叶绿素测定与校准

5.13 叶绿素

介绍

叶绿素以多种形式存在于藻类、浮游植物和其它在环境水样中存在的植物中。叶绿素是一种重要的生物化学分子，它是光合作用的基础，而光合作用是一个重要的过程，它用太阳能产生生命赖以生存的氧气。通常，被收集的水样中叶绿素的量可以被用来计算悬浮的浮游植物的浓度，悬浮的浮游植物的浓度对水质有非常大的影响。

水和海水标准检测方法(Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater)的10200A节中详细介绍了将浮游植物作为指示物来检测水质的相关知识。检测特定地点水样中的叶绿素量的经典方法是收集相当大量的水样，然后将其做实验室分析。过程包括：将水样过滤以浓缩叶绿素包括有机体，对收集的细胞进行机械破碎，然后将破碎了的细胞中的叶绿素萃取到有机溶剂－丙酮中。然后用已知的叶绿素光学性质进行光谱光度测定或者用HPLC(高效液相色谱)对萃取物进行分析。通常的方法在水和海水标准检测方法(Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater)的10200A节中有详细的描述，多次的试验和应用表明只要进行实验室分析的分析员操作正确，这方法是非常准确的。这种操作通常在科学文献的报导中是可接受的。但是，这种方法耗时长、经常需要一名有经验的、高效率的分析员以得到长期准确和重复性好的结果。它也不能方便的用于叶绿素和浮游植物的连续监测，因为在合理的时间间隔(比如，1小时)内对样品进行收集是非常繁琐的。

YSI公司已经开发了YSI 6025叶绿素传感器用于叶绿素的采样研究或连续监测。它是根据另一种方法来进行叶绿素的测定，这种方法克服了这些缺点，虽然可能会损失一些准确度。用此方法进行测定时，叶绿素是被活体(in vivo)测定的，也就是说不像萃取分析那样破坏细胞。YSI 6025 叶绿素传感器是设计用来活体测定的，它的使用使得无论是采样研究或连续监测都可以简便、轻而易举的获得大量的叶绿素数据。但是，必须记住：活体分析得到的结果不会像萃取分析方法那样准确。

以下将会说明活体方法的局限性，您在用YSI 检测系统和传感器进行叶绿素测定之前必须充分考虑这些局限性。在采样研究或连续监测研究过程中将YSI 6025得到的数据同对少量样品进行萃取分析获得的数据相结合可以减少这种不准确度。但是，活体测定无法代替标准的方法。叶绿素系统简便易操作，而传统叶绿素测定方法获得的结果更准确，YSI估测的叶绿素浓度是传统方法测定结果的补充。

叶绿素的活体(in vivo)测定

叶绿素一个重要的特征是它可以发荧光，即当用特定波长的光照射它时，它可以发射出更高波长的光(或者更低能量)。叶绿素发荧光的能力是所有商品化荧光计可以进行叶绿素活体测定的基础。这种类型的荧光计已经使用了一段时间。这些仪器用合适波长的光束照射样品诱导叶绿素发荧光，然后检测叶绿素发射的更高波长的荧光。大多数的叶绿素系统使用峰波长大约在470nm的发光二极管(LED)作为激发光源。这种规格的LED产生的光束在光谱的可见区，是肉眼可见的蓝光。用这种蓝光照射时，在完整细胞中存在的叶绿素发射出的光在光谱的650-700nm的区域之内。为了量化荧光信号，系统检测器通常是高灵敏度的光敏二极管，并且用光学滤光片限定检测波长。滤光片阻止被水样中颗粒反射的470nm 的激发光被检测到。如果没有滤光片，混浊的水样即使没有发荧光的浮游植物，也可能表现为含有浮游植物。下面的图表可以帮助您更好的理解YSI系统的原理。

大多数的商品化荧光计都可以归为两类。第一类是台式的仪器，通常拥有很好的光学灵活性和能力，但相对昂贵，而且常常很难用于野外测定。第二类是探测器式的荧光计，它拥有固定的光学结构，但是较便宜，可以更方便的用于野外测定，并且通常与数据收集平台兼容。其中一些探测器式的荧光计需要使用泵，这样就需要更大容量的电池以适应野外测定。

独特的YSI叶绿素系统是YSI 环境监测系统主机的可选部件，它包括一个在原理上类似于探测器式荧光计的荧光系统，但是它体积很小，可以与YSI 6820，6920，600 OMS和6600主机的探头接口兼容。传感器的输出叶绿素结果自动通过主机软件进行处理，读数可以用一般荧光单位(generic fluorescence units，percent full scale; % FS)或者μg/L为单位。YSI系统不需要泵，因此允许传感器脱离主机内置电池或者YSI 650 MDS显示/记录仪电池工作。像YSI 6026和6136浊度探头一样，YSI 6025 叶绿素探头装配有一个机械清洁刷，可以手动或自动地定期清洗光学表面。YSI叶绿素传感器具有这些特点，因此它可以达到探测器型荧光计同样水平的性能，但是它更容易使用，可以在环境水样中连续使用几个星期，无需其它维修保养。另外，探头是主机的组成部分，主机还可以同时获得除叶绿素外的10个其它参数，而不是提供单个参数。

校准方法-概述

正如本手册第二部分中描述的，主机的软件提供了几种校准方法的选择：将一般荧光单位(generic fluorescence units，percent full scale; % FS)调零或者对μg/L表示的叶绿素进行1点、2点或者3点校正。大多数情况下，在0和中间范围(比如, ca. 100 μg/L)的2点校正就已经足够了。在通常环境水样叶绿素范围(0-400 μg/L)内进行3-点校正可以克服系统小的非线性。如果环境水样中的叶绿素含量范围已知，任意叶绿素数值标准都可以被用在3-点或2-点校正中。但是，标准中必须有一个等于0μg/L，并且这一点必须是校正序列中的第一个。

对YSI叶绿素系统进行校正，只有一种标准物可以保证野外现场读数的准确度: 已知叶绿素含量的浮游植物悬浮液。这种悬浮液中叶绿素的含量必须是通过萃取分析过程测定的，如标准方法中所述。在现场测量之前，多数用户会用主机软件进行的2-点校正，而此时大多数使用者没有这种被萃取分析过的浮游植物悬浮液。因此，最好的“校准”方法通常包含以下几个步骤：

1.在野外监测之前，将传感器放入干净的水中，在0μg/L进行1点校正

2.将主机浸没入一个染料标准物(如下)并记录下读数。注意您不是要将传感器“校正”

到染料的读数，而只是检查传感器的默认灵敏度

3.在进行野外现场读数时(采样或无人伺服研究)，收集一些样品并记录下数据/时间和采

样的地点

4.回到实验室后，对采集的样品进行萃取分析叶绿素，并记录下结果

5.研究完毕后，将您的YSI叶绿素数据放在电子表格的一列中，将实验室数据放在相邻

的一列中进行比较。计算每一个采样样品的现场读数与实验室结果的比值，然后将结果平均得到现场读数的调整比率(或者称为‘后校准’)以得到准确的叶绿素读数(相对于萃取分析而言)。

6.用电子表格的计算功能把所有YSI 6025现场读数乘以上述的校正比率，以得到尽可能

最准确的结果。

这种方法的0A变量是指在使用前用干净的水和染料标准物进行2-点校正，将显示的相当于染料标准物的叶绿素设置为下表所示的数值。然而，必须强调的是：这种方法并不会提高用上述1-点校正法进行校正的叶绿素传感器的准确度，使用者还是必须收集样品并进行实验室分析以确保叶绿素数值有意义。染料的使用主要是在使用过程中当传感器还原后，对染料溶液进行再次分析，以检查传感器的漂移。使用2-点校准可能会更容易定量使用的染料。但是，请记住用染料作为校准物并没有真正提高传感器的准确度。

准备染料溶液，检查传感器的漂移

吖啶橙(ACRIDINE ORANGE)标准溶液

警告：吖啶橙(acridine orange)被列入可能诱导有机体突变的物质，在操作过程中必须穿着合适的保护衣。用固体标准物配制标准溶液前请确认已阅读厂商提供的安全指导。谨切：只有经过训练的人员才可以处理这种化学品。

配制

按以下步骤配制吖啶橙(acridine orange)溶液作为检查传感器稳定性的试剂：

1.吖啶橙(acridine orange)通常被作为染料/标记物试剂使用，可从Sigma/Aldrich等供应

商处购得。请购买尽可能最少的量，因为通常只需要非常稀的溶液。下述的溶液是从吖啶橙盐酸盐，水合物(Acridine Orange Hydrochloride, Hydrate Sigma item # A 4921)配制而来。

2.准确称取0.0500g的吖啶橙(acridine orange)并定量转移到500mL的容量瓶中，用纯水

(蒸馏水或去离子水)溶解固体，加入20mL的1M盐酸作为安定剂，然后将容量瓶加到刻度。这个溶液中每1000ml水中包含100mg的吖啶橙(acridine orange)。(警告：使用盐酸时请确保遵循供应商的警告。)

3.准确量取上述配制的溶液2.0mL到一个1000mL的容量瓶中，加入20mL 1M的盐酸

作为安定剂，然后用纯水将容量瓶加到刻度。将溶液混合均匀，配制的溶液浓度为

0.20 mg/L(浓缩液按500：1稀释)。(警告：使用盐酸时确保遵循供应商的警告。)

4.浓缩标准溶液必须装在深色的玻璃瓶中保存于冰箱，防止分解。按上述步骤配制的稀

释标准溶液必须在配制后的1小时内使用。

如果以后需要吖啶橙(acridine orange)标准液时，只需要将浓缩染料溶液取出，回复到室温后再进行稀释。我们的经验表明保存在低温下的浓缩液比室温下保存的稀释液稳定得多。

众所周知，许多染料的荧光强度与温度成反比。用吖啶橙(acridine orange)对YSI叶绿素传感器进行“校正”时也必须考虑这种效应。以下表格表示温度与校正值之间的关系，根据温度输入正确的数值。

警告：当用吖啶橙(acridine orange)进行校正时，高级|传感器(Advanced|Sensor)菜单中的“Chl Tempco”因子必须被设置为0。

以下的表格表示近似等于0.2mg/L吖啶橙(acridine orange)的浮游植物叶绿素与温度的函数关系。

°C μg/L

Chl

to

Enter ° C μg/L Chl to

Enter

30 119 18 153 28 126 16 158 26 133 14 162 24 139 12 165 22 143 10 170 20 148 8 173

罗丹明B标准溶液(RHODAMINE B)

警告：罗丹明B被列入可能致癌/诱导有机体突变的物质，在操作过程中必须配戴手套。用固体物质配制标准溶液前请确认已阅读厂商提供的安全指导。谨切：只有经过训练的人员才可以处理这种化学品。

按以下步骤配制罗丹明B溶液作为检查传感器稳定性的试剂：

1.罗丹明B通常被作为标记物试剂使用，可从Sigma/Aldrich等供应商处购得。YSI使用

的是从Aldrich 化学品公司购得的罗丹明B (Item # R95-3)，因为这种染料产品有不同的纯度，我们建议您尽可能购买此货号的染料。请购买尽可能最少的量，因为只需非常稀的溶液。

2.准确称取0.0500g的罗丹明B固体并定量转移到500mL的容量瓶中，用纯水(蒸馏水

或去离子水)溶解固体，然后用去离子水或蒸馏水将容量瓶加到刻度。这个溶液中每1000ml水中包含100mg的罗丹明B。

3.准确量取上述配制的溶液5.0mL到一个1000mL的容量瓶中，然后用纯水将容量瓶加

到刻度。将溶液混合均匀，配制的溶液浓度为0.5 mg/L(浓缩液按200：1稀释)。

4.浓缩标准溶液必须装在深色的玻璃瓶中保存于冰箱，防止分解。按上述步骤配制的稀

释标准溶液必须在配制后的24小时内使用。

如果以后需要罗丹明标准液时，只需要将浓缩染料溶液取出，回复到室温后再进行稀释。我们的经验表明保存在低温下的浓缩液比室温下保存的稀释液稳定得多。

众所周知，许多染料的荧光强度与温度成反比。用罗丹明B对YSI叶绿素传感器进行“校正”时也必须考虑这种效应。以下表格表示温度与校正值之间的关系，根据温度输入正确的数值。

警告：当用罗丹明B进行校正时，高级|传感器(Advanced|Sensor)菜单中的“Chl Tempco”因子必须被设置为0。

以下的表格表示近似等于0.5mg/L罗丹明B的藻类叶绿素与温度的函数关系。

T, C ug/L Chl to

Enter T, C Ug/L Chl to

Enter

30 72.6 18 86.4

28 74.1 16 90.8

26 75.6 14 93.2

24 77.0 12 95.1

22 79.4 10 98.0

20 82.0 8 100.0

罗丹明 WT标准溶液(RHODAMINE WT )

警告：操作前请确认已阅读厂商提供所有安全指导和MSDS文件。谨切：只有经过训练的人员才可以处理这种化学品

按以下步骤配制罗丹明WT溶液作为检查传感器稳定性的试剂：

1.罗丹明WT购买时通常是溶液形式，标识的浓度会有些差别。YSI 使用的罗丹明WT

购自以下所示的供应商，我们建议您尽可能购买此货号的染料。这种溶液大约含有2%的罗丹明WT。

Fluorescent FWT Red Dye (Lot# 257201; 16 Fl. Oz.)

Kingscote Chemicals

9676 N. Looney Road

Piqua, OH 45356

1-800-394-0678

Fax: 937-773-7994

2.准确量取5.0mL罗丹明WT溶液并定量转移到1000mL的容量瓶中，用纯水(蒸馏水或

去离子水)将容量瓶加到刻度。混合均匀后这个溶液中每1000ml水中包含100mg的罗丹明WT。将此溶液转移至玻璃瓶中以备将来使用。

3.准确量取上述配制的溶液5.0mL到一个1000mL的容量瓶中，然后用纯水将容量瓶加

到刻度。将溶液混合均匀，配制的溶液浓度为0.5 mg/L(浓缩液按200：1稀释)。

4.浓缩标准溶液必须装在深色的玻璃瓶中保存于冰箱，防止分解。按上述步骤配制的稀

释标准溶液必须在配制后的24小时内使用。

如果以后需要罗丹明WT标准液时，只需要将浓缩染料溶液取出，回复到室温后再进行稀释。我们的经验表明保存在低温下的浓缩液的稳定性大大好于室温下保存的稀释液的稳定性。

众所周知，许多染料的荧光强度与温度成反比。用罗丹明WT对YSI叶绿素传感器进行“校正”时也必须考虑这种效应。以下表格表示温度与校正值之间的关系，根据温度输入正确的数值。

警告：当用罗丹明WT进行校正时，高级|传感器(Advanced|Sensor)菜单中的“Chl Tempco”因子必须被设置为0。

以下的表格表示近似等于0.5mg/L罗丹明WT的藻类叶绿素与温度的函数关系。

T, C ug/L Chl to

Enter T, C Ug/L Chl to

Enter

30 100 18 122 28 103 16 126 26 106 14 131 24 110 12 136 22 113 10 140 20 118 8 144

谨记：使用吖啶橙、罗丹明B、罗丹明WT 进行的“校正”只是近似值。要保证从6025传感器中得到准确的读数，使用者必须将现场得到的荧光读数与上述的样品萃取分析得到的结果相联系。因为这些局限性YSI不提供叶绿素测定准确度的技术指标说明。

温度对读数的影响

虽然温度对传感器叶绿素本身的读数的影响很小，但YSI 进行的实验表明浮游植物悬浮液的荧光受温度的影响很大。例如，当温度从21°C下降到1°C时，实验测试的藻类样品的叶绿素含量从185μg/L上升到226μg/L，尽管水样中的浮游植物的量没有发生任何变化。如果不进行温度补偿，当被测地点的温度与校正温度有很大差别时，这种影响将会导致现场叶绿素读数的错误。通过使用主机软件高级|传感器(Advanced|Sensor)菜单下的一个叶绿素温度补偿程序(“Chl tempco”)可以减少这种误差。

对于我们的研究，在“Chl tempco” 输入每°C 2%的数值是合适的，可以部分解决环境水样中浮游植物的荧光随温度的变化。这个数据可以通过估算得到，例如上面提到的那个例子的估算如下：

温度变化 = 21–1 = 20 °C

荧光变化 = 226-185 = 41 μg/L

% 荧光变化 = (41/185) x 100 = 22.1

Chl Tempco 因子 = 22.1/20 = 1.11 % per degree °C

注意：使用这种由经验得到的补偿因子并不保证准确的现场读数，因为每一种浮游植物的荧光强度随温度的变化程度不同。荧光强度随温度变化是活体(in vivo)荧光方法的最大局限性，通过补偿只能减小或减低这种影响。总的来说，最好的减小误差的方法就是用已知叶绿素含量的浮游植物标准品进行校正，并且校准温度必须尽可能与被测的环境水样的温度一致。

沉积物对光学测量法的影响

野外光学测定极易受沉积物的影响，这种影响不仅来自于长时间的生物、化学残留的聚集，也可能来自于对环境水样进行除气时产生的气泡的影响。在短时间的采样研究中，可以手动的搅动主机以除去这些气泡。对于超过几小时的长期研究来说，使用者不可能一直在现场，用不带机械清洁刷的荧光传感器得到的叶绿素读数很可能是不正确的。YSI 6025探头安装有机械清洁刷，这使它可以很好的用于无人伺服状态下的研究。在不连续采样操作过程中可以实时激活清洁刷，在长期无人伺服监测研究时每次采样之前都会自动运行。清洁刷运动的次数和无人伺服模式下清洗循环次数可以在主机软件中进行设定。通常，对于大多数的应用，清洁刷运动一次就已经足够了，但是在特别混浊的媒介中可能需要额外的清洗循环。

浊度对叶绿素读数的影响

如上所述，YSI 6025叶绿素探头的光敏二极管前的滤光片阻止了大多数470nm的光线进入检测器，这些光线原本用于激发叶绿素分子发出荧光，但被水样中的非荧光颗粒(混浊)反射。然而，滤光系统不是完美无缺的，因此悬浮固体对叶绿素的读数还是有小部分的影响。实验室实验证明用YSI 6026传感器检测的固体悬浮液受浊度的影响因子大约0.03

μg/L 每 NTU。例如，水样的浊度大于100 NTU就会呈现叶绿素读数等于3 μg/L。在非常混浊的水样中，使用者可能需要用独立测定的浊度数值和上述的补偿因子通过电子表格来校正叶绿素读数。

叶绿素活体( IN VIVO)测定的局限性

如上所述，用活体(in vivo)荧光测定的方法进行叶绿素测定经常比用标准方法测定的结果可信度低，标准方法必须是测定从细胞中提取的叶绿素分子（如Standard Methods中所述）。本节描述了关于活体(in vivo)荧光测定存在的一些问题。

其它荧光物种的影响:标准方法(Standard Methods)方法中描述的分析方法是将存在于悬浮液中的活生物体破碎，然后将叶绿素分子萃取到有机溶剂中形成均一溶液。将萃取物酸化

有助于减小许多其它非叶绿素物质的干扰。另外，可以在分光光度计的多个波长处读数以区分不同的叶绿素形式(a, b, c)和脱镁叶绿素a(pheophytin a)。

如上所述，标准可以很好的排除其它非叶绿素物质的干扰，与此不同，所有的活体传感器操作都是在保存多种完整细胞的情况下进行的，传感器会检测到、至少部分检测到所有在470nm光照射下会在光谱630nm以上区域发荧光的物质。因此，传感器在这种光学条件下事实上是对所有的荧光物质进行定量，而不是特异性的针对叶绿素。虽然可能大部分的荧光都是由悬浮植物和藻类发出的，而大部分的生物荧光都是来自于叶绿素，但是用上述方法要完全排除其它荧光物质的干扰是不可能的。

注意：活体(in vivo)荧光光度计通常不能区分不同形式的叶绿素。

缺少校准试剂:标准方法中用有机溶剂萃取叶绿素后，会使用从化学品供应商(如Sigma)处购得的“提纯叶绿素a purified chlorophyll a”作为标准物质，对荧光测定进行校准。这些标准物在水介质中不太稳定，即使它们可以稳定存在，它们的荧光也不可能与存在于完整活细胞中的叶绿素完全一致。因此，即使对于半定量的校准过程，使用者也需要使用一个“替代”标准物质(如上所述的吖啶橙Acridine Orange)以测定传感器的灵敏度。对完整细胞的悬浮液进行的活体测定，如果以这种类型的校准为基础，得到的现场读数只能是对环境水样中的叶绿素估算。可以给活体叶绿素传感器提供最好准确的校准标准物是浮游植物悬浮液，并且此悬浮液已有部分用萃取方法进行了叶绿素含量的测定。我们建议用户使用这种方法，并且建议此悬浮液应该是从被监测地点获得，这样标准物中产生荧光的物质可以尽可能的接近于现场的生物体。要真正评估长期监测研究的数据可靠性，必须定期采集样品，比如每周采一次样，然后将其进行实验室分析。这些数据随后可以在研究过程中被用于读数的“后校准postcalibrate”，可以使用电子表格进行简单的数学运算。无论如何，从任何活体(in vivo)荧光传感器获得定量数据都比从其它环境传感器获得定量数据困难得多。因为这个原因，很难提供活体(in vivo)荧光测定叶绿素的准确度规范，因此YSI 6025没有准确度的技术指标描述。

细胞结构、颗粒大小和生物体类型对活体读数的影响:即使活体(in vivo)荧光测定中唯一的荧光物质是叶绿素，并且有可信赖的校准标准物，确定叶绿素的绝对量可能仍然非常困

难，因为样品不是均一的。不同的藻类会有不同的形状和大小，即使叶绿素的种类和含量完全一致，荧光也会不同。这大大限制了活体测定的准确度。

温度对浮游植物荧光的影响:如上所述，YSI 的实验证明浮游植物随着温度的下降而升高。因此浮游植物悬浮液在低温时的读数将会比室温下的读数高，似乎表明前者存在更多的浮游植物，然而这是错误的。除非考虑了这个影响效应，否则大多数的野外读数都将会有一些误差，因为野外现场的温度与校准时的温度是不同的。高级|传感器(Advanced|Sensor)菜单中“Chl Tempco”因子的使用将有助于减少这种误差，但是使用时应当谨慎，因为每一种的浮游植物可能对温度的依赖性会有轻微的不同。

光线对浮游植物荧光的影响:文献中普遍认为浮游植物中的叶绿素荧光会受光的抑制。实验数据已经证实了这种“光抑制”，在浮游植物保持一定时，在一天中荧光信号会发生变化，白天时荧光强度较弱而夜晚时荧光强度较强。表明这种昼夜循环的数据参见附录I，叶绿素测定。这种效应无疑将会对叶绿素绝对数值带来误差，除非使用者考虑了这种影响。

标准方法中的叶绿素一节证实了这些局限性，还包括通用荧光计制造商们提供的应用提示。这些局限性导致了任何活体叶绿素传感器的定量能力大大小于YSI主机使用的其它传感器。

测定和校准小提示

为了得到最好的结果，对于现场采集的用于传感器“校正”的样品要尽可能快的进行分析。

如果校正过程中出现不寻常的高读数或读数的跳跃，可能是因为光学器件表面上有气泡。进行校正之前，必须手动启动清洁刷清洗光学器件表面。

YSI 荧光传感器的输出不仅受环境介质中浮游植物总浓度的影响，而且也受经过探头表面光学器件的悬浮颗粒的大小和运动速度的影响。因此，虽然一个环境样品中的浮游植物含量肉眼看来好像相对稳定，但它的叶绿素可能表现有很大的变化，这取决于检测瞬间光学

通道中颗粒的性质。例如，在对环境水样进行不连续采样分析时，读数的变化可以非常大。用染料标准物时不会出现这种明显的跳跃，因为溶液是均一的，没有悬浮物质。

主机的叶绿素系统允许用户应使用一个数学过滤器对原始数据进行处理，这样传感器输出的结果会更能代表环境水样中浮游植物含量的平均值。从主机软件的8-高级菜单，用户可能激活并调整这个数据过滤器。对于经典的采样和监测研究，YSI建议叶绿素数据过滤器设置为如下：Enabled -- On; Wait for Filter -- Off; Chlorophyll Time Constant = 12; Chlorophyll Threshold = 1。数据过滤器的优点就是使叶绿素读数显示更稳定。

5.14 罗丹明 WT

介绍及操作原理

罗丹明 WT 是一种红色的染料，通常用于流量研究。当罗丹明 WT被合适波长的光照射时会发荧光，YSI6130罗丹明 WT传感器可以检测到这种荧光，原理如上述的YSI6025叶绿素传感器。运用这一原理，可以测定被测水中不同地点(水平的或垂直的)该物质的量。

叶绿素，罗丹明 WT 可以发荧光，也就是，当特定波长的光照射它们时，它们可以发射更高波长的光(或更低能量)。罗丹明 WT 的这种发荧光的能力是所有现场(in situ)检测罗丹明WT的商品化荧光计的基础。这种类型的荧光计已经使用了一段时间。这些仪器用合适波长的光束照射样品诱导罗丹明 WT发荧光，然后检测发射的更高波长的荧光。大多数的罗丹明系统使用峰波长大约在540nm的发光二极管(LED)作为激发光源。这种规格的LED 产生的光束在光谱的可见区，是肉眼可见的绿光。用这种绿光照射时，罗丹明 WT发射出的比激发波长长的可见光，也就是罗丹明荧光。为了量化荧光信号，系统检测器通常是高灵敏度的光敏二极管，并且用光学滤光片限定检测波长。

滤光片减少了(a)被水样中颗粒反射的激发光；(b)其它荧光物质的干扰，比如浮游植物中的叶绿素。如果没有滤光片，混浊的水样或者含有大量浮游植物的水样也可能表现为含有罗丹明 WT，即使事实上并没有罗丹明 WT的存在。下面的图表可以帮助您更好的理解YSI罗丹明 WT系统的原理。

(完整word版)叶绿素含量的测定

叶绿素含量的测定 一、原理 根据叶绿体色素提取液对可见光谱的吸收，利用分光光度计在某一特定波长测定其吸光度，即可用公式计算出提取液中各色素的含量。 根据朗伯—比尔定律，某有色溶液的吸光度A 与其中溶质浓度C 和液层厚度L 成正比，即A ＝αCL 式中：α比例常数。当溶液浓度以百分浓度为单位，液层厚度为1cm 时，α为该物质的吸光系数。各种有色物质溶液在不同波长下的吸光系数可通过测定已知浓度的纯物质在不同波长下的吸光度而求得。 如果溶液中有数种吸光物质，则此混合液在某一波长下的总吸光度等于各组分在相应波长下吸光度的总和。这就是吸光度的加和性。今欲测定叶绿体色素混合提取液中叶绿素a 、b 和类胡萝卜素的含量，只需测定该提取液在三个特定波长下的吸光度A ，并根据叶绿素a 、b 及类胡萝卜素在该波长下的吸光系数即可求出其浓度。在测定叶绿素a 、b 时为了排除类胡萝卜素的干扰，所用单色光的波长选择叶绿素在红光区的最大吸收峰。 已知叶绿素a 、叶绿素b 的80%丙酮溶液在红外区的最大吸收峰分别位于663、645nm 处。已知在波长663nm 下叶绿素a 、叶绿素b 在该溶液中的吸光系数的分别为82.04和9.27；在波长645nm 处的吸光系数分别为16.75和45.60。根据加和性原则列出以下关系式： A663=82.04Ca+9.27Cb （1） A645=16.76Ca+45.60Cb （2） 式（1） （2）A 663nm 和A645nm 为叶绿素溶液在663nm 和645nm 处的吸光度，C a C b 分别为叶绿素a 、叶绿素b 的浓度，以mg/L 为单位。 解方程（1） （2）组得 C a =12.72 A 663—2.59 A 645 (3) C b =22.88 A 645—4.67 A 663 (4) 将C a +C b 相加即得叶绿素总量C T C T ＝ C a 十C b ＝20.29A 645—8.05 A 663 (5) 从公式（3）、（4）、（5）可以看出，，就可计算出提取液中的叶绿素a 、b 浓度另外，由于叶绿素a 叶绿素b 在652nm 的吸收峰相交，两者有相同的吸光系数（均为30.5），也可以在此波长下测定一次吸光度（A 652）而求出叶绿素a 、叶绿素 b 总量 所测定材料的单位面积或单位重量的叶绿素含量可按下式进行计算： C T ＝ 5 .341000 652 A (6) 有叶绿素存在的条件下，用分光光度法可同时测出溶液中类胡萝卜素的含量。Licht-enthaler 等对Arnon 进行了修正，提出了 80%丙酮提取液中3种色素含量的计算公式： C a ＝12.21A 663—2.59 A 646 (7)

植物叶绿素测定方法

叶绿素含量的测定 一、原理 根据叶绿体色素提取液对可见光谱的吸收，利用分光光度计在某一特定波长测定其吸光度，即可用公式计算出提取液中各色素的含量。根据朗伯—比尔定律，某有色溶液的吸光度A与其中溶质浓度C和液层厚度L成正比，即A＝αCL式中：α比例常数。当溶液浓度以百分浓度为单位，液层厚度为1cm时，α为该物质的吸光系数。各种有色物质溶液在不同波长下的吸光系数可通过测定已知浓度的纯物质在不同波长下的吸光度而求得。如果溶液中有数种吸光物质，则此混合液在某一波长下的总吸光度等于各组分在相应波长下吸光度的总和。这就是吸光度的加和性。今欲测定叶绿体色素混合提取液中叶绿素a、b和类胡萝卜素的含量，只需测定该提取液在三个特定波长下的吸光度A，并根据叶绿素a、b 及类胡萝卜素在该波长下的吸光系数即可求出其浓度。在测定叶绿素a、b时为了排除类胡萝卜素的干扰，所用单色光的波长选择叶绿素在红光区的最大吸收峰。 二、材料、仪器设备及试剂 （一）材料：新鲜（或烘干）的植物叶片。 （二）仪器设备：1）分光光度计；2）电子顶载天平（感量0.01g）；3）研钵；4）棕色容量瓶； 5）小漏斗；6）定量滤纸；7）吸水纸； 8）擦境纸；9）滴管。 （三）试剂：1）95%乙醇（或80%丙酮）（v丙酮：v乙醇=2：1的95%水溶液）；2）石英砂；3）碳酸钙粉。暗中2h，0.5g，25ml 三、实验步骤 1）取新鲜植物叶片（或其它绿色组织）或干材料，擦净组织表面污物，剪碎（去掉中脉），混匀。 2）称取剪碎的新鲜样品 0.2g ，共3份，分别放入研钵中，加少量石英砂和碳酸钙粉及2～3ml 95%乙醇，研成均浆，再加乙醇10ml，继续研磨至组织变白。静置3～5m 3）取滤纸1张，置漏斗中，用乙醇湿润，沿玻棒把提取液倒入漏斗中，过滤到25ml棕色容量瓶中，用少量乙醇冲洗研钵、研棒及残渣数次，最后连同残渣一起倒入漏斗中。 4）用滴管吸取乙醇，将滤纸上的叶绿体色素全部洗入容量瓶中。直至滤纸和残渣中无绿色为止。最后用乙醇定容至25ml，摇匀。 5）把叶绿体色素提取液倒入光径1cm的比色杯内，以95%乙醇为空白，在波长663nm 和645nm下测定吸光度。在波长663nm、645nm下或652nm测定吸光度。 四、实验结果计算 叶绿素a的含量 = 12.7 ? OD 663 – 2.69 ? OD 645 叶绿素a的含量 = 22.9 ? OD 645 – 4.86 ? OD 663 叶绿素a、b的总含量 = 8.02 ? OD 663 + 20.20 ? OD 645

叶绿素a的测量-乙醇提取法

Hydrobiologia485:191–198,2002. ?2002Kluwer Academic Publishers.Printed in the Netherlands. 191 Chlorophyll-a determination with ethanol–a critical test ′Eva P′a pista1,′Eva′Acs2&B′e la B?ddi3,? 1E?tv?s Lor′a nd University of Science,Doctoral School,P′a zm′a ny P′e ter allee1/A,Budapest H-1117,Hungary 2E?tv?s Lor′a nd University of Science,Department of Microbiology,P′a zm′a ny P′e ter allee1/C Budapest H-1117, Hungary 3E?tv?s Lor′a nd University of Science,Department of Plant Anatomy,P′a zm′a ny P′e ter allee1/C,Budapest H-1117,Hungary Tel:12660240;E-mail:bbfotos@ludens.elte.hu (?Author for correspondence) Received2May2001;in revised form30August2002;accepted20August2002 Key words:algae,chlorophyll-a determination,ethanol,ISO standard10260(1992) Abstract Chlorophyll-a content is widely used as an indicator of the quality of freshwater bodies.Quanti?cation of chlorophyll-a is a routine procedure in the test laboratories of water works,and in research laboratories.Although attempts have been made to standardise the measurement procedure,there are nonetheless many procedures currently in use.This work is focused on a careful re-examination of the ISO:10260,1992standard,which prescribes90%(v/v)ethanol for chlorophyll extraction and measurement.Chlorophyll contents of cultures of the cyanobacterium Synechococcus elongatus N?geli and the chlorophyte Scenedesmus acutus Meyen were determined by means of a series of concentrations of ethanol/water mixtures which were employed as extracting agents–the water content was gradually decreased from20to0%.The extraction procedure was veri?ed by measuring the amount of retained water after using both water and oil pumps for?ltering the samples.The spectroscopic effects of the presence of water were studied and the molecular background of these spectral phenomena is discussed.The extraction yields obtained with90%ethanol were compared to those obtained with methanol and acetone.On the basis of the calculated error level,improvements to the ISO:10260,1992standard method have been suggested. Introduction The chlorophyll(Chl)content of freshwater bodies is a widely accepted indicator of water quality.Research projects on periphyton(Cattaneo,1983;Jonsson, 1987;Robinson&Rushforth,1987;Pantecost,1991) or phytoplankton(Kiss&Genkal,1993;Balogh et al., 1995;Jones,1995;Kiss,1996;Sha?k et al.,1997; Skidmore et al.,1998;Kiss et al.,1998)use these characteristics to describe the trophic state(Sumner &Fisher,1979;V?r?s&Padisák,1991;Talling, 1993)of the studied system.However,the identi?c-ation of the alga species,the knowledge of the algal cell number,or the physiological state of cells may also be important in providing a true picture of the water quality or trophic state.A combination of Chl determination and consideration of these other factors may provide an improvement in the reliability and ac-curacy of water quality estimation.Uterm?hl(1958) developed a method to determine the individual num-ber of algae with an inverted microscope and Lund et al.(1958)described a procedure to estimate the accuracy and limitations of Uterm?hl’s method. If certain taxa are in developing or degrading stages in the studied populations,consideration of the factors above is essential,since certain species produce toxins harmful to both water animals and hu-man(Slatkin et al.,1983;Codd et al.,1992).It has been established that the presence of algae and thus the Chl content indicate the concentration of certain chemicals or the appearance of toxins in the drinking water(Bernhardt&Clasen,1991).Thus,considera-

叶绿素检测作业指导书

叶绿素检测作业指导书 1.试剂 1.1碳酸镁悬浮液：称取 1.0g细粉末碳酸镁悬浮于100ml蒸馏水中。每次使用 时，要充分摇匀。 1.2丙酮溶液：在900ml丙酮中加100ml蒸馏水。 1.3盐酸溶液：量取83ml盐酸溶于水中，冷却并稀释至1000ml。 2.测定步骤 2.1浓缩：在一定量的试样中添加0.2ml碳酸镁悬浮液，充分搅匀后，用直径60mm的微孔滤膜吸滤。过滤器内无水分后，还要继续抽吸几分钟。如果要延时提取，可把载有浓缩样品的滤膜放在干燥器里冷冻避光贮存。 2.2提取：将载有浓缩样品的滤膜放入研钵中，加入3ml丙酮溶液至滤纸浸湿的程度，把滤膜研碎，再少量地加90%的丙酮溶液，把滤膜完全研碎，然后用90%丙酮溶液将已磨碎的滤膜和丙酮溶液洗入带刻度的带塞离心管中，使离心管内提取液的总体积不超过6ml，盖上管塞，置于4℃的暗处浸泡24h。 2.3离心：将离心管放入离心机中，以4000r/min速度离心分离20min。将上清液移入标定过的10ml具塞刻度

管中，加少量90%丙酮溶液于原提取液的离心管中，再次悬浮沉淀物并离心，合并上清液。此操作重复2~3次，直至沉淀不含色素为止，最后将上清液定容至10ml。 2.4测定：取上清液于10mm或50mm的比色池中，以90%丙酮溶液为对照溶液，读取波长750,663,645和630nm 的吸光度。选择比色池的光程长度或稀释度，使其光密度OD663大于0.2小于1.0。 3.结果表示 从各波长的吸光度中减去波长750nm的吸光度，作为已校正过的吸光度D，按下式计算叶绿素的浓度： Ca=（11.64D663-2.16D645+0.10D630）V1/(V2·L) Cb=(20.97D645-3.94D663-3.66D630)V1/(V2·L) Cc=（54.22D630-14.8D645-5.53D663）V1/(V2·L) 式中: Ca——叶绿素a的浓度； Cb——叶绿素b的浓度； Cc——叶绿素c的浓度； V1——提取液的定容体积； V2——过滤水样的体积； L——比色池的光程长度； D——已校正过的提取液吸光度。

叶绿素的测定

叶绿素含量的测定（参考李合生） 一、实验原理 根据叶绿体色素提取液对可见光谱的吸收，利用分光光度计在某一特定波长下测定其吸光度，即可用公式计算出提取液中各色素的含量。 二、材料、仪器设备及试剂 25ml容量瓶14个，分别标号0~6和0Y~6Y（标有Y的装子叶,带0的表示实验组）； 80%的丙酮；剪刀；手术刀；注射器；长方形硬纸盒 三、试验方法与步骤 1、叶绿素的提取 取一个实验组，从每个培养皿中取出等量个数的材料，用手术刀将根茎叶分开，再单独取叶或茎剪碎，称取叶0.1g左右，茎段0.2g左右；记录各组的质量，然后分别放入对应的容量瓶中，等到所有实验组的叶和茎都装入容量瓶后，再用注射器吸取适量80%的丙酮，加入容量瓶中，并定容至刻度线，摇匀后立即放入预先准备的纸盒中（内用报纸垫着），依次逐个加入。等所有的都加完后，把纸盒放在暗处，提取24小时以上，备用。 2、分光光度计测定其OD值 打开分光光度计，设置470、663、646nm三个波段，测量次数设为3，间隔10s。预热30min。预热结束后，用80%的丙酮较零，取出遮光下的溶液，从容量瓶中直接倒到比色杯中开始测量，每组试剂测3次。 注：之前先测两个实验组，若值偏大，可适当用80%的丙酮稀释，并记录好稀释倍数四、结果计算 叶绿素a Ca=12.21*A663-2.81*A646 叶绿素b Cb=20.13*A646-5.03*A663 类胡萝卜素Cx=（1000*A470-3.27*Ca-104*Cb）/229 叶绿素色素含量=色素浓度*提取液体积*稀释倍数/样品鲜重（mg/g） 注：A663、A646、A470分别指在663、646、470nm波长下的吸光度。

叶绿素测定方法

实验三十三叶绿素含量的测定(分光光度法) 根据朗伯-比尔（Lambert-Beer）定律，某有色溶液的吸光度A值与其中溶质浓度C以及光径L成正比，即A＝aCL（a为该物质的吸光系数）。各种有色物质溶液在不同波长下的吸光值可通过测定已知浓度的纯物质在不同波长下的吸光度而求得。如果溶液中有数种吸光物质，则此混合液在某一波长下的总吸光度等于各组分在相应波长下的吸光度的总和，这就是吸光度的加和性。今欲测定叶绿体色素提取液中叶绿素a、b含量，只需测定该提取液在2个特定波长下的吸光度度值，并根据叶绿素a与b在该波长下的吸光系数即可求出各自的浓度。在测定叶绿素a、b含量时，为了排除类胡萝卜素的干扰，所用单色光的波长应选择叶绿素在红光区的最大吸收峰。 已知叶绿素a、b的80％丙酮提取液在红光区的最大吸收峰分别为663nm和645nm，又知在波长663nm下，叶绿素a、b在该溶液中的比吸收系数分别为82.04和9.27，在波长645nm 下分别为16.75和45.60，可根据加和性原则列出以下关系式： A663=82.04Ca+9.27Cb (1) A645=16.75Ca+45.6Cb (2) 式中A663、A664分别为波长663nm和645nm处测定叶绿素溶液的吸光度值；Ca、Cb分别为叶绿素a、b的浓度(g/L)。 解联立方程(1)、(2)可得以下方程： Ca=0.0127A663-0.00269A645 (3) Cb=0.0229A645-0.00468A663 (4) 如把叶绿素含量单位由g/L改为mg/L，(3)、(4)式则可改写为： Ca(mg/L)=12.7A663-2.69A645 (5) Cb(mg/L)=22.9A645-4.68A663 (6) 叶绿素总量CT(mg/L)=Ca+Cb=20.2A645+8.02A663 (7) 叶绿素总量也可根据下式求导 A652=34.5×CT 由于652nm为叶绿素a与b在红光区吸收光谱曲线的交叉点(等吸收点)，两者有相同的比吸收系数（均为34.5），因此也可以在此波长下测定一次吸光度（A652）求出叶绿素总量：CT(g/L)=A652/34.5 CT(mg/L)=A652×1000/34.5 (8) 因此，可利用(5)、(6)式可分别计算叶绿素a与b含量，利用(7)式或(8)式可计算叶绿

叶绿素含量的测定

叶绿素含量的测定 绿素含量的绿定叶 一、绿绿目的 1.了解分光光度绿的工作原理～ 2.掌握不同型分光光度绿的操作方绿～号 3.通绿本绿绿的绿掌握绿素含量绿定的一绿常绿的方法学叶------分光光度法。 二、绿绿原理 叶叶体体体叶绿素是脂溶性色素～主要存在于以绿绿首的色素中。在活中～绿绿 素脂蛋白绿合受到绿原系绿的保绿～绿和光是绿定的。与并氧 叶绿素的80%丙绿提取液在波绿663nm～645nm有吸收峰～绿素叶a和绿素叶b 的绿度符合以下公式, C=0.0127A-0.00259A a663645 C=0.0229A-0.00467A绿度绿位是,g/Lb645663 C=12.7A-2.59Aa663645 C=22.9A-4.67A绿度绿位是,mg/Lb645663 叶绿素绿绿度绿, C=C+CTab 若以绿液中色素含量表示～绿来 三、绿器、绿绿和材料 1.绿器 紫外-可绿分光光度绿、、研体25ml容量、璃漏斗、璃棒、皮绿滴管瓶玻玻2. 绿绿

丙绿;分析绿,、85%丙绿、80%丙绿 2.材料 绿绿、石英砂、酸绿碳 四、操作步绿 1. 在遮光件下取出等绿绿品～剪碎～混～取绿绿条匀称0.1-0.5g～ 2. 绿品置于绿～加入少量酸绿和石英砂～加入一定绿的丙绿磨绿绿～再加研内碳体研匀 85%丙绿适量绿绿磨至绿绿白色～研 3. 绿绿有绿绿的漏斗绿液绿入将匀25ml的容量中～用瓶并80%的丙绿分次洗绿和绿绿清研～ 最后用80%的丙绿定容。 4. 以80%的丙绿绿比液～在参663和645nm波绿绿绿定吸光绿;A绿在0.2-0.8范绿～内 绿度绿大绿用80%丙绿适稀绿,。当 五、绿果绿理 按照公式绿算出绿素叶a和绿素叶b的绿度～再绿算出绿素的含量。叶六、 注意事绿 1. 在活～绿合绿绿素是绿定的～绿绿一绿破～绿素易被光解。因此～抽提和绿体内叶坏叶 定工作绿可能避光快速完成。尽 2. 绿含有大量酸性液泡的绿品～绿首先加入微性的绿液～仔绿磨后加入丙绿绿行碱冲研抽提。 3. 分光光度绿的精度绿绿定的绿果有至绿重要的影～使用前绿绿器绿行校正。响七、思考绿

叶绿素含量测定方法(精)

叶绿素含量测定方法---丙酮法 由于微藻的生长周期比较复杂，包括无性繁殖阶段和有性繁殖阶段，其在不同阶段的生理形态不同，有时藻细胞会聚集在一起，以片状或团状形式存在，在显微镜下难以确定其所包含的细胞数量。 藻细胞中叶绿素的含量（特别是叶绿素a的含量）通常随与细胞的生长呈较好的线性关系，因此可通过测定藻细胞中叶绿素含量变化来反映微藻的生长情况。叶绿素测定采用丙酮研磨提取法。 取适量藻液于10 mL离心管中在4000 rpm转速下离心10 min，弃去上清液，藻泥中加入适量的100 %的丙酮。采用丙酮提取法时在试管研磨器中冰浴研磨5 min，4000 rpm离心后，上清液转入10 mL容量瓶中。按上述方法对藻体沉淀进行萃取，直至藻体沉淀呈白色为止。定容后，采用722S型可见分光光度计分别测定645 nm和663 nm下萃取液的吸光值，叶绿素含量用以下公式进行计算（Amon,1949）： 叶绿素a含量用以下公式进行计算： Chlorophyll a (mg/L) = (12.7×A663 nm－2.69×A645 nm)×稀释倍数 叶绿素b含量用以下公式进行计算： Chlorophyll b (mg/L) = (22.9×A645 nm－4.64×A663 nm)×稀释倍数 叶绿素总含量用以下公式进行计算： Chlorophyll a＋b (mg/L) = (20.2×A645 nm＋8.02×A663 nm)×稀释倍数 由于丙酮的沸点较低，较高温度下挥发很快。此外，叶绿素稳定性较差，见光易分解，因此，本实验中叶绿素的提取和测定均在低温黑暗条件下进行，以减少提取过程中的损失。 叶绿素提取方法 提取液：本试验用DMSO/80%丙酮(l/2，v/v)提取的叶绿素，谭桂英周百成底栖绿藻叶绿素的二甲基亚砜提取和测定法* 海洋与湖沼 1987 18（3）295--300. 一、直接浸提法： 1、准确量取10ml藻液,加到15ml离心管中，放在台式离心机离心，3500r/min （根据不同的藻选择不同那个的离心转速）离心5min倒上清；留藻泥。随后在盛有藻泥的离心管中加入蒸馏水，与藻泥混匀后再次离心，目的是除去藻细胞表面的盐份，此清洗过程重复三次。 2、往藻泥中加二甲基亚砜3.33ml，65℃水浴9h，20h； 3、然后离心，将上清转移到10ml棕色瓶中， 4、添加6.67ml80%丙酮到离心管中，混匀，离心，再将上清转移到10ml棕色瓶中。 5、定容，待测。

叶绿体色素的提取分离理化性质和叶绿素含量的测定

实验报告 植物生理学及实验（甲）实验类型：课程 名称：实验名称：叶绿体色素的提取、分离、理化性质和叶 绿素含量的测定姓名：专业：学 号：指导老师：同组学生姓名： 实验日期：实验地点： 二、实验内容和原理一、实验目的和要求装 四、操作方法与实验步骤三、主要仪器设备订 六、实验结果与分析五、实验数据记录和处理 七、讨论、心得一、实验目的和要求、掌握植物中叶绿体色素的分离和 性质鉴定、定量分析的原理和方法。1 和b的方法及其计算。a2、熟悉在 未经分离的叶绿体色素溶液中测定叶绿素二、实验内容和原理以青菜为 材料，提取和分离叶绿体色素并进行理化性质测定和叶绿素含量分析。 原理如下：80%的乙醇或95%叶绿素和类胡萝卜素均不溶于水而溶于有机溶剂，1、常用的丙酮提取。、皂化反应。叶绿素是二羧酸酯，与强碱反应， 形成绿色的可溶性叶绿素2． 盐，就可与有机溶剂中的类胡萝卜素分开。- COOCHCOO3 Mg + 2KOH C32H30ON4Mg + 2KOH +CH3OH

HONC43230+C20H39OH 、3H+可依次被在酸性或加温条件下，叶-COOCOOCH39 20 绿素卟啉环中的Mg++取代反应。Mg2+, Cu2+ 取代Cu++取代形成褐色的去镁叶绿素和绿色的铜代叶绿素。(H+和H+ ) 取代(Zn2+) 绿色褐色 、叶绿素受光激发，可发出红色荧光，反射光下可见红色荧光。4645其中叶绿素吸收红光和兰紫光，红光区可用于定量分析，5、定量分析。 652可直接用于总量分析。663用于定量叶绿素a,b及总量，而和C最大吸收光谱不同的两个组分的混合液，它们的浓度根据朗伯-比尔定律， *k+C*kOD=Ca*k与吸光值之间有如下的关系： OD=Ca*k+C b2 1g/L和b的80查阅文献得，2b1 b1a1a2b时，比吸收系％丙酮溶液，当浓度为 叶绿素a 值如下。数k k 比吸收系数波长/nm b 叶绿素a 叶绿素 9.27 82.04 663 45.60 645 16.75

青菜叶中叶绿素含量的测定

青菜叶中叶绿素含量的测定 食品学院S100111029 王婷同组人：王莹、王芳 一、实验目的 1.学习并且使用分液漏斗分离水与不溶于水的有机溶剂。 2.熟悉掌握用有机溶剂萃取青菜叶中叶绿素的方法。 二、实验原理 将青菜叶中的叶绿素萃取到丙酮中，然后将溶于丙酮的叶绿素转移到乙醚中，在指定的波长下，测定叶绿素-乙醚溶液的吸光度，然后根据公式计算青菜叶中的叶绿素a、叶绿素b 和总叶绿素的含量。 三、实验器材 1.实验仪器：天平、组织捣碎机、水、循环真空泵、抽滤瓶、滤纸、布氏漏斗、容量瓶（100ml、500ml各一个）、分液漏斗（2个）、尖嘴管、铁架台、铁圈（2个）、分光光度计。 2.实验试剂：碳酸钙、丙酮（85﹪）、乙醚、无水硫酸钠。 3.实验原料：青菜叶。 四、实验步骤 1.称取30g新鲜青菜叶置于组织捣碎机中，然后加0.05gCaCO3和85ml丙酮（85﹪），在高速组织捣碎机中，在转速20000r/min下捣碎，2min，捣碎青菜叶组织。 2.抽滤所得的匀浆，用少量85﹪丙酮多次洗涤残渣，直到残渣不带绿色为止，将溶液合并后用丙酮定容至500ml。 3.吸取25ml叶绿素-丙酮溶液，加入到含有25ml乙醚的分液漏斗中，然后加入50ml水，观察到所有的叶绿素都转入到上层乙醚相时，放出下层水相。 4.在另一只分液漏斗中加入50ml水，插入一只末端拉成小孔的玻璃管，将叶绿素-乙醚溶液注入玻璃管，溶液通过通过玻璃环末端小孔进入水相后再上升聚集在水相表面，放出下层水相，重复上述操作步骤五次，让溶于叶绿素-乙醚溶液中的丙酮转移到水相中，将乙醚层转移至容量瓶中。 5.将以上放出的下层水合并，加入25ml乙醚，同上操作，将乙醚层也转移至容量瓶中。 6.用乙醚将叶绿素-乙醚溶液定容到100ml。 7.用少量无水硫酸钠吸收叶绿素-乙醚溶液中的水分。 8.在波长660nm和642.5nm下，分别测定叶绿素-乙醚溶液的吸光度。

分光光度法测定叶绿素含量

一、实验目的 1.了解植物组织中叶绿素的分布及性质。 2.掌握测定叶绿素含量的原理和方法。 二、实验原理 叶绿素广泛存在于果蔬等绿色植物组织中，并在植物细胞中与蛋白质结合成叶绿体。当植物细胞死亡后，叶绿素即游离出来，游离叶绿素很不稳定，对光、热较敏感；在酸性条件下叶绿素生成绿褐色的脱镁叶绿素，在稀碱液中可水解成鲜绿色的叶绿酸盐以及叶绿醇和甲醇。高等植物中叶绿素有两种：叶绿素a 和b ，两者均易溶于乙醇、乙醚、丙酮和氯仿。 叶绿素的含量测定方法有多种，其中主要有： 1.原子吸收光谱法：通过测定镁元素的含量，进而间接计算叶绿素的含量。 2.分光光度法：利用分光光度计测定叶绿素提取液在最大吸收波长下的吸光值，即可用朗伯—比尔定律计算出提取液中各色素的含量。 叶绿素a 和叶绿素b 在645nm 和663nm 处有最大吸收，且两吸收曲线相交于652nm 处。因此测定 提取液在645nm 、663nm 、652nm 波长下的吸光值，并根据经验公式可分别计算出叶绿素a 、叶绿素b 和总叶绿素的含量。 三、仪器、原料和试剂 仪器 分光光度计、电子顶载天平(感量0．01g)、研钵、棕色容量瓶、小漏斗、定量滤纸、吸水纸、擦境纸、滴管。 原料 新鲜(或烘干)的植物叶片 试剂 1. 96％乙醇(或80％丙酮) 2. 石英砂 3. 碳酸钙粉 四、操作步骤 取新鲜植物叶片(或其它绿色组织)或干材料，擦净组织表面污物，去除中脉剪碎。称取剪碎的新鲜样品2g ，放入研钵中，加少量石英砂和碳酸钙粉及3mL95％乙醇，研成均浆，再加乙醇10mL ，继续研磨至组织变白。静置3～5min 。 取滤纸1张置于漏斗中，用乙醇湿润，沿玻棒把提取液倒入漏斗，滤液流至100mL 棕色容量瓶中；用少量乙醇冲洗研钵、研棒及残渣数次，最后连同残渣一起倒入漏斗中。 用滴管吸取乙醇，将滤纸上的叶绿体色素全部洗入容量瓶中。直至滤纸和残渣中无绿色为止。最后用乙醇定容至100mL ，摇匀。 取叶绿体色素提取液在波长665nm 、645nm 和652nm 下测定吸光度，以95％乙醇为空白对照。 五、计算 按照实验原理中提供的经验公式，分别计算植物材料中叶绿素a 、b 和总叶绿素的含量 叶绿素a= （12.7 A 665 -2.69 A 645）× W V ?1000 叶绿素b=（12.7 A 645 - 2.69A 665）× W V ?1000 总叶绿素a=（20.0A 645 + 8.02 A 665 ）× W V ?1000 或总叶绿素a= W V A ??10005.34652

叶绿素测定方法

叶绿素测定方法 一、方法选择 1、分光光度计法>荧光光度法>SPAD速测法，浸提比色法>萃取比色法，常温浸提比色 测定>高温速浸提比色法，如果时间条件允许，建议选择常温浸提比色法。 2、药品的选择，常用有机浸提叶绿素的试剂由甲醇、乙醇、丙酮，乙醇对身体的伤害 最小，丙酮最厉害，如果通风条件不是太好，建议选择乙醇;有机试剂混合液提取具有 协同优势，乙醇与丙酮的混合液比甲醇与丙酮的混合液(甲醇乙醇混合很少)浸提的要 完全，而且稳定，乙醇、丙酮、水的浸提效果次之，差异不显著;综上，如果能买到丙 酮的话，乙醇、丙酮以1:3的比例混合液提取最好，其次是乙醇、丙酮、水以4.5:4.5:1 的比例混合液，如果不想用丙酮，可以用95%的乙醇代替，但是与混合液比，提取效率 不高。 3、称样量，0.2g样品，选用20ml浸提液浸提，0.5g样品，选用50ml浸提液浸提。二、实验原理 分光光度法测定叶绿素(包括a\b\类胡萝卜素\总量) 含量的原理是，以有机溶剂在常温暗室直接提取样品中的叶绿素，测定其吸光度，根据叶绿素(包括a\b\类胡萝卜素\总量)在特定波长的吸收，用公式计算其含量。

三、器材 棕色容量瓶、721型分光光度计(751型分光光度计更好，越精确越好) 四、步骤 1、将叶片洗净，选取中间部分，称0.200克左右，并剪成2mm左右碎条 2、将样品放入容量瓶中，加入浸提液，定容，放在暗处26h左右 3、比色，如果仅仅测定叶绿素A\B总量，测定波长在665nm、649nm、652nm 处吸光 度即可，如果还测定类胡萝卜素含量，再测定处波长在470nm处的吸光度即可。目 前，不同的浸提液提取方法都是在这些波长下测定的。 4、每个实验样品重复三次，空白两次重复即可(本实验中空白意义不大) 五、计算 Ca=13.95*A665-6.88*A649 Cb= 24.96* A649-7.32* A665 C类胡萝卜素= (1000*A470-2.05* Ca -114.8* Cb)/245 C总= A652*50/(34.5*m) Ca 为叶绿素a的浓度 M 为称样量

叶绿素含量的测定(精)

实验05 叶绿素含量的测定 一、原理 根据叶绿体色素提取液对可见光谱的吸收，利用分光光度计在某一特定波长测定其吸光度，即可用公式计算出提取液中各色素的含量。根据朗伯—比尔定律，某有色溶液的吸光度A与其中溶质浓度C和液层厚度L成正比，即A＝αCL式中：α比例常数。当溶液浓度以百分浓度为单位，液层厚度为1cm时，α为该物质的吸光系数。各种有色物质溶液在不同波长下的吸光系数可通过测定已知浓度的纯物质在不同波长下的吸光度而求得。如果溶液中有数种吸光物质，则此混合液在某一波长下的总吸光度等于各组分在相应波长下吸光度的总和。这就是吸光度的加和性。今欲测定叶绿体色素混合提取液中叶绿素a、b和类胡萝卜素的含量，只需测定该提取液在三个特定波长下的吸光度A，并根据叶绿素a、b及类胡萝卜素在该波长下的吸光系数即可求出其浓度。在测定叶绿素a、b时为了排除类胡萝卜素的干扰，所用单色光的波长选择叶绿素在红光区的最大吸收峰。 二、材料、仪器设备及试剂 （一）材料：新鲜（或烘干）的植物叶片。 （二）仪器设备：1. 分光光度计；2. 电子顶载天平（感量0.01g）；3. 研钵；4. 棕色容量瓶； 5. 小漏斗； 6. 定量滤纸； 7. 吸水纸； 8. 擦境纸； 9. 滴管。 （三）试剂：96％乙醇（或80％丙酮）；石英砂；碳酸钙粉。 三、实验步骤 1. 取新鲜植物叶片（或其它绿色组织）或干材料，擦净组织表面污物，剪碎（去掉中脉），混匀。 2. 称取剪碎的新鲜样品0.2g，共3份，分别放入研钵中，加少量石英砂和碳酸钙粉及2～3ml95％乙醇，研成均浆，再加乙醇10ml，继续研磨至组织变白。静置3～5min。 3. 取滤纸1张，置漏斗中，用乙醇湿润，沿玻棒把提取液倒入漏斗中，过滤到25ml棕色容量瓶中，用少量乙醇冲洗研钵、研棒及残渣数次，最后连同残渣一起倒入漏斗中。 4. 用滴管吸取乙醇，将滤纸上的叶绿体色素全部洗入容量瓶中。直至滤纸和残渣中无绿色为止。最后用乙醇定容至25ml，摇匀。 5. 把叶绿体色素提取液倒入光径1cm的比色杯内。以95％乙醇为空白，在波长665nm、649nm下测定吸光度。 四、实验结果计算： 将测定得到的吸光值代入下面的式子：Ca=13.95A665－6.88A649；Cb=24.96A649－7.32A665。据此即可得到叶绿素a和叶绿素b的浓度（Ca、Cb：mg/L），二者之和为总叶绿素的浓度。最后根据下式可进一步求出植物组织中叶绿素的含量： 叶绿素的含量（mg/g）= [叶绿素的浓度×提取液体积×稀释倍数]/样品鲜重（或干重）。

叶绿素含量的测定

叶绿素含量的测定 一、 实验目的 1. 了解分光光度计的工作原理； 2. 掌握不同型号分光光度计的操作方计； 3. 通过本实验的学习掌握叶绿素含量测定的一种常见的方法------分光光度法。 二、 实验原理 叶绿素是脂溶性色素，主要存在于以叶绿体为首的色素体中。在活体中，叶绿素与脂蛋白结合并受到还原系统的保护，对氧和光是稳定的。 叶绿素的80%丙酮提取液在波长663nm ，645nm 有吸收峰，叶绿素a 和叶绿素b 的浓度符合以下公式： C a =0.0127A 663-0.00259A 645 C b =0.0229A 645-0.00467A 663 浓度单位是：g/L C a =12.7A 663-2.59A 645 C b =22.9A 645-4.67A 663 浓度单位是：mg/L 叶绿素总浓度为： C T =C a +C b 若以试液中色素含量来表示，则 1000 )()()/(/??=g ml L mg C ）g （mg 样品重提取液总体积鲜样叶绿素含量 三、 仪器、试剂和材料 1. 仪器 紫外-可见分光光度计、研体、25ml 容量瓶、玻璃漏斗、玻璃棒、皮头滴管 2. 试剂 丙酮（分析纯）、85%丙酮、80%丙酮 2. 材料

滤纸、石英砂、碳酸镁 四、操作步骤 1. 在遮光条件下取出等测样品，剪碎，混匀，称取鲜样0.1-0.5g； 2. 样品置于研钵内，加入少量碳酸镁和石英砂，加入一定体积的丙酮研磨匀浆，再加85%丙酮适量继续研磨至组织白色； 3. 经铺有滤纸的漏斗将匀浆液转入25ml的容量瓶中，并用80%的丙酮分次清洗研钵和滤纸，最后用80%的丙酮定容。 4. 以80%的丙酮为参比液，在663和645nm波长处测定吸光值（A应在0.2-0.8范围内，浓度过大应用80%丙酮适当稀释）。 五、结果处理 按照公式计算出叶绿素a和叶绿素b的浓度，再计算出叶绿素的含量。 六、注意事项 1. 在活体内，结合态叶绿素是稳定的，组织一经破坏，叶绿素易被光解。因此，抽提和测定工作应尽可能避光快速完成。 2. 对含有大量酸性液泡的样品，应首先加入微碱性的缓冲液，仔细研磨后加入丙酮进行抽提。 3. 分光光度计的精度对测定的结果有至关重要的影响，使用前对仪器进行校正。 七、思考题 1. 当溶液中有两种成分共存时，利用分光光度计进行测定时，如何选择测定波长？ 附属实验： 1.溶剂极性对有机物精细结构影响 苯-环己烷、苯-乙醇、苯-水 2.溶剂pH对光谱的影响 苯酚、苯酚—H+（pH=6）、苯酚—OH-（pH=10）

十二叶绿素的定量测定分光光度法

实验二十叶绿素含量的测定 叶绿素的含量与植物光合作用及氮素营养有密切的关系，在科学施肥、育种及植物病理研究上常有测定的需要。 方法Ⅰ 一、目的 掌握叶绿素含量测定的基本原理和方法。 二、原理 叶绿素与其他显色物质一样，在溶液中如液层厚度不变则其吸光度与它的浓度成一定的比例关系。已知叶绿素a 、b在652 nm波长处有相同的比吸收系数（均为34.5）。因此，在此波长下测定叶绿素溶液的吸光度，即可计算出叶绿素a 、b的总量。 三、材料、仪器设备及试剂 1. 材料：菠菜叶；芥菜叶或其他植物叶片。 2. 仪器设备：电子分析天平；分光光度计；漏斗；25ml容量瓶；剪刀；滤纸；玻棒等。 3. 试剂：95﹪乙醇、石英砂、碳酸钙粉。 四、实验步骤 1. 叶绿素的提取 称取植物鲜叶0.20g（可视叶片叶绿素含量增减用量），剪碎放入研钵中，加少量碳酸钙粉和石英砂及3～5ml95﹪乙醇研成匀浆，再加约10ml 95﹪乙醇稀释研磨后，用滤纸过滤入25ml 容量瓶中，然后用95﹪乙醇滴洗研磨及滤纸至无绿色为止，最后定容至刻度，摇匀，即得叶绿素提取液。 2. 测定 取光径为1cm的比色杯，倒入叶绿素提取液距杯口1cm处，以95﹪乙醇为空白对照，在652 nm波长下读取吸光度（A）值。 五、计算 将测得的吸光度A652值代入公式(1), 即可求得提取液中叶绿素浓度。所得结果再代入公式(2)，即可得出样品中叶绿素含量（mg ·g－1Fw）。 A652 C ( mg .ml－1 ) = ———— (1) 34.5 公式中：C —叶绿素（a 和b ）的总浓度( mg ·ml－1 )

A652—表示在652nm 波长下测得叶绿素提取液的吸光度 34.5为叶绿素a和b混合溶液在652nm波长的比吸收系数（比色杯光径为1cm, 样 品浓度为1g·L－1时的吸光度）。 C（mg.ml－1）×提取液总量（ml）叶绿素含量（mg .g－1Fw）= ———————————————— (2) 样品鲜重（g） 方法Ⅱ 一、目的 掌握叶绿素a、b含量测定的基本原理和方法。 二、原理 叶绿素a、b分别在663nm和645nm波长处有最大的吸收峰，同时在该波长处叶绿素a.、b的比吸收系数K为已知，我们即可以根据Lambert－Beer定律，列出浓度C与吸光度A之间的关系式： A663 = 82.04 C a + 9.27C b……………………( 1 ) A645 = 16.75 C a + 45.6C b……………………( 2 ) （1）、（2）式中的A663. A645为叶绿素溶液在波长663nm和645nm时测得的吸光度。 C a、、C b为叶绿素a 、b的浓度，单位为mg·L－1。 82.04 、9.27为叶绿素a 、b在波长663nm下的比吸收系数。 16.75 、45.6为叶绿素a 、b在波长645nm下的比吸收系数。 解（1）、(2 )式联立方程，得： C a=12.70 A663– 2.69 A645……………………( 3 ) C b=22.9 A645– 4.68 A663……………………( 4 ) C T =C a + C b= 20.21 A645 + 8.02A663……………………( 5 ) C a、C b为叶绿素a 、b的浓度, C T为总叶绿素浓度，单位：（mg ·L－1），.利用上面( 3 )、（4）、（5）式可以分别计算出叶绿素a 、b及总叶绿素浓度。 三、材料、仪器设备及试剂 1. 材料：菠菜叶、芥菜叶或其他植物叶片 2. 仪器设备：电子分析天平；分光光度计；恒温水浴锅；25ml刻度试管；剪刀；试管； 试管架；玻棒等。 3. 试剂：80﹪乙醇。 四、实验步骤 1. 叶绿素的提取

测定叶绿素a和b的方法及其计算

实验二十五测定叶绿素a和b的方法及其 计算 一目的要求： 熟悉在未经分离的叶绿体色素溶液中测定叶绿素a和b 的方法及其计算。 二实验原理： 如果混合液中的两个组分，它们的光谱吸收峰虽然有明显的差异，但吸收曲线彼此有些重叠，在这种情况下要分别测定两个组分，可根据Lambert-Beer定律，通过代数方法，计算一种组分由于另一种组分存在时对光密度的影响，最后分别得到两种组分的含量。 如图z-4叶绿素a和b的吸收光谱曲线，叶绿素a的最大吸收峰在663nm，叶绿素b在645nm，吸收曲线彼此又有重叠。 图z-4 叶绿素a和b的吸收光谱曲线 横坐标为波长（nm），纵坐标为比吸收系数

根据Lambert-Beer定律，最大吸收光谱峰不同的两个组分的混合液，它们的浓度C与光密度OD之间有如下的关系： OD1=Ca·ka1+Cb·kb1 （1） OD2=Ca·ka2+Cb·kb2 （2） 式中：Ca为组分a的浓度，g/L。 Cb为组分b的浓度，g/L。 OD1为在波长λ1（即组分a的最大吸收峰波长）时，混合液的光密度OD值。 OD2为在波长λ2（即组分b的最大吸收峰波长）时，混合液的光密度OD值。 ka1为组分a的比吸收系数，即组分a当浓度为1g/L时，于波长λ1时的光密度OD值。 kb2为组分b的比吸收系数，即组分b当浓度为1g/L时，于波长λ2时的光密度OD值。 ka2为组分a（浓度为1g/L），于波长λ2时的光密度OD 值。 kb1为组分b（浓度为1g/L），于波长λ1时的光密度OD 值。 从文献中可以查到叶绿素a和b的80%丙酮溶液，当浓度为1g/L时，比吸收系数k值如下：