当前位置：文档库 › LC3

LC3

L A

N D

E S B I

O S

C I E

N C

E .

D O

O T D I S T

R I B U T E

Research Paper

LC3, an Autophagosome Marker, Can be Incorporated into Protein Aggregates Independent of Autophagy

Caution in the Interpretation of LC3 Localization

[Autophagy 3:4, 323-328; July/August 2007]; ?2007 Landes Bioscience

Akiko Kuma 1-3Makoto Matsui 2

Noboru Mizushima 1-3,*

1Department of Physiology and Cell Biology; Tokyo Medical and Dental University;

Tokyo, Japan

2Department of Bioregulation and Metabolism; The Tokyo Metropolitan Institute

of Medical Science; Tokyo, Japan

3SORST; Japan Science and Technology Agency; Kawaguchi, Japan

*Correspondence to: Noboru Mizushima; Department of Physiology and Cell Biology; Tokyo Medical and Dental University; 1-5-45 Yushima, Bunkyo-ku, Tokyo 113-8519 Japan; Tel.: +81.3.5803.5158; Fax: +81.3.5803.0118; Email: nmizu.phy2@tmd.ac.jp

Original manuscript submitted: 11/16/06Manuscript accepted: 02/12/07

Previously published online as an Autophagy E-publication:

https://www.wendangku.net/doc/3712181284.html,/journals/autophagy/abstract.php?id=4012

Key words

autophagosome, LC3, aggregate, polyQ, ubiquitin, senescence AbbreviAtioNs LC3 microtuble-associated protein light chain 3

PE phosphatidylethanolamine GFP green fluorescent protein MEF mouse embryonic fibroblast polyQ

polyglutamine

AcKNowledgeMeNts

We would like to thank Dr. A. Kakizuka (Kyoto University) for providing polyQ expression plasmids, and Dr. S. Sugano (The University of T okyo) for providing the SV40 large T expression plasmid. This work was supported in part by Grants-in-aid for Scientific Research from the Ministry of Education, Culture, Sports, Science and T echnology of Japan. The authors thank the Kato Memorial Bioscience Foundation, the T oray Science Foundation, and the Cell Science Research Foundation for financial support. The authors declare that they have no competing financial interests.

AbstrAct

Autophagy is an intracellular bulk degradation system, through which a portion of the cytoplasm is delivered to lysosomes to be degraded. Microtuble -associated protein light chain 3 (LC3), a mammalian homolog of yeast Atg8, has been used as a specific marker to monitor autophagy. Upon induction of autophagy, LC3 is conjugated to phosphati-dylethanolamine and targeted to autophagic membranes. Therefore, changes in LC3 localization have been used to measure autophagy. However, this method has some limitations. In this report, we show that LC3 protein tends to aggregate in an autophagy - independent manner when it is transiently overexpressed by transfection. In addition, LC3 is easily incorporated into intracellular protein aggregates, such as inclusion bodies induced by polyQ expression or formed in autophagy -deficient hepatocytes, neurons, or senescent fibroblasts. These findings demonstrate that punctate dots containing LC3 do not always represent autophagic structures. Therefore, LC3 localization should be carefully interpreted, particularly if LC3 is overexpressed by transient transfection or if aggregates are formed within cells.

iNtroductioN

Autophagy is a degradation pathway that delivers cytoplasmic materials to lysosomes via double-membraned organelles termed autophagosomes that enclose a portion of the cytoplasm.1 It has been determined that the primary role of autophagy in a variety of organisms is to adapt to nutrient starvation by producing amino acids.2 The absence of autophagy genes results in rapid death in yeast 3 and Dictyostelium discoideum under starvation conditions,4 early chlorosis in plants during starvation,5-7 defective dauer development in Caenorhabditis elegans ,8 and early neonatal lethality in mice following interruption of the transplacental nutrient supply.9,10 In addition to enhanced autophagy during starvation, basal autophagy is important for intracellular quality control in quies-cent cells. Mice lacking autophagy genes exhibit intracellular accumulation of protein aggregates in neurons and hepatocytes.10-12 Cells utilize the autophagy recycling system for both the constitutive removal of cytosolic proteins and organelles to maintain quality and nutrient supply under adverse conditions. Besides these fundamental roles, autophagy is thought to be involved in the degradation of intracellular bacteria, antigen presentation, tumor suppression, and cell survival and death.2,13-16

Recent progress in autophagy research has been led by the identification of a number of autophagy-related genes in the yeast, Saccharomyces cerevisiae .3,17 The nomenclature of these genes has been recently unified, and they have been termed ATG genes. Analyses of the Atg proteins have identified two ubiquitination-like conjugation systems required for autophagosome formation.18 One of these systems mediates the conjugation of Atg12 to Atg519 and the other mediates a covalent linkage between Atg8 and phosphatidylethanol-amine (PE).20

Most of the Atg proteins, including the two conjugation systems, are highly conserved in mammals. Among these proteins, Atg5 and LC3 (a mammalian homolog of Atg8) have been analyzed in detail. An Atg12-Atg5 conjugate is present on the outer side of the isolation membrane and is required for elongation of the isolation membrane.21 A PE-conjugated form of LC3 localizes on the isolation membrane and the autophagosome membrane.22,23 The unconjugated (LC3-I) and conjugated forms (LC3-II) of LC3 can be easily separated by SDS-PAGE. Because the amount of LC3-II correlates with the number of autophagosomes, immunoblotting of endogenous LC3 can be used to measure autophagic activity.22 In Atg5-/- embryonic stem cells, LC3-II is not detected.21 Another

A second important case of LC3 aggregation is incorporation into inclusion bodies. We have demonstrated that two different types of inclusion bodies, one formed by polyQ expression and the other induced by autophagy-defective conditions, can recruit GFP-LC3 and even endogenous LC3. We have recently identified another example of LC3 incorporation into a type of aggregate called aggresome-like induced structures (ALIS), which could be autophagy-independent.29 Therefore, this incorporation may be a general phenomenon. It is usually difficult to distinguish aggregate related GFP-LC3 dots from autophagosomes, even though the aggregated structures never exhibit the cup-shaped structure characteristic of authentic autophagosomes. This may represent a serious problem in experiments testing whether protein aggregates are sequestered by autophagosomes. Because the accumulation of misfolded proteins is considered to be the cause of cell degeneration in many neurodegenerative diseases, understanding the mechanisms by which cells eliminate these mutant or misfolded proteins is important. While human genetic studies have revealed a number of mutations in genes related to the ubiquitin-proteasome system, the involvement of autophagy in the pathogenesis of these diseases has been also suggested.30-32 However, our data imply that it would be difficult to address this question using the LC3 marker. T o demonstrate the direct sequestration of aggregates by autophago-somes, electron microscopic analysis will be required.

Our data suggest that LC3 itself could be an aggregation-prone protein, but another possible mechanism for LC3 dot formation is p62/sequestosome1-mediated incorporation into protein aggregates. Recently, it was demonstrated that p62/sequestosome 1, which is a common component of protein aggregates, can bind LC3.33 LC3 is the only protein to be identified on the inner and outer membranes of autophagosomes. Therefore, the LC3-p62/sequestosome1 inter-action may mediate selective recognition of protein aggregates by autophagosomes. Again, this hypothesis needs to be addressed by electron microscopy.

Our analyses have demonstrated that the requirement of autophagy for preventing intracellular protein aggregation differs among tissue and cell types (Fig. 3).11 Although the reason is unclear at the moment, one possible explanation is that intracellular quality control is not very important in rapidly dividing cells, in which damaged materials can be quickly diluted. Yeast atg mutant cells 3 as well as autophagy-deficient mammalian cells, such as Atg5-/- embryonic stem cells 21 and immortalized embryonic fibroblasts,9 do not exhibit significant abnormalities under normal conditions, despite the absence of low levels of constitutive autophagy. Basal autophagy may be more important in quiescent cells. This hypothesis is supported by our observations that senescent fibroblasts tend to form GFP-LC3 aggregates if autophagic activity is inhibited (Fig. 5). As autophagy is thought to exert an anti-aging function,8,34,35 our data provide additional information for this hypothesis.

In summary, our results emphasize that, although LC3 is a good marker for autophagosomes, it can also indicate protein aggregates, particularly if overexpressed by transient transfection or if aggregates are formed within cells. Under these conditions, LC3 localization should be interpreted with caution and the occurrence of autophagy should be examined with additional methods such as immunoelec-tron microscopy against GFP-LC3 or endogenous LC3. In any cases, use of GFP-LC3 stable transformants is preferred.

References

1. Mizushima N, Ohsumi Y, Yoshimori T. Autophagosome formation in mammalian cells. Cell

Struct Funct 2002; 27:421-9. 2. Mizushima N. The pleiotropic role of autophagy: From protein metabolism to bactericide.

Cell Death Differ 2005; 12:1535-41.

3. Tsukada M, Ohsumi, Y. Isolation and characterization of autophagy-defective mutants of

Saccharomyces cerevisiae . FEBS Lett 1993; 333:169-74.

4. Otto GP , Wu MY, Kazgan N, Anderson OR, Kessin RH. Macroautophagy is required for

multicellular development of the social amoeba Dictyostelium discoideum. J Biol Chem 2003; 278:17636-45.

5. Hanaoka H, Noda T, Shirano Y, Kato T, Hayashi H, Shibata D, Tabata S, Ohsumi Y.

Leaf senescence and starvation-induced chlorosis are accelerated by the disruption of an Arabidopsis autophagy gene. Plant Physiol 2002; 129:1181-93.

6. Doelling JH, Walker JM, Friedman EM, Thompson AR, Veirstra RD. The APG8/

12-activating enzyme APG7 is required for proper nutrient recycling and senescence in Arabidopsis thaliana . J Biol Chem 2002; 277:33105-14.

7. Yoshimoto K, Hanaoka H, Sato S, Kato T, Tabata S, Noda T, Ohsumi Y. Processing of

ATG8s, ubiquitin-like proteins, and their deconjugation by ATG4s are essential for plant autophagy. Plant Cell 2004; 16:2967-83.

8. Melendez A, Talloczy Z, Seaman M, Eskelinen EL, Hall DH, Levine B. Autophagy genes

are essential for dauer development and life-span extension in C. elegans . Science 2003; 301:1387-91.

9. Kuma A, Hatano M, Matsui M, Yamamoto A, Nakaya H, Yoshimori T, Ohsumi Y, Tokuhisa

T, Mizushima N. The role of autophagy during the early neonatal starvation period. Nature 2004; 432:1032-6.

10. Komatsu M, Waguri S, Ueno T, Iwata J, Murata S, Tanida I, Ezaki J, Mizushima N, Ohsumi

Y, Uchiyama Y, Kominami E, Tanaka K, Chiba T. Impairment of starvation-induced and constitutive autophagy in Atg7-deficient mice. J Cell Biol 2005; 169:425-34.

11. Hara T, Nakamura K, Matsui M, Yamamoto A, Nakahara Y, Suzuki-Migishima R,

Yokoyama M, Mishima K, Saito I, Okano H, Mizushima N. Suppression of basal autophagy in neural cells causes neurodegenerative disease in mice. Nature 2006; 441:885-9.

12. Komatsu M, Waguri S, Chiba T, Murata S, Iwata JI, Tanida I, Ueno T, Koike M, Uchiyama

Y, Kominami E, Tanaka K. Loss of autophagy in the central nervous system causes neuro-degeneration in mice. Nature 2006; 441:880-4.

13. Kirkegaard K, Taylor MP Jackson WT. Cellular autophagy: Surrender, avoidance and sub-version by microorganisms. Nat Rev Microbiol 2004; 2:301-14.

14. Münz C. Autophagy and antigen presentation. Cell Microbiol 2006; 8:891-8.

15. Levine B, Klionsky DJ. Development by self-digestion: Molecular mechanisms and biologi-cal functions of autophagy. Dev Cell 2004; 6:463-77.

16. Debnath J, Baehrecke EH, Kroemer G. Does autophagy contribute to cell death? Autophagy

2005; 1:66-74.

17. Klionsky DJ, Cregg JM, Dunn WA, Jr., Emr SD, Sakai Y, Sandoval IV, Sibirny A, Subramani

S, Thumm M, Veenhuis M, Ohsumi Y. A unified nomenclature for yeast autophagy-related genes. Dev Cell 2003; 5:539-45.

18. Ohsumi Y. Molecular dissection of autophagy: T wo ubiquitin-like systems. Nat Rev Mol

Cell Biol 2001; 2:211-6.

19. Mizushima N, Noda T, Yoshimori T, Tanaka Y, Ishii T, George MD, Klionsky DJ, Ohsumi

M, Ohsumi Y. A protein conjugation system essential for autophagy. Nature 1998; 395:395-8.

20. Ichimura Y, Kirisako T, Takao T, Satomi Y, Shimonishi Y, Ishihara N, Mizushima N, Tanida

I, Kominami E, Ohsumi M, Noda T, Ohsumi Y. A ubiquitin-like system mediates protein lipidation. Nature 2000; 408:488-92.

21. Mizushima N, Yamamoto A, Hatano M, Kobayashi Y, Kabeya Y, Suzuki K, Tokuhisa T,

Ohsumi Y, Yoshimori T. Dissection of autophagosome formation using Apg5-deficient mouse embryonic stem cells. J Cell Biol 2001; 152:657-67.

22. Kabeya Y, Mizushima N, Ueno T, Yamamoto A, Kirisako T, Noda T, Kominami E, Ohsumi

Y, Yoshimori T. LC3, a mammalian homologue of yeast Apg8p, is localized in autophago-some membranes after processing. EMBO J 2000; 19:5720-8.

23. Kabeya Y, Mizushima N, Yamamoto A, Oshitani-Okamoto S, Ohsumi Y, Yoshimori T. LC3,

GABARAP and GATE16 localize to autophagosomal membrane depending on form-II formation. J Cell Sci 2004; 117:2805-12.

Figure 5. GFP -LC3 aggregates are generated in senescent Atg5-/- MEFs. Primary MEFs prepared from Atg5+/+; GFP -LC3 or Atg5-/-; GFP -LC3 transgenic mice were passaged by the 3T9 protocol. At 10 passages, cells were seeded in glass dishes and analyzed by fluorescence microscopy. Scale bar, 20 m

24. Mizushima N. Methods for monitoring autophagy. Int J Biochem Cell Biol 2004;

36:2491-502.

25. Mizushima N, Yamamoto A, Matsui M, Yoshimori T, Ohsumi Y. In vivo analysis of

autophagy in response to nutrient starvation using transgenic mice expressing a fluorescent autophagosome marker. Mol Biol Cell 2004; 15:1101-11.

26. Hosokawa N, Hara Y, Mizushima N. Generation of cell lines with tetracycline-regulated

autophagy and a role for autophagy in controlling cell size. FEBS Lett 2006; 580:2623-9.

27. Ikeda H, Yamaguchi M, Sugai S, Aze Y, Narumiya S, Kakizuka A. Expanded polyglutamine

in the Machado-Joseph disease protein induces cell death in vitro and in vivo. Nat Genet 1996; 13:196-202.

28. T odaro GJ, Green H. Quantitative studies of the growth of mouse embryo cells in culture

and their development into established lines. J Cell Biol 1963; 17:299-313.

29. Szeto J, Kaniuk NA, Canadien V, Nisman R, Mizushima N, Yoshimori T, Bazett-Jones DP,

Brumell JH. ALIS are stress-induced protein storage compartments for substrates of the proteasome and autophagy. Autophagy 2006; 2:189-99.

30. Ravikumar B, Rubinsztein DC. Can autophagy protect against neurodegeneration caused

by aggregate-prone proteins? Neuroreport 2004; 15:2443-5.

31. Rubinsztein DC, Difiglia M, Heintz N, Nixon RA, Qin ZH, Ravikumar B, Stefanis L,

T olkovsky A. Autophagy and its possible roles in nervous system diseases, damage and repair.

Autophagy 2005; 1:11-22.

32. Rubinsztein DC. The roles of intracellular protein-degradation pathways in neurodegenera-

tion. Nature 2006; 443:780-6.

33. Bj?rk?y G, Lamark T, Brech A, Outzen H, Perander M, ?vervatn A, Stenmark H, Johansen

T. p62/SQSTM1 forms protein aggregates degraded by autophagy and has a protective effect on huntingtin-induced cell death. J Cell Biol 2005; 171:603-14.

34. Cuervo AM. Autophagy: In sickness and in health. T rends Cell Biol 2004; 14:70-7.

35. Bergamini E, Cavallini G, Donati A, Gori Z. The role of macroautophagy in the ageing

process, anti-ageing intervention and age-associated diseases. Int J Biochem Cell Biol 2004;

36:2392-404.

应用CRISPR技术制备ATG7基因Knockout的N2a细胞的试验研究宋

应用CRISPR 技术制备ATG7基因Knockout的N2a细胞的实验研究宋福永1小潘美贵2小松雅明2 1山东大学公共卫生学院卫生毒理学系，山东济南 250012 2 新泻大学医学部第一生化研究室，日本新泻 951-8510 （*通讯作者：宋福永，E-mail: fysong3707@https://www.wendangku.net/doc/3712181284.html,）摘要：【目的】Clustered regularly interspaced short palindromic repeats /CRISPR-associated 9 (CRISPR/Cas9) 技术是基因定点修饰的最新技术，它通过crRNA 和Cas 蛋白所形成的核蛋白复合物对靶基因的PAM和protospacer序列进行特异性识别，实现基因组的精确修饰。Neuro-2a (N2a) 细胞是小鼠神经瘤细胞，经诱导能分化成神经元样细胞，且对有机磷毒物具有良好的反应性，因此被作为评价有机磷神经毒性的首选细胞株。本研究拟利用CRISPR-cas 9技术制备ATG7基因Knockout 的自噬缺陷型N2a细胞，以便于深入地探讨细胞自噬与有机磷化合物的神经毒性之间的关系。【材料和方法】⑴设计合成1对ATG7 靶向序列（上链：TGTATGAGACCACGAAGTTGAACAGTACCGCC，下链：AAACGGCGGTACTCGTTCAACTTGTGGTCTCA）；⑵ATG7靶向引物变性与Cas9 smart Nuclease Vector的连接；⑶转染E. coli，提取质粒DNA测序验证；⑷将Cas9-ATG7质粒DNA、pBHR-Vector、FuGENE HD按比例混合，转染N2a细胞；⑸荧光显微镜观察N2a细胞GFP表达，利用嘌呤霉素筛选；⑹FACS流式细胞仪单细胞分选培养；⑺提取克隆细胞的DNA，PCR 扩增ATG7 (上游引物为TGTTTTGGTAGGCTGGTAAG；下游引物为CAATATAGAACGGATGCCCT，利用异源双链泳动分析(HMA)技术检测ATG7突变体；⑻将筛选的ATG7突变细胞培养，Western Blot检测ATG7表达，将筛选出的ATG7-/-细胞扩大培养；⑼利用饥饿诱导法验证自噬活性，即EBSS处理细胞4小时，提取细胞蛋白，Western Blot检测LC3的表达。【结果】⑴DNA测序：经DNA测序证实ATG7靶向序列插入到Cas9 smart Nuclease Vector，表明 Cas9-ATG7质粒构建成功。⑵ HMA检测：Cas9-ATG7质粒转染的N2a细胞经过嘌呤霉素筛选，流式细胞仪单细胞分选培养96孔板5个，2周内共生长出 126个细胞克隆中，经HMA检测发现57株ATG7突变细胞。⑶Western Blot检测ATG7表达：ATG7突变细胞扩大培养后，Western Blot检测发现有3株细胞不表达ATG7，即为ATG7-/-的N2a细胞。⑷细胞自噬活性鉴定：上述3株细胞经EBSS处理后，WB检测仅观察到LC3-Ⅰ，未观察到LC3-Ⅱ。在此基础上，我们又利用溶酶体抑制剂（E64d 和pepstatin A，EP）阻断自噬降解途径，进一步观察了细胞自噬流的影响，仍未观察到LC3-Ⅱ。实验结果证实上述3株细胞均为自噬缺陷型细

管理体系过程方法的概念和使用指南

最新国际质量管理文件管理体系过程方法的概念和使用指南 1 引言本文件为理解“过程方法”的概念、意图及其在ISO9000族质量管理体系标准中的应用提供指南。本指南也可用于其他管理体系采用过程方法，不论组织的类型和规模如何。本指南的目的是推动描述过程的方法的一致性，并使用与过程有关的术语。过程方法的目的是提高组织在实现规定的目标方面的有效性和效率。过程方法的好处有： ?对过程进行排列和整合，使策划的结果得以实现； ?能够在过程的有效性和效率上下功夫； ?向顾客和其他相关方提供组织一致性业绩方面的信任； ?组织内运作的透明性； ?通过有效使用资源，降低费用，缩短周期； ?获得不断改进的、一致的和可预料的结果； ?为受关注的和需优先安排的改进活动提供机会； ?鼓励人员参与，并说明其职责。 2 什么是过程？ “过程”可以定义为“将输入转化为输出的一组相互关联、相互作用的活动”。这些活动需要配置资源，如人员和材料。图1所示为通用的过程。

与其他方法相比，过程方法的主要优点是对这些过程间的相互作用和组织的职能层次间的接口进行管理和控制（在第4章中详细说明）。输入和预期的输出可以是有形的（如设备、材料和元器件）或无形的（如能量或信息）。输出也可能是非预期的，如废料或污染。每一个过程都有顾客和受过程影响的其他相关方（他们可以是组织内部的，也可以是外部的），他们根据其需求和期望规定所需要的输出。应通过系统进行收集数据、分析数据，以提供有关过程业绩的信息，并确定纠正措施或改进的需求。所有过程都应与组织的目标相一致，要规定所有过程都增值，与组织的规模和复杂程度相适应。过程的有效性和效率可通过内部和外部评审过程予以评审。 3 过程的类型可规定以下类型的过程 ——组织的管理过程。包括与战略策划、制定方针、建立目标、提供沟通、确保获得所需的资源和管理评审有关的过程。 ——资源管理过程。包括为组织的管理、实现、测量过程提供所需资源的所有过程。 ——实现过程。包括提供组织预期输出的所有过程。 ——测量、分析和改进过程。包括测量和收集业绩分析及提高有效性和效率的数据的那些过程，如测量、监视和审核过程，纠正和预防措施，它们是管理、资源管理和实现过程不可缺少的一部分。 4 过程方法的理解过程方法是一种对如何使活动为顾客和其他相关方创造价值进行组织和管理的有力方法。

全肠外营养药物使用指南

**市人民医院肠外营养药物使用指南全肠外营养（TPN）药物是经静脉途径供应患者所需的营养要素，包括热量（碳水化合物、脂肪乳）、必需和非必需氨基酸、维生素、电解质及微量元素，以抑制分解代谢、促进合成代谢，并维持细胞、器官结构与功能的需要。营养支持的适应症、肠外营养剂的选择、营养液的配制及输注方法、途径、护理都会影响患者的恢复治疗，因此，规范化的营养支持模式势在必行，从而避免在营养支持过程中发生不合理现象，最大程度保证为患者提供安全、合理、有效、经济的营养支持。一、肠外营养的适应证（一）重度营养风险或蛋白质-能量营养不良，经口或经肠道营养素摄入不足，且短期内（10～14天）无法恢复正常进食者。（二）胃肠功能障碍。（三）胃肠道梗阻、消化道瘘、短肠综合征。（四）重症活动期炎症性肠病，无法耐受肠内营养支持。（五）重症胰腺炎，肠内营养出现不良反应或热量供应不足时，须联合应用肠外营养。（六）重症胰腺炎，无法耐受肠内营养时。（七）放射性肠炎。

二、肠外营养的禁忌证

（一）严重水、电解质紊乱，酸碱平衡失调。（二）休克、器官功能衰竭终末期。（三）下列情况慎用肠外营养： 1、无明确治疗目的或已确定为不可治愈而盲目延长治疗者：如广泛转移的晚期恶性肿瘤伴恶病质的患者，生活质量差、任何治疗方法均无明显改善作用，此时肠外营养也无明显益处，反而会增加患者生理和经济负担。 2、胃肠道功能正常或有肠内营养适应证者：对接受肠外营养支持的患者，应注意观察胃肠道功能恢复情况，及时有肠外营养过渡到肠内营养。 3、患者一般情况良好，预计需要肠外营养少于5天者。 4、原发病需立即进行急诊手术者。 5、预计发生肠外营养并发症的危险性大于其可能带来的益处者。 6、心血管功能紊乱或严重代谢紊乱尚未控制或处于纠正期间。 7、脑死亡或临终或不可逆昏迷。三、TPN合理配方设计原则（一）静脉营养支持的模式是个体化给药，在配方上应突出个体化的特点。（二）TPN的配方没有统一的处方，处方设计应全面考虑，包括是否有使用TPN的指证、患者的年龄、性别、体重或体表面积及病情。

实验五荧光显微镜的使用和细胞的荧光染色

实验五荧光显微镜的使用和细胞的荧光染色【实验目的】掌握荧光显微镜的原理和使用；掌握生物材料荧光染色的原理和应用。【实验原理】吖啶橙（acridine orange，AO）是最经典的极灵敏的荧光染料，它可对细胞中的DNA和RNA同时染色而显示不同颜色的荧光。其激发峰为492nm，荧光发射峰为530nm（DNA）、640（RNA），它与双链DNA的结合方式是嵌入双链之间，而与单链DNA和RNA则由静电吸引堆积在其磷酸根上。在蓝光（502nm）激发下，细胞核发亮绿色荧光（约530nm），核仁和胞质RNA发橘红色荧光（>580nm）。吖啶橙的阳离子也可以结合在蛋白质、多糖和膜上而发荧光，但细胞固定阻抑了这种结合，从而主要显示DNA、RNA两种核酸。【实验用品】 1、器材荧光显微镜、牙签、载玻片、盖玻片、滴管、吸水纸。 2、试剂（1）0.1mol/l pH7.0 PBS液 A液：NaH2PO4·H2O 2.76g，加蒸馏水至100ml； B液：Na2HPO4·7H2O 5.36g，加蒸馏水至100ml；

取A液16.5ml＋B液33.5ml＋NaCl 8.5g，用蒸馏水稀释至100ml。（2）1%吖啶橙原液取0.1g吖啶橙加蒸馏水稀释至100ml（临用时配制0.01%吖啶橙染液：将1%吖啶橙原液用pH7.0 PBS溶液稀释10倍）。 3、材料口腔黏膜上皮细胞临时制片或人肝癌BEL-7402细胞爬片。【方法与步骤】（1）取口腔上皮细胞涂在干净载玻片上。（2）95%乙醇溶液固定5min。（3）滴加0.01%吖啶橙染液5min。（4）盖上盖玻片，吸水纸吸去盖玻片周围多余液体，镜下观察。【结果与观察】荧光显微镜下（选用蓝色激发滤片），可见含DNA的细胞核显示黄绿色荧光，含RNA的细胞质及核仁显示橘红色荧光体外培养的肝癌细胞吖啶橙荧光染色

正确使用手机的方法

正确使用手机的方法手机的广泛使用，使我们被罩在“电子雾”中，无处躲避。很多人都会有这种体会，打手机超过几分钟后，耳朵和脸部都会有发热的感觉。长时间使用手机会影响大脑的功能，造成记忆力减退、失眠，甚至会发生情绪的改变。个别人也可能因为神经细胞和神经胶质细胞的畸变形成恶性脑肿瘤。这样用手机危害大：年轻人爱煲电话粥许多年轻人有意无意的成为煲电话粥的一员，从大学生到社会上的白领阶层，煲电话粥可以说成为一种非常常见的事情。然而长时间的手机辐射会对大脑造成伤害。热心肠电话变细菌中转站有些人非常的热心肠，手机常常给别人使用，这样造成的后果就是手机变成细菌的中转站，成为各种病菌的乐园。大忙人接电话有些个大忙人，分秒中几百万，所以为了省事就侧着头接电话，长此以往必将危害脊椎，危害大脑，形成健康隐患。躲起来说悄悄话有些人打电话害羞，就爱躲到楼梯里避开大家打，可这样的往往让手机的辐射翻倍的增长，对自己的辐射更加厉害。聊到尽兴充电打有时候聊的尽兴了，会边充电边打，这样固然能很好的保持气氛，但对健康很不利打电话性急有些性急的人拨完号就开始把手机放在耳朵上，其实所有电话在接通状态时辐射都是非常厉害的，所以接电话不用性急。

用质量不好的手机有些人贪图小便宜用一些非常廉价的手机，这样的手机质量不好，接听电话时往往造成很大的辐射。正确使用手机的方法 1、在手机呼出时最好先将手机远离头部，以避免手机较大功率发射时对头部的辐射。 2、尽量减少每次使用手机的时间，以及每天使用手机的次数。在必须要较长时间通话时，应左右耳交替或者使用耳机更为科学。 3、当手机信号变弱时，手机会自动提高电磁波的发射功率，此时不要把耳朵紧贴手机。 4、不要在墙角处接打手机，建筑物角落的信号覆盖比较差，因此会在一定程度上使手机的辐射功率增大。基于同样道理，身处电梯等小而封闭的环境时，应慎打手机。 5、接打手机时不要随意走动,频繁移动位置会造成接收信号的强弱起伏，从而引发不必要的短时间高功率发射。

全肠外营养药物使用指南

全肠外营养药物使用指南 LG GROUP system office room 【LGA16H-LGYY-LGUA8Q8-LGA162】

（七）放射性肠炎。二、肠外营养的禁忌证（一）严重水、电解质紊乱，酸碱平衡失调。（二）休克、器官功能衰竭终末期。（三）下列情况慎用肠外营养： 1、无明确治疗目的或已确定为不可治愈而盲目延长治疗者：如广泛转移的晚期恶性肿瘤伴恶病质的患者，生活质量差、任何治疗方法均无明显改善作用，此时肠外营养也无明显益处，反而会增加患者生理和经济负担。 2、胃肠道功能正常或有肠内营养适应证者：对接受肠外营养支持的患者，应注意观察胃肠道功能恢复情况，及时有肠外营养过渡到肠内营养。 3、患者一般情况良好，预计需要肠外营养少于5天者。 4、原发病需立即进行急诊手术者。 5、预计发生肠外营养并发症的危险性大于其可能带来的益处者。 6、心血管功能紊乱或严重代谢紊乱尚未控制或处于纠正期间。 7、脑死亡或临终或不可逆昏迷。三、TPN合理配方设计原则（一）静脉营养支持的模式是个体化给药，在配方上应突出个体化的特点。

灌浆料是以高强度材料作为骨料以水泥作为结合剂辅以高

灌浆料是以高强度材料作为骨料，以水泥作为结合剂，辅以高流态、微膨胀、防离析等物质配制而成。它在施工现场加入一定量的水，搅拌均匀后即可使用。灌浆料具有自流性好，快硬、早强、高强、无收缩、微膨胀；无毒、无害、不老化、对水质及周围环境无污染，自密性好、防锈等特点。在施工方面具有质量可靠，降低成本，缩短工期和使用方便等优点。从根本上改变设备底座受力情况，使之均匀地承受设备的全部荷载，从而满足各种机械，电器设备（重型设备高精度磨床）的安装要求，是无垫安装时代的理想灌浆材料。型号根据流动度及早期强度分为H-40、H-60、C60、CGM灌浆料系列；客运专线支座灌浆料；特种灌浆料系列（防冻型、超早强型、超高强型,加固型，超细型，耐高温型等）。灌浆料技术特点早强,高强,大流动度(自流),无收缩,抗油渗参数 1、早强、高强：一天强度最高可达60MPa以上，设备安装完毕一天后即可运行生产。 2、自流态：现场只需加水搅拌后，直接灌入设备基础，不需震捣便可填充设备基础的全部空隙。 3、微膨胀：保证设备与基础紧密接触，基础与基础之间无收缩，并适当的膨胀压应力确保设备长期安全运行。 4、无锈蚀作用：对钢筋、钢板等无锈蚀危害。 5、抗油渗：在机油中浸泡30天后其强度比浸油前提高10%以上。成型体、密实、抗渗、适应机座油污环保。 6、耐久性：200万次疲劳实验，50次冻融循环实验强度无明显变化。 7、耐候性好-40℃～600℃长期安全使用。 8、低碱耐蚀严格控制原材料碱含量，适用于碱-集料反应有抑制要求的工程。用途

灌浆料主要用于：地脚螺栓锚固、飞机跑道的抢修、核电设备的固定、路桥工程的加固、机器底座、钢结构与地基杯口、设备基础的二次灌浆、栽埋钢筋、混凝土结构加固和改造、旧混凝土结构的裂缝治理，机电设备安装，轨道及钢结构安装，静力压桩工程封桩，建筑加固，梁柱截面加大、墙体结构的加厚及漏渗水的修复，各种基础工程的塌陷灌浆以及各种抢修工程等。影响因素灌浆料的强度的决定因素主要是配合比，水灰比，骨料，外加剂，密实度以及后期的养护等。原材料 1 水泥宜采用硅酸盐水泥或普通硅酸盐水泥，且符合GB 175的规定。采用其它水泥时应符合相应的标准要求。 2 细骨料应符合G B/T 14684规定的I类天然砂或人工砂。 3 混凝土外加剂混凝土外加剂应符合GB 8076及JC4 76的规定。 4 其它材料 GB/T50448-2008 应符合相关标准要求灌浆料配合比通过合理的配合比设计，使灌浆料的强度更高。灌浆料水灰比

吖啶橙荧光染色法

吖啶橙荧光染色法【实验原理】吖啶橙(acridine orange, A0)是最经典的极灵敏的荧光染料，它可对细胞中的DNA和RNA同时染色而显示不同颜色的荧光。其激发峰为492nm，荧光发射峰为530nm (DNA )、640 ( RNA )，它与双链DNA 的结合方式是嵌入双链之间，而与单链DNA和RNA则由静电吸引堆积在其磷酸根上。在蓝光( 502nm) 激发下，细胞核发亮绿色荧光(约530nm)，核仁和胞质RNA发橘红色荧光(>580nm)。吖啶橙的阳离子也可以结合在蛋白质、多糖和膜上而发荧光，但细胞固定阻抑了这种结合，从而主要显示DNA、RNA两种核酸。【实验用品】 1、器材荧光显微镜、牙签、载玻片、盖玻片、滴管、吸水纸。 2、试剂 (1)0.1mol/l pH7.0 PBS 液 A 液：NaH2PO4?H2O 2.76g，加蒸馏水至100ml; B 液：Na2HPO4 ? 7H2O 5.36g，加蒸馏水至100ml; 取A 液16.5ml + B 液33.5ml + NaCl 8.5g，用蒸馏水稀释至100ml。 (2)1%吖啶橙原液取0.1g吖啶橙加蒸馏水稀释至100ml (临用时配制0.01%吖啶橙染液：将1%吖啶橙原液用pH7.0 PBS溶液稀释10倍)。 3、材料口腔黏膜上皮细胞临时制片或人肝癌BEL-7402细胞爬片。 (1 )取口腔上皮细胞涂在干净载玻片上。 (2)95%乙醇溶液固定5min。 (3)滴加0.01%吖啶橙染液5min。 (4)盖上盖玻片，吸水纸吸去盖玻片周围多余液体，镜下观察。【结果与观察】荧光显微镜下(选用蓝色激发滤片)，可见含DNA的细胞核显示黄绿色荧光，含RNA的细胞质及核仁显示橘红色荧光【注意事项】 (1 )制片后一定要晾干玻片，在进行后续步骤，否则会导致细胞脱落。 (2)每种荧光染料，均有自己的最适pH,此时荧光最强。当pH改变时，不仅荧光强度减弱，而且波长将有所改变，因此荧光检测时要在一定的pH缓冲液中进行。

正确使用说明的方法

恰当使用说明的方法一、教学目标 1．掌握几种最常见的说明方法。 2．学会运用恰当的说明方法写说明文。二、教学重点教师讲解和学生讨论、训练相结合。三、教学过程（一）导入新课师：同学们，现在假设你们面前有一条河，大家到河对岸去，应该怎么去? 生：从桥上走过去。趟过去。乘船…… 师：对，大家的方法都很好!但究竟是趟河、是过桥还是乘船呢?这就要根据情况来选择。比如现在是夏天，河水也很浅，你就可以趟过去。但如果河水很深，而河上又没有桥，那你就只有乘船了。总之，到河的对岸，这是我们的目的。现在，如果我把“过河”比作说明的目的，那么我们过河的各种方法就是说明方法。大家想—想：我们写说明文的目的是什么? 生：是为了把事物特征说清楚，或者把事理阐述明白。师：对!为了达到这个目的，我们在写说明文时就必须运用恰当的说明方法。(板书) （二）讲授新课师：现在大家回忆一下，我们学过的说明方法有那些? 生：举例子、打比方、列数据、下定义、作比较、作诠释、分类别、摹状貌、画图表。(教师板书) 师：对!那么我们经常用到的说明方法有那些呢? 生：举例子、打比方、列数据。师：那么，谁能告诉我，“恰当”是什么意思?(指导学生查字典，回答) 生：恰当，是能够恰如其分的说明事物或事理。师：对!我们写说明文，就是要根据说明对象和写作目的，选用最佳的方法。比如刚上课时为了让大家明白说明方法的重要，我就采用了打比方的说明方法。好，现在大家打开书，回忆一下我们学过的《中国石拱桥》、《万紫千红的花》这两课，看作者都运用丁那些恰当的说明方法。 (学生分组讨论) 生：《中国石拱桥)说“石拱桥的桥洞成弧形，就像虹”，是打比方；说卢沟桥“桥长265米，由11个半圆形的石拱组成，每个石拱长度不一。自16米到21．6米”，是列数据：说桥上的石狮子“有的母子相抱，有的交头接耳，有的像倾听水声，千态万状，惟妙惟肖”，是摹状貌。师：《万紫千红的花》举了很多大家熟悉的例子，用图表来说明。如果不用这些说明方法行不行?

自噬监测——LC3双标腺病毒(完整版)

自噬双标腺病毒（mRFP-GFP-LC3）使用指南 1 自噬双标腺病毒（mRFP-GFP-LC3）使用指南背景：自噬是细胞内的一种“自食（Self-eating ）”的现象，凋亡是“自杀（Self-killing ）”的现象，二者共用相同的刺激因素和调节蛋白，但是诱发阈值和门槛不同，如何转换和协调目前还不清楚. 自噬是指膜（目前来源还有争议，大部分表现为双层膜，有时多层或单层）包裹部分胞质和细胞内需降解的细胞器、蛋白质等形成自噬体，最后与溶酶体融合形成自噬溶酶体，降解其所包裹的内容物，以实现细胞稳态和细胞器的更新。目前文献对自噬过程进行观察和检测常用的策略和手段有：通过western blot 检测LC3的剪切；通过电镜观测自噬体的形成；在荧光显微镜下采用GFP （-RFP ）-LC3等融合蛋白来示踪自噬体形成以及降解。近几年对自噬流的研究日趋增多，针对于此我们汉恒生物科技（上海）有限公司自主研发了用于实时监测自噬(流) 的mRFP-GFP-LC3腺病毒，mRFP 用于标记及追踪LC3，GFP 的减弱可指示溶酶体与自噬小体的融合形成自噬溶酶体，即由于GFP 荧光蛋白对酸性敏感，当自噬体与溶酶体融合后GFP 荧光发生淬灭,此时只能检测到红色荧光。这种串联的荧光蛋白表达载体系统直观清晰的指示了细胞自噬流的水平，是我们自噬研究尤其是自噬流研究不可或缺的利器。

mRFP-GFP-LC3腺病毒的操作收到病毒后的处理（一）、腺病毒的储存 1、腺病毒采用冰袋运输。（1）、收到病毒液后如未融化请置于-80℃冰箱，下次使用时再进行分装；（2）、如客户收到时腺病毒已融化，请直接分装后置于-80℃冰箱保存；若短期内用于实验，可分装部分于4℃保存（尽量一周内用完）。 2、尽量避免反复冻融，否则会降低病毒滴度（每次冻融会降低病毒滴度10%）。建议不要在-20℃下长期保存。如果病毒储存时间超过6个月，应该重新测定病毒滴度。 3、建议收到病毒产品后根据实验需求自行分装或购买经过分装的小包装病毒产品（购买时请提出）。（二）、腺病毒的稀释需要稀释病毒时，将病毒取出后置于冰上融解，使用培养目的细胞用PBS 或培养基稀释到所需浓度后混匀分装后4℃保存，并尽快用于实验（尽量一周内用完），动物实验建议使用注射用平衡液来稀释，并尽快用完。感染目的细胞 2

国家基本药物临床应用指南

《国家基本药物临床应用指南》和《国家基本药物处方集》培训大纲一、2012年版《国家基本药物临床应用指南》（化学药品和生物制品）（一）培训目标。掌握各系统、章节疾病概述、诊断要点、药物治疗和注意事项等内容，以及基层常见病、多发病和需要现场及时抢救的急诊与危重症应用基本药物的处理。熟悉较为复杂疾病应用基本药物的初步处理。了解复杂或疑难疾病应用基本药物的有关处理。（二）授课学时及重点内容。 1．第一章急诊及危重症和第十一章急性中毒掌握：猝死和心肺复苏、高血压危象、急性左心衰、动物咬蜇伤、中暑、淹溺、电击伤、鼠药中毒、有机磷杀虫剂中毒、急性酒精中毒。熟悉：休克、破伤风、亚硝酸盐中毒、苯二氮卓类中毒。了解：糖尿病急性病发症、氰化物中毒、阿片类药物中毒、瘦肉精中毒。 2．第二章感染性疾病掌握：上呼吸道病毒感染、流行性感冒、急性化脓性扁桃体炎、急性气管支气管炎、慢性支气管炎急性加重、社区获得性肺炎、急性膀胱炎、肾盂肾炎、细菌性食物中毒、细菌性痢疾、猩红热、肠道寄生虫病。熟悉：化脓性脑膜炎、流行性脑脊髓膜炎、病毒性肝炎、伤寒和副伤寒、霍乱、阿米巴病、败血症、百日咳、钩端螺旋体病、血吸虫病、华支

睾吸虫病、肺吸虫病。了解：急性脓胸、肺脓肿、感染性心内膜炎、新型隐球菌脑膜炎、结核性脑膜炎、流行性乙型脑炎、流行性出血热、布鲁菌病、炭疽、黑热病、绦虫病、囊虫病、包虫病。 3．第三章呼吸系统疾病掌握：支气管哮喘、慢性阻塞性肺病、支气管扩张症、咯血。熟悉：慢性肺源性心脏病、急性呼吸衰竭。了解：肺血栓栓塞症。 4．第四章消化系统疾病掌握：急性胃炎、慢性浅表性胃炎、慢性萎缩性胃炎、胆汁返流性胃炎、胃食管返流病、消化性溃疡、便秘、肠易激综合征、功能性消化不良、急性胰腺炎、消化道出血。熟悉：药物性肝病、肝硬化、酒精性肝病、溃疡性结肠炎、慢性腹泻。了解：食道喷门粘膜撕裂综合征、应激性溃疡、幽门梗阻、非酒精性脂肪性肝病、慢性胰腺炎。 5．第五章心血管系统疾病掌握：高血压病、冠心病、风湿性心脏病。熟悉：高血压心脏损害、高血压肾脏损害、心脏神经症、心力衰竭。了解：心肌病、心包炎、心肌炎。 6．第六章血液系统疾病掌握：缺铁性贫血、过敏性紫癜、血友病。

铝酸盐水泥性能与作用

高铝水泥性能及其作用一. 前言高铝水泥和硅酸盐水泥都是属于水硬性水泥，前者的主要矿物组成是铝酸钙，后者的主要矿物组成是硅酸钙，由于矿物组成的不同，水泥的特性也不相同。早在十九世纪后半页，法国由于海水和地下水对混凝土结构侵蚀破坏事故的频繁发生，一度成为土木工程上的重大问题，法国国民振兴会曾以悬赏金鼓励为此做贡献者。研究者们发现，合成的铝酸钙具有水硬性，并对海水和地下水具有抗侵蚀能力。1908年，法国拉法基采用反射炉熔融法生产成功高铝水泥并取得专利，解决了海水和地下水工程的抗侵蚀问题。在实际使用中还发现了高铝水泥有极好的早强性，在第一次世界大战期间，高铝水泥被大量用来修筑阵地构筑物。20世纪20年代以后，逐渐扩展到工业与民用建筑。到30年代初，在法国本土及其非洲殖民地区的一批高铝水泥混凝土工程不断出现事故，诸多研究工作者遂着手深入进行该水泥的水化硬化机理和以强度下降为中心的耐久性研究，发现高铝水泥的水化产物因发生晶形转变而使强度降低。此后，在结构工程中的应用都比较慎重。而主要发展了在耐热、耐火混凝土和膨胀水泥混凝土中的应用。20世纪八十年代以后，不定形耐火材料在耐火材料行业中的比例迅速增加，高铝水泥作为结合剂的用量也日益增加。中国的高铝水泥，在建国初期为国防建设需要而开始立项研制，并开创性的采用回转窑烧结法生产高铝水泥，产品主要用作耐火浇注料的结合剂，以及配制自应力水泥、膨胀剂等。也成功的应用于火箭导弹的发射场地等国防建设和抢修用水泥。近年来，随着化学建材的迅速兴起，高铝水泥作为硅酸盐水泥凝结硬化时间的调节添加剂已愈来愈被材料工作者重视，并将成为化学建材的重要原材料之一。其用量将大大超过耐火材. 二. 高铝水泥的制造方法与化学矿物组成高铝水泥的制造方法主要有以下几种： 2.1 回转窑烧结法由于中国的矾土含铁量较低，因此具有较宽的烧结温度范围，比较适合用回转窑烧结法生产。回转窑烧结法采用烟煤作燃料，具有生产成本低、生产效率高、质量容易稳定的特点，在中国被广泛采用。回转窑烧结法的要点是：选用优质矾土和优质石灰石为原料，按一定比例配合送入球磨机，粉磨成生料，然后进入回转窑进行烧结，烧成的熟料经球磨机粉磨成细粉即成为高铝水泥。当选用工业氧化铝和优质石灰石为原料时，采用天然气和柴油或重油等无灰燃料可生产出白色的纯铝酸钙水泥。由于其杂质含量低，广泛用来配制高档耐火浇注料，同时由于其颜色为白色，已将它与白色硅酸盐水泥混合用于化学建材中需要装饰效果的场合。回转窑烧结法的组分设计一般在Al2O3－CaO－SiO2三元相图中的CA－CA2－C2AS 三角形内，生料在回转窑的烧结过程中，首先通过固相反应形成CA矿物，由于石灰石在分解后具有较高的反应活性，因此会局部出现少量C12A7矿物，但随着温度的提高，矾土中的Al2O3和SiO2的反应速度加大，熟料中的矿物会逐渐按设计组成达到相平衡，最终C12A7消失，熟料矿物主要矿相为CA，其次为CA2和C2AS，以杂质存在的Fe2O3和TiO2,形成C2F和CT。因此，用回转窑烧结法生产的高铝水泥，在煅烧状态较好的情况下，不会存在C12A7（这也是化学建材用高铝水泥中不希望存在的矿物）。用回转窑烧结法生产化学建材用高铝水泥，其配料成分的稳定控制、烧成制度的严格掌握和稳定水泥的矿相组成，十分重要。 2.2 电弧炉熔融法用矾土和石灰质原料，按设计成分计算配合比混合，用电弧炉进行熔化，在控制冷却的

自噬研究方法

MDC:取12 mg粉末溶于720 nl DMSO使其浓度为50 mmol/L,分装后-20冰箱保存。临用前用MEM稀释到终浓度50 umol/L; Rapamycin:用MEM培养基配成终浓度为1 umol/L,现用现配; 400ng/ml喹乙醇:称取4 mg喹乙醇,DMSO预溶(体积<0.1%)后加入10 ml MEM培养液至完全溶解,现用现配,避光保存; 3-MA:首先用PBS溶解粉末,临用前加热至完全溶解后再加入MEM培养基至终浓度10mmol/L; PI3K抑制剂（3-MA，Wortmannin）可干扰或阻断自噬体的形成用RAPAMYCIN诱导自噬我也查过一部分文献，有用无血清的，也有用，一般培养基的，浓度从25nM到100nM都有，用的是50nM的雷帕霉素，加入一般的培养基中，目的是排除无血清所诱导出来的自噬。文献说饥饿初期激活的是大分子自噬，在4-6小时活力达到最大，24h后以CMA途径为主Earle's balanced salts solution (EBSS) for 48 h sigma的EBSS，货号E2888，有碳酸氢钠，有酚红的，酚红到不是很必须，只是一个PH指示作用，好看些无血清诱导自噬：EBSS 诱导6个小时就可以了。 EBSS一定可以诱导出来，只是需要说明的是时间点的设置，因为从饥饿诱导开始半个小时就可能开始自噬了，一直到24小时都持续，所以应该设置不同的时间点观察这个作用。另外一个很大的问题是，饥饿诱导的一个很大的弊端是细胞死亡，这也是我面临的问题，就是在细胞收养的时候蛋白浓度太小了。24小时就很少了，更不要说48小时和72小时了 Hank's诱导，也就是通常所说的饥饿诱导，细胞培养到对数生长期后以Hank's替代常规完全培养基，3h后就可诱导出自噬。我用Hank's诱导了3h后电镜观察有30%细胞都有自噬这种现象，但不如国外报道的高。 sigma的氯喹的货号C6628。用氯喹做自噬抑制剂，293T细胞50uM就可以。1. 可以用双蒸水配制2. 配制后4度保存不同的自噬抑制剂机制不同。抑制的步骤也不同。有的不能抑制lc3的剪切，但能抑制后续的步骤，Chloroquine抑制自噬体与溶酶体的融合过程，autophgy不能完成，所以lc3才会累积。因此加了抑制剂lc3之后会比不加的要高。氯喹能提高溶酶体中的pH值，使溶酶体中的酸性水解酶丧失活性，从而导致“自噬溶酶体”不能降解，因此，位于自噬体和自噬溶酶体膜上的LC3不能按时降解，表现为LC3荧光长时间的保留或WB中LC3条带变粗。 Z-VAD-FMK（caspase-3 抑制剂）抑制EV71感染所引起的细胞凋亡，观察细胞的自噬情况。研究发现，抑制细胞凋亡能增加LC3-I转化为LC3-II以及p62的降解。 1. 雷帕霉素：作为以mTOR 为靶点最经典的诱导剂已经被广为应用，推荐工作浓度为1μmol-10μmol； 2. 氯喹：氯喹（Chloroquine）作为溶酶体的抑制剂，可以抑制自噬体与溶酶体的融合从而可以用来作为自噬以及自噬流的抑制剂用于实验研究，推荐使用浓度：10umol-50umol。正常培养的细胞自噬活性很低，不适于观察，因此，必须对自噬进行人工干预和调节，经报道的

半天工程序操作指南

一．实名登记完整流程二．半天工程序操作指南（一）主页（功能简介）半天工程序了实现工地现场的务工人员实名登记管理、实名考勤管理、工资发放信息公示和其他系统管理功能。（二）专户信息登记 1.管理工程左键单击【专户信息登记】→【管理工程】，点击项目名称左边的图标，可查看项目专户信息，该信息不可更改，如需更改请联系半天工客服人员。

2.基本信息左键单击【专户信息登记】→【基本信息】，可填写项目的基本信息。注意：请程序操作人员（劳资专管员）正确填写本人身份证号，同时关注半天工微信公众号，在微信号内绑定个人身份证号码即可接收工人登记信息提醒。 3.微信用户管理左键单击【专户信息登记】→【微信用户管理】，填写人员身份证信息，添加多个微信用户，关注微信公众号并绑定后即可接收工人登记信息提醒。（三）实名登记管理注意：务工人员实名制登记时，请严格按照【用工单位登记】→【务工班组登记】→【务工人员实名制进场登记】的顺序来操作。 1. 用工单位管理

左键单击【实名登记管理】→【用工单位管理】，填写用工单位信息。 2. 务工班组登记左键单击【实名登记管理】→【务工班组登记】，添加务工班组信息（请准确选择务工班组所属企业）。如需删除或修改务工班组信息，请点击班组名称左边图标进行编辑操作。 3. 务工人员实名制进场登记注意：务工人员实名制登记进场有两种操作方法，一是在【实名登记管理】→【务工人员实名制进场登记】界面进行人员进场登记，二是在【实名登记管理】→【工人花名册】界面进行人员进场登记。这里先介绍第一种方法，第二种方法在下面会介绍。（1）左键单击【实名登记管理】→【务工人员实名制进场登记】，点击左侧的[全部班组] →[xxx单位] →[xxx班组]，然后点击右侧的[进场登记]，开始进场登记操作。

临床诊疗指南及药物临床应用指南.doc

临床诊疗指南及药物临床应用指南 1、社区获得性肺炎的诊断及治疗 2、扁桃体炎治疗指南 3、成人水痘的症状和治疗 4、急性阑尾炎诊疗规范 5、流行性腮腺炎诊断标准 6、带状疱疹治疗指南 7、丹毒诊治指南 8、皮肤感染指南 9、上消化道出血 10、抗菌药物的合理应用 11、激素的使用

社区获得性肺炎诊断和治疗指南中华医学会呼吸病学分会社区获得性肺炎(community-acquired pneumonia,CAP)是指在医院外罹患的感染性肺实质(含肺泡壁，即广义上的肺间质)炎症，包括具有明确潜伏期的病原体感染而在入院后潜伏期内发病的肺炎。CAP是威胁人类健康的常见感染性疾病之一，其致病原的组成和耐药特性在不同国家、不同地区之间存在着明显差异，而且随着时间的推移而不断变迁。近年来，由于社会人口的老龄化、免疫损害宿主增加、病原体变迁和抗生素耐药率上升等原因，CAP的诊治面临许多新问题。最近，中华医学会呼吸病学分会完成了两项较大样本的全国性CAP流行病学调查，在此基础上，结合国外CAP诊治方面的最新研究进展，对1999年制定的《社区获得性肺炎诊断和治疗指南(草案))进行了适当修改，旨在指导临床建立可靠的诊断，全面评估病情，确定处理方针，改善预后，尽量避免不恰当的经验性治疗，减少抗生素选择的压力，延缓耐药，节约医药卫生资源。一、CAP的临床诊断依据 1.新近出现的咳嗽、咳痰或原有呼吸道疾病症状加重，并出现脓性痰，伴或不伴胸痛。 2.发热。 3.肺实变体征和(或)闻及湿性啰音。 4.WBC>10×109/L或<4×109/L，伴或不伴细胞核左移。 5.胸部X线检查显示片状、斑片状浸润性阴影或间质性改变，伴或不伴胸腔积液。以上1～4项中任何1项加第5项，并除外肺结核、肺部肿瘤、非感染性肺间质性疾病、肺水肿、肺不张、肺栓塞、肺嗜酸性粒细胞浸润症及肺血管炎等后，可建立临床诊断。二、CAP的病原学诊断 1.病原体检测标本和方法：见表1。 2.痰细菌学检查标本的采集、送检和实验室处理：痰是最方便且无创伤性的病原学诊断标本，但痰易被口咽部细菌污染。因此痰标本质量的好坏、送检及时与否、实验室质控如何将直接影响细菌的分离率和结果解释，必须加以规范：(1)采集：尽量在抗生素治疗前采集标本。嘱患者先行漱口，并指导或辅助其深咳嗽，留取脓性痰送检。无痰患者检查分枝杆菌和肺孢子菌可用高渗盐水雾化吸人导痰。真菌和分枝杆菌检查应收集3次清晨痰标本；对于通常细菌，要先将标本进行细胞学筛选。对于厌氧菌、肺孢子菌，采用支气管肺泡灌洗液(BALF)标本进行检查的

结合实例探析水泥混凝土路面施工技术应用

结合实例探析水泥混凝土路面施工技术应用发表时间：2013-01-08T14:00:14.763Z 来源：《建筑学研究前沿》2012年11月Under供稿作者：钱涛[导读] 水泥混凝土路面在道路工程中应用较为广泛且施工质量直接影响着道路行车安全。钱涛石林彝族自治县地方公路管理段摘要：水泥混凝土路面在道路工程中应用较为广泛且施工质量直接影响着道路行车安全。通过结合水泥混凝土路面施工实例，提出其施工技术以及冬季施工可采取的有效施工方法，都可以在为同类工程提供参考借鉴。关键词：路面施工；选材；技术应用 1 材料选取工程的材料选取需要从以下几个方面考虑： ①水泥鉴于水泥混凝土路面中水泥在工程施工中的重要性，本工程中的水泥主要从上级指定的中标单位水泥厂购进。同时，由于本公路工程的水泥需求量大，采用仓库进行库存而且指定专人进行保管，另外，还对水泥采取专门的防水措施，坚决做到防水、防潮，对每次购进的水泥进行分堆存放，以免部分水泥库存时间过长，对于失效的水泥坚决不用； ②碎石本工程在碎石选取上，选用级配良好，颗粒均匀、坚硬，同时还确保针片状颗粒≤15%，压碎值<16%，含泥量≤1%，设专人验质收方，不符合要求的碎石坚决不准进场并堆放整齐； ③砂对于砂的选取,要求选用级配良好，而且要确保砂的细度模量在2.5以上，含泥量≤3%，同时也设专人验质收方，同时对材料进行整齐堆放，不符合要求的材料不允许进入场地； ④钢材钢筋要在指定的地点购进加工，对钢筋采用堆放于仓库，做到防水、防锈、防盗，堆放地用木头垫衬，同时用油布包裹，保证不变形、不锈蚀； ⑤水水泥混凝土路面施工所采用的水以饮用水或不含有机物且pH值大于4的干净水进行拌和。 2 水泥混凝土路面施工实施在浇筑水泥混凝土面板之前必须先对公路基层进行检查和整修，考虑到公路的通行能力和车流量，一般情况下普遍采用天然砂砾料进行路基调型处理，然后进行级配碎石基层处理，以保证基层稳定性及强度，减少对上部结构产生的负作用。同时，应当在混凝土铺筑前对基层表面进行洒水润湿，以有效避免干燥的基层吸收混凝土底部的水分，而造成混凝土路面的疏松或产生裂缝。 2.1 模板安装施工本工程为有效保持混凝土面板在线形及外形上的美观性，同时防止路面出现歪斜和不平的现象，使面板的边线齐、厚度准，施工中采取的模板安装必须接头平顺，几何尺寸准确，而且确保不漏浆，支架能承受所加荷载而不出现变形问题。另外，在浇筑混凝土前，在模板内侧涂润滑剂有助于拆模。 2.2 直径25cm传力杆钢筋安设在胀缝处设有传力杆时，需要在胀缝处模板的下部挖出缺口以使传力杆穿过。施工的同时也将胀缝填缝板打孔，穿过传力杆，并将填缝板紧靠胀缝模板立好，其上放置压缝板。施工中为了有效地防止混凝土浇筑过程中传力杆发生移动，采取两根直径14mm～16mm的钢筋将同一胀缝所有传力杆两端与其绑扎起来，在钢筋下垫以支架或混凝土垫块若干只，结合工程实践，值得注意的是在施工工作缝中也要安设传力杆。 2.3 砼配料本道路半成品混凝土混合料的拌和及运输采用50型强制式搅拌机混凝土拌和站方式集中拌和，用人工推斗车上原材料。各种原材料进行拌和时，水泥与砂砾、碎石料按重量比例掺配，水也以重量比加入，砂砾在进入料斗前最大粒径应不超过40mm，级配碎石最大粒径不应超过31.5mm，水泥自始至终均匀分布于材料中。 2.4 砼拌和混凝土的正确装料顺序为：砂→水泥→碎石或碎石→水泥→砂，进料后边搅拌边加水。拌和过程中，必须根据配合比严格掌握水灰比，确保每次拌和时间不少于90s，拌和机内死角中得不到充分搅动的材料将及时进行排除，同时应当将各种组合材料拌和成分布均匀、颜色一致的混合大于最佳含量1.0%～1.5%，以有效地补偿运输和摊铺过程中水份的损失。而且为了确保混凝土拌和资料，在料场设专职安全员一名，确保拌和场正常生产。 2.5 砼运输从加水拌和到砼从搅拌机中倒出后，利用5台农用车保证出料、摊铺正常工作。在运输过程中应尽量避免中途停车或颠簸，确保混合料的延迟时间并不产生离析现象。 2.6 摊铺本混凝土路面采用人工摊铺的方式进行混凝土摊铺，摊铺过程中，必须要摸清施工进度和摊铺速度，确保摊铺的平整度，要尽量缩短摊铺时间，避免混合料出现离析现象。 2.7 振捣对摊铺好的混凝土混合料，应当迅速采用插入式振捣器和平板振捣器均匀地进行振捣。平板振捣器的有效作用深度一般为22cm左右。插入式振捣器主要用于振捣面板，在边角部、窨井、井水口附近及已经安设钢筋的部位。混凝土混合料振捣时,施工人员在模板边缘角隅等平板振捣器不到之处用插入式振捣器振捣一次以上（如面板厚度大于22cm，则需用插入式振捣器全面顺序插振一次）同一位置保证振捣时间在20s以上。施工人员在移动插入式振捣器时，为免碰撞模板，移动间距不宜大于其作用半径的0.5倍。混凝土施工分两次摊铺的，振捣上层混凝土混合料时，插入式振捣器应插入下层混凝土混合物5cm处，上层混凝土混合料的振捣下须在下层混凝土拌和物初凝之前完成。其次，再用平板振动器进行全面的振捣，振捣时重叠10cm～20cm。同一位置振捣时，水灰比小于0.45时，振捣时间不宜少于30s，而对于水灰比大于0.45时则应当不少于15s，以不再冒气泡并泛出水泥浆为准。 2.8 整平和收光护理

引导孩子合理使用电子产品的正确方法

引导孩子合理使用电子产品的正确方法家长朋友们：大家好，今天和大家交流的话题是：如何引导孩子合理使用电子产品。这是家长很头痛的问题，也是教育部门高度关注的问题。随着信息时代的发展，电子产品已经走进了千家万户。高科技的生活方式，为我们带来便利的同时，也出现了一些难以应对的问题，尤其是电子产品对青少年学生的冲击较大。今天我主要围绕孩子在使用网络及电子产品时产生的问题与大家做个交流。一、学生使用手机、电脑等电子产品的现状及危害（一）学生使用电子产品的现状生活中常见的电子产品，主要包括：电脑、平板电脑、智能手机、智能手表、电视机、摄像机等等。今后随着数字产业的发展和人们生活需求的提高，还会有更多的电子产品融入我们的生活。电子产品的普及，给我们的生活带来便利的同时，也带来了一些不利的影响。虽然说，很多电子产品的利大于弊，但从不利影响来看，主要是网络、手机等电子产品对自制力差的人群，尤其是青少年学生，产生了较大的危害。目前中小学生使用频率最高的电子产品就是手机了，其次是电脑。作为家长，我们对这些现象并不陌生：孩子放学一回到家就千方百计的想玩手机，好多孩子周末、假期不喜欢到户外活动，宅在家里玩手机、电脑；一群孩子即使聚集在一起，多数也是在组团打网络游戏；亲子相处，即使同处

一室，多数是拿着手机在各自的虚幻世界里遨游。手机更成为我们教育孩子的重要难题：孩子小的时候，为了哄孩子开心，手机无形中成为电子保姆；稍大一点的孩子，可以把玩电脑、玩手机作为和父母谈判的交换条件，甚至会用生闷气、哭闹、威胁的方式对抗父母。父母明知长时间玩电子产品对孩子的健康和心理发展有害，却束手无策。我就亲眼见到一个孩子因为家住深沟无信号，他周末每天起床很早，坐在沟口桥上玩一天手机，不吃不喝，十分投入。学校对手机也是屡禁不止。学生偷偷把手机带到学校，上课下课钻空子玩，晚上在宿舍偷着玩；甚至有学生半夜从窗户翻进教师办公室玩通宵；有的三五成群蹲坐在教师办公室窗下蹭wifi；有的在课间打开教室里的多媒体设备玩游戏；有的甚至因为老师的批评而顶撞老师，厌学，逃学……这些现象严重影响了学生的成长和师生关系，成为学校教育的难题之一。在玩电子产品的时间上，专家则建议：4-6 岁，每天大约20-30分钟，7-10 岁每天大约30-45分钟，11-13 岁每天大约60分钟。而据统计，中小学生手机持有率逐年攀升，目前已达到71.1%，用手机上网比较普遍，且年级越高上网的人数越多。有41.07%学生放学回家后，不是先写作业，而是去用电子产品娱乐放松，有46.43%的学生偶尔会这么做；课堂上使用电子产品的占8.93%，在家庭中使用的占83.93%； 16.07%的玩游戏，25%的是聊天，50%看视频听音乐，学习的只有8.93%，使用时间在一小时内占28.57%，1—2小时的占