含有bFGF的N3培养基。

5、将细胞接种在包被多聚-L-鸟氨酸/纤维连接蛋白的盖玻片上（最好将盖玻片放于24孔培养板或6孔培养板，6孔培养板中每孔放置5个盖玻片如果是塑料的放置4个，以使最大可能的获得样品数量）。24孔板接种3.5×105/孔或6孔板1.7×106 /孔。

6、2天后更换培养基

第5步：N3培养基通过撤除bFGF使神经前体细胞分化

1、细胞被接种在盖玻片上4天后将培养基换成不含bFGF的N3培养基

2、根据需要换液（大约每隔一天）

3、分化10～15天后固定细胞

移除培养基

PBS洗涤

加入4%福尔马林

室温放置30分钟

PBS洗涤2次

储存于PBS。长期储存使用含0.01％叠氮化纳的PBS

移植细胞的准备

细胞在胚状体形成4天以后被移植（相应于体外分化过程中的第2步末细胞被转种到组织培养板）。正如在前文体外分化中所描述的在移植之前4天开始形成胚状体。通常再需要一天时间以便将胚状体移植入一10cm的培养皿。

移植

1、将胚状体转移至一15ml 圆锥形管中放置3～5分钟使胚状体沉降下来。

细胞被离心3分钟会更好。放置使之沉降将会去除更多的单个细胞（包括死细胞）而这些细胞可以被离心下来。

2、去除上清将胚状体重悬于无钙镁离子的1×PBS中

3、离心3分钟

4、去除上清加入1×胰酶（10cm的培养皿加1ml）

5、37℃水浴5分钟

6、加入5mlEB培养基小心吹打约10次

小心处理细胞很重要，进行细胞传代分散细胞时不可剧烈吹打。

7、离心2分钟

8、吸出上清将细胞重悬于500μl EB培养基

9、用光滑的巴斯德吸管小心吹打5次

10、离心2次

11、吸出上清将细胞重悬于100μl E B培养基

烟酸己可碱标记ES细胞进行移植

1、准备一10μg/ml的烟酸已可碱染液（双苯酰亚胺，在冷冻室118）

2、加入1mg（你能称到的最小量）到5ml EB培养基（制成200μg/ml）

3、将溶液稀释成10μg/ml （100μl 200μg/ml 溶液和1.9ml EB培养基）

4、如前所述将细胞重悬于2ml烟酸已可碱染液而不是EB培养基中制备ES细胞悬液

5、将悬液置于室温（或冰上）30分钟

6、离心2分钟

7、吸出上清将细胞重悬于2ml EB培养基

8、重复一次

9、离心2分钟

10、吸出上清将细胞重悬于100μl EB培养基并置于冰上。

细胞的冻存与复苏

为了防止因污染或技术原因使长期培养功亏一篑，考虑到培养细胞因传代而迟早会出现变异，有时因寄赠、交换和购买，培养细胞从一个实验室转运到另一个实验室，最佳的策略是进行低温保存。这对于维持一些特殊细胞株的遗传特性极为重要。现简要介绍深低温保存法（-70℃～196℃）的特点。细胞深低温保存的基本原理是：在-70℃以下时，细胞内的酶活性均己停止，即代谢处于完全停止状态，故可以长期保存。细胞低温保存的关键，在于通过0～20℃阶段的处理过程。在此温度范围内，水晶呈针状，极易招致细胞的严重损伤。

一、细胞的冻存：为避免污染造成的损失，最小化连续细胞系的遗传改变和避免有限细胞系的老化和转化，需要冻存哺乳细胞。冻存细胞前，细胞应该特性化并检查是否污染。

有几种普通培养基用来冻存细胞。对于包含有血清的培养基，成分可能如下：

◆包含10%甘油的完全培养基，

◆包含10%二甲基亚砜（DMSO）的完全培养基，

◆50%细胞条件培养基和50%含有10%甘油的新鲜培养基，或

◆50%细胞条件培养基和50%含有10%二甲基亚砜的新鲜培养基。

对于无血清培养基，一些普通的培养基成分可能是：

◆50%细胞条件无血清培养基和50%包含有7.5%二甲基亚砜的新鲜的无血清培养基，或

◆包含有7.5%二甲基亚砜和10%细胞培养级BSA的新鲜无血清培养基。

1、悬浮细胞

●计数将要冻存的活细胞。细胞应该处于对数生长期。以大约200～400g离心5分钟沉淀细胞，使用移液管移去上清到最小体积，不要搅乱细胞。

●以1×107到5×107细胞/ml密度，在包含有血清的冷冻培养基中再次悬浮细胞，或者以0.5×107到1×107在无血清培养基中，再次悬浮细胞。

●分装进冻存管，将冻存管置于湿冰上或放入4℃冰箱中，5分钟内开始冷冻步骤。

●细胞以1℃/分钟进行冷冻，可以通过可编程序的冷冻器进行或者把隔离盒中的冻存管放到-70℃到-90℃的冰箱中，然后转移到液氮中贮存。

2.贴壁细胞

●使用分离试剂从基层分离细胞，分离时尽可能温和，使对细胞的损伤减少到最小。

●在完全生长培养基中，再次悬浮分离细胞，确定有活力细胞数。

●以大约200g离心5分钟沉淀细胞。使用移液管移去上清到最小体积，不要搅乱细胞。

●以5×106到1×106细胞/ml密度，在冻存液中悬浮细胞。

●分装进冻存管，将冻存管置于湿的冰上或放入4℃冰箱中，5分钟内开始冷冻步骤。

●细胞以1℃/分钟进行冷冻，可以通过可编程序的冷冻器进行或者把隔离盒中的冻存管放到-70℃到-90℃的冰箱中，然后转移到液氮中贮存。

二、冻存细胞的复苏：冻存细胞较脆弱，要轻柔操作。冻存细胞要快速融化，并直接加入完全生长培养基中。若细胞对冻存剂（DMSO或甘油）敏感，离心去除冻存培养基，然后加入完全生长培养基中。

1、直接铺板方法

●取出贮存细胞，37℃水浴中快速融化。

●直接用完全生长培养基铺板细胞。1ml冻存细胞使用10～20ml完全生长培养基。进行活细胞计数，细胞接种应该至少在3×105活细胞/ml。

●培养细胞12到24小时，更换新鲜的完全生长培养基，去除冻存剂。

2、离心方法

●取出贮存细胞，37℃水浴中快速融化。

●把1到2ml冻存细胞加入到大约25ml完全生长培养基，轻轻混匀。

●以大约80xg离心2到3分钟。

●弃去上清。

●在完全生长培养基轻轻再次悬浮细胞，并且进行活细胞计数。

●细胞铺板，细胞接种应该至少为3×105活细胞/ml。

复苏技术

1. 细胞复苏的原则

在实际操作中，冻存细胞要进行复苏，再培养传代。复苏细胞一般采用快速融化法。以保证细胞外结晶快速融化，以避免慢速融化水分渗入细胞内，再次形成胞内结晶损伤细胞。

2. 细胞复苏的主要操作步骤

（1）佩戴眼镜和手套，从液氮罐中取出安瓿或冷冻管。

（2）迅速放入38℃水浴中，并不时摇动，在1分钟内使其完全融化，然后在无菌下取出细胞。

（3）在1000r/min速度下离心5～10分钟，弃去上层液，加入适量培养液后接种于培养瓶中，接种浓度1×109/L，置37℃温箱静置培养，次日更换一次培养液，继续培养，观察生长情况。若细胞密度较高，及时传代。或无需离心直接将细胞加入瓶中，并加入培养基贴壁培养12～24小时后，充去上清，换入新鲜培养基继续培养。

细胞冻存液中一般会含有5—10%的DMSO，常温下DMSO对细胞有较强的毒副作用，因此在细胞解冻后应及时离心（1000r/min，5min）去除冻存液，否则严重影响细胞生存。若担心离心损失细胞量，可将细胞悬液先孵育4—6h（不离心），此时细胞已经贴壁，再轻轻倒掉含有冻存液的培养液，更换新的培养液后继续培养。另外，经丝裂霉素C或r射线处理过的饲养层细胞最好在事先包被过明胶的培养皿中培养，则更容易贴壁。

3. 注意事项

在细胞复苏操作时，应注意融化冻存细胞速度要快，可不时摇动安瓿或冷冻管，使之尽快通过最易受损的温度段（-5～0℃）。这样复苏的冻存细胞存活率高，生长及形态良好。然而，由于冻存的细胞还受其他因素的影响，有时也会有部分细胞死亡。此时，可将不贴壁、飘浮在培养液上（已死亡）的细胞轻轻倒掉，再补以适量的新培养液，也会获得较为满意的结果。

技术总结要点

1. 冷冻速度

冷冻速度也就是降温的速度，它与冷冻效果直接相关。Morris认为在冷冻过程中生物物理作用比生物化学作用更重要。冷冻速度、细胞收缩引起细胞膜和细胞器的变化是造成损伤的主要因素目。冷冻速度不同，细胞内水分向细胞外流动的情况也会不同。如果冷冻速度过慢，细胞内水分外渗多，细胞脱水，体积缩小，同时细胞内溶质浓度增高，细胞内不发生结冰；冷冻速度过快，细胞内水分没有足够时间外渗，随着温度的下降，细胞内会发生结冰；如果冷冻速度非常快，细胞内形成的冰晶反而非常小或不结冰而呈玻璃状凝固（玻璃化冷冻）。

不同的冷冻速度会使细胞内外产生不同的生理变化，同样也会对细胞造成损伤。冷冻速度过慢，细胞严重脱水，体积急剧收缩．超过一定程度时细胞失去活性。冷冻速度过慢会引起细胞外溶液部分结冰，从而使细胞外未结冰的溶液中溶质浓度增高，产生溶液损伤。冷冻速度过快，细胞内水分来不及外渗，会在胞内形成较大冰晶，造成细胞膜和细胞器的损伤，产生细胞内冰晶损伤。1937年，Luyet实液体的凝固可分为两种形式：一种是晶体化，液体中的分子呈有序的排列；另一种为非晶体化即玻璃化，液体中的分子呈无序排列，保持未凝固前的状态。故从细胞存活角度来说玻璃化冷冻是最为理想的冻存方法。细胞内外呈玻璃化凝固。无冰晶形成或形成很小的冰晶，对细胞膜和细胞器不造成破坏；细胞也不会在高浓度溶质的溶液中因暴露时间过长而受损。

不同细胞的最适冷冻速度不同，主要取决于水分渗透过程是否与降温速度相匹配；同时还取决于细胞的表面积与体积之比，以及细胞膜的渗透率。一般来说，小细胞（如红细胞等）对水通透性强，适用于快冻，最佳冷冻速率较高，可达103℃/min或更高；相反大的细胞或组织，如直径100nm以上的胚胎，对水的通透性弱，则适于慢冻。此外，最佳冷冻速度还受是否应用防冻剂、防冻剂的含量以及培养的细胞所处的状态等多方面的因素影响。目前被普遍接受的是皮肤的低温保存中采用慢冻快复温，一般认为降温速率以1～5 ℃/mi n为最佳。

2. 冷冻保存温度

冷冻保存温度是指长久保存细胞的超低温度，在此温度下，细胞生化反应极其缓慢甚至停止。经过长期保存的细胞和组织在复苏后仍能保存正常的结构和功能。

冷冻保存温度可以随着不同的细胞和生物体以及不同的冷冻保存方法而不同。液氮温度（-196 ℃）是目前最佳冷冻保存温度。在-196 ℃时，细胞生命活动几乎停止，但复苏后细胞结构和功能完好。应用-70～-80 ℃条件冷冻保存细胞，短期内对细胞活性无明显影响，但随着冻存时间延长，细胞存活率明显降低。在0～40℃范围内保存细胞效果不佳。

3. 复苏

复温速度是指在细胞复苏时温度升高的速度。冷冻保存体外培养物，除了必须有最佳的冷冻速度、合适的冷冻保护剂和冻存温度外，在复苏时也需要有最佳的复温速度，这样才能保证最终得最佳冷冻保存效果。与冷冻过程相比，复温过程的研究显得薄弱得多。

复温速度不当同样会造成细胞损伤，降低冻存细胞存活率。其损伤发生非常快，持续时间也很短，原因可能有多方面。Mackenzie和Bank通过对酵母细胞的冷冻研究发现，冷冻过程中胞内形成的冰晶并未对细胞造成致命的损伤，反而是在复温过程中，复温到-40℃或者更高的温度时，细胞内会重新形成较大冰晶而造成细胞的致命损伤。常规的做法是，在37℃水浴中，于1～2min内完成复温，也就是通常采用的快速复苏。因此，最佳复温速率与最佳冷冻速率对保证获得最佳冻存效果同等重要。

4. 冻存保护剂

冻存保护剂（Cryoprotectant）是指可以保护细胞免受冷冻损伤的物质（常为溶液）。细胞悬液中加入冷冻保护剂可保护细胞免受溶液损伤和冰晶损伤。冷冻保护剂同溶液中的水分子结合，发生水合作用，弱化水的结晶过程使溶液的粘性增加从而减少冰晶的形成．同时冷冻保护剂可以通过在细胞内外维持一定的摩尔浓度，降低细胞内外未结冰溶液中电解质的浓度，使细胞免受溶质的损伤。冷冻保护剂根据其是否穿透细胞膜可分为渗透性和非渗透性两类。渗透性冷冻保护剂多是一些小分子物质，可以透过细胞膜渗透到细胞内。该类保护剂主要包括二甲基亚砜（Dimethyl Sulfoxide，DMSO）、甘油、乙二醇、丙二醇、乙酰胺、甲醇等。其保护机制是在细胞冷冻悬液完全凝固之前，渗透到细胞内，在细胞内外产生一定的摩尔浓度，降低细胞内外未结冰溶液中电解质的浓度，从而保护细胞免受高浓度电解质的损伤同时。细胞内水分也不会过分外渗，避免了细胞过分脱水皱缩。在使用该类冷冻保护剂时，需要一定时间进行预冷，在细胞内外达到平衡以起到充分的保护作用。目前使用较多的是DMSO、甘油、乙二醇和丙二醇等。

非渗透性冷冻保护剂一般是些大分子物质，不能渗透到细胞内。该类保护剂主要包括

聚乙烯吡咯烷酮（Polyvinylpyrrolidone，PVP）、蔗糖、聚乙二醇、葡聚糖、白蛋白及羟乙基淀粉等。其保护机制的假设很多，其中一种可能是，聚乙烯吡咯烷酮等大分子物质可以优先同溶液中的水分子相结合，降低溶液中自由水的含量。使冰点降低。减少冰晶的形成；同时，由于其分子量大，使溶液中电解质浓度降低，从而减轻溶质损伤。

不同的冷冻保护剂有不同的优缺点。目前的趋势是联合使用两种以上冷冻保护剂组合。由于许多冷冻保护剂在低温条件下保护细胞，在常温下对细胞有害。故在细胞复温后要及时清除冷冻保护剂。

1. Quick and humane sacrifice of pregnant female CD1 mice (E13.5) by cervical dislocation.

2. Dissect out uterine horns and transfer into 90mm dish.

3. Carefully remove fetuses from the uterus using forceps and scissor

s and rinse in DPBS.

4. Cut away brain and dark red organs, wash with fresh DPBS, and remo ve as much blood clots as possible.

5. Put tissue into a 60mm dish. Using an elbow iris scissors finely m ince the fetuses until they become 1-3mm3 piece of tissue.

6. Wash with fresh DPBS three times.

7. Add 2ml of 0.05% trypsin/EDTA and incubate at 37°C for 5-10min.

8. Inactivate trypsin/EDTA by adding equal volume of MEF medium, Put into syringe up and down several times to dissociate into single cell.

9. Collect the suspensions in a fresh 15 ml centrifuge tube and pelle

t cells by centrifugation at 200g for 5-10min.

10. Carefully take off the supernatant and resuspend cells in 1ml MEF medium.

11. Seed cells into approximately two 60mm dishes containing 6ml MEF medium. Incubate dishes in a 37°C incubator with 5% CO2 for approxim ately 3h.

12. Change medium after cells attach (label these cells as P0).

13. The next day, allow cells to grow until confluence (repeat step 6 -10). Split the cells 1:3-4 (label these cells as P1).

14. When cells reach confluence, repeat step 6-10. Resuspend cells in freezing medium and freeze each plate in three cryovials.

15. Transfer the cryovials to -80°C freezer, the next day transfer c ells to a liquid nitrogen store tanks (see Fig. 1).

小鼠胚胎干细胞培养

以下培养针对于小鼠的R1胚胎干细胞系，其它胚胎干细胞的培养可以参考。不过人的胚胎干细胞培养不可以采用下面的protocol，需要用专用的protocol和培养基。 一般培养－－维持ES细胞处于未分化状态 ES细胞培养用含有LIF（白血病抑制因子）和Feed细胞的培养基（高糖）来阻止细胞的分化。为细胞提供包被有0.1％明胶的平板作为粘附细胞的基质。建议每2－3天从达到80％－90％融合的平板按1：8的比率传代细胞一次，细胞传代以后，在将细胞接种在0.1％明胶包被的培养皿之前，通过预先将细胞接种在没有经过包被的组织培养板2个小时，使分化细胞粘附，从而将分化和未分化细胞分开。将细胞全程置于37℃，5％CO2，100％湿度条件下培养。如果在Feed细胞，那么就需要采用MMC进行处理，抑制Feed细胞增殖，但仍然能保持其分泌LIF因子的活性。下文中暂不提及Feed细胞。Feed细胞可以来源于STO细胞或原代胚胎成纤维细胞。 培养基 ES: 配制一20×不含DMEM，HS，LIF的溶液（该溶液也能用于EB培养基－－见下文）。分装在50ml 离心管中，（稀释为2×，每管42ml），贮存在-20℃。通过将21ml该溶液，HS和LIF加入450ml DMEM中制备培养基，0.22 μm滤膜过滤。贮存于4℃，时间不要超过2周。 贮存液 DMEM（高糖） 马血清（HS） L-谷氨酰胺（200mM） MEM NEAA（10mM） HEPES（1M） β-巯基乙醇（55Mm） PEST LIF 复苏细胞 细胞被冻存在10％二甲基亚砜（DMSO）中防止结晶的形成，结晶的形成会损害细胞。然而，二甲基亚砜对细胞有毒性，快速的进行细胞复苏是很重要的。 步骤： 1．从液氮中取出一管细胞； 2．将冻存管置于37℃水浴中2分钟（或放到管内溶液恰好完全溶解）； 3．将细胞转移到一15ml Falcon管中； 4．加入5ml ES培养基（用培养基冲洗冻存管）； 5．离心3分钟； 6．弃上清，用2ml ES培养基重悬细胞，至少吹打10次； 7．接种在明胶包被（见下文）的6孔或6cm组织培养皿； 8．孵育。 冻存细胞 冻存液

血脂检测的七个注意事项

血脂检查的七个注意事项 如今，血脂检查已是成人体检中的必备项目，其中的各个项目都会受到诸多因素，特别是饮食的影响，所以，在抽血检查前，患者需要做好各种准备。我们结合化验血脂时大家经常犯的错误，做以下具体讲解。 三天内避免高脂饮食 病例一：按照医生的嘱咐，李女士周一清晨空腹来医院化验血脂。结果显示甘油三酯偏高。原来，周末两天李女士全家聚会，自然少不了一番大吃大喝。 错误之处：化验前一日进食了大量高脂肪的食物，会影响血脂的化验结果。建议：血脂尤其是甘油三酯，容易受短时间食物中脂肪含量的影响而升高。我们经常遇到过这样的病人，化验前一天吃了很多烤鸭，第二天抽出来的血都是乳糜状的，这种“浑浊”的血液透光度差，肯定会影响化验结果。所以，在抽血前三天内应避免日常生活以外的高脂饮食，例如聚会等，以免造成血脂升高的假象。 保持平时的饮食习惯 病例二：赵女士因为血脂异常，已经吃药治疗1个月了，她特别希望这次化验是正常的，所以近几天吃饭非常注意，有点油腻的一概不吃，只吃青菜。 错误之处：这种做法类似“作弊”行为，有可能拿到一张正常的化验结果，不过是“假的”，会让血脂这个心脑血管疾病的“罪犯”逍遥法外。建议：抽血化验前2周内要保持平常的生活习惯和饮食习惯，才能反映出真实的血脂情况，进而才可以判断是否需要接受药物治疗，正在服用的药量是否合适等。 抽血前一天别喝酒 病例三：张先生约好要见一个客户，在餐桌上，张先生对客人说：“我明天要去体检，化验血脂，您自己多吃点，我就不吃太多揉菜了。陪您喝两杯酒吧。” 错误之处：不止史吃饭，饮酒也能影响血脂的浓度，例如明显升高血液中甘油三酯的浓度，降低高密度脂蛋白胆固醇的浓度，会导致化验结果出现误差。建议：临床上发现，大量饮酒者2-3天之内的血脂浓度，尤其是甘油三酯的浓度常常显著升高。所以，抽血前三天内不能有大量饮酒情况，24小时内连少量饮酒都不可以。 空腹10-12小时 病例四：王大爷昨天家里来了客人，热闹极了，高朋满座，晚上快11点才吃完。第二天一大早就赶去医院抽血化验血脂了。 错误之处：患者一般只知道做血脂检查需要空腹，但对空腹多长时间及其他注意事项了解甚少，往往造成步准确的检验结果。建议：在餐后，血脂尤其是甘油三酯的浓度会明显升高，餐后2-4小时，血脂浓度达到最高峰，8小时后基本恢复至空腹水平。但由于不同个体的代谢能力不同，为了准确起见，最好是空腹10个小时以上再化验。不过，如果空腹时间过长，也可因身体里储存的脂肪被“动员”起来，使甘油三酯浓度升高，影响血脂测定结果，所以饿的时间也不要太长，以空腹10-12小时为最佳。比如说，如果想在早晨8点抽血，前一天晚上8点以后就不能进食，可少量饮水；10点以后最好连水也不要喝。血脂检测的化验单中，参考的正常值范围也是依据空腹时间12小时左右的结果制定的。因此，只有严格按照要求的空腹时间，才能够得到准确的结果，进而和标准的参考范围进行比较。 休息5分钟后抽血 病例五：老周早晨出门晚了，没打上车，眼看着医院抽血时间就要结束了，老周一路小跑就去了医院，直奔抽血窗口，累得直喘粗气，但及时抽上了血。 错误之处：剧烈运动对血脂也有一定的影响。建议：体位会影响水分在血管内外的分布，进而影响血脂的浓度。研究表明，站立5分钟，可使血脂浓度提高5%，15分钟即可提高

小鼠胚胎干细胞mES小鼠iPS培养Protocol

小鼠胚胎干细胞（mES细胞）、小鼠iPS细胞培养Protocol MEF细胞铺制： 1. 在T25培养瓶中加入0.2%明胶，摇匀后覆盖底面即可，于37℃细胞培养箱至 少放置15 min以上。 2. 吸除0.2%明胶，加入事先水浴加热至37℃的MEF完全培养液。一般地，一 个T25培养瓶中加入5 ml MEF完全培养液。 3. 按实验需要：小鼠胚胎干细胞使用KM-r P3 MEF或CF-1 P3 MEF；小鼠iPS 使用ICR-r P3 MEF，复苏MEF细胞若干支。将冻存管从液氮中取出，置于37℃水浴中使之迅速融解，取出后拿到超净台内用75%酒精擦拭冻存管旋口处及外壁，防止污染。 4. 将冻存管内细胞悬液转移至含2 ml MEF完全培养液的15 ml离心管内，以 1000 rpm，离心5 min，离心后将上清液吸除，另加入新鲜的MEF完全培养液1 ml，重悬后按照一个T25培养瓶铺1?106的MEF细胞，平均加入到T25培养瓶中，轻轻摇匀后置于37℃细胞培养箱。24 h以后可以传入小鼠胚胎干细胞或小鼠iPS细胞。 5. 复苏或传代小鼠胚胎干细胞或小鼠iPS细胞前，将T25培养瓶中的MEF完全 培养液吸除，加入2 ml小鼠胚胎干细胞、小鼠iPS细胞完全培养液轻轻冲洗一遍后吸除，加入新鲜的小鼠胚胎干细胞、小鼠iPS细胞完全培养液待用。 复苏： 1. 将小鼠胚胎干细胞、小鼠iPS细胞冻存管从液氮中取出，置于37℃水浴中使 之迅速融解，取出后拿到超净台内用75%酒精擦拭冻存管旋口处及外壁，防止污染。 2. 将冻存管内细胞悬液转移至含3-4 ml小鼠胚胎干细胞、小鼠iPS细胞完全培 养液的15 ml离心管内，以1000 rpm，离心5 min。 3. 离心后将上清液吸除，另加入新鲜的小鼠胚胎干细胞、小鼠iPS细胞完全培 养液2 ml，吹打悬浮。 4. 重复吹打，制成单细胞悬液，尽量避免气泡。 5. 转移至1个已经铺好MEF细胞的T25培养瓶中培养。 6. 每天更换小鼠胚胎干细胞、小鼠iPS细胞完全培养液。 传代： 1.一般在复苏后第2-3天传代，视克隆大小和密度而定。 2.吸除废液。 3.用PBS（不含钙镁离子）轻轻冲洗一遍。

小鼠胚胎干细胞的培养

小鼠胚胎干细胞分化为精子细胞的研究进展 郑晨光生科091 学号090304109 (河北科技大学生物科学与工程学院石家庄050018) 摘要:胚胎干细胞(ESCs) 是一种具有分化发育为三个胚层组织细胞潜能的全能性细胞, 哺乳动物的精子起源于原始生殖细胞(PGCs), ESCs 可分化为PGCs, 并进一步分化为精子细胞。通过在培养基中添加诱导分化因子(如维甲酸等) 或与希望诱导分化的目的细胞(如Sertoli细胞等) 共培养, 并通过鉴别ESCs分化为生殖细胞的各阶段特异性基因标志物 c-kit、VASA、DAZL、fragilis、miwi、mil1和mil2等, 获取不同阶段的生殖细胞。鼠的ESCs 已诱导出了不成熟的精子细胞, 但到目前为止尚无成熟精子培养成功, 且诱导分化的效率很低。 关键字：小鼠；胚胎干细胞；精子 胚胎干细胞是由哺乳动物早期胚胎分离克隆的一类未分化二倍体细胞, 能在体外增殖, 并能保持未分化状态。在一定条件下可以分化为包括生殖细胞在内的三个胚层的所有细胞类型。目前, 已从ESCs 诱导出神经细胞、心肌细胞、肝细胞、骨细胞、胰岛素分泌细胞等。小鼠胚胎干细胞体外已成功诱导分化为精子细胞和卵母细胞, 人胚胎干细胞理论上也具备分化为生殖细胞的潜能。2003 年5 月Hubner 等成功将鼠胚胎干细胞体外分化为生殖系统的卵母细胞,并在Science 上报道了该成果。近来有实验室从小鼠ESCs体外分化产生雄性原始生殖细胞, 孵育分化后注入到卵母细胞可发育成囊胚, 且检验为正常的二倍体核型。本文从小鼠胚胎干细胞定向分化为精子细胞的基因标记和方法学2 个方面, 对ESCs 向精子细胞分化的最新研究进展作一综述。 1 原始生殖细胞的发育 雌、雄鼠合笼至母鼠见阴栓后(days post-coitum,dpc) 7 d ,鼠胚胎中出现原始生殖细胞(primordiralgerm cells, PGCs), 经过增殖, 移行到生殖嵴, 并继续分化为生殖干细胞(germ stem cells, GSCs), 这些细胞是精子和卵子发生的基础。大部分研究者都认为, PGCs 是生殖细胞最初的形式,小鼠胚胎在三个胚层形成时, PGCs同时出现。PGCs 从性腺原条移行到尿囊再移行到近端内胚层中, dpc 7 d 后在中胚层远端可观察到PGCs, dpc 8 d移行到尿囊再到原肠, 这被称为移行期PGCs, 在dpc 9.5-11.0 d , 移行至生殖嵴, 这一阶段被称为移行后期PGCs, 当PGCs 分化为生殖母细胞时, 睾丸或卵巢的结构就已经确立。对于雄性小鼠, 生殖母细胞一直停留在有丝分裂期直到出生后2 d , 然后到达输精管基底膜或者停留在管腔中退化, 那些存活下来的细胞则继续分化为GSCs, 经过多细胞分化阶段, 分化为精母细胞, 精母细胞减数分裂为精子细胞, 后者最终分化为精子。也就是说, 在雄性胚胎中生殖细胞要经历移行前期P G C s 、移行期PGCs、移行后PGCs 、生殖母细胞、A 型精原细胞、GSCs 和减数分裂前生殖细胞, 才形成成熟的精子。在这段复杂漫长的变化中, 有多种不同的特异基因的表达。 2 生殖细胞分化的基因标记 PGCs的很多标志物在未分化的ESCs 上也有表达, 摆在研究者面前的挑战就是如何区分这2种细胞。且ESCs 在分化为PGCs 的过程中, 各个阶段 的基因标记也不同。ESCs的分化依赖于特异基因表达, 在生殖细胞分化中起关键作用的基因有c - k i t 、V A S A 、DAZL、fragilis、miwi、mil1和mil2等, 这些基因的表达有阶段特异性, 即在生殖细胞的不同发育阶段, 它们分别稳定地表达, 从而成为原始生殖细

第一包快速血脂检测系统

第一包、快速血脂检测系统 数量：1套 技术参数： 1.仪器要求：小型快速检测仪器，便携式。 2.标本采集：手指末梢血，方便受检者，也可应用静脉全血、血清、血浆。 3.标本用量：＜40μl。 .检测项目：能同时检测总胆固醇，甘油三酯，高密度脂蛋白及血糖数值，并能计算出低密度脂蛋白数值。 5.检测速度：≤5分钟。 6.结果表达：仪器有液晶显示结果，并标配外接打印机打印。 7.评估系统：仪器自带血脂管理及冠心病风险评估系统软件，能做10年风险评估。 8.认证体系：通过中国SFDA、美国FDA、欧盟CE及胆固醇参考方法实验室网络（CRMLN）认证。 第二包、全自动配血及血型分析仪 数量：1台 技术参数

第三包、诊断听力计 数量：1台 一、标准： 符合相关医疗器械生产销售技术标准及相关医疗器械设备电气安全标准。 二、具备功能： 1．气导测试。 2．骨导测试。 3．高频测试。 4．噪声掩蔽。 5．自由声场测试。 6．言语测听。 7．双通道。 8．双耳交替响度平衡测试（ALT）。 9．短增量敏感指数测试（SISI）。 10．医患交谈系统。 11．信号监听。 12．可外接双路音频接口。 13．可直接连接打印机打印测试结果或连接计算机储存病人档案。 14．高清晰度大屏幕液晶显示。 15．内置声场放大器。 三、技术参数： 1．纯音- 通道1和通道2。 2．频率范围：气导：125Hz 至 12000Hz； 高频：8000Hz 至 20000Hz； 骨导：250Hz 至 8000Hz； 声场：250Hz 至 12000Hz。 3．精度：±1%。 4．总谐波失真≤2% (气导耳机)；≤5%(骨导震动器)。 5．强度范围：气导：-10 dB HL 至 120 dB HL；

小鼠胚胎干细胞培养体系的建立

第19卷第2期 江西农业大学学报 V o l.19,N o.2 1997年6月 A cta A gricu ltu rae U n iversitatis J iangx ien sis June,1997 α 小鼠胚胎干细胞培养体系的建立 汪河海1　刘红林2　范必勤1　钟　卉3　丁家桐4 (1　江苏农科院牧医所,南京　210014;2　南京农业大学动物科技学院,南京　210059;3　南京铁道医学院,南京　210009;4　扬州大学农学院动物科学系　225009) 摘 要 通过探讨影响小鼠胎儿成纤维细胞饲养层制备及胚胎干细胞体外培养的若干因素,建立了小鼠胚胎干细胞体外培养体系,并建成小鼠ES细胞系。 关键词:小鼠;胚胎干细胞;培养体系;ES细胞系 中图分类号:S865.1 胚胎干细胞又称ES细胞(Em b ryon ic Stem Cells)。其特点是在体外特定的培养条件下能保持其只生长、不分化的增殖状态,并具早期胚胎细胞发育的全能性。哺乳动物的ES细胞系自Evan s和Kaufm an(1981)首次建立以来[1],引起人们高度的重视,并被广泛地用于动物发育遗传学的基础理论研究和转基因动物的生产实践。但ES细胞系要在体外克隆成功,必须有成纤维细胞或STO细胞饲养层的支持[2],为建立有效的哺乳动物ES细胞体外培养体系,本文就影响小鼠胎儿成纤维细胞饲养层制备及胚胎干细胞体外培养的若干因素做初步探讨,为今后进一步开展研究奠定基础。 1　材料和方法 111　动物准备 选3～4月龄的性成熟的昆明鼠,母鼠自然发情或超排后与公鼠交配,第2天早晨检查阴道栓,见栓查为发情受精。妊娠至一定日龄后取其胚胎或胎儿用于分离囊胚内细胞团细胞或制备胎儿成纤维细胞饲养层。 112　溶液的配制 按日本学者管原七郎的配方配制D PB S液,胰蛋白酶溶液、DM E M液及ES细胞培养液(配方略)。 113　胎儿成纤维细胞饲养层的制备 α

小鼠胚胎干细胞培养实验步骤

细胞的原代培养 点击次数：540 作者：佚名发表于：2009-03-06 16:26转载请注明来自丁香园 一、原代细胞培养原理 原代细胞培养是将机体内的某组织取出，分散成单细胞，在人工条件下培养使其生存并不断生长、繁殖的方法。借助这种方法可以观察细胞的分裂繁殖、细胞的接触抑制以及细胞的衰老、死亡等生命现象。 ? 幼稚状态的组织和细胞，如：动物的胚胎、幼仔的脏器等更容易进行原代培养 ? 掌握无菌操作技术 ? 了解小鼠解剖操作技术 ? 了解原代细胞培养的一般方法与步骤 ?了解培养细胞的消化分散 ? 了解倒置显微镜的使用 二、实验材料 ? 实验动物：孕鼠或新生小鼠 ? 液体：细胞生长液（内含20%小牛血清） 0.25%胰蛋白酶 平衡盐溶液 70%乙醇 ?器材：灭菌镊子、剪刀若干把 灭菌培养皿、细胞培养瓶、小瓶、烧杯若干个 吸管若干支 酒精灯 原代细胞培养方法 三、胰酶消化法 （1）胰酶消化法操作步骤——取材 a. 用颈椎脱位法使孕鼠迅速死亡。

b. 把整个孕鼠浸入盛有75%乙醇的烧杯中数秒钟消毒，取出后放在大平皿中携入超净台。 c. 用无菌的镊子和剪子在前腿下作一腹部水平切口，用无菌镊子将皮肤扯向后腿。 d. 用另一无菌的剪刀和镊子切开腹部，取出含有胚胎的子宫，置于无菌的培养皿上。 e. 剔除胚胎周围的包膜（若胚胎较大，应剪去头、爪），将胚胎放于无菌的含有平衡盐溶液的培养皿中。 f. 漂洗胚胎，去掉平衡盐溶液。继续用平衡盐溶液漂洗胚胎直至清洗液清亮为止。 （2）胰酶消化法操作步骤——切割 a. 将部分胚胎转移至一个无菌小瓶中，用平衡盐溶液漂洗。 b. 然后用眼科手术剪刀小心地绞碎胚胎，直到成1mm3左右的小块，再用平衡盐溶液清洗，洗到组织块发白为止。 c. 静置，使组织块自然沉淀到管底，弃去上清。 （3）胰酶消化法操作步骤——消化、接种培养 a. 视组织块量加入5-6倍的0.25%胰酶液，37℃中消化20-40分钟，每隔5分钟振荡一次，或用吸管吹打一次，使细胞分离。 b. 加入3-5ml细胞生长液以终止胰酶消化作用（或加入胰酶抑制剂）。 c. 静置5-10分钟，使未分散的组织块下沉，取悬液加入到离心管中。 d. 1000rpm，离心10分钟，弃上清液。 e. 加入平衡盐溶液5ml，冲散细胞，再离心一次，弃上清液。 f. 加入细胞生长液l-2ml（视细胞量），血球计数板计数。 e. 将细胞调整到5×105/ml左右，转移至25ml细胞培养瓶中，37℃下培养。 （4）胰酶消化法操作步骤——消化、接种培养

C57胚胎小鼠神经干细胞的分离、培养与鉴定

-C57胚胎小鼠神经干细胞的分离、培养与鉴定 广东学药学院 报ournJa lfoGuang dngo ParmhceutiaalcUn ievrsty i unJ 2．14， 030（3） C 7 5胚小胎神经鼠干胞的分离、培细与养定 鉴 12 万丽 1 易，林，桦贝伟 剑（ 1 广．药学院东中医药研究 / 广东省院代性谢病疾中医防 治药重实点室验，家国中医药理局管脂高血调肝降脂症重研点 究室/ 国家中药管理医局代谢脂级实三室验，东广广 5州10006 ；．2中大学山生科命学院干学胞研究细室，广广州东510 006）培 养神经干胞细（NSCs ）并，对其行进鉴定方。采法用动手 法胰蛋白酶消化及法摘：要的体外分目离分离、鼠脑细胞胎，用化的无优血清NS C 培s养基行进养培。细胞疫免光荧检法测N CSs特异性标记子 3 d分左获右得大未分量化巢呈悬浮状生的长表的达结。果分离脑的细体胞培外养48 h已部分大壁贴神，经干胞细团第 3 代时，。少很见到贴细壁胞，几乎是神全球，经

神经球周围在存较多刺微。细表胞达一中种间丝蛋白，即巢 蛋白（nes ti）n 。论结成功分、离鉴定出C57小鼠 NSsC， 并在体外可件条进下行传扩增培代养。关键词：C 57 胎小胚；鼠经干细胞；神胞细培；养蛋巢白中分图类：号Ｒ392 文献 志标码 A：d i： 10．o396 9 j/．sin．1s060873．8214003．0．22878 （3 214）0 00354340 章文编号：0016 -Is laoion，t culurtean d iedtifnciaitnoo f eunalrste mcel sl rfmoC5 e7bmyorin mccieW N Ai1L， IYHual n2 ，iBEI W iejia1n 1．（uGnagdogn TMCKey L abratory ofroM taboelc iisDaees，s Ky eLbarotorayo Modfluaintg Lievrt oTrat HepeyripemlaiS ATM， anC Ldeev 3l Labraotroyo f Liid Mpteboaism SAlTM，CIn stiute oftChinese edMciinla Sicneec，GsuagnongdPha racemtucail UinvesrtyiGuan，gzohu5 1006，0hCin；a 2．St m eCle Ｒlseeacrh Depratmne，t choSlo o fifL Sceeicens， uS nYtasn Ueinersivyt， Guagnzhou， 50006，1China） bsArtatc：Obejtivc Toei slotae cu，turl aned deitnfiy hte eunarlste m cllse（ SCN ）s． Meth od NSsCs for mftal eimce ewe irsloteda bydi sesticon ad nnzeyatmi dcgiestoin a，n ductlrude ni he opttima slreufreem SCN mdeimu． he Tpesifcicb ioamker orf

小鼠胚胎干细胞培养实验步骤 一般培养-保持胚胎干细胞处于未分化 ...

小鼠胚胎干细胞培养实验步骤 一般培养-保持胚胎干细胞处于未分化状态 培养基 细胞复苏 冻存细胞 明胶包被 细胞传代 体外分化 培养基 包被有多聚鸟氨酸/纤维结合蛋白的培养板（使用或不使用盖玻片） 体外分化方法 注：以下培养针对于小鼠的R1胚胎干细胞系，其它胚胎干细胞的培养可以参考。不过人的胚胎干细胞培养不可以采用下面的protocol，需要用专用的protocol 和培养基。 一般培养--维持ES细胞处于未分化状态 ES细胞培养用含有LIF（白血病抑制因子）和Feed细胞的培养基（高糖）来阻止细胞的分化。为细胞提供包被有0.1％明胶的平板作为粘附细胞的基质。建议每2－3天从达到80％－90％融合的平板按1：8的比率传代细胞一次，细胞传代以后，在将细胞接种在0.1％明胶包被的培养皿之前，通过预先将细胞接种在没有经过包被的组织培养板2个小时，使分化细胞粘附，从而将分化和未分化细胞分开。将细胞全程置于37℃，5％CO2，100％湿度条件下培养。如果在Feed 细胞，那么就需要采用MMC进行处理，抑制Feed细胞增殖，但仍然能保持其分泌LIF因子的活性。下文中暂不提及Feed细胞。Feed细胞可以来源于STO细胞或原代胚胎成纤维细胞。 培养基 ES: 配制一20×不含DMEM，HS，LIF的溶液（该溶液也能用于EB培养基--见下文）。分装在50ml 离心管中，（稀释为2×，每管42ml），贮存在-20℃。通过将21ml 该溶液，HS和LIF加入450ml DMEM中制备培养基，0.22 μm滤膜过滤。贮存于4℃，时间不要超过2周。 贮存液 DMEM(高糖) 马血清（HS） L-谷氨酰胺（200mM） MEM NEAA（10mM） HEPES（1M） β-巯基乙醇（55Mm） PEST LIF

高脂血症的实验室和辅助检查

血脂异常症的诊断主要依靠实验室检查，其中最主要的是血TC和TG测定。此外，测定血浆apo-B、apo-Al对预测冠心病有一定意义。 1.血浆外观检查可判断血浆中的CM含量。将血浆放置于4℃冰箱中过夜后，如见到"奶油样"顶层，而下层澄清，表明CM的含量较高；IIa型和IIb型者的血浆澄清或轻度混浊；Ⅲ型的血浆混浊，可见模糊的"奶油样"顶层；IV 型澄清或混浊，一般无"奶油样"顶层；V型可见"奶油样'顶层，下层混浊。家族性脂蛋白脂酶缺陷症和家族性载脂蛋白CⅡ缺陷症患者的新鲜血浆呈乳白色，于4℃放置12h后，可见血浆表面有一层白色漂浮物。 2.脂蛋白电泳可分为CM、前β、β和α四条脂蛋白区带。电泳时CM滞留在原位，a区带含HDL2和HDL3，β区带包括IDL和LDL；前β区带代表VLDL.CM、VLDL、IDL、LDL和HDL的密度依次增加，颗粒逐渐变小，LP（a）的密度大于LDL.家族性脂蛋白脂酶缺陷症表现为CM增多；家族性高TC血症和Ⅲ型高脂蛋白血症的β带增宽（亦见于IIb或V型高脂蛋白血症）。若将血浆高速离心，用分离出的VLDL进行琼脂糖电泳，出现β带对Ⅲ型高脂蛋白血症的诊断价值更大。聚丙烯酰胺梯度凝胶电泳可有效分离血浆中的各种脂蛋白成分，结合等电聚焦，可鉴别载脂蛋白E异构物，也有助于Ⅲ型高脂蛋白血症的诊断。 3.超速离心可分辩CM、VLDL、IDL、LDL和HDL等组分。 4.脂蛋白代谢分析将脂蛋白或载脂蛋白用放射性碘标记，注入受试者体内，取血样分析其代谢变化。 5.基因突变分析脂蛋白脂酶、胆固醇酯化酶和合酶、LDL受体、apoB和apoB等的基因突变分析可明确血脂异常的分子病因。 6.其他检查家族性混合型血脂异常症和家族性高甘油三脂血症存在胰岛素抵抗，伴高胰岛素血症、糖耐量减退或高尿酸血症；III型高脂蛋白血症常合并糖尿病或甲减。

小鼠胚胎干细胞培养实验具体步骤及方法

小鼠胚胎干细胞培养实验具体步骤及方法 胚胎干细胞在体内外可以分化为各种类型的细胞。我们的体外分化方法有利于神经前体细胞通过在最少量的培养基内选择（第3步），在有bFGF存在的情况下扩增（第4步）并最终分化在第5步。细胞全程培养在37℃，5％CO2，100％湿度条件下。一般体外诱导向神经细胞方向分化，也可以采用低浓度的RA进行诱导。 具体步骤 一、ES培养基 在LIF存在的条件下维持细胞培养。 二、EB培养基 使用细菌培养皿去除LIF后胚状体的形成需要4天。 1. 分散纯化细胞（参见上面的细胞传代部分）。 2. 纯化2小时后将细胞转入含有ES培养基的50 ml Falcon管中，计数细胞取适量体积放入15 ml管中离心3分钟。 3. 用2mlEB培养基重悬细胞，吹打至少10次制成单细胞悬液

4. 一个15 cm的细菌培养皿接种4～5x106个细胞（1个完全融合的组织培养皿通常足以接种4个同样规格的细菌培养皿）。 5. 2天后更换培养基，将胚状体转入锥形管中放置3～5分钟使细胞沉降。弃去上清，将细胞重悬于新鲜培养基并接种在新的细菌培养皿中。 6. 用EB培养基培养的第4天将细胞转入没有包被的组织培养皿中（这即是细胞的移植步骤）。1个组织培养皿之中放置1个细菌培养皿，在进行第3步之前一天将胚状体黏附在同样规格的培养板上。 7. 形成胚状体需要4天时间。在EB培养基中再培养1天使胚状体粘附在组织培养皿的表面。这一天被认为是第2步和第3步的分界。 三、ITSFn培养基 在最少量培养基中选择神经前体细胞 1. 胚状体接种在组织培养皿一天后将培养基换成ITSFn培养基。 2. 并非所有胚状体在这一时期都已经发生粘附，因此在移除培养基时要小心谨慎以使大部分胚状体留在培养皿内。

小鼠胚胎干细胞培养

小鼠胚胎干细胞培养

以下培养针对于小鼠的R1胚胎干细胞系，其它胚胎干细胞的培养可以参考。不过人的胚胎干细胞培养不可以采用下面的protocol，需要用专用的protocol和培养基。 一般培养－－维持ES细胞处于未分化状态 ES细胞培养用含有LIF（白血病抑制因子）和Feed细胞的培养基（高糖）来阻止细胞的分化。为细胞提供包被有0.1％明胶的平板作为粘附细胞的基质。建议每2－3天从达到80％－90％融合的平板按1：8的比率传代细胞一次，细胞传代以后，在将细胞接种在0.1％明胶包被的培养皿之前，通过预先将细胞接种在没有经过包被的组织培养板2个小时，使分化细胞粘附，从而将分化和未分化细胞分开。将细胞全程置于37℃，5％CO2，100％湿度条件下培养。如果在Feed 细胞，那么就需要采用MMC进行处理，抑制Feed细胞增殖，但仍然能保持其分泌LIF因子的活性。下文中暂不提及Feed细胞。Feed细胞可以来源于STO细胞或原代胚胎成纤维细胞。 培养基 ES:

配制一20×不含DMEM，HS，LIF的溶液（该溶液也能用于EB培养基－－见下文）。分装在50ml 离心管中，（稀释为2×，每管42ml），贮存在-20℃。通过将21ml该溶液，HS和LIF 加入450ml DMEM中制备培养基，0.22 μm滤膜过滤。贮存于4℃，时间不要超过2周。 贮存液 DMEM（高糖） 马血清（HS） L-谷氨酰胺（200mM） MEM NEAA（10mM） HEPES（1M） β-巯基乙醇（55Mm） PEST LIF 复苏细胞 细胞被冻存在10％二甲基亚砜（DMSO）中防止结晶的形成，结晶的形成会损害细胞。然而，二甲基亚砜对细胞有毒性，快速的进行细胞复苏是很重要的。

昆明种小鼠胚胎干细胞的培养及鉴定

昆明种小鼠胚胎干细胞的培养及鉴定（作者:___________单位: ___________邮编: ___________） 【摘要】目的从昆明种小鼠的早期胚胎中获取并培养胚胎干细胞。方法收集小鼠3.5 d的囊胚培养，用小鼠胚胎成纤维细胞作为饲养层，形成的ES细胞样集落，72 h后分离隆起生长的内细胞团并继续培养，观察集落的生长状态，并通过碱性磷酸酶染色进行鉴定。结果 ES细胞有其典型的形态学特征：集落呈鸟巢状，边缘清楚，表面平滑，结构致密，隆起生长，细胞之间界限不清楚；单个细胞体积小、核大；对ES 细胞碱性磷酸酶进行检测，在AKP底物作用下，未分化的ES 细胞显微镜下为棕褐色，分化的不着色。结论昆明种小鼠囊胚在小鼠胚胎饲养层细胞上可以发育为胚胎干细胞。 【关键词】小鼠胚胎干细胞 ES细胞系 Abstract：Objective To isolate and culture embryonic stem (ES) cells from Kunming species mouse. Methods The blastocysts of 3.5 d from Kunming species mouse were collected, cultured on the fibroblast cell feeder layers for 72 h. The cells from inner cell mass(ICM) were isolated and subsequently cultured in vitro.Then the stem cells were identified by AKP stainin

胚胎干细胞的培养及其影响因素

胚胎干细胞的培养及其影响因素 前言 胚胎干细胞（embryonic stem cell，ESC）是一种高度未分化的、具有发育多潜能性的细胞，可在体外培养扩增、遗传操作，在适当条件下可诱导分化为多种组织细胞，还可与受体胚胎发生嵌合，形成嵌合体，为细胞分化、胚胎发育、肿瘤发生、药物鉴定等方面的深入研究提供了理想的细胞模型，为组织工程、细胞移植、基因治疗等开创了取之不尽、用之不竭的细胞资源。 1981年Evans 和Kaufman 将延迟着床的小鼠囊胚接种在经丝裂霉素C处理的STO（一种已建系的鼠胚成纤维细胞）上，获得了增殖而未分化的内细胞（inner cell mass,ICM ），后经传代克隆，第一个建立了小鼠ES细胞系［1］。 由于小鼠的胚胎干细胞较易发生分化，昆明种属更是如此，成功分离和克隆胚胎干细胞的关键是一方面要促进其分裂增殖，一方面要最大限度抑制其分化。体外生长的细胞直接生长在培养液中，培养液是细胞分离培养中重要的因素[9]。胚胎干细胞对体外培养环境的要求更为严格，其很小的变化都会影响胚胎干细胞的增殖和分化。本课题研究了三种不同培养液对小鼠胚胎干细胞生长的影响，为今后胚胎干细胞建系工作提供一定参考依据。 研究内容与方法 1.材料 1.1实验动物 昆明白小鼠。 1.2 主要试剂：PMSG;HCG;DMEM培养液；、无Ca2+、Mg2+的PBS缓冲液；杜氏磷酸盐缓冲液（PBS液）；0.25% 胰酶-ETDA混合液；丝裂酶素C （Mitomycine,Sigma）；胎牛血清（FCS，浙江生物制品厂）；新生牛血清（NBS，天津生物制品厂）；白血病抑制因 子；干细胞生长因子；牛胰岛素。[2] 2 小鼠胎儿成纤维细胞的原代培养[3][4][5] 2.1 胚胎的获取 昆明雌性小鼠选择阴道口粘膜色淡红、略湿润的性成熟母鼠，孕马血清（PMSG）16：00腹腔注射10U，48小时后腹腔注射HCG10U，即与雄鼠按1：1合笼交配。次日10：00观察母鼠阴道栓有无，阴道口见阴栓（乳白色或淡黄色蜡状物）即记为妊娠0.5 d，并做标记，同时雌雄分笼喂养。选妊娠11.5-16.5D 母鼠进行胎儿成纤维细胞饲养层的制备；将妊娠3.5天孕鼠断颈处死，取出子宫，用含5%NBS的PBS液从子宫角冲出胚胎[6]。 2.2 组织原代培养

血脂检测的临床意义

血脂检测的临床意义 血脂是血浆中所含脂类物质的总称,脂类分脂肪和类脂, 脂肪又称甘油三脂,功能是储存能量 和供给能量。类脂包括胆固醇(Ch),磷脂(PC)和糖脂等,功能是维持生物膜的正常结构和功能。 1.甘油三酯(TG) 临床意义：为心血管疾病的危险因素，血清甘油三酯水平受年龄、性别和饮食的影响。血甘油三酯增高可见于家族性高甘油三酯血症，饮食大量甘油三酯和继发於某些疾病如糖尿病、甲状腺功能减退、肾病综合征和胰腺炎等。甘油三酯降低见于甲状腺功能亢进、肾上腺皮质功能降低、肝功能严重低下等。参考值：0.56～1.69mmol/L 2.胆固醇(CH) 临床意义：血清胆固醇水平受年龄、性别等影响。高胆固醇血症与动脉粥样硬化的形成有明确关系；降低血清胆固醇使冠心病的发病率降低及停止粥样斑块的进展。除家族性高胆固醇血症（FH）外、血清胆固醇增高多见于继发于肾病综合征、甲状腺功能减低、糖尿病和胆道梗阻等。胆固醇降低见于甲状腺功能亢进、营养不良和肝功能严重低下等。参考值：2.23～5.17mmol/L 3.高密度脂蛋白(HDL-C) 临床意义：约25%的胆固醇在HDL中，一般认为HDL-C与心血管疾病的发病率和病变程度呈负相关，HDL-C或HDL-C/TC比值较TC能更好地预测心脑动脉粥样硬化的危险性。HDL-C降低见于急、慢性肝病、急性应激反应（心肌梗塞、外科手术、损伤）、糖尿病、甲状腺功能亢进或减低、慢性贫血等。参考值：男0.90～1.45 mmol/L, 女 1.15～1.68 mmol/L 4.低密度脂蛋白（LDL-C）临床意义：LDL是动脉粥样硬化发生和发展的主要脂类危险因素。参考值：1.3～4.0 mmol/L 5.载脂蛋白A1（ApoA1）、载脂蛋白B（ApoB）临床意义：ApoA1和B 可直接反应映HDL和LDL的含量。血清apoA1与HDL-C呈明显正相关。但在一些病理状态下apoA1的含量不一定与HDL-C成比例。冠心病患者、脑血管患者apoA1偏低。家族性高TG血症患者HDL-C往往偏低，但apoA1不一定低，不增加冠心病危险；但家族性混合型高脂血症患者apoA1与HDL-C都会下降，冠心病危险性高。apoA1缺乏症(如Tangier病)、家族性低α脂蛋白血症、鱼眼病等血清中apoA1与HDL-C极低。血清apoB与LDL-C成显著正相关。但当高TG血症时(VLDL 极高)，小而密LDL(B型LDL) 增高，与大而轻LDL (A型LDL)相比，则apoB含量较多而胆固醇较少，故可出现LDL-C虽然不高，但血清apoB增高的所谓“高apoB脂蛋白血症”，它反映B型

小鼠饲养层细胞制备与小鼠胚胎干细胞SF1_G的培养_刘峰

中国组织工程研究与临床康复 第14卷 第23期 2010–06–04出版 Journal of Clinical Rehabilitative Tissue Engineering Research June 4, 2010 Vol.14, No.23 ISSN 1673-8225 CN 21-1539/R CODEN: ZLKHAH 4303Department of Endocrinology, Xiangya Hospital, Central South University, Changsha 410008, Hunan Province, China Liu Feng ☆, Studying for doctorate, Department of Endocrinology, Xiangya Hospital, Central South University, Changsha 410008, Hunan Province, China liufengdyx@https://www.wendangku.net/doc/359858459.html, Correspondence to: Chen Hui-ling, Doctor, Associate chief physician, Department of Endocrinology, Xiangya Hospital, Central South University, Changsha 410008, Hunan Province, China huilingcheng_8@ https://www.wendangku.net/doc/359858459.html, Supported by: the National Natural Science Foundation of China, No. 30771025* Received:2010-03-24Accepted:2010-05-12 中南大学湘雅医院内分泌科，湖南省长沙市410008 刘 峰☆，男，1980年生，江西省安福县人，汉族，中南大学在读博士，主要从事糖尿病及其并发症的研究。 liufengdyx@https://www.wendangku.net/doc/359858459.html, 通讯作者：陈慧玲，博士，副主任医师，中南大学湘雅医院内分泌科，湖南省长沙市410008 huilingcheng_8@https://www.wendangku.net/doc/359858459.html, 中图分类号:R394.2 文献标识码:B 文章编号:1673-8225(2010)23-04303-06 收稿日期：2010-03-24修回日期：2010-05-12(20100324013/W · Q) 小鼠饲养层细胞制备与小鼠胚胎干细胞SF1-G 的培养*☆ 刘 峰，雷闽湘，陈慧玲 Preparation of mouse feeder layer cells and culture of mouse embryonic stem cell SF1-G Liu Feng, Lei Min-xiang, Chen Hui-ling Abstract Liu F, Lei MX, Chen HL. Preparation of mouse feeder layer cells and culture of mouse embryonic stem cell SF1-G. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu. 2010;14(23): 4303-4308. [https://www.wendangku.net/doc/359858459.html, https://www.wendangku.net/doc/359858459.html,] 摘要 刘峰，雷闽湘，陈慧玲.小鼠饲养层细胞制备与小鼠胚胎干细胞SF1-G 的培养[J].中国组织工程研究与临床康复，2010，14(23):4303-4308. [https://www.wendangku.net/doc/359858459.html, https://www.wendangku.net/doc/359858459.html,] 0 引言 胚胎干细胞是从早期胚胎内细胞团和原始生殖细胞中分离出来的全能干细胞[1-2]，具有无限增殖和全能分化的潜力。在研究生长发育胚胎发育、遗传疾病、肿瘤发生的理想模型，组织再生工程中具有广阔的临床应用价值，为疾病治疗提供了崭新的思路。近年来，胚胎干细 胞成为生物医学领域的研究热点之一。 胚胎干细胞体外培养条件要求非常严格，在体外极易分化、死亡，保持其未分化状态生长是充分利用胚胎干细胞资源的前提。目前，要保持其未分化状态生长，必须在培养基中加入分化抑制因子——白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor ，LIF)或将其培养在能分泌分化抑制因子且无增殖能力的饲养层细胞上[3]，MEF 饲养层作为一种哺乳动物胚胎干

小鼠胚胎干细胞R1E说明书

小鼠诱导型多能干细胞OSKM -1说明书 SCSP number: SCSP-1201 细胞名称: OSKM-1 细胞描述: 小鼠诱导型多能干细胞 小鼠品系: C57BL/6，Oct4-EGFP转基因小鼠 重编程转录因子：Oct4，Sox2，Klf4，c-Myc 细胞来源: 中科院上海生命科学研究院生化细胞所李劲松研究组 SCSP 培养液: 小鼠iPS完全培养液：SCSP-618 DMEM（invitrogen 12430）485 ml ES级FBS（biochrom S0415）90 ml Glutamax（invitrogen 35050） 6 ml NEAA（invitrogen 11140） 6 ml Nucleosides（Millipore ES-008-D） 6 ml LIF（Millipore ESG1107）60 ul β-Mer（invitrogen 21985） 1.5 ml PS (Millipore TMS-AB2-C) 6 ml 细胞说明: 小鼠诱导型多能干细胞（iPS），带GFP基因 细胞总数/每支: 106 体积/每支: 500μl 传代方法:提前24h准备MEF细胞：事先包被0.2%明胶，按106/T25的 量铺MEF细胞，使用10%DMEM。待接种上mES细胞后更换 为mES完全培养液。 传代周期：3-4天传代比例：1：4—1：7 换液频率：每天 气相：空气，95%；二氧化碳，5%。温度：37℃ 冻存液：培养液80%，FBS10%，DMSO 10% References: Jiang, J., Lv, W., Ye, X., Wang, L., Zhang, M., Yang, H., Okuka, M., Zhou, C., Zhang, X., Liu, L., et al. Zscan4 promotes genomic stability during eprogramming and dramatically improves the quality of iPS cells as demonstrated by tetraploid complementation. Cell research. 2013 Jan;23(1):92-106

实验室检查

实验室检查 R B C 【参考值】成男：（4.0～5.5)×1012/L 成女：（3.5～5.0)×1012/L 新生儿：（6.0～7.0)×1012/L Hb 【参考值】成年男性：120～160g/L 成年女性： 110～150g/L 新生儿： 170～200g/L WBC 【参考值】成人：（4～10）?109/L，新生儿：（15～20）?109/L， 6月～2岁：（11～12）?109/L 【临床意义】与中性粒细胞变化有相关性，意义差不多。 【参考值】成人 % ?中性杆状核粒细胞(Nst) 1～5 ?中性分叶核粒细胞(Nsg) 50～70 ?嗜酸性粒细胞 (E) 0.5～5 ?碱性粒细胞 (B) 0～1 ?淋巴细胞 (L) 20～40 ?单核细胞(M) 3～8 1.中暑，大量出汗患者，血常规：R B C6.0×1012/L,H b172g/L,W B C10×109/L,N0.75,L0.25。实验 室检查结果有何提示？ R B C，H b增多，提示有脱水。 2.肝硬化，急性上消化道出血患者，血常规：R B C2.8×1012/L,H b75g/L,W B C 3.2×109/L,N0.70,L 0.30，P l t80×109/L。如何解释实验结果？ R B C，H b减少提示失血性贫血。 W B C,P l t减少提示脾功能亢进。 3.法洛四联症患者，血常规：R B C6.5×1012/L,H b190g/L,W B C5.0×109/L,N0.70,L0.30。血常规有何异常？提示何意义？ R B C，H b明显增多。 提示机体慢性缺氧。 4.消化性溃疡并急性上消化道大出血患者，血常规：R B C3.0×1012/L,H b85g/L,W B C12×109/L,N 0.75,L0.25。请解释实验结果。