十单核细胞增生李斯特氏菌检验标准操作程序

DBS22 DBS22/019-2012

吉林省食品安全地方标准

食品中单核细胞增生李斯特菌的定量检测

2013年发布 2013年实施

吉林省卫生厅发布

前言

本标准根据GB/T1.1-2000《标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写规则》的要求编写。

本标准分为两种检测方法：

第一法：单核细胞增生李斯特氏菌平板计数法；

第二法：MPN计数法。

其中第一法适用于污染较严重的食品，第二法适用于单核细胞增生李斯特氏菌含量较低而杂菌含量较高的食品。

本标准负责起草单位：吉林省疾病预防控制中心、长春市疾病预防控制中心。

本标准负责起草人:刘桂华、龚云伟、李月婷、赵薇

吉林省食品安全地方标准

食品中单核细胞增生李斯特菌的定量检测

1 范围

本操作程序规定了食品中单核细胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）的定量检验方法。本操作程序适用于食品中单核细胞增生李斯特氏菌的定量检验。

2 设备和材料

除微生物实验室常规无菌及培养设备外，其他设备和材料如下：

2.1 冰箱：2℃～5℃和-18℃。

2.2 恒温培养箱：30℃±1℃、36℃±1℃。

2.3 均质器。

2.4 显微镜：10×～100×。

2.5 电子天平：感量0.1 g。

2.6 锥形瓶：100 mL、500 mL。

2.7 无菌吸管：1 mL（具0.01 mL刻度）、10 mL（具0.1 mL刻度）。

2.8 无菌平皿：直径90 mm。

2.9 无菌试管：16 mm×160 mm.。

2.10 离心管：30 mm×100 mm。

2.11 无菌注射器：1 mL。

2.12 金黄色葡萄球菌（ATCC 25923）。

2.13 马红球菌（Rhodococcus equi）。

2.14 全自动微生物生化鉴定系统。

3 培养基和试剂

3.1 含0.6%酵母浸膏的胰酪胨大豆肉汤（TSB-YE）：见附录A中A.1。

3.2 含0.6%酵母浸膏的胰酪胨大豆琼脂（TSA-YE）：见附录A中A.2。

3.3 李氏增菌肉汤LB（LB1，LB2）：见附录A中A.3。

3.4 1%盐酸吖啶黄（acriflavine HCl）溶液：见附录A中A.3.2.1。

3.5 1%萘啶酮酸钠盐（naladixic acid）溶液：见附录A中A.3.2.1。

3.6 PALCAM琼脂：见附录A中A.4。

3.7 革兰氏染液：见附录A中A.5。

3.8 SIM动力培养基：见附录A中A.6。

3.9 缓冲葡萄糖蛋白胨水[甲基红（MR）和V-P试验用]：见附录A中A.7。3.10 5%-8%羊血琼脂：见附录A中A.8。

3.11 糖发酵管：见附录A中A.9。

3.12 过氧化氢酶试验：见附录A中A.10。

3.13 李斯特氏菌显色培养基。

3.14 API listeria 10300生化鉴定试剂盒。

第一法单核细胞增生李斯特氏菌平板计数法

4 检验程序

单核细胞增生李斯特氏菌平板计数法检验程序见图1。

图1 单核细胞增生李斯特氏菌平板计数法检验程序

5 操作步骤

5.1 样品处理

冷冻样品应在45℃以下不超过15 min或在2℃～5℃不超过18 h解冻，若不能及时检验，应放于-15℃左右保存；非冷冻而易腐的样品应尽可能及时检验，若不能及时检验，应置于2℃～5℃冰箱保存，24 h内检验。

5.2 样品制备

称取样品25g，放入盛有225mL PBS或生理盐水的无菌均质杯内，用旋转刀片式均质器以8000 r/min～10000 r/min均质1 min～2 min，或放入盛有225 mL PBS或生理盐水的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1 min～2 min。若样品为液态，吸取25 mL 样品至盛有225 mL PBS或生理盐水的无菌锥形瓶(瓶内可预置适当数量的无菌玻璃珠)中，振荡混匀，作为1：10的样品匀液。

5.3 样品的稀释

吸取上述1：10的样品匀液1 mL加到装有9 mL PBS或生理盐水的稀释管中，充分混匀制成1：100的样品匀液。据对样品污染状况的估计，按上述操作，依次制成十倍递增系列稀释样品匀液。每递增稀释1次，换用1支1mL无菌吸管或吸头。

5.4 样品接种

根据对样品污染状况的估计，选择2个～3个适宜稀释度的样品匀液（液体样品可包括原液），以0.3 mL、0.3 mL、0.4 mL 接种量分别入三块李斯特显色或PALCAM琼脂培养基，然后用无菌L 棒涂布整个平板，注意不要触及平板边缘。使用前，如李斯特显色或PALCAM琼脂培养基表面有水珠，可放在25℃～50℃的培养箱里干燥，直到平板表面的水珠消失。

5.5 分离、培养

在通常情况下，涂布后，将平板静置10 min。如样液不易吸收，可将平板放在培养箱36℃±1℃培养1 h，等样品匀液吸收后翻转平皿，倒置于培养箱，36℃±1℃培养24 h±2 h。如果菌落不典型,可继续培养至48 h±2 h再观察。在科玛嘉李斯特氏菌显色培养基上，典型菌落为小的圆形蓝色菌落，周围有白色晕圈（其它品牌李斯特氏菌显培养基上的菌落特征按照产品说明书判定）。典型菌落在PALCAM琼脂平板上为小的圆形灰绿色菌落，周围有棕黑色水解圈，有些菌落有黑色凹陷。

6 确证实验

6.1 初筛

自选择性琼脂平板上分别挑取5个以上典型或可疑菌落，分别接种在木糖、鼠李糖发酵管于36℃±1℃培养24 h；同时在TSA-YE平板上划线纯化，于30℃±1℃培养24 h～48 h。选择木糖阴性、鼠李糖阳性的纯培养物继续进行鉴定。

6.2鉴定

6.2.1染色镜检：李斯特氏菌为革兰氏阳性短杆菌，大小为（0.4 μm～0.5 μm）×（0.5 μm～2.0 μm）；用生理盐水制成菌悬液，在油镜或相差显微镜下观察，该菌出现轻微旋转或翻滚样的运动。

6.2.2动力试验：李斯特氏菌有动力，呈伞状生长或月牙状生长。

6.2.3生化鉴定：挑取纯培养的单个可疑菌落，进行过氧化氢酶试验，过氧化氢酶阳性反应的菌落继续进行糖发酵试验和MR-VP试验。单核细胞增生李斯特氏菌的主要生化特征见表1。

6.2.4溶血试验：将羊血琼脂平板底面划分为20个～25个小格，挑取纯培养的单个可疑菌落刺种到血平板上，每格刺种一个菌落，并刺种阳性对照菌（单增李斯特氏菌和伊氏李斯特氏菌）和阴性对照菌（英诺克李斯特氏菌），穿刺时尽量接近底部，但不要触到底面，同时避免琼脂破裂，36℃±1℃培养24 h～48 h，于明亮处观察，单增李斯特氏菌和斯氏李斯特氏菌在刺种点周围产生狭小的透明溶血环，英诺克李斯特氏菌无溶血环，伊氏李斯特氏菌产生大的透明溶血环。

6.2.5协同溶血试验（cAMP）：在羊血琼脂平板上平行划线接种金黄色葡萄球菌和马红球菌，挑取纯培养的单个可疑菌落垂直划线接种于平行线之间，垂直线两端不要触及平行线，于30℃±1℃培养24 h～48 h。单核细胞增生李斯特氏菌在靠近金黄色葡萄球菌的接种端溶血增强，斯氏李斯特氏菌的溶血也增强，而伊氏李斯特氏菌在靠近马红球菌的接种端溶血增强。

6.2.6 可选择API listeria 10300生化鉴定试剂盒或全自动微生物鉴定系统等生化鉴定系统。

7 结果计算

7.1 典型菌落计数和确认

7.1.1 选择有典型单核细胞增生李斯特氏菌平板，且同一稀释度3 个平板所有菌落数合计在20 CFU～200 CFU 之间的平板，计数典型菌落数。如果：

a）只有一个稀释度的平板菌落数在20 CFU～200 CFU之间且有典型菌落，计数该稀释度平板上的典型菌落；

b）所有稀释度的平板菌落数均小于20 CFU且有典型菌落，应计数最低稀释度平板上的典型菌落；

c）某一稀释度的平板菌落数大于200 CFU 且有典型菌落，但下一稀释度平板上没有典型菌落，应计数该稀释度平板上的典型菌落；

d）若所有稀释度的平板菌落数大于200 CFU 且有典型菌落，应计数最高稀释度平板上的典型菌落；

e）若所有稀释度的平板菌落数均不在20 CFU～200 CFU 之间且有典型菌落，其中一部分小于20 CFU 或大于200CFU 时，应计数最接近20 CFU 或200 CFU的稀释度平板上的典型菌落。

以上按公式（1）计算。

f）若2 个连续稀释度的平板菌落数均在20 CFU～200 CFU 之间，按公式（2）计算

7.1.2从典型菌落中至少挑取5个典型菌落（小于5个全选），划线接种于营养琼脂平板做纯培养，30℃±1℃培养24 h±2 h。

7.2 结果计数

公式（1）：T =

Cd

AB

…………………………………………………………… （1） 式中：

T ——样品中单核细胞增生李斯特氏菌菌落数；

A ——某一稀释度单核细胞增生李斯特氏菌典型菌落的总数；

B ——鉴定结果为单核细胞增生李斯特氏菌的菌落数；

C ——用于单核细胞增生李斯特氏菌鉴定的菌落数； d ——稀释因子。 公式（2）：

(2)

式中：

T ——样品中单核细胞增生李斯特氏菌菌落数；

A1——第一稀释度（低稀释倍数）单核细胞增生李斯特氏菌典型菌落的总数； A2——第二稀释度（高稀释倍数）单核细胞增生李斯特氏菌典型菌落的总数； B1——第一稀释度（低稀释倍数）鉴定结果为单核细胞增生李斯特氏菌的菌落数； B2——第二稀释度（高稀释倍数）鉴定结果为单核细胞增生李斯特氏菌的菌落数； C1——第一稀释度（低稀释倍数）用于单核细胞增生李斯特氏菌鉴定的菌落数； C2——第二稀释度（高稀释倍数）用于单核细胞增生李斯特氏菌鉴定的菌落数； 1.1——计算系数（如果第二稀释度单核细胞增生李斯特氏菌鉴定结果为0，计算系数采用1）； d ——稀释因子（第一稀释度）。

8 结果与报告

8.1 根据李斯特氏菌显色培养基或PALCAM 琼脂平板上单核细胞增生李斯特氏菌的典型菌落数，按7中公式计算，报告每g （mL ）样品中单核细胞增生李斯特氏菌菌数，以CFU/g(mL)表示；如T 值为0，则以小于1乘以最低稀释倍数报告。

第二法 单核细胞增生李斯特氏菌MPN 计数法

9 检验程序

单核细胞增生李斯特氏菌MPN 计数法检验程序见图2

图2 单核细胞增生李斯特氏菌MPN 计数法检验程序

.1d

12

22111C B A C B A T +=

9.1 基于“三管”MPN法，取检样25 g（mL）加入装有225 mL LB1增菌液中，均质制成1:10稀释液，用灭菌吸管吸取1:10稀释液1 mL，注入含有9 mL LB1增菌液的试管内，振摇试管混匀，制备1:100的稀释液。

9.2 另取1 mL灭菌吸管，按上条操作依次制备10倍递增稀释液，每递增稀释一次，换用1支1 mL灭菌吸管。

9.3 根据对检样污染情况的估计，选择三个连续的适宜稀释度（液体样品可选择原液），每个稀释度接种3支含有9 mL LB1增菌液的试管，每管接种1 mL（如果接种量超过1 mL，则用双料LB1增菌液）。于30℃±1℃培养24h，移取0.1 mL LB2增菌液内，于30℃±1℃培养18 h～24 h。

9.4 分离、鉴定方法同第一法。

10 结果报告

根据证实为单核细胞增生李斯特氏菌阳性的试管管数，查MPN检索表（附录B），报告每g（mL）单核细胞增生李斯特氏菌的MPN值。

附录A 培养基和试剂

A.1 含0.6%酵母浸膏的胰酪胨大豆肉汤（TSB-YE）

A.1.1 成分

胰胨17.0 g

多价胨3.0 g

酵母膏6.0 g

氯化钠5.0g

磷酸氢二钾2.5 g

葡萄糖2.5 g

蒸馏水1 000 mL

pH 7.2～7.4

A.1.2 制法

将上述各成分加热搅拌溶解，调节pH，分装，121 ℃高压灭菌15 min，备用。

A.2 含0.6%酵母膏的胰酪胨大豆琼脂（TSA-YE）

A.2.1 成分

胰胨17.0 g

多价胨3.0 g

酵母膏6.0 g

氯化钠5.0 g

磷酸氢二钾2.5 g

葡萄糖2.5 g

琼脂15.0 g

蒸馏水1 000 mL

pH 7.2～7.4

A.2.2 制法

将上述各成分加热搅拌溶解，调节pH，分装，121 ℃高压灭菌15 min，备用。

A.3 李氏增菌肉汤（LB1，LB2）

A.3.1 成分

胰胨5.0 g

多价胨5.0 g

酵母膏5.0 g

氯化钠20.0 g

磷酸二氢钾1.4 g

磷酸氢二钠12.0 g

七叶苷1.0 g

蒸馏水1 000 mL

pH 7.2～7.4

A.3.2 制法

将上述成分加热溶解，调节pH，分装，121 ℃高压灭菌15 min，备用。

A.3.2.1 李氏Ⅰ液（LB1）225 mL中加入：

1 % 萘啶酮酸（用0.05 mol/L氢氧化钠溶液配制）0.5 mL

1 % 丫啶黄（用无菌蒸馏水配制）0.3 mL

A.3.2.2 李氏Ⅱ液（LB2）200 mL中加入:

1 % 萘啶酮酸0.4 mL

1 % 丫啶黄0.5 mL

A.4 PALCAM 培养基

A.4.1 成分

酵母膏8.0 g

葡萄糖0.5 g

七叶甙0.8 g

柠檬酸铁铵0.5 g

甘露醇10.0 g

酚红0.1 g

氯化锂15.0 g

酪蛋白胰酶消化物10.0 g

心胰酶消化物3.0 g

玉米淀粉1.0 g

肉胃酶消化物5.0 g

氯化钠5.0 g

琼脂15.0 g

蒸馏水1 000 mL

pH 7.2～7.4

A.4.2制法

将上述成分加热溶解，调节pH，分装，121 ℃高压灭菌15 min，备用。

A.4.2.1 PALCAM选择性添加剂

多粘菌素B 5.0 mg

盐酸吖啶黄2.5 mg

头孢他啶10.0 mg

无菌蒸馏水500 mL

A.4.2.2 制法

将PALCAM基础培养基溶化后冷却到50 ℃，加入2 ml PALCAM选择性添加剂，混匀后倾倒在无菌的平皿中，备用。

A.5 革兰氏染色液

A.5.1 结晶紫染色液

A.5.1.1 成分

结晶紫 1.0 g

95％乙醇20.0 mL

1％草酸铵水溶液80.0 mL

A.5.1.2 制法

将结晶紫完全溶解于乙醇中，然后与草酸铵溶液混合。

A.5.2 革兰氏碘液

A.5.2.1 成分

碘 1.0 g

碘化钾 2.0 g

蒸馏水300 mL

A.5.2.2 制法

将碘与碘化钾先进行混合，加入蒸馏水少许，充分振摇，待完全溶解后，再加蒸馏水至300 mL。

A.5.3 沙黄复染液

A.5.3.1 成分

沙黄0.25 g

95％乙醇10.0 mL

蒸馏水90.0 mL

A.5.3.2 制法

将沙黄溶解于乙醇中，然后用蒸馏水稀释。

A.5.4 染色法

A.5.4.1 将纯培养的单个可疑菌落涂片，火焰上固定，滴加结晶紫染色液，染1 min，水洗。

A.5.4.2 滴加革兰氏碘液，作用1 min，水洗。

A.5.4.3 滴加95％乙醇脱色，约15 s～30 s，直至染色液被洗掉，不要过分脱色，水洗。

A.5.4.4 滴加复染液，复染1 min，水洗、待干、镜检。

A.6 SIM 动力培养基

A.6.1 成分

胰胨20.0 g

多价胨6.0 g

硫酸铁铵0.2 g，调节pH 7.2 。

A.6.2 制法

将上述各成分加热混匀，调节pH，分装小试管，121 ℃高压灭菌15 min，备用。

A.6.3 试验方法

挑取纯培养的单个可疑菌落穿刺接种到SIM培养基中，于30 ℃培养24 h～48 h，观察结果。

A.7 缓冲葡萄糖蛋白胨水（MR和VP试验用）

A.7.1 成分

多胨7.0 g

葡萄糖5.0 g

磷酸氢二钾5.0 g

蒸馏水1 000 mL

调节pH 7.0 。

A.7.2制法

溶化后调节pH，分装试管，每管1 mL，121 ℃高压灭菌15 min，备用。

A.7.3 甲基红（MR）试验

A.7.3.1甲基红试剂

A.7.3.1.1成分

甲基红10 mg

95 %乙醇30 mL

蒸馏水20 mL

A.7.3.1.2制法

10 mg甲基红溶于30 mL 95 %乙醇中，然后加入20 mL蒸馏水。

A.7.3.1.3试验方法

取适量琼脂培养物接种于本培养基，36 ℃±1 ℃培养2 d～5 d。滴加甲基红试剂一滴，立即观察结果。鲜红色为阳性，黄色为阴性。

A.7.4 V-P试验

A.7.4.1 6 % α-萘酚-乙醇溶液

成分及制法：取α-萘酚6.0 g，加无水乙醇溶解，定容至100 mL。

A.7.4.2 40 %氢氧化钾溶液

成分及制法：取氢氧化钾40 g，加蒸馏水溶解，定容至100 mL。

A.7.4.3试验方法

取适量琼脂培养物接种于本培养基，36 ℃±1 ℃培养2 d～4 d。加入6% α-萘酚-乙醇溶液0.5 mL和40 %氢氧化钾溶液0.2 mL，充分振摇试管，观察结果。阳性反应立刻或于数分钟内出现红色，如为阴性，应放在36 ℃±1 ℃继续培养4 h再进行观察。

A.8 血琼脂

A.8.1 成分

蛋白胨1.0 g

牛肉膏0.3 g

氯化钠0.5 g

琼脂1.5 g

蒸馏水100 mL

脱纤维羊血5 mL～10 mL

A.8.2 制法

除新鲜脱纤维羊血外，加热溶化上述各组分，121 ℃高压灭菌15 min，冷到50 ℃，以无菌操作加入新鲜脱纤维羊血，摇匀，倾注平板。

A.9 糖发酵管

A.9.1. 成分

牛肉膏5.0 g

蛋白胨10.0 g

氯化钠3.0 g

磷酸氢二钠（Na2HPO4.12H2O）2.0 g

0.2%溴麝香草酚蓝溶液12.0 mL

蒸馏水1 000 mL

A.9.2 制法

A.9.2.1 葡萄糖发酵管按上述成分配好后，按0.5 %加入葡萄糖，分装于有一个倒置小管的小试管内，调节pH至7.4，115℃高压灭菌15 min，备用。

A.9.2.2 其他各种糖发酵管可按上述成分配好后，分装每瓶100 mL，115℃高压灭菌15 min。另将各种糖类分别配好10%溶液，同时高压灭菌。将5 mL糖溶液加入于100 mL培养基内，以无菌操作分装小试管。

A.9.3 试验方法

取适量纯培养物接种于糖发酵管，36℃±1℃培养24 h～48 h，观察结果，蓝色为阴性，黄色为阳性。

A.10 过氧化氢酶试验

A.10.1 试剂

3%过氧化氢溶液：临用时配制。

A.10.2试验方法

用细玻璃棒或一次性接种针挑取单个菌落，置于洁净试管内，滴加3%过氧化氢溶液2 mL，观察结果。

A.10.3 结果

于半分钟内发生气泡者为阳性，不发生气泡者为阴性。

附录B 最可能数（MPN）检索表

12

无菌检测操作规程

无菌操作规程 1.目的 建立无菌检查标准操作规程，确保检查结果准确、可靠。 2.适用范围 本公司无菌产品的无菌检查 3.职责 质量部QC 4.依据 2015版《中国药典》通则1101 5.内容 5.1无菌检查环境保障 5.1.1无菌检查的所有操作均需在严格控制微生物污染的环境下进行，即无菌检查应在环境洁净度10000级下的局部洁净度100级的单向流空气区域内或隔离系统中进行。 5.1.2操作环境的无菌保障程度将直接影响无菌检查结果，为了保证无菌检查用洁净室（区）环境的稳定性，确保检查结果的可靠性，对洁净室（区）的环境定期检测并采取合理的措施保证洁净环境符合要求。 5.1.3无菌检查全过程必须严格遵守无菌操作，防止微生物污染。 5.1.4洁净区的温度、湿度等参数必须符合相应洁净级别的要求 5.1.5无菌检查操作还需要对环境进行监控， 5.2培养基、稀硫酸、缓冲液 5.2.1硫乙醇酸盐流体培养基，市售培养基干粉。除另有规定，接种后应置30-35℃培养。 5.2.2胰酪大豆胨液体培养基，市售培养基干粉。接种后应置20-35℃培养。 5.2.3中和或灭活用培养基，按上述硫乙醇酸盐流体培养基或胰酪大豆胨液体培养基的处方及制法，在培养基灭菌或使用前加入适宜的中和剂、灭活剂或表面活性剂，其用量同方法实用性试验。 5.2.4胰酪大豆胨琼脂培养基，市售培养基干粉。 5.2.5沙氏葡萄糖液体培养基，市售培养基干粉。 5.2.6沙氏葡萄糖琼脂培养基，市售培养基干粉。 5.2.7PH7.0氯化钠蛋白胨缓冲液，市售培养基干粉。 5.2.80.9%无菌氯化钠溶液。 5.2.9培养基使用性检查 无菌检查用的硫乙醇酸盐流体培养基和胰酪大豆胨液体培养基等应符合培养基的无菌性检查及灵敏度检查的要求。本检查可在供试品的无菌检查或与供试品的无菌检查同时进行5.2.9.1无菌性检查：每批培养基随机取5支（瓶），按各培养基规定的温度下培养14天，用无菌生长。 5.2.9.2灵敏度检查 5.2.9.2.1菌种：培养基灵敏度检查所用的菌株传代数不得超过5代（从菌钟存中心获得的干菌种第0代），并采用适宜的菌种保藏技术进行保存，以证试验菌株的生物学特性。 金黄色葡萄球菌【CMCC(B)26 003】 铜绿假单胞菌[CMCC(B)10 104] 枯草芽孢杆菌[CMCC(B)63 501] 生孢梭菌[CMCC(F)64 941] 白色念球菌[CMCC(F)98 001] 黑曲霉[CMCC(F)98 003]

单核细胞增生李斯特氏菌(Listeriamonocytogenes)

单核细胞增生李斯特氏菌（Listeriamonocytogenes） 荧光定量PCR检测试剂盒说明书 规格：48份/盒 用途：单核细胞增生李斯特氏菌PCR体外检测。 检测原理： 试剂盒中含有单增李斯特氏菌特异的引物，当样品中含有单增李斯特氏菌时，前增菌后提取的单增李斯特氏菌DNA通过PCR成指数扩增，在反应过程中单增李斯特氏菌特异的荧光探针跟靶核酸杂交,同时被Taq酶水解,把探针上的荧光基团和淬灭基团分开,从而通过荧光增量来实时判断单增李斯特氏菌的存在。 产品盒组成： 试剂盒的保存条件及有效期： 1．本试剂盒于-20℃保存。 2．有效期为6个月。 适用仪器： ABI7500，9600系列，MJopticon2，Bio-Rad等荧光定量PCR仪均可。 实验方法： 1．取增菌液1ml加到1.5ml无菌离心管中，10,000rpm离心5min，弃去上清；采纳经典酚氯仿提取法，将提取到的模板进行检测或保存于-20℃以待检测。 2．将PCR反应液置室温平衡，融化后取Taq酶,按2U/管加入Taq酶，即每个测试反应体系配制为：PCR反应液22.5ul+0.4ulTaq 酶。 3．加入模板：将保存在-20℃的核酸提取物置室温解冻，以13,000rpm离心5min。阴、阳性对比使用前置室温解冻。在每个PCR反应管中分别加入步骤1中处理过的模板或阴、阳性对比各2ul，盖好管盖，置于PCR仪上，记录相应样品号。 4．上机扩增、检测区：反应条件为95℃：3min，1个循环；95℃：5sec，60℃：40sec〔信号采集〕，40个循环。反应体系设为25ul。 关于多通道荧光PCR仪，信号采集时设定为Fam荧光素。 结果分析： 关于MJOpticon2系列荧光定量PCR检测仪进行结果分析时，扣除本底后再输入1-15之间的荧光值，进行Ct值的设置或拖动基线到合适的位置以确定ct值。 关于ABI7500，9600系列荧光PCR检测仪进行结果分析时基线的确定：取3-10或3-15个循环的荧光值，阈值设定原那么为阈值线刚好超过正常阴性对比品扩增曲线的最高点，而不显示Ct值为宜。 质控标准： 本试剂盒灵敏度为100拷贝/ml。定量检测线性范围为：10-1010拷贝/ml。 阴性对比无Ct值显示或Ct值为40，阳性对比的Ct值≤30.0，否那么为实验失败。 结果判断： 1．检测样本Ct值≤35.0时，报告阳性。 2．检测样本Ct值>35.0且Ct值<40时，需重复检测一次，假如Ct值仍<40，但曲线有明显的对数增长特性，报告本阳性，否那么报告阴性。 3．样本不显示Ct值时，报告阴性。 试剂盒使用本卷须知 1．本试剂盒仅用于体外检测和研究用途，开始使用前请认真阅读本说明书全文。 2．实验必须严格分区操作：PCR前预备区——预备实验试剂；样本处理区——待测样本、模板处理；检测区——PCR扩增、检测。

单核细胞增生李斯特菌

单核细胞增生李斯特菌 形态特征： ①革兰氏阳性的类球形杆菌 ②大小约为0.4~0.5μm x 0.5～2.0μm ③两端钝圆 ④在有些培养基中稍弯，单个、成V形或成对平行排列 ⑤在陈旧培养中的菌体可呈丝状及革兰氏阴性 ⑥兼性厌氧，无芽孢，一般不产生荚膜 ⑦在20~25℃时以4根周毛运动，在37℃时只有较少的鞭毛或1根鞭毛 培养特性： ①需氧和兼性厌氧 ②生长范围为2-42℃ ③最适温度为35-37℃ ④pH中性至弱碱性（pH9.6） ⑤在6.5% NaCl 肉汤中生长良好。 ⑥在20-25℃培养有动力，穿刺培养2-5天可见倒立伞状生长，肉汤培养物在显微镜下可见翻跟斗运动。 ⑦在固体培养基上，菌落初始很小，透明，边缘整齐，呈露滴状，但随着菌落的增大，变得不透明。

⑧在5-7%的血平板上，菌落通常也不大，灰白色，刺种血平板培养后可产生窄小的β-溶血环。 ⑨在0.6%酵母浸膏胰酪大豆琼脂(TSAYE)和改良Mc Bride(MMA)琼脂上，用45°角入射光照射菌落，通过解剖镜垂直观察，菌落呈兰色、灰色或兰灰色。 生化特性：（甘露醇、木糖为阴性，其他为阳） 1.该菌触酶阳性，氧化酶阴性。 2.发酵多种糖类，产酸不产气。 发酵葡萄糖、乳糖、水杨素、麦芽糖、鼠李糖、七叶苷、蔗糖（迟发酵）、山梨醇、海藻糖、果糖。 不发酵木糖、甘露醇、肌醇、阿拉伯糖、侧金盏花醇、棉子糖、卫矛醇和纤维二糖。 3.不利用枸橼酸盐，40%胆汁不溶解。 4.吲哚、硫化氢、尿素、明胶液化、硝酸盐还原、赖氨酸、鸟氨酸均阴性。 5.MR-VP试验和精氨酸水解阳性。 生化试验： ①动力试验+ 原理：有动力的细菌扩散生长，培养基浑浊，无动力的细菌培养基澄清。（结果：有动力，呈伞状生长，底为弯月牙形）

食品中霉菌和酵母菌测定的标准操作规程

食品中霉菌和酵母菌测定的标准操作规程 公司内部编号：（GOOD-TMMT-MMUT-UUPTY-UUYY-DTTI-

规范食品中霉菌和酵母菌测定的标准操作规程。 2范围 本标准规定了食品中霉菌和酵母菌（moulds and yeasts）的计数方法。本标准适用于各类食品中霉菌和酵母菌的计数。 3责任 质量部组织制订、化验室负责实施。 4内容 4.1 设备和材料 除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下： 4.1.1 冰箱：2 ℃～5 ℃。 4.1.2 恒温培养箱： 28 ℃±1 ℃。 4.1.3 均质器。 4.1.4 恒温振荡器。 4.1.5 显微镜：10×～100×。 4.1.6 电子天平：感量0.1 g。 4.1.7 无菌锥形瓶:容量500 mL、250 mL。 4.1.8 无菌广口瓶：500 mL。

4.1.9 无菌吸管：1 mL(具0.01 mL 刻度)、10 mL(具0.1 mL 刻度)。4.1.10 无菌平皿：直径90 mm。 4.1.11 无菌试管: 10 mm×75 mm。 4.1.12 无菌牛皮纸袋、塑料袋。 4.2 培养基和试剂 4.2.1 马铃薯-葡萄糖-琼脂培养基：见附录A 中A.1。 4.2.2 孟加拉红培养基：见附录A 中A.2。 4.3检验程序 霉菌和酵母计数的检验程序见图1。 图 1 霉菌和酵母计数的检验程序 4.4操作步骤 4.4.1 样品的稀释 4.4.1.1 固体和半固体样品：称取25 g 样品至盛有225 mL 灭菌蒸馏水的锥形瓶中，充分振摇，即为1:10稀释液。或放入盛有225 mL 无菌蒸馏水的均质袋中，用拍击式均质器拍打2min，制成1:10 的样品匀液。 4.4.1.2 液体样品：以无菌吸管吸取25 mL 样品至盛有225 mL 无菌蒸馏水的锥形瓶（可在瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分混匀，制成1:10 的样品匀液。 4.4.1.3 取1 mL 1:10 稀释液注入含有9 mL 无菌水的试管中, 另换一支1 mL 无菌吸管反复吹吸,此液为1:100 稀释液。 4.4.1.4 按 5.1.3 操作程序，制备10 倍系列稀释样品匀液。每递增稀释一次，换用1 次1 mL 无菌吸管。

GMP-无菌检查操作规程

1.目的： 建立无菌检查的标准操作规程，确保检验结果的准确性。 2.范围： 适用于本厂质监科化验室对本厂生产的注射剂进行无菌检查。 3.责任： 化验员有责任按本操作规程操作，并对检验结果负责。 4.定义： 无菌检查法系指检查药品是否无菌的一种方法。 5.内容： 5.1无菌操作设备： 无菌操作室或超净工作台，无菌衣、口罩、帽子、消毒鞋、酒精灯等。5.1.1无菌室分无菌操作室和缓冲间。在缓冲间内应有洗手盆、干手器、无菌衣放置架及挂钩、拖鞋等。无菌操作室应具有空气除菌过滤的层流装置，局 部洁净度100级超净工作台。缓冲间及操作室内均设置能达到空气消毒的紫外光灯和照明灯，操作室或工作台应保持空气正压。 5.1.2无菌室应每周和每次操作前用0.1％新洁尔灭或2％甲酚液擦拭操作台及可能污染的死角，开动无菌空气过滤器及紫外光灯杀菌1小时。在每次操作完毕，同样用2％甲酚或0.1％新洁尔灭溶液擦拭工作台面，用紫外光灯杀菌半小时。 5.1.3无菌室的无菌程度检查：无菌室在消毒处理后，无菌试验前及操作过程中需检查空气中菌落数。取直径90mm双碟，在接种室内点燃酒精灯，在酒精灯旁，以无菌操作，将双碟半开注入溶化的营养琼脂培养基约20ml，制成平板：

在35-37℃预培养48小时，证明无菌后将3个平板以无菌方式带入无菌操作间的洁净区域左、中、右各放1个；打开碟盖扣置，平板在空气中暴露30分钟后将盖盖好，置35-37℃培养48小时，取出检查，3个平板上生长的菌落数相加总数不得超过10个。 无菌操作台面或超净工作台应定期请有关部门检测其洁净度，应达到100 级（一般用尘埃粒子计数仪），检测尘埃粒径≤5μm的粒数不得超过3.5个／升；空气流量应控制在0.75-1.0m3/s；细菌菌落数平均<1个，可根据无菌状况定期置换过滤器。 5.1.4无菌室内应准备好盛有消毒用5％甲酚的玻璃缸、酒精灯、火柴、镊子、75％酒精棉及拖鞋等。 5.2仪器、用具： 5.2.1真空泵、恒温培养箱、生物显微镜、托盘天平（精度0.1g）、抽滤瓶（500ml）、三角瓶（100、500 ml）、移液管（1、10ml）、注射器（要求规格）、试管、双碟（9cm）、注射针、镊子、剪刀、白金耳、橡皮管、纱布、棉花（原棉）、不锈钢吸管筒、接种环、微孔滤膜（直径约5cm），孔径应在0.45±0.02μm )载玻片、洒精灯、取样勺、吸耳球、喷雾瓶。 5.2.2用具的包扎： 5.2.2.1移液管 在移液管上端管内,松松地塞进少许原棉,然后放入不锈钢灭菌筒内。 5.2.2.2试管 在管口塞上纱布棉塞。 5.2.2.3无菌衣、裤、帽、口罩

李斯特氏菌介绍

李斯特氏菌介绍 录入时间:2006-6-26 10:16:37 来源：青岛海博生物技术部 李斯特菌 一、概况： 李斯特菌在环境中无处不在，在绝大多数食品中都能找到李斯特菌。肉类、蛋类、禽类、海产品、乳制品、蔬菜等都已被证实是李斯特菌的感染源。李斯特菌中毒严重的可引起血液和脑组织感染，很多国家都已经采取措施来控制食品中的李斯特菌，并制定了相应的标准。目前国际上公认的李斯特菌共有七个菌株： 1、单核细胞增生李斯特菌 (L.monocytohenes) 2、绵羊李斯特菌 (L.iuanuii) 3、英诺克李斯特菌 (L.innocua) 4、威尔斯李斯特菌 (L.innocua) 5、西尔李斯特菌 (L.seeligeri) 6、格氏李斯特菌 (L.grayi) 7、默氏李斯特菌 (L.murrayi) 其中单增李斯特菌是唯一能引起人类疾病的。单核细胞增生李斯特氏菌是一种人畜共患病的病原菌。它能引起人、畜的李氏特菌病，感染后主要表现为败血症、脑膜炎和单核细胞增多。它广泛存在于自然界中，食品中存在的单增李氏菌对人类的安全具有危险，该菌在4℃的环境中仍可生长繁殖，是冷藏食品威胁人类健康的主要病原菌之一。 (一) 特点： 1、分布广：存在于土壤、水域(地表水、污水、废水)、昆虫、植物、蔬菜、鱼、鸟、野生动物、家禽。 2、生存环境可塑性大：能在2-42℃下生存(也有报道0℃能缓慢生长 )能在冰箱冷藏室内较长时间生长繁殖。 3、适应范围大：酸性、碱性条件下都适应。 4、带菌较高的食品有：牛奶和乳制品；肉类(特别是牛肉)；蔬菜；沙拉；海产品；冰淇凌等。 （二）流行情况： 1999年底，美国发生了历史上因食用带有李斯特菌的食品而引发的最严重的食物中毒事件，据美国疾病控制和防治中心资料显示，在美国密歇根州有14人因食用被该菌污染的“热狗”和熟肉而死亡，在另外22个州97人患此病，6名妇女流产。 1992-1995年法国出产的奶酪及猪肉中发现李斯特菌，2001年11月以来，我国质检部门多次从美国、加拿大、法国、爱尔兰、比利时、丹麦等二十多家肉类加工厂进口的猪腰、猪肚、猪耳、小排等三十多批近千吨猪副产品中检出单增李斯特菌、沙门氏菌等致病菌。 二、流行病学 单增李斯特氏菌广泛存在于自然界中，不易被冻融，能耐受较高的渗透压，在土壤、地表水、污水、废水、植物、青储饲料、烂菜中均有该菌存在，所以动物很容易食入该菌，并通过口腔-粪便的途径进行传播。据报道，健康人粪便中单增李氏菌的携带率为0.6-16%,有70%的人可短期带菌，4-8%的水产品、5-10%的奶及其产品、30%以上的肉制品及15%以上的家禽均被该菌污染。人主要通过食入软奶酪、未充分加热的鸡肉、未再次加热的热狗、鲜牛奶、巴氏消毒奶、冰激凌、生牛排、羊排、卷心菜色拉、芹菜、西红柿、法式馅饼、冻猪舌等而感染，约占85-90%的病例是由被污染的食品引起的。 该菌可通过眼及破损皮肤、粘膜进入体内而造成感染，孕妇感染后通过胎盘或产道感染胎儿或新生儿,栖居于阴道、子宫颈的该菌也引起感染，性接触也是本病传播的可能途径，且有上升趋势。

卫生标准操作规程(SSOP)

目录表 目录页-----------------------------------------------------------------------------------------0 文件批准页-----------------------------------------------------------------------------------1 1.目的------------------------------------------------------------------------------------------2 2.范围------------------------------------------------------------------------------------------2 3.职责------------------------------------------------------------------------------------------2 4.程序------------------------------------------------------------------------------------------2 4.1加工用水的安全-----------------------------------------------------------------------------------------2 4.2食品接触面卫生控制-----------------------------------------------------------------------------------2 4.3防止交叉污染--------------------------------------------------------------------------------------------3 4.4卫生设施的维护-----------------------------------------------------------------------------------------4 4.5防止掺杂物污染-----------------------------------------------------------------------------------------5 4.6有毒化合物的标记、储存及使用--------------------------------------------------------------------5 4.7加工人员健康状况的控制-----------------------------------------------------------------------------5 4.8虫害的去除-----------------------------------------------------------------------------------------------6

菌种抗生素的抗性检查标准操作规程

菌种抗生素的抗性检查标准操作规程 依据：《中华人民共和国药典》2005年版第三部。 范围：适用于大肠杆菌表达的重组人基因工程产品。 目的：验证该菌种的抗生素抗性是否与原始菌株相符。 原理：该菌种所携带的重组质粒含有氨苄青霉素抗性基因，在含有氨苄青霉素的LB琼脂培养基上能够生长。 责任：检定人员。 内容： 1 材料 1．1 材料 1．1．1 菌种：PBV 888/DH 5α ，来源于主种子批或工作种子批。 1．1．2 注射用水：符合《中华人民共和国药典》2005年版的要求。1．1．3 药品 氯化钠 NaCl 分析纯 琼脂粉分析纯 酵母粉 OXOID 蛋白胨 OXOID 氨苄青霉素 C 16H 19 N 3 O 4 S 分析纯 无水乙醇 CH 3CH 2 OH 分析纯 1．1．4 器皿 三角烧瓶（1L）、量筒（500ml、1000ml）、烧杯（500ml）、平皿、盐水瓶（250ml、500ml、1000ml）。 1．1．5 其它材料 线绳、牛皮纸、硫酸纸、剪刀、接种环、煤气灯、脱脂棉。 1．2 设备 恒温培养箱 HG303-5B型湖北省黄石市医疗器械厂 生物安全台Ⅱ级A型安徽蚌埠净化设备厂 扭力天平TN-100B 上海第二天平厂

2 方法 2．1 准备工作 2．1．1 生产环境：在十万级洁净间中进行。场地摘下“清场合格”标志牌，挂上“使用中”标志牌。 2．1．2 器皿的洁净要求 玻璃器皿经本室洗刷组处理后，用二层硫酸纸、一层牛皮纸包好，用线绳系紧，送高压灭菌（121.3℃，60分钟）。脱脂棉用硫酸纸、牛皮纸包好，121.3℃60分钟高压灭菌。 2．1．3．1 确认扭力天平运行状态良好，已挂有“备用”标志牌。 2．1．3．2 确认恒温培养箱运行状态良好，已挂有“运行”标志牌。 2．1．3．3确认生物安全台运行状态良好，已挂有“备用”标志牌。 2．1．4 配液 2．1．4．1 LB琼脂培养基的配制（500ml） 摘下扭力天平“备用”标志牌，挂上“运行”标志牌。用扭力天平准确称取酵母粉2.5克，蛋白胨5克，NaCl 5克，琼脂粉10克，倒入500ml烧杯中，加入400ml 注射用水，用玻棒搅匀溶解，定容至500ml，混匀，倒入1L三角瓶中，分别用二层硫酸纸和一层牛皮纸包瓶口，用线绳系紧，115.6℃，30分钟高压灭菌。贴上标签，标明液体名称、批号、配制日期，备用。 2．1．4．2 75%酒精1000ml 用量筒量取750ml无水乙醇，加入250ml无菌注射用水，置1000ml盐水瓶中，摇匀，标明液体名称、批号、浓度、日期，室温备用。 2．1．5 LB琼脂平板培养基的制作 摘下生物安全台“备用”标志牌，挂上“运行”标志牌，用75%酒精棉擦拭台内，接通电源。打开电机，无菌风吹30分钟，待已灭菌LB琼脂培养基500ml冷却到50℃左右，加入25mg氨苄青霉素，轻轻摇匀，倒平板，每皿20-30ml，待培养基冷却后，贴上标签，并注明名称、批号、配制日期，置37℃孵箱中孵育，判定合格后置于4℃冰箱中保存，待用。 2．3 操作步骤 2．3．1 在生物安全台中，将接种环用火焰灭菌并冷却后，用接种环取一环菌

无菌技术操作流程及评分标准

无菌技术操作流程 开始：各位老师下午好，我操作的项目是无菌技术操作。 1.无菌技术操作的目的：保持无菌物品无菌区域不被污染，防止一切微生物侵入机体，避免给患者带来不应有的损失和危害 2.环境评估：操作前30分钟停止清扫，操作中减少人员走动，开窗、通风、换气，操作台宽敞、平坦、整洁、干燥。 3.用物准备：治疗盘无菌包：包内置无菌巾若干无菌容器内置无菌持物钳棉签无菌包：内置治疗碗一个，镊子两把，弯盘一个无菌纱布罐无菌棉球罐无菌生理盐水一次性无菌手套 铺无菌盘 1.洗手戴口罩。 2.治疗盘清洁，干燥。铺无菌换药盘。 3.开无菌包：化学指示胶带有变色，在有效期内，无潮湿、无破损。斜角打开（打开无菌包内角时，手不可触及包布内面，不得跨越无菌区域）看化学指示卡，有变色。用无菌持物钳夹取一块无菌巾放入治疗盘内，将无菌包按原折痕“一字”包好后，看时间：记录日期、时间、并签名、24小时内有效。 4.铺无菌巾：双手捏住无菌巾一侧两角外面轻轻抖开，由近及远的将治疗巾一半铺于治疗盘上，将上下对齐后上层扇形折三次，开口外边向外，使治疗巾内面构成一无菌区。 5.开无菌包，前述指示胶带变色，在有效期内，侧孔、底孔闭合 1）打开无菌包，看化学指示卡变色 2）用无菌钳分别取治疗碗（内含两把镊子）、弯盘入无菌盘内。 3）打开无菌纱布罐夹取纱布置无菌盘内；同法夹取无菌棉球置治疗碗内（手不可触及容器边缘或内侧），无菌容器盖内面朝下直接盖上。 6.倒无菌溶液：（拿起溶液瓶，看瓶签）述：瓶身干净，标签完整、字迹清楚，0.9%Nacl500ml，在有效使用期内，瓶盖无松动，瓶身瓶底无无裂缝，对光检查：溶液澄清、无杂质。除盖：查棉签（无漏气，在有效试用期内）写好开包日期，消毒瓶盖、手指，开瓶盖。倒溶液于治疗碗内，再次消毒瓶口，盖回瓶盖看时间：记录日期、时间、签名，24小时有效。 7.铺完盘，看时间口述：记录名称、时间并签名（小标签贴于盘缘）、4小时内有效。述：已铺好换药盘，可以给病人进行换药护理。一份无菌物品只供一位病人使用，以防交叉感染。 8.注意事项：在操作中应注意：无菌容器盖放于稳妥处时，应内面朝上。到远处夹取无菌物品，应同时搬移无菌持物钳和容器。无菌持物钳和浸泡容器每周灭菌2次，同时更换消毒液，干燥保存4小时更换一次 带无菌手套 1．目的：用于进行无菌操作，防止患者受到感染，用于接触某些无菌物品或区域，保持无菌物

SSOP卫生标准操作试题

S S O P卫生标准操作试题 TTA standardization office【TTA 5AB- TTAK 08- TTA 2C】

卫生标准操作程序（S S O P）培训试题姓名：部门：得分： 一、选择题 1食品加工企业制定ssop计划，首先要考虑那个元素（） A食品接触表面的卫生要求 B水或冰的卫生要求 C员工健康 D交叉污染的防止 2、以下哪些不属于生产车间对外口应设置防虫害措施（） A风帘 B暗室 C翻水弯 D 挡水板 3、员工洗手的消毒液一般情况应多长时间检测一次（）。上班高峰（） A 30min B 60min C 45min D 50min 4、食品生产企业，人流、水流和气流的方向是（） A从高密度区到低密度区 B从高气流区到低气流区 C从高污染区到低污染区 D从高清洁区到低清洁区 5、以下哪项操作是正确的（） A 加工前要洗手消毒，离开车间可不用 B皮肤病患者穿好工作服可以正常工作 C车间中的冷凝水无可避免只能减少 D内外包装材料应该要分开存放 6、以下哪项材料不属于避免食品接触材料（） A 竹木材料 B塑料 C铸铁材料 D黄铜 7、凡从事食品生产的人员都必须进行（）体检。 A 一次/年 B一次/半年 C一次/三个月 D一次/月 8、以下哪项不属于食品的直接接触面（）

A工作服 B 包装间传送带 C内包装物料 D蓄水池 9、工作服应该用专用洗衣房清洗（）工作服要分开清洗。 A不同食品区域 B不同加工区域 C不同湿度区域 D不同清洁区域 10、以下哪项属于食品交叉感染（） A装过化学物质的容器再装食品 B流感病毒的传染 C饼干放进冰箱后变软 D切完大蒜的刀再切鸡肉一股蒜味 二、判断题 1、食品接触面可分为直接接触面和间接接触面，两者是固定的，在食品加工过程中不能混淆。（） 2、清洁剂与对象接触时间越长，温度越高，清洁对象表面擦的越干净，水中Ca2+、Mg2+越高，清洁效果越好。（） 3、车间空气消毒一般采用臭氧和紫外线消毒。（） 4、厕所的位置应设在卫生设施区域内并尽可能离作业区近一些，方便员工。 （） 5、消毒效果与食品接触面的清洁度、pH、消毒剂浓度和时间有关（） 6、使用自供水与城市供水的实验室监测的频率一样，每月一次进行微生物检测。（） 7、许多国家已经明令禁止使用竹木器具，所以一般不推荐在企业生产过程中使用木质器具。（） 8、有毒化学物的监测区域主要包括食品接触面、包装材料、加工过程和包含在成品内的辅料。（） 9、加工食品的员工如果携带致病菌应禁止接触食品，如果症状轻微没有表现出来就不用禁止。（） 10、水样监测取样时应该先对出水口进行消毒，放水5min后取样做检测。（）

标准菌株使用标准操作规程

标准菌株使用标准 操作规程

标准菌株使用标准操作规程 1 检验目的 对实验室的标准菌株进行合理的保存，并规范合理的使用流程，保证菌株的性能稳定可靠。 2 范围 微生物实验室保存的标准菌株。 3 职责 微生物组工作人员正确执行本操作规程。 4 术语和定义 4.1标准菌株 其特征进行了分类和描述，有明确的来源。ATCC（American Type Culture Collection）美国标准菌株收藏中心。 4.2标准储备菌株 标准菌株经过一代转接后获得的同种菌株。 4.3 工作菌株 标准储备菌株传代后得到的同种菌株。 4.4 标准培养物 标准菌株、标准储备菌株、工作菌株的统称。 4.5质控菌株 ATCC最佳，但当无法获得时能够使用ATCC演化的菌株或中国国家菌种库储存的标准菌株。特殊情况，例如定性试验可用已知的菌种作为质控菌

株。室间质评的菌株即可。 5 保存程序 5.1标准菌株 5.1.1商业购买的ATCC标准菌株干粉，-80℃低温保存，能够2年以上。安瓿真空包装的，-80℃可长期稳定保存。将标准菌株进行编号和登记。 5.1.2复苏 用1ml无菌的小牛血清或营养肉汤溶解。根据菌种的生长特点，接种到新鲜培养基上选择适宜的培养条件培养18-24h。酵母菌要求3天，形成孢子的微生物宜保存孢子。 5.2标准储备菌株 5.2.1由复苏后的ATCC标准菌株制备。复苏后的标准菌株要检查其纯度，必要时进行生化试验检查。刮取培养物上的菌体，用足量的菌悬浮于防冻培养基中。防冻液能够是无菌脱纤维羊血、10%甘油肉汤。储存足够量的标准储备菌株，可用1-2年。一年52周需要52支以上。 5.2.2甘油肉汤保存法 成分有蛋白胨、牛肉浸出粉、氯化钠、甘油、纯化木。相当于20%的甘油。挑取5环菌落加入到1ml甘油肉汤中混匀。苛养菌能够适当增加菌量。-80℃保存。除链球菌和嗜血杆菌以外细菌均可使用。保存期限1-5年。 5.2.3全血保存法 成分为脱纤维羊血。挑取5环菌落加入到1ml甘油肉汤中混匀。苛养菌能够适当增加菌量。-80℃保存。主要用于保存链球菌、嗜血杆菌及厌氧菌。保存期限1-5年。

无菌检查操作规程2015 (1)

无菌检查操作规程 1.目的 建立无菌检查标准操作规程，确保检查结果准确、可靠。 2.使用范围 本公司无菌产品的无菌检查 3.职责 质量部QC 4.依据 2015版《中国药典》通则1101 GB/T 19973.2-2005（ISO11737-2:1998） 《疗器械的灭菌微生物学方法第2部分：确认灭菌过程的无菌试验》 GB/T 14233.2-2005 《医用输液、输血、注射器具检验方法第2部分：生物学试验方法》 5.内容 5.1.无菌检查环境保障 5.1.1.无菌检査的所有操作均需在严格控制微生物污染的环境下进行，即无菌检 査应在环境洁净度10000级下的局部洁净度100级的单向流空气区域内或隔离系统中进行。 5.1.2.操作环境的无菌保障程度将直接影响无菌检查结果，为了保证无菌检查用 洁净室（区）环境的稳定性，确保检查结果的可靠性，对洁净室（区）的环境定期监测并采取合理的措施保证洁净环境符合要求。 5.1.3.无菌检查全过程必须严格遵守无菌操作，防止微生物污染。 5.1.4.洁净区的温度、湿度等参数必须符合相应洁净级别的要求。 5.1.5.无菌检查操作还需要对检查环境进行监控， 5.2.培养基、稀释液、缓冲液 5.2.1.硫乙醇酸盐流体培养基，市售培养基干粉。除另有规定，接种后应置 30~35℃培养。 5.2.2.胰酪大豆胨液体培养基，市售培养基干粉。接种后应置20~35℃培养。 5.2.3.中和或灭活用培养基，按上述硫乙醇酸盐流体培养基或胰酪大豆胨液体培

养基的处方及制法，在培养基灭菌或使用前加入适宜的中和剂、灭活剂或表面活性剂，其用量同方法适用性试验。 5.2.4.胰酪大豆胨琼脂培养基，市售培养基干粉。 5.2.5.沙氏葡萄糖液体培养基，市售培养基干粉。 5.2. 6.沙式葡萄糖琼脂培养基，市售培养基干粉。 5.2.7.PH7.0氯化钠蛋白胨缓冲液，市售培养基干粉。 5.2.8.0.9%无菌氯化钠溶液。 5.2.9.培养基使用性检查 无菌检査用的硫乙醇酸盐流体培养基和胰酪大豆胨液体培养基等应符培养基的无菌性检査及灵敏度检査的要求。本检查可在供试品的无菌检査或与供试品的无菌检査同时进行。 5.2.9.1.无菌性检查：每批培养基随机取5支（瓶），按各培养基规定的温度下 培养14天，应无菌生长。 5.2.9.2.灵敏度检查 5.2.9.2.1.菌种：培养基灵敏度检查所用的菌株传代数不得超过5代(从菌种存中 心获得的干菌种第0代），并采用适宜的菌种保藏技术进行保存，以 证试验菌株的生物学特性。 金黄色葡萄球菌[CMCC(B)26 003] 铜绿假单胞菌[CMCC(B)10 104] 枯草芽孢杆菌[CMCC(B)63 501] 生孢梭菌[CMCC(B)64 941] 白色念珠菌[CMCC(F)98 001] 黑曲霉[CMCC(F)98 003] 5.2.9.2.2.菌液制备：接种金色葡萄球菌、铜绿假胞菌、枯草芽孢杆菌的培养物 至胰酪大豆胨液体培养基中或胰酪大豆胨琼脂培养基上，接种生孢梭 菌的培养物至硫乙醇酸盐流体培养基中，30?35℃培养18?24小时； 接种白色念珠菌的培养物至沙氏葡萄糖液体培养基中或沙氏葡萄糖琼 脂培养基上，20?25℃培养24?48小时，上述培养后的新鲜培养物用 PH7.0无菌化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌化钠溶液制成每lml菌数小

李斯特氏菌对食品安全的危害及防治

品种名称：PALCAM平板 品种编号：029970 PALCAM平板用途：用于单增李斯特氏菌的选择性分离培养。 单增李斯特氏菌介绍： 单核增生李斯特菌是一种常见的土壤细菌，在土壤中它是一种腐生菌，以死亡的和正在腐烂的有机物为食。它也是某些食物(主要是鲜奶产品)中的一种污染物，能引起严重食物中毒。单核细胞增生李斯特氏菌是一种人畜共患病的病原菌。它能引起人、畜的李氏特菌病，感染后主要表现为败血症、脑膜炎和单核细胞增多。它广泛存在于自然界中，食品中存在的单增李氏菌对人类的安全具有危险，该菌在4℃的环境中仍可生长繁殖，是冷藏食品威胁人类健康的主要病原菌之一。 微生物图鉴： 培养基使用原理： 蛋白胨提供生长必须的碳氮源;酵母膏粉和淀粉提供碳氮源、维生素和生长因子;氯化钠可维持均衡的渗透压;葡萄糖提供碳源;李斯特氏菌水解七叶苷与铁离子反应形成黑色的6,7-二羟基香豆素;甘露醇是可发酵的糖，酚红是pH指示剂;氯化锂和其它的抗生素能抑制革兰氏阴性菌和大多数革兰氏阳性菌;琼脂是 培养基的凝固剂。 贮存：贮存于4-8℃。贮存期三个月。 规格：20个/盒

PALCAM平板培养基配方(每升)： 蛋白胨23.0g 淀粉1.0g 酵母膏粉3.0g 氯化钠5.0g D-葡萄糖0.5g D-甘露醇10.0g 柠檬酸铁铵0.5g 七叶苷0.8g 氯化锂15.0g 酚红0.08g 琼脂13.0g 盐酸吖啶黄素0.5mg 硫酸多粘菌素B1mg 复达新2.0mg 最终pH 7.2±0.2 PALCAM平板使用方法： 1、取待检菌划线接种于PALCAM平板上，于35℃±1℃培养24h～48h。 2、观察结果。李斯特氏菌在PALCAM平板上生长24h后菌落呈黑色，直径为1mm，在其周围形成一个黑色环，培养48h，菌落仍呈黑色，直径2mm～3mm，除在菌落周围有一环外，在菌落中心部位的深层也形成黑点。 质量控制： 质控菌株接种后于37℃培养24h结果如下： 菌名菌号生长状况

ISO标准(参考译文)单核增生李斯特氏菌的检测和计数方法

国际标准ISO11290-1 第一版1996-12-15 食品和动物饲料微生物学---单核增生李斯特氏菌的检测和计数方法第一部分 检测方法 目录 内容页次 1 范围 1 2 参考标准 1 3 定义 1 4 原理 2 5 培养基和试剂 2 6 设备和玻璃仪器 3 7 取样 3 8 取样前处理 3 9 步骤 3 10 结果表述7 11 检验报告7 附录 A 检验步骤图8 B 培养基和试剂的组成和配制9 C 亨氏证明试验16

食品和动物饲料微生物—单核增生李斯特氏菌检测和计数的水平方法 第一部分 检测方法 警告：为了保障实验室人员的安全，强烈推荐执行单核增生李斯特氏菌检验应在具备相应设备条件的实验室进行，在有经验的微生物专家控制下，保温后的一切丢弃物应小心处理。特别是，强烈推荐孕妇不能操作单核增生李斯特氏菌的培养。 1 范围 本ISO11290详细说明了单核增生李斯特氏菌检测和计数的水平方法。 限于简介中讨论的条件，本ISO11290适用于给人消费和作为动物饲料的产品。 2 参考标准 以下标准包含的条件；通过参照这些内容，组成了这部分ISO11290的条件。出版时，引用的这些版本是有效的。所有标准都需要修订，而各机构对本部分基于ISO11290的批准应鼓励调查和应用以下引用标准的最近版本。IEC和ISO成员保留目前有效的国际标准的注册。 ISO6887：1983，微生物学---微生物检验中稀释液制备的一般导则 ISO7281：1996，食品及动物饲料微生物学---微生物检验通则 3 有关定义 本部分ISO11290适用以下定义： 3.1 单核增生李斯特氏菌依据本部分ISO11290实施检验，在固体选择性培养基上形成典型菌落并呈现固有形态、生理生化特征的微生物。 3.2单核增生李斯特氏菌的检验依据本部分ISO11290实施检验，在给定产品的质量和体积的条件下，检验这些微生物的存在或不存在。 4.原理 在本部分ISO11290范围内，单核增生李斯特氏菌检验需要四个连续的阶段（见附录A检验流程图） 注意1：李斯特氏菌可能存在量少并与大量的其它种类细菌混杂，因此需要选择性富集。同时也必须检测受破坏的李斯特氏菌，初级选择性富集培养基，含有降

第一章 卫生标准操作程序(SSOP)(DOC)

第一章卫生标准操作程序(SSOP) 第一节卫生标准操作程序内容 第二节卫生监控与记录 第三节卫生标准操作程序和卫生标准操作记录的编制 第四节卫生标准操作程序与记录示例（略） 第一节卫生标准操作程序内容 食品标准操作程序（Sanitation Standard Operation Procedure,SSOP）是食品生产企业为了使其加工的食品符合卫生要求，制定的指导食品加工过程中如何具体实施清洗、消毒和卫生保持的作业指导文件，以SSOP文件的形式出现。 第一节卫生标准操作程序内容 SSOP至少包括8项内容： 1、与食品接触或与食品接触物表面接触的水（冰）的安全 2、与食品接触的表面（包括设备、手套、工作服）的清洁度 3、防止食品发生交叉污染 4、手的清洗与消毒，厕所设施的维护与卫生保持 5、防止食品被污染物污染 6、有毒化学物质的标记、储存和使用 7、雇员的健康与卫生控制 8、虫害的防治 水（冰）的安全 食品加工中用水（冰）的卫生质量是影响食品卫生的关键因素。生产中要重点保证： 与食品接触或与食品接触物表面接触的水（冰）的安全 制冰用水的安全供应 饮用水与非饮用水间没有交叉关联 一、水（冰）的安全 水源 标准 水的处理 监控 供水设施 废水的排放 生产用冰 纠偏及纪录 水的作用 产品组成 传送或运输产品 清洗产品 清洗消毒设施、工器具、容器和设备

制冰及镀冰衣 饮用 水源 水源: 城市供水 安全、优质、可靠 防止交叉连接、压力回流、虹吸管回流 自供水 井水 深度、周围环境（粪池、垃圾掩埋场） 水井内壁破坏 江湖水 上游不得有：化工厂、造纸厂、医院和城镇居民生活区等污染排放源 两种供水系统并存 水的安全(包括冰) 水的贮存 水塔 蓄水池 储水罐 清洗和消毒：方法、次数和记录 安全 水的安全(包括冰) 达不到卫生要求的水源，工厂要采取相应的消毒处理措施，主要有： 加氯处理 至少20分种 余氯浓度为0.05 --- 0.3 ppm(国标) 加氯消毒（氯气、氯胺、次氯酸钠、二氧化氯 常氯消毒：1-3mg/L, 30分钟，0.5-1ppm 超氯消毒：10倍于常氯，1-5ppm(严重污染） 水的处理 折点消毒：当水中有机物主要为氨和氮化物，其实际需氯量满足后，加氯量增加，余氯量增加，但是后者增长缓慢，一段时间后，加氯量增加，余氯量反而下降，此后加氯量增加，余氯量又上升，此折点后自由性余氯出现，继续加氯消毒效果最好，即折点加氯。原因：当余氯为化合性氯时，发生反应，使氯胺被氧化为不起消毒作用的化合物，余氯会逐渐减小，但一段时间后，消耗氯的杂质消失，出现自由性余氯时，随加氯量增加，余氯又会上升。利：当原水受严重污染，它能降低水的色度，去除恶臭，降低水中有机物含量，提高混凝效果。弊：水中有机污染物与氯生成三卤甲烷，必须预处理或深度处理。 臭氧消毒 紫外线消毒 生产加工用水的要求

洁净区沉降菌、浮游菌检测标准操作规程

1.目的：建立沉降菌、浮游菌检测的标准操作程序，用以规范检测操作。 2.范围：适用于公司内部生产洁净区内的沉降菌、浮游菌检测工作 3.责任：中心检验室主任、检验员对本规程的执行负责。 4.内容： 浮游菌检测 4.1.1 检测前的准备 4.1.1.1按照药典规定制作平皿培养基。 4.1.1.2领出检测仪器，去掉防尘护罩。 4.1.1.3先用喷洒方法对仪器及采样管进行消毒，无法喷洒的地方应用擦拭或 浸泡办法进行消毒，消毒后置放十分钟使仪器基本干燥。 4.1.1.4将采样器放在采样工作台面上，拧下采样盖，使整个缝隙完全暴露在 空气中，便于直接采样。 4.1.1.5当在较高位置取样时，可把仪器采样盖拧紧，插上采样塑料管，把管 子延伸到所要采样的空间。 4.1.1.6打开采样器透明外罩，迅速将准备好的平皿放入采样托盘内，拿去平 皿上盖，立即拧上透明外罩密封。 4.1.1.7拧松外罩顶部装有指针的螺母，让指针自然下落或使指针底部刚接触 到培养基为止。 4.1.1.8调节狭缝螺母，使狭缝上升直至到头，再反方向调节使狭缝面下降， 将齐狭缝大螺母侧面的色标线与指针于水平线上。（保持狭缝的底平面与培养基表面相距1-3mm）。

4.1.1.9将指针向上轻轻拔起，使其底部离开培养基表面，并拧紧螺母，使之 固定不动。 4.1.2 采样操作 4.1.2.1将采样器后面板上的电源插上，按下仪器面板上的电源开关，指示灯亮， 时间显示窗内的数码应为“P”。 4.1.2.2根据采样现场环境的洁净度，选择采样时间中的某一档，并按下相应按 钮，指示灯亮，数码由“P”显示为“Y”，约经10分钟后气泵自动开启进 行采样。当采样时间达到时，气泵自动停止运行，数码显示终点采样时间。 4.1.2.3关掉电源开关，打下仪器的活动透明外罩，迅速把平皿上盖盖上并从仪 器中取出。 4.1.2.4按照上述方法，再放入新的平皿，进行第二次采样，直到采样完毕。4.1.2.5采集样品的平皿应置入培养箱，在培养48小时后，按检验规程检查菌 落数。 4.1.2.6采样工作结束，关断仪器电源，将程序： 4.2沉降菌检测 4.2.1消毒φ90mm×15mm的硼硅酸玻璃培养皿。 4.2.2称取普通肉汤琼脂培养基31克，加蒸馏水1000ml，加热溶解分装，经 116℃30分钟灭菌备用。 4.2.3在无菌条件下将消毒的培养基注入培养皿中备用。 4.2.4放平板前应先洗手，穿消毒好的无菌衣、裤、帽、口罩。 4.2.5将已制备好的培养皿按净化级别要求选择放置位置和平皿块数。 4.2.6到车间打开培养皿盖，使培养基表面暴露，再将培养皿盖盖上后倒置。 4.2.7全部采样结束后，将培养皿倒置于恒温培养箱中培养。（温度30℃~35℃， 时间不少于48h）。 4.2.8每批培养基应有对照试验，可选2~3只培养皿作对照培养，以检验培养 基本身是否污染。

无菌检查法标准操作程序

1目的 建立一个无菌检查法标准操作程序，保证实验的准确性、可靠性。 2范围 适用于原料、辅料及成品的无菌检查。 3职责 微生物检验员遵照执行。 4内容 无菌检查法系用于检查药典要求无菌的药品、生物制品、医疗器具、原料、辅料及其他品种是否无菌的一种方法。若供试品符合无菌检查法的规定，仅表明了供试品在该检验条件下未发现微生物污染。 无菌检查应在无菌条件下进行，试验环境必须达到无菌检查的要求，检验全过程应严格遵守无菌操作，防止微生物污染，防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检出。单向流空气区、工作台面及环境应定期按医药工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法的现行国家标准进行洁净度确认。隔离系统应定期按相关的要求进行验证，其内部环境的洁净度须符合无菌检查的要求。日常检验还需对试验环境进行监控。 4.1 培养基 硫乙醇酸盐流体培养基主要用于厌氧菌的培养，也可用于需氧菌的培养；胰酪大豆胨液体培养基用于真菌和需氧菌的培养。 4.1.1 培养基的制备及培养条件 培养基可按以下处方制备，亦可使用按该处方生产的符合规定的脱水培养基或成品培养基。配制后应采用验证合格的灭菌程序灭菌。制备好的培养基应保存在2?25°C、避光的环境，若保存于非密闭容器中，一般在3 周内使用；若保存于密闭容器中，一般可在一年内使用。 4.1.1.1 硫乙酵酸盐流体培养基

胰酪胨15. 0g 氯化钠 2. 5g 酵母浸出粉 5. 0g 新配制的0. 1 % 刃天 无水葡萄糖 5.0g 青溶液 1.0ml L-胱氨酸0. 5g 琼脂0. 75g 硫乙醇酸钠0.5g 水1000ml (或硫乙醇酸）（0.3ml) 除葡萄糖和刃天青溶液外，取上述成分混合，微温溶解，调节p H 为弱碱性，煮沸，滤清，加入葡萄糖和刃天青溶液，摇匀，调节p H , 使灭菌后在25℃的p H 值为7.1 土0.2。分装至适宜的容器中，其装量与容器高度的比例应符合培养结束后培养基氧化层（粉红色)不超过培养基深度的1/2。灭菌。在供试品接种前，培养基氧化层的高度不得超过培养基深度的1/5，否则，须经100°C水浴加热至粉红色消失（不释过2 0分钟），迅速冷却只限加热一次，并防止被污染。 除另有规定外，硫乙醇酸盐流体培养基置30?35C培养。 4.1.1.2 胰酪大豆胨液体培养基 胰酪胨 1 7 . 0g 氯化钠 5.0g 大豆木瓜蛋白酶水解物 3. 0g 磷酸氢二钾 2. 5g 葡萄糖/无水葡萄糖 2. 5g/2. 3g 水1000m l 除葡萄糖外，取上述成分，混合，微温溶解，滤过，调节p H 使灭菌后在2 5℃的p H 值为7. 3±0. 2，加入葡萄糖，分装，灭菌。 胰酪大豆胨液体培养基置20?2 5 ℃培养。 4.1.1.3 中和或灭活用培养基 按上述硫乙醇酸盐流体培养基或胰酪大豆胨液体培养基的处方及制法，在培养基灭菌或使用前加入适宜的中和剂、灭活剂或表面活性剂，其用量同方法适用性试验。 4.1.1.4 0.5% 葡萄糖肉汤培养基(用于硫酸链霉素等抗生素的无菌检查） 胨 1 0 . 0g 氯化钠 5 . 0g 牛肉浸出粉 3 . 0g 水1000m l 葡萄糖 5. 0g 除葡萄糖外，取上述成分混合，微温溶解，调节p H 为弱碱性，煮沸，加入葡萄糖溶解后，摇匀，滤清，调节pH使灭菌后在25℃的p H 值为7. 2士0.2，分装，灭菌。 4.1.1.5 胰酪大豆胨琼脂培养基 胰酪胨15.0g 琼脂 1 5 . 0g