Smad7抑制TGF_1对肝星状细胞_1_前胶原基因表达的促进作用
Lin-Fang Xu, Hai-Lin Liu, Department of Gastroenterol-ogy, Shanghai Ninth People’s Hospital, Af? liated to Shang-hai Jiao Tong University School of Medicine, Shanghai 200011, China
Supported by: the Foundation of Shanghai Municipal Sci-ence and Technology Commission, No. 04JC14043 Correspondence to: Hai-Lin Liu, Department of Gastro-enterology, Shanghai Ninth People’s Hospital, Affiliated to Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, 639 Zhizaoju Road, Shanghai 200011,
China. liuhailin@https://www.wendangku.net/doc/308216759.html,
Received: 2009-11-14 Revised: 2009-12-14 Accepted: 2009-12-21 Published online: 2010-01-28
Abstract
AIM: To investigate the effects of Smad7 overexpression on transforming growth factor-β1 (TGF-β1)-stimulated procollagen α1 (III) expression in cultured hepatic stellate cells (HSC-T6).
METHODS: Cultured HSC-T6 cells were divided into six groups: normal control group, TGF-β1 group, vehicle plasmid group, Smad7 plasmid group, TGF-β1 plus vehicle plasmid group, and TGF-β1 plus Smad7 plasmid group. Smad7 plas-mid and vehicle plasmid were transfected into HSC-T6 cells with FuGENE 6 Reagent. Forty-eight hours after transfection, the expression lev-and the TGF-β1 plus vehicle plasmid group (t = 103.8 and 45.7, respectively; both t > t0.01 and both P < 0.01).
CONCLUSION: Overexpression of Smad7 inhib-its the expression of procollagen α1 (III) stimu-lated by exogenous TGF-β1 in cultured hepatic stellate cells.
Key Words: Smad7; transforming growth factor-β1; Liver ? brosis; Hepatic stellate cell
Xu LF, Liu HL. Smad7 overexpression inhibits TGF-β1-stimulated procollagen α1 (III) expression in cultured hepatic stellate cells. Shijie Huaren Xiaohua Zazhi 2010; 18(3): 280-283
摘要
目的:探讨在加入TGF-β1的条件下, Smad7过度表达对肝星形细胞-T6(HSC-T6)α1(Ⅲ)前胶原mRNA水平的作用.
方法:体外培养HSC-T6细胞, 分为正常对照组、TGF-β1对照组、空载质粒组、Smad7质粒组、TGF-β1+空载质粒组和TGF-β1+Smad7质粒组. 通过Fugene6介导Smad7质粒转染, 继
?
■同行评议者
高润平, 教授, 吉
林大学第一医院
肝病科; 高泽立,
副教授, 上海交通
大学医学院附属
第九人民医院周
浦分院消化科
徐林芳, 等. Smad7抑制TGF-β1对肝星状细胞α1(Ⅲ)前胶原基因表达的促进作用 281
续培养48 h. 采用Real time-PCR、RT-PCR方法检测Smad7和α1(Ⅲ)前胶原mRNA水平.
结果: TGF-β1+Smad7质粒组、Smad7质粒组Smad7 mRNA水平较正常对照组、空载质粒组显著增高(t = 59.43、59.41、54.27及54.25, 均t>t0.01, 均P<0.01). Smad7质粒组α1(Ⅲ)前胶原基因mRNA表达与正常对照组、空载质粒组相比无明显差异(t = 1.25与1.27, 均t
0.01
, 均P<0.01).
结论:S m a d7可显著抑制T G F-β1对H S C-T6α1(Ⅲ)前胶原mRNA表达的促进作用,而对HSC-T6α1(Ⅲ)前胶原mRNA表达无明显影响.
关键词: Smad7; 转化生长因子β1; 肝纤维化; 肝星状细胞
徐林芳, 刘海林. Smad7抑制TGF-β1对肝星状细胞α1(Ⅲ)前胶原基因表达的促进作用. 世界华人消化杂志 2010; 18(3): 280-283 https://www.wendangku.net/doc/308216759.html,/1009-3079/18/280.asp
0 引言
肝星状细胞(hepatic stellate cell, HSC)是肝纤维化形成过程中细胞外基质(extracellular matrix, ECM)的主要来源. 活化的HSC合成大量ECM, 包括Ⅰ、Ⅲ型胶原, 在肝内过度沉积[1,2]. 作为促肝纤维化细胞因子, TGF-β1能激活HSC促进ECM合成, 并抑制其降解[3,4]. 而Smad7可抑制TGF-β1的信号转导[5,6]. 我们的前期研究表明转染Smad7质粒可显著减少HSCα1(Ⅰ)前胶原mRNA表达, 但对α1(Ⅲ)前胶原mRNA水平无明显影响[7]. 究竟是Smad7对α1(Ⅲ)前胶原基因表达无调控作用, 还是需要在特定条件下才能发挥作用, 值得进一步深入研究. 肝纤维化时TGF-β1表达显著增加[8-10]. 因此, 本文应用Real time-PCR定量检测了加入TGF-β1后, Smad7质粒转染对HSC-T6细胞α1(Ⅲ)前胶原mRNA表达的作用.
1 材料和方法
1.1 材料 HSC-T6细胞由上海中医药大学肝病研究所提供; pcDNA3.0-人Smad7重组质粒和pcDNA3.0空载质粒为本院组织工程实验室惠赠; Fugene6转染试剂、TRIzol RNA提取试剂盒、TGF-β1分别购自Roche公司、Sigma公司和英国Peprotech公司; 各目的基因引物由上海生工生物
工程公司合成.
1.2 方法将浓度为1×108细胞/L的HSC-T6细
胞悬液接种于6孔培养板, 每孔2 mL, 37 ℃, 50
g/L CO
2
、饱和湿度培养24 h, 随机分为6组: (1)
正常对照组; (2)TGF-β1对照组; (3)Smad7质粒
组; (4)TGF-β1+Smad7质粒组; (5)空载质粒组;
(6)TGF-β1+空载质粒组. 每组3复孔. pcDNA3.0-
人Smad7重组质粒或空载体pcDNA3.0质粒用配
制的脂质体Fugene6转染液介导转染. TGF-β1
的终浓度为10 μg/L, 正常对照组加入同体积的
50 g/L FSC DMEM培养基. 继续培养48 h后, 收
集细胞, 用TRIzol试剂盒提取细胞总RNA. 取
RNA 2 μg按照RT试剂盒(Sigma公司)说明书进
行逆转录. 应用Mx3000P实时荧光定量PCR仪
(美国Stratagene公司)分别检测Smad7, αl(Ⅲ)前
胶原mRNA水平. 引物序列如下: Smad7: 5'-CA ACTGCAGACTGTCCAGATG-3'(上游), 5'-CTG CTGCATAAACTCGTGGTC-3'(下游); α1(Ⅲ)前
胶原: 5'-GTACAGCTGGCCTTCCTCAG-3'(上
游), 5'-GGCCTTGCGTGTTTGATATT-3' (下游);
反应体系为: ddH
2
O 10.125 μL, cDNA 1 μL, 2×
SYBR Green QPCR master mix 12.5 μL, ROX passivereference 0.375 μL, Forwardprimer (10
μmol/L) 0.5 μL, Reverse primer(10 μmol/L) 0.5
μL, 总体积25 μL. 每个样品设3个复孔, 并设置
无模板对照. 各目的基因反应条件为: Smad7:
95 ℃预变性10 min, 95 ℃, 2 min, 60 ℃, 30
s, 72 ℃, 1.5 min, 共40个循环; αl(Ⅲ)前胶原:
95 ℃预变性10 min, 1个循环; 接着94 ℃, 30 s,
55 ℃ 45 s, 72 ℃, 30 s, 共40个循环. 循环结束
后继续进行建立熔解曲线的反应, 最后用专用
软件自动分析结果. mRNA水平用相对含量图
表示. 同时采用RT-PCR测定各目的基因mRNA
水平, 其中Smad7和αl(Ⅲ)前胶原均为扩增28个
循环, 引物和其他反应条件同上. PCR产物经12
g/L琼脂糖凝胶电泳, 用天能凝胶分析系统图像
分析. 计算目的基因条带灰度值, 与内参β-actin
条带灰度值的比值, 作为该目的基因表达的相
对值.
统计学处理数据用mean±SD表示, 多组比
较用方差分析, 两组间比较用t检验. P<0.05为有
统计学意义.
2 结果
2.1 Smad7 mRNA表达TGF-β1+Smad7质粒
■创新盘点
本研究采用体外
培养肝星状细胞
系(HSC-T6), 探讨
在加入TGF-β1条
件下Smad7过量
表达对α1(Ⅲ)前
胶原mRNA水平
的影响, 有助于进
一步了解Smad7
的抗纤维化机制.
282 ISSN 1009-3079 CN 14-1260/R 世界华人消化杂志 2010年1月28日 第18卷 第3期
组、Smad7质粒组Smad7 mRNA 水平较其他4组(正常对照组、空载质粒组、TGF-β1对照组、TGF-β1+空载质粒对照组)显著升高(t = 59.43, 59.41, 57.15, 57.13, 54.27, 54.25, 44.66, 51.70, 均P <0.01, 图1). 与正常对照组和空载质粒组相比, TGF-β1对照组、TGF-β1+空载质粒对照组Smad7 mRNA 表达亦有增加(t = 37.26, 36.99, 54.26, 53.87, 均P <0.01). RT-PCR 的结果与Real t i m e-P C R 一致. 表明S m a d7质粒有效转染至HSC-T6细胞; TGF-β1可增加Smad7 mRNA 表达, 但远低于Smad7质粒转染组.
2.2 αl(Ⅲ)前胶原mRNA 水平 与正常对照组和空载质粒组相比, Smad7质粒组αl(Ⅲ)前胶原mRNA 水平无明显差异(t = 1.25, 1.27, P >0.05).但TGF-β1+Smad7质粒组αl(Ⅲ)前胶原mRNA 水平较TGF-β1组和TGF-β1+空载质粒组显著降低(t = 10
3.87, 45.70, 均P <0.01, 图2). RT-PCR 结果与Real time-PCR 一致.3 讨论
T G F-β1能激活H S C, 促进Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ胶原和纤维连接蛋白、蛋白多糖等细胞外基质的合成. 同时, 使金属蛋白酶组织抑制因子(tissue inhibitors of metalloproteinase, TIMP)表达增加, 减少胶原的降解, 导致ECM 大量沉积, 加速肝纤维化的发展
[11]
. TGF-β1首先通过与其Ⅱ型受体
结合使之激活, 活化的Ⅱ型受体蛋白激酶使Ⅰ型受体(T βR Ⅰ)磷酸化, 后者再作用于Smad2、Smad3, 并与Smad2、Smad3和Smad4形成异源寡聚体复合物, 由胞质转入核内. 通过与特定的序列结合, 启动基因转录, 包括胶原基因、纤溶酶原激活物抑制因子-1基因、Smad7基因等发挥生物学效应[12-14]. Smad7是TGF-β1/Smad 信号转导通路中的主要抑制性调控蛋白[5,15], 可与
Smad2、Smad3竞争性结合T βR Ⅰ, 抑制TGF-β1/Smads 的信号转导; 另外, Smad7还可与smurfl/2结合, 通过泛素化途径降解T βR Ⅰ. TGF-β1与Smad7之间存在负反馈调节. 本文中, TGF-β1组、TGF-β1+空载质粒组Smad7 mRNA 表达较正常对照组和空载质粒组增高, 即是这种负反馈调节的反应. 但仅靠自身的负反馈调节尚不足于抑制TGF-β1对α1(Ⅲ)前胶原mRNA 表达的促进作用. 因此, TGF-β1组、TGF-β1+空载质粒组的α1(Ⅲ)前胶原mRNA 水平显著高于正常对照组和空载质粒组.
与正常对照组和空载质粒组相比, Smad7质粒组Smad7 mRNA 水平显著升高, 而αl(Ⅲ)前胶原m R N A 水平无明显差异. 说明S m a d7对HSC-T6的α1(Ⅲ)前胶原mRNA 表达并无直接作用, 与我们的前期研究结果一致[7]. TGF-β1+Smad7质粒组αl(Ⅲ)前胶原mRNA 水平显著低于TGF-β1组和TGF-β1+空载质粒组, 表明Smad7过度表达可抑制TGF-β1对α1(Ⅲ)前胶原mRNA 表达的促进作用.
总之, Smad7表达上调本身并不能直接抑制HSC-T6细胞α1(Ⅲ)前胶原基因转录, 但可抑制TGF-β1对α1(Ⅲ)前胶原基因表达的促进作用. 由于在肝纤维化发展过程中, TGF-β1显著增加, 所以Smad7过度表达可以发挥抗纤维化作用.4 参考文献
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图 1 Real time-PCR检测Smad7 mRNA表达. 1: 正常对照组; 2: TGF-β1对照组; 3: TGF-β1+Smad7质粒组; 4: Smad7质粒组; 5: TGF-β1+空载质粒对照组; 6: 空载质粒组, b P <0.01 vs TGF-β1对照组和TGF-β1+空载质粒对照组; d P <0.01 vs 正
常对照组和空载质粒组.
S m a d 7 m R N A 相对含量
400350300250200150100500
图 2 Real time-PCR检测α1(Ⅲ)前胶原mRNA水平. 1: 正常对照组; 2: TGF-β1对照组; 3: TGF-β1+Smad7质粒组; 4: Smad7质粒组; 5: TGF-β1+空载质粒对照组; 6: 空载质粒组, b
P <0.01 vs TGF-β1对照组和TGF-β1+空载质粒对照组.
α1(Ⅲ)前胶原m R N A 相对含量
3530252015105
1 2 3 4 5 6
■应用要点
本研究表明, S m a d 7过量表达可显著抑制TGF-β1对HSC-T6细胞α1(Ⅲ)前胶原mRNA 表达的促进作用. 为Smad7用于抗纤维化治疗提供了实验依据.
徐林芳, 等. Smad7抑制TGF-β1对肝星状细胞α1(Ⅲ)前胶原基因表达的促进作用 283
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编辑 李军亮 电编 吴鹏朕
■同行评价
本文研究了目前
肝病治疗领域的
热点之一-肝纤维
化的防治机制, 密
切联系临床, 值得
参考.
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2008年版《中文核心期刊要目总览》
本刊讯《中文核心期刊要目总览》(2008年版)采用了被索量、被摘量、被引量、他引量、被摘率、影响因子、获国家奖或被国内外重要检索工具收录、基金论文比、Web下载量等9个评价指标, 选作评价指标统计源的数据库及文摘刊物达80余种, 统计文献量达32 400余万篇次(2003-2005年), 涉及期刊12 400余种. 本版还加大了专家评审力度, 5 500多位学科专家参加了核心期刊评审工作. 经过定量评价和定性评审, 从我国正在出版的中文期刊中评选出1 980余种核心期刊, 分属七大编73个学科类目. 《世界华人消化杂志》入选本版核心期刊库(见R5内科学类核心期刊表, 第66页). (编辑部主任: 李军亮 2010-01-08)