豌豆抗白粉病资源筛选及分子鉴定_王仲怡

_大豆根瘤菌剂载体的选择及最佳施用浓度筛选

第33卷第2期2014年 4月 大豆科学SOYBEAN SCIENCE Vol．33No．2Apr． 2014 大豆根瘤菌剂载体的选择及最佳施用浓度筛选 刘庆莉1，王金生1，刘丽君1，林蔚刚1，王红蕾2，张俐俐3，吴俊江 1 （1．黑龙江省农业科学院大豆研究所，黑龙江哈尔滨150086；2．黑龙江省农业科学院信息中心，黑龙江哈尔滨150086；3．黑龙江省农业科学院，黑龙江哈尔滨150086） 摘要：为筛选出适宜根瘤菌吸附且能促进大豆生长、提高产量的优质载体，并且在优质载体的条件下，筛选出大豆 根瘤菌液的最佳使用浓度，通过3种载体吸附不同浓度根瘤菌液拌种大豆盆栽播种后，对大豆的生物量、结瘤及产量的对比发现：不同载体介入、大豆接入根瘤菌后均对大豆的生物量及结瘤产生一定的促进作用。根瘤菌以草炭和蛭石为载体，更有利于促使大豆植株生长，积累更多的干物质；草炭的促进结瘤作用持续效果时间较长，液体的持续效果时间最短，而蛭石的持续效果时间相对比较居中；以草炭和蛭石作为根瘤菌载体，低浓度的根瘤菌液接入更能发挥其提高产量的作用，以液体作为根瘤菌载体，根瘤菌接入浓度较高才能发挥其提高产量的作用。结合生产成本来看， 草炭土更适宜作为自主研发根瘤菌剂的载体，同时推荐根瘤菌使用浓度为1．4?108 菌细胞 ·mL －1。关键词：大豆根瘤菌；结瘤；载体 中图分类号：S565．1文献标识码：A 文章编号：1000- 9841（2014）02-0207-04收稿日期：2013-10-11基金项目：国家“十二五”科技支撑计划（2012BAD14B06）；现代农业产业技术体系（CAＲS-004）；黑龙江省自然科学基金（C201104）；哈尔滨市科技创新人才研究专项资金（2013ＲFXYJ043）。 第一作者简介：刘庆莉（1971-），女，技师，主要从事大豆耕作与栽培研究。E-mail ：liuqingli1971@126．com 。通讯作者：吴俊江（1970-），男，博士， 研究员，主要从事大豆耕作与栽培研究。E-mail ：nkywujj@163．com 。Chosen of Soybean Ｒhizobia Carrier and Screening of the Best Concentration LIU Qing-li 1，WANG Jin-sheng 1，LIU Li-jun 1，LIN Wei-gang 1，WANG Hong-lei 2，ZHANG Li-li 3，WU Jun-jiang 1 （1．Soybean Ｒesearch Institute ，Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences ，Harbin 150086，China ；2．Information Center of Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences ，Harbin 150086，China ；3．Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences ，Harbin 150086，China ） Abstract ：In order to screen the carrier that was more appropriate for the absorption of rhizobia ，improving yield and quality of inoculated soybean ，and screen the best soybean rhizobia bacterial concentration at levels of quality carrier ，three carriers ab-sorbed different soybean rhizobia bacterial concentration with seed dressing were performed according to the biomass ，nodular rate and yields of soybean plant by soil pot experiments．The results showed that different carriers and inoculating soybean rhi-zobia could improve the biomass and nodular rate of soybean plant．Peat and vermiculite were used as carriers of rhizobia could remarkably promote the growth of soybean plant and enhance dry matter accumulation ；thus the lasting effect of nodular was the longest ，followed by vermiculite and liquid．Low level bacterial concentration could remarkably increased soybean yield and quality with peat and vermiculite as carriers ，however the opposite when used liquid as carriers．In conclusion ，in view of the cost ，peat was more appropriate for soybean rhizobia ，and the best bacterial concentration was 1．4?108 cells ·mL －1．Key words ：Soybean rhizobia ；Nodulation ；Carrier 施用根瘤菌菌剂能促进大豆结瘤， 有效提高豆科植物的产量，减少生产中的化肥使用量，降低生产成本，而且可以提高土壤肥力，同时，由于根瘤菌剂耐污染能力强［1］ ，还可以减少因长期使用化肥对 环境的破坏 ［2-3］ ，对无公害大豆生产以及降低农民 投人， 保护环境等具有十分重要的作用［4-5］ 。因此 引起了人们的极大兴趣和广泛关注，已成为豆科植 物增产的主要研究方向。 近年来随着新技术特别是分子生物学技术的发展，各种高效菌种不断被选育或改造，制备菌剂的工艺、保藏菌剂的方法也不断完善和发展，配制成的菌剂的效果越来越好，在农业生产中得到了广泛利用。与此同时，诸如发酵水平低、保质期短和 技术不成熟、质量不过关等问题限制了根瘤菌剂的产业化和大面积推广应用。其中，菌种质量的高低一直是影响其应用效果的一个突出问题；载体也是大豆根瘤菌肥料质量控制的一个关键因素 ［6］ 。作 为根瘤菌的载体很多， 如草炭、蛭石、珍珠岩、煤炭、草炭、膨润土和高岭土等。草炭、蛭石由于其营养与pH 适中，表面积比较大和吸附性好，有利于根瘤菌的存活及菌剂保存，是理想的载体 ［7-9］ 。另外，草 炭和蛭石等资源丰富，价格低廉，适合于在根瘤菌剂生产中应用推广，已成为当代根瘤菌类肥料的主要类型。 本文的研究目的是筛选出适宜根瘤菌吸附且接种大豆能促进大豆生长、提高产量的优质载体，

特种设备无损检测机构鉴定评审指南——适用于核准

特种设备无损检测机构鉴定评审指南 (仅适用于核准) 中国特种设备检验协会 2016年05月01日

鉴定评审作业指导书审批单 特种设备无损检测机构 鉴定评审指南 （仅适用于核准） 版本：5-0 执行日期：2016-05-01 文件编号：PS-QW07-5 编制：日期：年月日审核：日期：年月日批准：日期：年月日

目录 1 引言 (4) 2 引用文件 (4) 3 术语 (4) 4 鉴定评审基本过程 (4) 附录A 质量管理体系文件结构 (9) 附录B 质量管理体系建立实施要点及说明 (18) 附录C 引用的表格结构及清单 (45) 附录D 《资源条件评审记录》填写说明及应当准备的材料 (46) 附录E 《质量管理体系评审记录》填写说明及应当准备的材料.. 48附录F 检测能力验证程序及要求 (55) 附录G 整改报告格式 (60) 附录H 整改报告编制要求 (65) 附录I 不符合整改现场确认程序 (68)

1 引言 本指南依据《中华人民共和国特种设备安全法》、《特种设备安全监察条例》、《特种设备无损检测机构核准规则》(TSG Z7005—2015，以下简称《核准规则》）、《特种设备检验检测机构质量管理体系要求》（TSG Z7003—2004，以下简称《体系要求》）等制定，是实施特种设备无损检测机构核准鉴定评审的指导性文件。申请机构宜按照本指南的要求，进行鉴定评审的准备工作。 2 引用文件 2.1 《中华人民共和国特种设备安全法》 2.2 《特种设备安全监察条例》 2.3 《特种设备行政许可鉴定评审管理与监督规则》 2.4 《特种设备无损检测机构核准规则》（TSG Z7005-2015） 2.5《特种设备检验检测机构质量管理体系要求》（TSG Z7003-2004） 2.6《特种设备无损检测人员考核规则》（TSG Z8001-2013） 2.7 其它有关安全技术规范 3 术语 本指南除采用《体系要求》中的术语外，还采用以下术语。 3.1固定资产：指申请机构按固定资产管理的房屋（包括办公用房、检测用房、仓库、职工生活用房、食堂用房、锅炉房等）、建筑物（包括道路、围墙、水塔、雕塑等）及其附属设施（包括房屋、建筑物内的电梯、通讯线路、输电线路、水气管道等）；专用的机器、机械、运输工具，办公和事务用的通用性设备、交通工具、通讯工具、家具等，以及其它与检测有关的设备、器具与工具等。 3.2固定资产总值：指3.1所述固定资产的原值的总和。 3.3 检测能力验证：指首次核准或增项核准的申请机构，为证明其有能力独立从事某种检测方法的检测，在鉴定评审机构见证下，在指定的检测对象上完成检测工作，并对检测过程和结果符合性进行评价的活动。 4 鉴定评审基本过程 鉴定评审过程通常包括：约请-受理-鉴定评审-审批-发证。 4.1 约请鉴定评审 申请机构收到《特种设备行政许可受理决定书》后，可以约请协会进行鉴定评审。约请分两步进行，第一步网上约请，第二步提交书面约请。

利用不同的方法筛选和鉴定转化子

生物工程上游技术实验综合实验设计 利用不同的方法筛选和鉴定转化子 生命科学学院 生工121 指导老师: 田长恩、周玉萍 摘要 本次实验我们小组通过含Amp的培养基初步筛选出转化子、菌落直接PCR、摇菌培养观察细菌表达形态等一系列实验方法，从6个转化子中筛选出了2个目的重组子.，从而达到实

验的基本目的，基本掌握了转基因生物筛选鉴定的基本方法。 关键词 筛选、菌落直接PCR、摇菌培养、电泳 引言 在质粒载体上进行克隆时，由于重组质粒转化的大肠杆菌的量少，连接产物没有也不可能在经过分离纯化而获得纯的重组质粒，连接产物中混有载体自连而成的空载体、载体与目的片段连接而成的目的重组质粒和载体与非目的片段连接而成的非目的重组质粒。同时，宿主的转化效率极低，因此，绝大部分宿主是没有被转化的，所以很有必要对转化产物进行筛选与鉴定。首先，通过抗生素抗性从转化后代中筛选出转化子。然后，通过菌落直接PCR从转化子中筛选出候选转基因生物。最后，摇菌培养观察菌株表达形态。 通过抗生素抗性筛选，从转化后代中筛选出转化子。因为非转化菌没有质粒而缺乏相应的抗生素抗性，所以可将转化产物涂布在含有相应抗生素的培养基上筛选，只有含有相应抗性的抗生素抗性基因才能生长繁殖形成菌落。 通过菌落直接PCR从转化子中筛选出转基因生物，扩增出特殊目的基因片段，判断所得转化子是否为重组子。但因为PCR技术的高灵敏性，往往会产生假阳性结果，所以有必要进一步进行鉴定.。从候选重组子中进行摇菌培养关注菌株表达形态，若出现荧光蛋白则说明菌株成功转化并表达了GFP荧光蛋白。 三、使用仪器、材料 1、材料：实验九准备好的菌株。 2、实验仪器及设备:PCR仪、恒温摇床、台式高速离心机、恒温水浴锅、琼脂糖凝胶电泳装置、电热恒温培养箱、电泳仪、超净工作台、微量移液抢、1.5mL离心管等。 3、主要试剂：10×PCR buffer 、dNTP mixture 、前向引物(P1) 、反向引物r(P2) 、 rTaq 酶、灭菌蒸馏水、LB液体培养基： 四、实验步骤 1、转化子筛选：在实验九含有Amp的筛选培养基中长出的菌落中挑选出6个白色单菌 落，并做好标记，这6个单菌落即为转化子。 2、菌落直接PCR：用无菌牙签把6个白色单菌落，先在编好号的6支PCR反应管中的 底部分别涂擦，然后在PCR管中配制60μL反应体系.并按每管9μL分装好反应体系。反应体系如下: DNA template buffer （用牙签挑取菌落在PCR管中涂抹） 10×PCR buffer 6μL

目的基因的克隆转化及重组子筛选

实验报告 题目:单元二:目的基因的克隆、转化及重组子筛选 指导老师:丛佩清 日期:2013/10/24-2013/10/26 一．实验目的： (1)学习和掌握DNA片段胶回收的方法。 (2)学习DNA连接的有关技术。 (3)掌握用CaCl2 法制备感受态细胞的原理和方法。 (4)学习和掌握质粒DNA的转化和重组质粒的筛选方法。 (5)掌握质粒提取的基本方法。

(6)学习和掌握限制性内切酶的使用方法。 二．实验原理： (1)cDNA的TA克隆:Taq酶能够在PCR产物的3’末端加上一个非模板依赖的A，而T载体是一种带有 3’T突出端的载体，在连接酶作用下，通过粘性末端连接，把PCR产物插入到质粒载体的多克隆位点，称为 T-A克隆。可用于PCR产物的克隆和测序。 (2)感受态细胞制备原理：细菌处于容易吸收外源DNA的状态叫感受态,细菌处于0℃，CaCl2的低渗溶液中，细胞膨胀，细胞壁通透性增强,在冷热变化刺激下细胞膜表面产生裂隙，使外源DNA进入。 (3)蓝白斑筛选:载体带有一个LacZ基因的调控序列和头146个氨基酸的编码信息，编码α-互补肽；宿主细胞编码C端部分序列。诱导物IPTG 和乳糖的结构相似，可以与乳糖操纵元的阻遏蛋白结合，从而解除阻遏蛋白的作用，使载体得以合成α-互补肽，与宿主细胞编码的C端部分结合形成β-半乳糖苷酶，而X-Gal是β-半乳糖苷酶的显色底物，在β-半乳糖苷酶的催化下会产生蓝色产物。可用于重组克隆的筛选，重组克隆无法产生α-互补肽，因而无法使X-Gal显色，培养基上表现为白色菌落。 三．实验材料： 大肠杆菌DH5a、LB培养基、0.1mol/L CaCl2溶液、Binding Buffer、spin-column、SPW 溶液、1μl pMD19-T Vector、5μlSolution Ⅰ、250μlSolution Ⅰ、250μlSolution Ⅱ、350μlSolution Ⅲ、HiBind ? Mini Columns (I)、500 μlBuffer HB、1400 μlDNA Wash Buffer等 四．实验步骤、现象、结果及分析： Ⅰ10月24号 (1)cDNA电泳及胶回收 1. 取上周制备的置于-20℃冰箱保存的目的基因产物1、2、3组DNA样品，选取其中2号组及3号组进行琼脂糖电泳，因1号组RT-PCR琼脂糖凝胶电泳有杂带故弃而不用，1、3号组DNA样品（已加入loading buffer）分别加入SYBR Gold2μl，1%琼脂糖电泳，紫外灯下切胶。 2.把所割胶放入1.5 ml EP管，称重如下表一。 表一：cDNA琼脂糖凝胶重量 空管2管3管 重量（g）0.9045 1.2280 1.2961 净重（g）0.3235 0.3916 3.按1g/1ml 的量，大致各加入400μl Binding Buffer，65℃水浴7min；（每隔2－3 min，摇一下）； 4.把溶液转移至spin-column，10000g 离心1 min ，倒出套管内残液； 5.在柱子中加入300μl Binding buffer，10000g 离心1min，倒出套管内残液； 6.在柱子中加入700ul 的SPW 溶液，放置3min，10000g 离心1min ，去残液； 7.10000g 离心1min（去乙醇）； 8.把柱子放入干净的1.5ml EP 管。加Elution Buffer 20μl。室温放置1min，10000g 离心1min。 9.检测DNA的纯度和浓度，如下表二所示。选取质量好的2号组进行接下来的连接转化。 表二：cDNA吸光度测定 2组3组

克隆的筛选和快速鉴定

实验六克隆的筛选和快速鉴定 一、目的 掌握快速细胞破碎法测定大小不等的众多的质粒DNA；和菌落PCR快速鉴定克隆。 二、原理 在这个实验方法中，只需配制一种细胞缓冲液（它可以在室温下保存，长期使用）。利用破碎细胞缓冲液中的阴离子去污剂SDS在37℃溶解膜蛋白，使细胞破裂，并解聚核蛋白，SDS还能与蛋白质结合形成复合物，使得蛋白质沉淀。利用EDTA螯合金属离子，防止破碎细胞的脱氧核糖核酸酶对DNA的降解。然后高速离心，去除细胞碎片核大部分的染色体DNA和RNA蛋白，将含有质粒DNA的上清夜直接进行点样电泳和分离。在琼脂糖凝胶上分离开的个组分中，有染色体DNA，不同大小的质粒DNA和RNA，它们都可以经肉眼观察或拍照显示。 或者用设计好的引物，做菌落PCR快速鉴定克隆。 三、试剂与仪器 （一）试剂 1．破碎细胞缓冲液50mmol/L Tris-HCl (pH6.8)、1% SDS、2mmol/L EDTA、400mmol/L 蔗糖和0.01%溴酚蓝。 配制方法：1mol/L Tris-HCl (pH6.8) 10ml 20% SDS 10ml 250mmol/L EDTA 1.6ml 蔗糖27.2g 1.2%溴酚蓝 1.67ml 加ddH2O至200ml 2．10mg/ml 溴乙啶 3．TBE电泳缓冲液（5×） 4．Taq DNA聚合酶(5U/μl) 5．10×反应缓冲液（含25mmol MgCl2） 6．dNTP 7．点样缓冲液Loading buffer（10×）：0.25%溴酚蓝，40%甘油。 （二）仪器 1．电泳仪2．1.5ml 离心管3．Tip 4．培养皿5．PCR扩增仪6．台式离心机 7．紫外分析仪8．恒温水浴 四、操作步骤 （一）快速细胞破碎法测定 1．取1.5ml离心管编号码，每管加入50μl破碎细胞缓冲液。 2 3．待转化的细菌菌落长到2mm时

根瘤菌及其应用

根瘤菌与豆科植物及其应用 摘要：自贝叶林克1888年首次从豆科植物根瘤中分离获得根瘤菌以来，国内外的许多学者都为揭开这一大自然的奥秘进行着孜孜不倦的研究，成为生命科学最为活跃的领域之一。人们从生物学，生态学，生理生化，分类和遗传等方面对根瘤菌进行了广泛研究，在根瘤菌和根瘤的形态结构，固氮酶的结构和功能，固氮机理和作用调件，根瘤菌在细菌分类学中的地位直到固氮基因，结瘤基因，固氮生态等应用方面都有着较快发展，20世纪90年代共生固氮体系已进入分子水平，研究转入根瘤菌与宿主豆目植物植物的相互识别和信息传递以及根瘤菌群体感应等方面。 关键词：根瘤菌生物固氮根瘤菌应用 一．根瘤菌的生物学特征 根瘤菌：根瘤菌主要指与豆类作物根部共生形成根瘤并能固氮的细菌，一般指根瘤菌属和慢生根瘤菌属；两属都属于根瘤菌目。根瘤菌侵入寄主根内，刺激根部皮层和中柱鞘的某些细胞，引起这些细胞的强烈和生长，使根的局部膨大形成根瘤；根瘤菌在根内定居，植物供给根瘤菌以矿物养料和能源，根瘤菌固定大气中游离氮气，为植物提供氮素养料，两者在拮抗寄生关系中处于均衡状态而表现共生现象。 根瘤菌的形态特征：根瘤菌是短杆状细菌，因生活环境和发育阶段的不同，在形态上有显著变化.根瘤菌在固体培养基上和土壤中呈杆状，端生或周生鞭毛能运动，革兰氏染色阴性，无芽孢，培养较久

菌体粗大，染色不均。 生存习性：根瘤菌与植物的共生体系具有很强的固氮能力。已知全世界豆科植物近两万种。根瘤菌是通过豆科植物根毛、侧根杈口(如花生)或其他部位侵入，形成侵入线，进到根的皮层，刺激宿主皮层细胞分裂，形成根瘤，根瘤菌从侵入线进到根瘤细胞，继续繁殖，根瘤中含有根瘤菌的细胞群构成含菌组织。 根瘤菌进入这些宿主细胞后被一层膜套包围，有些菌在膜套内能继续繁殖，大量增加根瘤内的根瘤菌数，以后停止增殖，成为成熟的类菌体；宿主细胞与根瘤菌共同合成豆血红蛋白，分布在膜套内外，作为氧的载体，调节膜套内外的氧量。 类菌体执行固氮功能，将分子氮还原成NH3，分泌至根瘤细胞内，并合成酰胺类或酰尿类化合物，输出根瘤，由根的传导组织运输至宿主地上部分供利用。与宿主的共生关系是宿主为根瘤菌提供良好的居住环境、碳源和能源以及其他必需营养，而根瘤菌则为宿主提供氮素营养。 二．根瘤菌与豆科植物 根瘤菌(root nodule bacteria)是与豆科植物共生，形成根瘤并固定空气中的氮气供植物营养的一类杆状细菌。这种共生体系具有很强的固氮能力。已知全世界豆科植物近两万种。根瘤菌是通过豆科植物根毛、侧根杈口(如花生)或其他部位侵入，形成侵入线，进到根的皮层，刺激宿主皮层细胞分裂，形成根瘤，根瘤菌从侵入线进到根

信息检索信息搜索、鉴别和筛选

信息检索信息搜索、鉴别和筛选 一提到网络搜索，大家马上会想到谷歌和百度。当然，一遇到问题人们可能最先想到的就是这两大搜索引擎。但是呢，好的信息搜索并不只有这两个，每一种搜索引擎都有各自的利弊，选不对搜索引擎，就像选了不合脚的鞋一样，能走路，但艰辛痛苦，也跑不快走不远。使用搜索引擎首先要了解各种搜索引擎特点，否则你可能浪费大量时间。这次搜索，你应该使用百度还是Yahoo？Google还是百度？分析你的需求，选根据需求找拥有相应功能优势的搜索引擎。这里介绍一些： 1.方向着手 （1）从行业入手查找，比较好用的是“百度产品大全”（点击首页“更多”选项即可）：行业报告——各行业官方报告、评定、专家解读，行业与单个品牌市场综述、分析，行业与单个品牌数据、过往新闻。当然这个不乏广告成分，所以需要鉴别，当心受骗。 （2）寻找特定领域的人了解情况，寻找合适采访对象，如专家学者、老一辈，想熟悉某个领域或了解某个城市、历史、词条……这些比较细致的东西，可以用“百度百科”，网友们集体贡献的智慧是无穷的，而且网友的料也是无穷的，你往往能有意外收获。

另外wikipedia（维基百科）也是巨型资料库，而且更新很快。 （3）Google有一个实用搜索功能是“大学搜索”，要知道现在多数有点名的所谓专家学者都没少在大学挂职，各种研究所、实验室、官方组织的这个那个不少也扎根大学，而大学又是产生思想文化的重要阵地。用这个搜索可以一网打尽和某所大学有关的所有东西。 （4）现在有一些新开发的搜索引擎，它们可以对网页库中的某类专门的信息进行一次整合。有人称之为：元搜索引擎。这种搜索引擎的特点是大大减少了你整合资料的时间。 比如比比猫（Bbmao）。这个搜索引擎的特点是：自动分类、自动去掉重复结果、汇集五大搜索引擎结果。智能分类，你可能在分类中发现一些你不曾想到的东西。 不过元搜索是不是好用，可能仁者见仁智者见智，但是只要适应了这种新方式，会给你带来很多方便。 2.技巧着手 （1）设计关键词：使用搜索引擎要避免大而空的关键词，它不知道你要找啥，就可能返回很多莫名其妙结果。

鉴定评审细则和现场评审记录

盛年不重来，一日难再晨。及时宜自勉，岁月不待人。 附件3 制造条件鉴定评审细则与现场鉴定评审记录 申请单位 申请项目 评审机构（章） 评审员评审组长 评审日期年月日至年月日 国家质量监督检验检疫总局制

制造条件鉴定评审细则与现场鉴定评审记录 说明 一、评审细则适用于《机电类特种设备制造许可规则》中的现场评审工作。 二、评审细则分为两部分内容：(一)基本条件的评审；(二)质量管理体系建立与运行的考核评审。 三、评审细则中每一项评审内容按符合、有缺陷、不符合、不适用四种结果进行评定。其中“不符合”是指不符合评审要点的要求；“有缺陷”是指按评审要点的要求进行控制，但控制得不完善、不全面；“不适用”是指该评审要点不适用于该单位或被抽查设备。 四、评审细则评审结论分为：具备条件、基本具备条件、不具备条件。 五、评审细则评审结论的判定原则： (一)具备条件：单项评审结果全部符合。 (二)基本具备条件：单项评审结果中重要项目（注#项）全部符合、非重要项目（未注#项）存在不符合和有缺陷项，但认为最长6个月内经整改能够达到要求。 (三)不具备条件：单项评审结果达不到基本具备条件要求。 六、评审第二部分时，应随机抽取一台申请项目范围内已完工设备的全部文件，以该设备制造过程执行

质量管理制度情况为主线进行评审。存在不适用项时，应随机抽取其它有代表性设备相应项目执行情况的记录，确认该项评审要点是否满足规定。

制造条件鉴定评审细则 一、基本条件的评审 评审 项目 评审内容评审要点考核方法评价方法 ＃1. 机构 营业执照 1.1 查看法人营业执照正本应与提出申请时递交的复印件一 致，核对注册资金应与申请项目范围对应要求相适应。 现场核实。不满足要求时停止评审。税务登记证 1.2 查看企业税务登记证应齐全，正本应与提出申请时递交的 复印件一致，应有独立的财务帐号。 法人条码证书 1.3 应有法人条码证书并记录企业机构代码 ＃2. 人员技术负责人 2.1 厂长（经理）应在本单位管理层中任命一名技术负责人， 其学历、职称、专业、工作经历及掌握法规与标准情况等，应 能满足规则和《基本条件》中的规定。 检查文件及现场座谈。 不满足评审要点中的要求 判为不符合。 技术人员 2.2 各类技术人员的学历、职称、专业、工作经历及配置数量 等应满足《基本条件》中的规定 检验人员 2.3 检验人员的学历、职称、专业、工作经历及配置数量等应 满足《基本条件》中的规定 作业人员 2.4 各类作业人员的数量及其资格应满足《基本条件》中的规 定。 ＃3. 基础工作场所 3.1 企业应具有满足生产需要的工作场所，且维护完好。厂房 应满足《基本条件》中的规定。 按企业申证范围检查工 作场所的最大能力。 对不满足评审要点中的申 证规格要求的判为不符合。

高效大豆根瘤菌的筛选

高效大豆根瘤菌的筛选 作者：张欣，李玉文转贴自：本站原创 (1．东北林业大学林学院；2．黑龙江省科学院生物肥料研究中心，黑龙江哈尔滨150086) 摘要：将选取的10株大豆根瘤菌菌株(HLJN1001，HLJN1002，HLJN1003，HLJN1004，HLJN10 05，HLJN1006，HLJN1007，HLJN1008，HLJN1009，HLJN10010)与在黑龙江省大面积栽培的5 个大豆品种（垦农18号，垦鉴豆25号，合丰25号，疆丰21-1381号，绥农4号）进行最佳共生匹配双瓶筛选试验，测定了大豆植株株高、叶片颜色、结瘤数、瘤干重和植株地上部分干重等生物学指标并进行统计分析，从中筛选出共生固氮结瘤能力强的优良菌株HLJN1001和HLJN 1003。 关键词：大豆根瘤菌；大豆品种；共生匹配；筛选 中图分类号：S565.1 文献标识码：A 文章编号：1007—6921(2011)10—0125—03 根瘤菌(Rhizobium)是一类广泛分布于土壤中的革兰氏阴性细菌，它可以侵染豆科植物根部，形成根瘤，固定空气中的分子态氮形成氨，为植物提供氮素营养。但根瘤菌与豆科植物独立存在时，不能利用大气中的N2，而当根瘤菌侵入豆科植物的根细胞并在其中迅速增殖后，可产生类菌体，并在根瘤内出现豆血红蛋白，同时具备类菌体和豆血红蛋白的根瘤便具有固氮能力。研究表明，不同的根瘤菌与大豆品种间的共生固氮能力存在着较大的差异［1,2］ 。因此，筛选与豆科作物品种匹配、固氮能力好、竞争结瘤能力强的优良菌株，是提高根瘤菌应用效果的重要途径［3］。现选取10株大豆根瘤菌菌株，与5个在黑龙江省大面积栽培的大豆品种进行共生匹配性研究，从中筛选出优良菌株，为大豆育种材料的选择和共生固氮作用的发挥提供依据。 1 材料与方法 1.1 试验材料 1.1.1 供试菌株 HLJN1001，HLJN1002，HLJN1003，HLJN1004，HLJN1005，HLJN1006，HLJN1007，HLJN1008，HLJN1009，

基因的转移与重组体的筛选和鉴定_百替生物

第四章基因的转移与重组体的筛选和鉴定 第一节转化 基因片段在体外只是一段核酸分子，是化学物质，无法表现出遗传物质的生命活性。只有当其存在于活细胞后，生命的特征才能充分展示出来。在分子克隆实践中，在体外操作的核酸分子只有进入细胞以后才能达到克隆的目的。 一、重组DNA分子转入原核生物细胞 1.重组质粒DNA分子转化大肠杆菌 转化（transformation）——重组质粒DNA分子通过与膜蛋白结合进入受体细胞，并在受体细胞内稳定维持和表达的过程。 转化不仅适合于大肠杆菌受体细胞，而且适合于枯草杆菌和蓝藻等其他原核生物以及酵母等低等真核生物受体细胞。 （1）CaCl2处理后的细菌转化或转染 A、制备感受态细胞 受体细胞的细菌，经一定浓度的冰冷的CaCl2（50～100mmol／L）溶液处理后变成。 所谓感受态细胞，处在感受态状态的菌体有摄取各种外源DNA的能力。 转化：感受态的大肠杆菌细胞捕获和表达质粒载体DNA分子的生命过程； 转染：感受态的大肠杆菌细胞捕获和表达噬菌体DNA分子的生命过程； 好的感受态细胞，每微克的超螺旋质粒DNA可得5×107个转化体。 B、细胞转化（或转染）的具体操作过程： ①将处于对数期的新鲜培养物于0℃4000转/分离心10分，回收细菌细胞； ②将细胞用0℃的0.1mol/L CaCl2低渗溶液处理30分钟，离心回收细胞，再用适量0℃的0.1mol/L CaCl2重悬细胞，以诱导感受态产生。 ③加入适量DNA，于42℃热处理混合物90秒，使DNA分子被细胞吸收； ④将混合物快速转到冰浴中，冷却1~2分，加入适当的培养基，在37℃培养45分，使细胞复苏并表达质粒所携带的转化基因； ⑤通过选择培养基上平板培养，选择转化体。 ⑥如果用抗菌素筛选转化体，作为对照的受体菌应该在此培养基上不生长。 （2）电穿孔转化法 基本原理是利用高压电脉冲作用，在大肠杆菌细胞膜上进行电穿孔（electroporation），形成可逆的瞬间通道，从而促进外源DNA的有效吸收。 受体细胞的准备：当细菌生长到对数中期后予以冷却、离心，然后用低盐缓冲液充分清洗降低细胞悬浮液的离子强度，并用10%甘油重悬细胞，使其细胞浓度为3×1010个／ml，分装，在干冰上速冻后置于-70℃贮存。每小份细胞融解后即可用于转化，有效期达6个月以上。 （3）三亲本杂交接合转化大肠杆菌 原理：是基于非接合型质粒的迁移作用（mobilization）而建立的一种DNA转化方式。首先将具有接合转化功能的辅助质粒转移至含有重组质粒的供体细胞中，然后将这种供体细胞与受体细胞进行混合，促使两者发生接合转化作用，将重组质粒导入受体细胞。整个接合转化过程涉及到3种有关的细菌菌株，即待转化的受体菌、含有要转化的重组质粒DNA的供体菌和含有广泛宿主的辅助质粒的辅助菌，故称三亲本杂交接合转化法。 尤其适用于那些难以采用Ca2+诱导转化法或电穿孔法等进行重组质粒DNA分子直接转化的受体菌。

利用不同的方法筛选和鉴定转化子

利用不同的方法筛选和鉴定转化子 摘要:通过使用不同的方法，从大肠杆菌中筛选和鉴定出转入了GFP基因并表达出GFP的菌株。实验先用蓝白斑筛选得到含有载体的转化子，之后用菌落PCR对其中的重组子进行进一步鉴定，最终通过对表达的产物的检测确证是否能表达出GFP。实验结果表明挑选出来的菌株并没有表达出GFP，需要挑选其他菌落继续实验。 关键词:蓝白斑筛选、菌落PCR、GFP、蛋白质检测 前言 我们采用的是目前应用最广泛、技术最成熟、同时也是最经典的微生物基因重组，作为载体的质粒，我们需要选择或者构建带有多克隆位点和带有抗性基因的质粒，前者有利于基因顺利导入到受体细胞，后者方便我们对转化产物进行筛选；对于受体细胞，我们所选择使用的大肠杆菌，具有遗传背景清楚，结构简单，表达效率高，容易获取等优点，已经建立起一套完善成熟的表达系统，是目前转基因领域最受欢迎、使用最普遍的系统之一。 GFP自从发现以来，已经获得了广泛充足的应用，是生物领域的重要材料绿。绿色荧光蛋白本身无毒，且不需要其他辅酶或者反应底物，在紫外或者蓝光激发下就可以自主发光，而且有较好的稳定性，当其基因与其他蛋白质表达基因相融合时，该蛋白质既能保持原有活性，发光能力也不受影响，这意味着我们可以将GFP与我们想要了解的蛋白质相接合在一起，将GFP作为荧光标签，对蛋白质的位置、运动、活性以及相互作用等机理进行追踪和观察，因为这种特性，绿色荧光蛋白具有其他报告蛋白无法比拟的优点，已经在生物研究中获得广泛的应用。 我们已经通过一系列的实验操作，获取GFP基因，用PCR技术将其扩增并连接到载体质粒pMD19-T Vector上，用CaCl2法将其转入到大肠杆菌中，经过本次实验的筛选和鉴定，构成了完整的转基因操作流程，将我们的课堂学习和实际操作结合起来，从而对转基因技术有一个最直接的认识。尽管在当下中国，转基因技术备受争议，但是每一名生物专业的学生，都应学习了解国际科学社会在转基因领域上所取得的巨大成就，并看到其广泛的应用前景和巨大的市场潜力，同时将所学习到的关于转基因知识科普出去，让每一个公民都能科学、正确地认识转基因，理性、客观地参与到关于转基因的有益讨论中去，推进我国生物科学技术的发展。

压力容器D1、D2级制造许可鉴定评审记录

文件编号：AHTJ-PSPX/QR-RQ02-2010压力容器制造许可现场鉴定评审记录 申请单位＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿_ 申请类别＿□增项□升级□取证□换证＿＿＿ 申请级别＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿_ 评审组长＿＿＿＿＿＿评审员＿＿＿＿＿＿_ 评审日期＿＿＿年＿月＿日至＿＿月＿＿＿日 发布日期：二0一0年十一月十五日 实施日期：二0一一年元月一日

安徽省特种设备检测院 说明 一、《压力容器制造许可现场鉴定评审记录》（以下简称《现场记录》）适用于现场评审工作。 二、《现场记录》分为三部分：第一部分〈资源条件〉；第二部分〈质量保证体系的建立和实施〉；第三部分〔产品（设备）安全性能抽查检验〕。 第一部分〈资源条件〉依据国务院373号令《特种设备安全监察条例》、国质检特[2005]220号《特种设备行政许可鉴定评审管理与监督规则》、TSGZ0004—2007《特种设备制造、安装、维修质量保证体系基本要求》、TSGZ0005—2007《特种设备制造、安装、维修许可鉴定评审规则》和国质检锅[2003]194号《锅炉压力容器制造许可条件》等法规、规章和技术规范的要求编制。 第二部分〈质量保证体系的建立和实施〉依据TSGZ0004—2007《特种设备制造、安装、维修质量保证体系基本要求》、TSGZ0005—2007《特种设备制造、安装、维修许可鉴定评审规则》的有关要素要求编制，其中评审项目所选取的体系要素应考虑申请单位的实际管理情况。 第三部分〔产品（设备）安全性能抽查检验〕依据TSGZ0004—2007《特种设备制造、安装、维修质量保证体系基本要求》、TSGZ0005—2007《特种设备制造、安装、维修许可鉴定评审规则》等法规、规章和技术规范的要求编制。

压力管道安装许可鉴定评审报告.doc

申请单位：XX公司 许可项目：安装 设备种类：压力管道 设备级别：GC1、GB1、GB2（1）级 鉴定评审类别：第一次复查和增项GB1、GB2（1）评审机构：河北省锅炉压力容器监督检验院

目录 一、压力管道安装许可鉴定评审结论………………………第 1 页附：特种设备许可种类、类别和级别明细表………………第 2 页 二、压力管道安装许可鉴定评审报告………………………第 3 页 1、鉴定评审组成员名单……………………………………第 4 页 2、鉴定评审基本情况确认表………………………………第 5 页 3、许可资源条件评审报告…………………………………第 5 页 4、质量保证体系评审报告…………………………………第 8 页 5、压力管道安装工程检验报告…………………………第 8 页 6、企业认证情况……………………………………………第 9 页 7、特种设备鉴定评审备忘录………………………………第 9 页 三、整改情况确认报告……………………………………第 10 页附：鉴定评审组和整改确认成员名单

一、压力管道安装许可鉴定评审结论

附表： 特种设备许可种类、类别和级别明细表

二、压力管道安装许可鉴定评审报告 XX公司于2010年6月30日向国家质量监督检验检疫总局（以下简称：国家总局）提出压力管道安装许可证换证及增项申请书，国家总局于2010年7月6日批准受理了该公司的换证及增项申请，受理决定书编号：TS3810120-2010S。 受该公司的约请，河北省锅炉压力容器监督检验院（以下简称：评审机构）依据《压力管道安全管理与监察规定》、《压力管道安装许可规则》的规定组成了审查组，在申请单位自我审查合格后，于2010年11月28日至29日对XX公司申请压力管道安装许可项目进行鉴定评审。其主要鉴定评审工作内容： ⑴压力管道安装单位应具备的条件 内容包括：单位的法人资格，工程技术人员及特殊工种（焊接、无损检测）人员资格，分包方的资格和人员的确认，安装设备、装备，检测仪器、仪表，试验设备等基本情况； ⑵质量体系的建立及实施情况； ⑶压力管道安装标准及工艺技术文件的控制情况； 内容包括：施工组织设计，材料，焊接工艺规程，焊接工艺评定，安装工艺及检验试验工艺等； ⑷典型压力管道安装工程的安装质量及质量记录 内容包括：压力管道的预制，装配，焊接，无损检测，压力试验等安装质量及质量记录；原材料证书，无损检测记录或报告，管道组成件和支承件的加工质量记录或质量合格证书，管道防腐质量记录，压力试验及气 密性试验等质量记录。 ⑸对特殊工种作业人员的技能考核。 ⑹安装监督检验情况。

重组子筛选

三．筛选 在转化过程中，并非每个宿主细胞都被转化，即使获得转化的细胞，也并非都含目的基因，可能含有自身形成环状的在体分子，一个载体与两个外源DNA 形成的重组子，或插入的非目的基因与载体形成的重组子等。因此转化后须在不同层次、不同水平上进行筛选，以区别转化子与非转化子、重组子与非重组子，以及鉴定所需的特异性重组子。 （一）根据重组子的遗传学特性筛选（平板筛选） 1.抗生素平板筛选 克隆载体具有抗生素抗性基因，如：Amp、Ter、Kan等。外源基因插在抗性 基因之外，这个重组子转化入宿主后，宿主就具有了抗生素抗性，因而在含抗生素的培养基中，只有阳性重组子才能生长。但有些单酶切的情况下，连接时有可能出现反向连接或自身环化，所以还需要进行酶切鉴定。 2．插入失活 pBR322含有Tetr及Ampr，插入Tet后变成Tets及Ampr。 3．插入表达 如质粒pTR262带有负调控Tetr基因的cI基因，cI基因表达产物可抑制Tetr 表达。当目的基因插入cI基因后，使后者失活，Tetr表达，因此重组子在含有Tet的平板上可生长，自身环化的载体转化细胞则不能生长。 4．营养素依赖表型 把亮氨酸自养型载体转入亮氨酸异养型菌株即可在无亮氨酸的培养基中生长。 5．蓝白筛选 蓝白筛选是通过插入失活lacZ基因，破坏重组子与宿主之间的ɑ-互补作用来鉴别重组子与非重组子的筛选方法，是携带lacZ基因的许多载体的筛选优势。这些载体包括M13噬菌体，pUC质粒系列，pEGM质粒系列等。它们的共同特点是载体上携带一段细菌lacZ基因的α肽编码序列，其编码产物为β-半乳糖苷酶的α肽。当无外源DNA插入时，质粒表达α肽。突变型Lac-E.Coli可表达该

评审报告

特种设备检验检测机构核准鉴定评审报告 报告编号： 申请单位：洛阳金立特种设备检测有限公司 许可项目：安全阀校验FD1(限在线校验）、FD2(限在线校验） 评审机构：河南省锅炉压力容器安全检测研究院

特种设备检验检测机构核准鉴定评审结论

注：确认的检验地址如果与确认的项目有关，请在确认的充装地址前面加上序号。

洛阳金立特种设备检测有限公司 特种设备检验检测机构核准鉴定评审报告洛阳金立特种设备检测有限公司（以下简称申请单位）于2013年6月25日向河南省质量技术监督局提交了特种设备检验检测机构核准申请（首次）——安全阀定期校验FD1（限在线校验）、FD2（限在线校验），河南省质量技术监督局于2013年6月25日同意受理，受理编号： TS2013-0759。 受申请单位约请，根据国家有关规定，河南省锅炉压力容器安全检测研究院（以下简称鉴定评审机构）组织了鉴定评审组于2013年9月27日至9月28日对申请单位的特种设备检验检测机构核准申请的安全阀定期校验FD1（限在线校验）、FD2（限在线校验）进行了鉴定评审。申请单位申请项目为：钢安全阀定期校验FD1（限在线校验）、FD2（限在线校验）；行政许可部门受理项目为：安全阀定期校验FD1（限在线校验）、FD2（限在线校验）。本次鉴定评审确定的项目为：安全阀定期校验FD1（限在线校验）、FD2（限在线校验）。本次鉴定评审为申请行政许可的首次鉴定评审。 一、概述： 鉴定评审组到达申请单位后，首先召开了鉴定评审预备会，与约请单位有关负责人商定了鉴定评审日程安排，然后召开了由鉴定评审组全体成员、特种设备安全监察机构代表和申请单位负责人（技术负责人、质量负责人）及相关人员参加的首次会议。会上，鉴定评审组申明了审查依据、程序、工作内容和有关要求以及申请单位的权利；确定了审查日程安排；

质量手册评审细则

机电类特种设备施工单位 安装改造维修许可鉴定评审细则

机电类特种设备施工单位安装改造维修许可鉴定评审细则 说明 一、本细则根据《特种设备安全监察条例》、《机电类特种设备安装改造维修许可规则(国质检锅〔2003〕251)》、《特种设备 制造安装改造维修许可鉴定评审细则(TSGZ0005-2007)》、《特种设备制造安装改造维修质量保证体系基本要求(TSGZ0004-2007)》和广东省质监局相关规定的要求编制,适用于机电类特种设备中电梯、起重机械、客运索道、大型游乐设施安装改造维修类施工单位的现场鉴定评审工作。 本细则分为四部分：（一）资源条件的鉴定评审；（二）质量保证体系的建立和运行考核评审；(三)产品(设备)安全性能抽查（四）业绩考核。每一小项的评审意见分别为: 符合条件、需要整改、不符合条件、不适用. 二、评审报告的鉴定评审结论分为：符合条件、不符合条件、需要整改： （一）符合条件：全部满足许可条件。 （二）需要整改；申请单位的现有部分条件不能满足受理的许可项目规定，但在规定时间内(最长6个月)能完成整改工作，并满足相关许可条件。 （三）不符合条件：申请单位存在以下情况之一时，鉴定评审结论为不符合条件: 1.法定资格不符合相关法律法规的规定; 2.实际资源条件不符合相关法规、安全技术规范的规定; 3.质量保证体系未建立或不能有效实施,质量控制系统未能得到有效控制,管理混乱; 4.产品(设备)安全性能抽查结果不符合相关安全技术规范及相应标准的规定; 5.申请单位有违反特种设备许可制度的行为。

一、资源条件的鉴定评审

二、质量保证体系的建立与运行考核评审