FasL与TNF引起凋亡的研究进展

FasL与TNF引起凋亡的研究进展国外医学免疫学分册1999年第22卷第5期

第三军医大学免疫学教研室

王希良综述朱锡华审阅

摘要死亡分子与死亡分子受体相互作用引发的细胞凋亡在保持自身平衡发挥着无法代替的重要作用。目前FasL、TNF和TRA1三个死亡分子及Fas、TNFR、DR3/WS1-1和CAR1四个死亡分子受体已被确定。本文就FasL和TNF两个死亡分子在与其受体、Fas下调免疫反应、效应分子和免疫特赦的研究现状予以综述。

关键词FasL TNF 凋亡免疫特赦

细胞是一个生命的实体和承载生命活动的基本单位。就人而言，一个生殖细胞通过不断分裂、分化、增殖产生上百亿个细胞组成了个体。在这一过程中会产生许多过剩有害细胞，并在发育、成熟的不同阶段要死亡[1]。细胞死亡是通过细胞凋亡完成而保持平衡。众多生长及分化因子在调节哺乳动物发育过程中对细胞的增殖和分化起着重要的作用，其中死亡分子与其受体结合诱导凋亡起着关键性作用。到目前为止，FasL、TNF和TRAIL三个死亡分子和Fas、TNFRI、DR3/WS1-1及CAR1四个死亡分子受体已被确定。本文就FasL和TNF两个死亡分子引起凋亡的研究现状综述如下：

一、FasL和TNF家族

细胞因子是属蛋白家族，它们通过结合靶细胞上特异性的受体来调节细胞的增殖与分化。按结构来划分，细胞因子至少可分化3个亚家族即cys族细胞因子，TNF和helical细胞因子[2，3]。fasL属于TNF家族，这个家族包括TNF、淋巴毒素、CD30配体、4-1BB配体、CD40配体、CD27配体和TRAL。FasL是Ⅱ类膜蛋白，即其N末端在胞浆里，C末端延伸到细胞外的空间里，在TNF家族成员中细胞外约150aa是高度保守的，而细胞内部分的长度和序列存在着很大差别。膜结合TNF的蛋白水解作用产生可溶性TNF，蛋白的水解作用是由金属蛋白酶介导[4]，同样，膜结合FasL通过金属蛋白酶介导的蛋白水解作用产生可溶性细胞因子[5]。一种特异性金属蛋白酶抑制剂阻碍TNFT和FasL的这个过程，这个现象表明剪切TNF和FasL的酶是相似的，由于CD40L也可以从膜剪切下来成为可溶性

CD40L，所以TNF家族的所有成员都有可能被处理成可溶的形式，人FasL的可溶性形式是具有功能性，而鼠FasL从膜上剪切下来后就失去了其活性。并且在活化Ⅱ型TNF受体时，膜结合TNF较可溶性TNF更具有活性，这些结果表明FasL和TNF通过在生理条件下细胞与细胞的相互作用而发挥局部作用，隐盖TNF或FasL的目的是为了减弱这个过程。

功能性可溶性形式TNF同人FasL一样是以三聚体形式存在[6]，关于膜结合性TNF或Fas是不是三聚体，这个问题还没证实清楚。然而TNF家族的一个成员淋巴毒素β，在膜上是由一个α和两个β链组成的异三聚体。这一结果表明，膜结合性TNF和FasL有三聚结构形式的可能性。对TNFα和TNFβ进行X射线衍射分析可知，每个聚体形成一个延长反平行β片层，或凝聚卷曲的局部拓朴学形状的三明治结构。在TNF家族成员中aa的保守序列主要位于β链中。根据FasLaa序列，借助计算机建立的模型表明FasL同TNFα、TNFβ有相似的四级结构。

二、Fas和TNF受体家族

FasL的受体Fas属Ⅰ型膜蛋白：它是TNF受体家族的一个成员[7]。TNF受体家族还包括TNFR1和TNFR2、淋巴毒素β受体、NGFR、CD40、CD27和CD30。这个家族仍在不断壮大，最近又有三个新的成员被证实，它们是：人DR3/ws1-1[8]、人HVEM[9]和小鸡CAR1[10]。TNF受体家族细胞外区域富含cys重复的2-6个亚结构域。在不同成员中，这些亚区有25%的相似性。相反，除Fas、TNFR1、DR-3/ws-1和CAR1外，这些成员的细胞质区域的相似性很少。

TNF诱导凋亡并活化转录因子NF-κB，它也能刺激胸腺细胞的增殖，虽然TNFR1和TNFR2两者都能转导凋亡和NF-κB活化的信号，但在大多数情况下，TNFR1负责这些信号的转导。另一方面是TNFR2而不是TNFR1负责TNF诱导胸腺细胞内的增殖信号转导，FasL 与Fas的结合或抗Fas抗体交联Fas，可诱导表达Fas的细胞凋亡。Fas和TNFR1的细胞质区域有一同源结构域，说明这一区域在转导死亡信号方面起作用。事实上，在后来对Fas

和TNFR1进行突变分析表明是这么回事，并把这一结构域定为死亡域，DR-3/ws1-1也有一死亡域并且它能传导凋亡信号及激活NF-κB[11]。具有死亡域的CAR1用ALSV表面蛋白交联时也引起小鸡细胞的凋亡。

死亡域有自聚化的趋势，通过用异源核磁共振、光谱分析揭示Fas死亡域的四级结构，表明死亡域是由6个反平行两岐性α螺旋组成的一种新蛋白折叠，其表面存在许多带电荷的氨基酸，这可能与介导死亡域之间的相互作用有关[12]。

三、Fas下调免疫反应的生理及病理意义

凋亡在哺乳动物生命的不同阶段均有发生。哪些凋亡受Fas系统调节？Fas在多种组织普遍存在，而在胸腺、肝、心、肾较多。另一方面，FasL虽然在“免疫特赦部位”如睾丸、眼中可组成性表达，但主要是在激活的T细胞和自然杀伤细胞表达。小鼠lpr突变和gld突变是自发的隐性突变。带有纯合lpr和gld突变的小鼠可产生淋巴结病及脾肿大症，一些品系可发生自身免疫病。lpr和gld突变的遗传和分子水平分析表明它们各自是Fas及FasL基因的无功能突变体。通过基因打靶技术建立的Fas裸鼠也表现出淋巴结病和脾肿大，这比携

带lpr突变的小鼠实验更有说有力[13]。并且，当Fas基因被转入lpr鼠的淋巴细胞表达时，淋巴细胞增生表型也随机被去掉，这证实Fas在T细胞的程序化死亡中有重要作用。

T细胞是负责清除病毒感染及癌变的细胞，在发育的不同时期都有死亡。多数未成熟T 细胞是无用的或对机体具有潜在危害性。迁移到胸腺的细胞有95%以上的胸腺细胞在其发育过程中被正、负选择作用清除掉。在外周淋巴器官，识别自身抗原的成熟T细胞也被外周克隆清除。当成熟T细胞遇到靶细胞后它们被激活而增殖。但是，激活T细胞在完成任务后应被清除以避免积累。来自lpr和gld鼠的成熟T细胞在激活后不会死去，而在淋巴结和脾脏积累。当一个中和Fas的分子存在时，激活的T细胞杂交瘤不会死亡。这些结果表明Fas与T细胞因激活而诱导的自杀，也就是说与免疫反应下调紧密相连。外周克隆消除可能也是由Fas系统介导，这是由于此过程中被清除的细胞可通过与表达自身抗原的细胞相互作用而被激活。然而。胸腺内的克隆选择在缺乏有功能的Fas系统小鼠中处于正常[14]，即使它们胸腺细胞表达较多Fas，并且对Fas诱导的凋亡敏感都不会受影响。从而说明Fas不参与胸腺内的克隆清除过程，人们还不能指出这个过程受别的机制介导的可能性。

除T细胞外，Fas缺陷小鼠也可发生B细胞积累并升高各类免疫球蛋白，包括抗ssDNA 及抗dsDNA抗体的水平，由此推测Fas参与了激活自身反应性B细胞的清除。事实上、抗原免疫小鼠可迅速诱导生发中心内表达Fas，并且初始B细胞被CD40激活可使它们对Fas 介导的凋亡敏感，而CD40与免疫球蛋白受体共刺激使它们具有了抗性[15]。虽然这些结果说明表达FasL的T细胞可以杀死表达Fas激活的B细胞，但B细胞清除的具体机制及Fas在其中的生理作用还有待研究。

已经发现Fas基因缺陷的小孩[16]。这些病人大多带有Fas基因杂合突变。改变的Fas蛋白似为以显性失活的方式起作用，病人来源的T细胞激活后不死亡，表现出类似于lpr小鼠的症状，包括淋巴结病，脾肿大及高γ-球蛋白症。一些病人因产生抗血细胞及抗血小板抗体而出现自身反应性疾病，如血友症、血小板减少症及中性粒细胞减少症。另一方面，病人的父亲或母亲也携带Fas基因杂合突变。或者说Fas只在围产期所必须，这些父母在孩子时也有类似表现，由于杂合的基因突变是有妥协后来被治愈。

四、CTL及NK细胞的效应分子

CTL杀死被细菌或病毒感染的细胞，而NK细胞杀死癌变的细胞。专职的CTL是CD8+T 细胞，但T H1型CD4+T细胞也有细胞毒性。这些CTL和NK细胞怎样杀死靶细胞长期以来争论不休，因为众所周知的以穿孔素/颗粒酶为基础的机制不能解释所有的CTL杀伤的例子。然而FasL激活T细胞表达细胞毒性分子的发现解决了这个问题。用缺陷穿孔素/颗粒酶或FasL的小鼠研究表明，穿孔素/颗粒酶和Fas系统是CTL介导细胞毒性的主要途径。CTL通过T细胞受体与抗原作用可以诱导FasL基因表达。在效应细胞表面表达的FasL与靶细胞表面的Fas结合而通过激活caspases诱导凋亡。CTL通过TCR激活可释放穿孔素和颗粒酶。

可以认为穿孔素在靶细胞膜上穿孔，然后颗粒酶由穿孔进入靶细胞。颗粒酶B作为颗粒酶之一，它是一个丝氨酸蛋白酶aspase，可以通过蛋白水解激活caspase家族的某些成员。虽然穿孔素和FasL可以互不依赖地启动凋亡。但这个过程在两种情况下是相似的。由于CD8+T 细胞和NK细胞都利用穿孔素/颗粒酶及FasL/Fas途径，而T H1型CD4+T细胞倾向于用FasL 系统。特定的CD8+T细胞和NK细胞在作用于特异的靶细胞是否使用穿孔素/颗粒酶或FasL/Fas的倾向性还有待研究。并且缺乏穿孔素和FasL系统小鼠，CTL在长期分析中还有一些残余的细胞毒活性，表明在这种条件下可能有TNF或TRAIL等死亡因子作为CTL效应因子[17]。

五、免疫特赦

细胞免疫反应及相关的炎症反应可引起周围组织的非特异性损伤，虽然多数器官可以容忍这种炎症，但如眼和睾丸这些器官却不能。这些器官因有特殊机制保护其免疫危险和不需要的免疫反应性伤害，被叫做免疫特赦部位。它可以允许同种或异种组织移植。最初认为免疫特赦是通过阻止激活细胞进入器官而维持。近来提出了另一个有吸引力的模型[18]。这就是激活的炎症细胞能进入这些器官，它们被器官内表达的FasL马上杀死，发现功能性的FasL 已表达在眼睛的角膜上皮、内皮、虹膜及睫状体细胞和睾丸的滋养细胞。当野生型小鼠感染HSV-1后，视网膜只发现有很少的炎症细胞，而gld鼠感染后可观察到剧烈的炎症反应。并且表达FasL的睾丸移植到同种动物的肾囊时可以存活，而来自于gld鼠的睾丸却受到排斥。这些发现表明，FasL至少可以部分解释眼睛和睾丸的免疫特赦所具有的特性，并猜测在移植时可用FasL作为免疫抑制剂攻击激活的效应细胞。事实上，当胰岛细胞群和表达有功能FasL的成肌细胞共同移植时，可以不受免疫排斥并能在相当长时期内保持糖尿病模型小鼠的血糖量正常[19]。几个研究小组近来发现某些肿瘤细胞对Fas诱导的凋亡有了抗性并能表达FasL。肿瘤细胞表达的FasL就可通过与细胞表面的Fas结合攻击CTL和NK细胞，诱导细胞凋亡，这个机制也可解释免疫细胞逃避免疫破坏的能力。

六、双刃剑的作用

只要死亡因子适当地表达，它们对维持机体自身平衡是有益无弊。如果这个系统功能过高或低下，都会有害的效应。失去功能可引起增生，象淋巴组织增生，积累在Fas基因杂合突变体病人的淋巴细胞不具致癌性，而这些病人家族有时有何杰金氏病史。过度的淋巴细胞不死亡现象也许可允许允许细胞积累诱导恶变或突变的可能。因此，FasL死亡因子及Fas

受体基因被认为是抑癌基因。另一方面，如系统功能过强时，它可以引起组织瓦解并杀死。当激动性的Fas抗体或FasL被注入小鼠体内激活Fas系统时，小鼠很快因肝功能障碍而死亡，症状与急性暴发性肝炎类似。暴发性肝炎是由异常激活的T细胞引起，用乙肝病毒或HCV转化肝细胞引起Fas表达上调。这些结果可推测，识别感染肝细胞表面的病毒抗原的CTL是通过TCR被激活，并通过Fas/FasL系统杀死肝细胞。如果这种杀伤过程正常进行，

对机体是有利。当系统被放大时，它可导致暴发性肝炎。有可能其它的CTL诱导自身免疫反应，如移植物抗宿主病、AIDS和胰腺炎等也是由Fas系统介导引起的。

许多癌症病人产生可溶形式的TNF α，TNFα可象恶液质素一样诱导系统性组织损伤。类似的FasL的可溶形式也在NK淋巴瘤或NK细胞和T细胞型大颗粒淋巴细胞白血病病人血清中检测到。白血病细胞自身表达有功能的FasL。这些病人常有系统性组织损伤，如肝炎和中性粒细胞减少症。因为肝细胞和中性粒细胞都对Fas介导的凋亡特别敏感，有可能这些病人的系统性组织损伤是由血清中的FasL或循环白血病细胞表达的FasL引起有关。

七、结论和展望

许多生长及分化因子可调节哺乳动物发育过程中细胞的增殖和分化。到目前为止，3个死亡因子（TNF、FasL、TRAIL）和4个死亡因子受体（Fas，TNFR1，DR3/ws-1,CAR1）已经被确定。lpr和gld鼠为Fas系统无功能突变，表明这种死亡因子系统在哺乳动物自身平衡维持，特别是在淋巴细胞的生存与死亡中具有重要作用。将来，也许有更多的特异性调节凋亡的死亡因子和受体被发现。生长和分化信号是由蛋白质的磷酸化和去磷酸化，以及小分子次张信使的介导引起，这些信号多数情况下是可逆的。死亡因子诱导的凋亡信号却是不可逆的，即是说蛋白酶链被死亡信号激活，蛋白酶水解细胞组分，导致作为凋亡特征的细胞和核的形态学变化。由于其他凋亡诱导因子也可激活caspase家族蛋白酶，它们的信号转导系统也许是相似的或相同的。哺乳动物的调亡系统似乎比线虫更复杂，更高级。与线虫的ICE/CED-3和Bcl-2/CED9不同，哺乳动物基因中至少有10个caspase家族成员和9个Bcl-2家族成员。它们是多余的还是具有不同作用还有待研究。相信每一个家族成员的生化分析和基因缺陷小鼠的建立将澄清这些疑点。TNF和FasL都可诱导凋亡，由于TNF也可诱导其他信号（如NF-κB激活），认为TNF受体信号途径可能更复杂些。实际上，与TNF和Fas

信号有关分子的确定，表明Fas介导的信号比TNF受体更简单。TNF受体和Fas都能激活凋亡的信号链。但TNF受体也可激活包括挽救信号在内的其他途径。检测NF-κB激活哪类挽救基因和这些分子怎样抑制凋亡具有重要含义。这些挽救基因的确定也许可以为解释某些肿瘤细胞对多种凋亡诱导试剂（包括FasL、TNF和抗原药物）具有抗性提供线索。

如上所述，死亡因子系统是一把双刃剑。如果这系统受到正确调节，它对免疫反应下调清除病毒感染或癌变的细胞是有益的。但是，如果这个系统被放大，它可以引起组织破坏。这个系统的调节怎样应用于治疗人类疾病呢？第一个明显的应用是杀死肿瘤细胞，因为一些肿瘤细胞，特别是一些淋巴瘤，表达有功能的Fas。由于用FasL进行全身治疗将引起有害副作用，应设计局部用药方法或将FasL靶定在肿瘤部位，FasL也可用作免疫抑制剂。移植排斥反应是由激活T细胞介导的，如果被移植组织表达FasL或与有表达FasL的细胞共移植，移植物也许可以存活。这个系统的另一应用是阻止FasL诱导的组织破坏。对暴发性肝火、ADS和其他涉及到CTL诱导后组织破坏的疾病中有作用，可以推测抗Fas或FasL的中和抗体或Fas诱导的凋亡途径的抑制剂将是潜在的治疗药物。从抗Fas单抗应用抗肿瘤的研

究看，抗Fas抗体只有特异地靶向于瘤细胞，才可用于临床肿瘤治疗，设想利用抗Fas抗体介导的细胞杀伤与抗CD7良好导向功能巧妙结合，特异杀伤CD7+白血病细胞的可行性。相信，随着研究的不断深入人们对死亡分子的研究将会奏出新的篇章，解决某些疾病的发病机理和临床治疗的关键问题。

细胞凋亡及相关因素的研究进展

细胞凋亡及相关因素的研究进展 论文摘要：细胞凋亡(Apoptosis)是一种生理性死亡Physiogicalcell death，PCD)，是细胞对内外信息刺激的 应答反应，[1]它与细胞的生长、分化一样．属于最基本的 细胞学事件或过程．它决定着生物体的基本特征和转归．是胚胎发生和个体发育中清除细胞以维持细胞数目正常的调 节机制。 [2]当组织细胞发生异常调亡时，即可引起疾病的发生。一般来讲．凋亡过多会引起退行性变或早衰，调亡过少．易诱发肿瘤。[3] 因此，细胞凋亡近年来引起生命科学研究领域的广泛关注。本文仅就细胞调亡的概念及相关因素作一简要的概述。 【Summary】 Apoptosis is a kind of Physiogicalcell death and a reaction of cells to around informations stimulate .[1] It is same as cells’ growth and differentiation which belong to the basic cell subject’s incident or process.it decide living things’essential character- Istics ,and used to clear away cells to keep it rgular number’s regulation mechanism in the procees of embryo occur and individual growth.[2]there will couse ill- Ness when the organization cells come into being particularly apoptosis .Generally speaking ,more cell

细胞周期和细胞凋亡类基因

细胞周期和细胞凋亡类基因 G0 G1 转变(G0 to G1 transition) 1: mdm4 G1/S 特异转录，有丝分裂细胞周 期(G1/S-specific transcription in mitotic cell cycl e) 1: gfi1 G1/S 转变, 有丝分裂细胞周 期(G1/S transition of mitotic cell cycle) 19: bca t1 ccnd1 ccne1 cdc34 cdc7 cdca5 cdk4 cdkn3 cul1 c ul2 cul3 cul4a cul5 gspt1 lats2 pml ppp6c rcc1 sk p2 G1/S 转变检控 点(G1/S transition checkpoint) 4: dlg1 hus1 nbn p ura G1 期(G1 phase) 2: cdc42 rb1 G1 期, 有丝分裂细胞周 期(G1 phase of mitotic cell cycle) 10: anapc2 cd c23 cdk6 cdkn1c dnaja2 e2f1 map3k11 taf1 taf1l tbr g4

G1 特异转录，有丝分裂细胞周 期(G1-specific transcription in mitotic cell cycle) 1: gfi1b G2/M转变, 有丝分裂细胞周 期(G2/M transition of mitotic cell cycle) 10: ana pc10 anapc4 anapc5 birc5 ccnb1 cdk2 dnm2 khdrbs1 l ats1 tpd52l1 G2/M转变DNA 损伤检控 点(G2/M transition DNA damage check-point) 1: brsk 1 G2 期, 有丝分裂细胞周 期(G2 phase of mitotic cell cycle) 4: cenpf ches 1 gtse1 kpna2 M期(M phase) 2: ilf3 rb1 M期, 有丝分裂细胞周 期(M phase of mitotic cell cycle) 4: cdc25b dlg7 mphosph6 mphosph9 M期特异微管过 程(M phase specific microtubule process) 1: kpna2

线粒体与细胞凋亡

万方数据

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线粒体与细胞凋亡 作者：周艺群， 谷志远， ZHOU Yi-qun， GU Zhi-yuan 作者单位：浙江大学医学院附属口腔医院口腔颌面外科,浙江,杭州,310006 刊名： 解剖科学进展 英文刊名：PROGRESS OF ANATOMICAL SCIENCES 年，卷(期)：2006,12(1) 被引用次数：14次 参考文献(17条) 1.樊廷俊;夏兰;韩贻仁线粒体与细胞凋亡[期刊论文]-生物化学与生物物理学报 2001(01) 2.赵云罡;徐建兴线粒体,活性氧和细胞凋亡[期刊论文]-生物化学与生物物理进展 2001(02) 3.蔡循;陈国强;陈竺线粒体跨膜电位与细胞凋亡[期刊论文]-生物化学与生物物理进展 2001(01) 4.Hortelano S;Dallaporte B;Zamzami N Nitric oxide induces apoptosis via triggering mitochondrial permeability transition[外文期刊] 1997(2-3) 5.Marchetti P;Hirsch T;Zamzami N Mitochondrial permeability transition triggers lymphocyte apoptosis 1996(11) 6.Marchetti P;Castodo M;Susin SA Mitochondrial permeability transition is a central coordinating event of apoptosis[外文期刊] 1996(03) 7.Susin SA;Zamzami N;Castedo M Bcl-2 inhibits the mitochondrial release of an apoptogenic protease [外文期刊] 1996(04) 8.Chou JJ;Li H;Salvesen GS Solution structure of BID,an intracellular amplifier of apoptotic signaling[外文期刊] 1999 9.Ji HB;Zhai QW;Liu XY Transcription regulation of bcl-2gene 2000(02) 10.Tsujimoto Y;Shimizu S Bcl-2 family:Life or death switch 2000(01) 11.Zamzami N;Susin SA;Marchetti P Mitochondrial control of nuclear apoptosis 1996(04) 12.Ruth MK;Ella BW;Douglas RG The release of cytochrome c from apoptosis[外文期刊] 1997(5303) 13.Narita M;Shimizu S;ItoT Bax interacts with the permeability transition pore to induce permeability transition and cytochrome c release in isolated mitochondrial 1998(25) 14.Cosulich SC;Savory PJ;Clarke PR Bcl-2 regulates amplification of caspase activation by cytochrome C[外文期刊] 1999(03) 15.Bossy-Wetzel E;Green DR Caspases induce cytochrome C release from mitochondria by activating cytosolic factors[外文期刊] 1999(25) 16.Sutton VR;Davis JE;Cancilla M Initiation of apoptosis by granzyme B requires direct cleavage of bid,but not direct granzyme B-mediated caspase activation[外文期刊] 2000(10) 17.Stoka V;Turk B;Schendel SL Lysosomal protease pathways to apoptosis.Cleavage of bid,not pro-caspases,is the most likely route[外文期刊] 2001(05) 本文读者也读过(10条) 1.杨胜细胞凋亡机制简述[期刊论文]-科技信息（学术版）2007(26) 2.冯俊奇.李秀兰.白人骁.FENG Jun-qi.LI Xiu-lan.BAI Ren-xiao细胞凋亡机制研究进展[期刊论文]-国际生物医学工程杂志2006,29(1)

细胞氧化应激基本概念

1、细胞氧化 细胞生命活动过程中所需的能量约有95%是来自于线粒体，其来源是将细胞内的供能物质氧化、分解、释放能量，并排出CO2和H2O，这一过程称之为细胞氧化（cellular oxidation)，又称细胞呼吸（cellular respiration)。其基本步骤有：糖酵乙酰辅酶A（CoA)的形成、进行三羧酸循环及电子传递和化学渗透偶联磷酸化作用。酶能使细胞的氧化过程在此比较低的温度下进行，并释放出仅仅使细胞能够扑获和储存的能量。这个受生物学控制的氧化结果起初就和简单的燃烧现象一样：复杂的分子被降解为水，二氧化碳，并释放能量。这个过程中一些经过交换的电子永久地逃离细胞的呼吸或从呼吸中心遗漏掉并同周围的氧分子相互作用，产生有毒性氧分子—自由基。在细胞呼吸的过程中，估计有2-5%的电子转化为过氧化物分子和其他类型的氧化自由基，自由基的持续增加就对机体组织造成大量的氧化压力。自由基被认为与大约60种(而且至少是60种)疾病的发生有关，科学有证据证实，抗氧化剂能停止甚至逆转(在某些疾病中)由于自由基所导致的损伤。自由基与机体细胞发生作用后，给机体留下了毁灭性的灾难。在细胞膜上留下了许多微笑的孔洞，使细胞的分子结构发生改变，破坏了细胞的蛋白和脂类分子。一旦我们机体细胞内有足够的抗氧化剂储备，我们就能将自由基对机体的损伤程度降到最低。 2、OS 氧化应激（Oxidative Stress，OS）是指体内氧化与抗氧化作用失衡，倾向于氧化，导致中性粒细胞炎性浸润，蛋白酶分泌增加，产生大量氧化中间产物。氧化应激是由自由基在体内产生的一种负面作用，并被认为是导致衰老和疾病的一个重要因素。指机体在内外环境有害刺激的条件下，体内产生活性氧自由基（Reactive Oxygen Species，ROS）和活性氮自由基（Reactive Ntrogen Species，RNS）所引起的细胞和组织的生理和病理反应。ROS有超氧阴离子（.O2-）、羟自由基（.OH-）和过氧化氢（H2O2）等等；RNS有一氧化氮（NO）、二氧化碳（CO2）和过氧亚硝酸盐（.ONOO-）等等。由于它们可以直接或间接氧化或损伤DNA、蛋白质和脂质，可诱发基因的突变、蛋白质变性和脂质过氧化，被认为是人体衰老和各种重要疾病如肿瘤、心脑血管疾病、神经退行性疾病（老年痴呆）、糖尿病-最重要的危氧化应激和抗氧化不单纯是一种生化反应，它更有着极其复杂的细胞和分子机制，包括膜氧化、线粒体代谢、内质网应激、核的重构、DNA损伤修复、基因转录表达、泛素和泛素化、自吞和溶酶体、细胞外基质、信号传递、蛋白折叠等多重的细胞和分子改变。 3、ROS 需氧细胞在代谢过程中产生一系列活性氧簇( reactive oxygen species, ROS)，包括：O2 -·、H2O2 及HO2·、·OH 等。 4、细胞凋亡 细胞凋亡（apoptosis ）是维持正常组织形态和一定功能的主动自杀过程，是在基因控制下按照一定程序进行的细胞死亡，故又称为程序性细胞死亡（ PCD ） 5、SOD 超氧化物歧化酶Orgotein (Superoxide Dismutase, SOD)，别名肝蛋白、奥谷蛋白，简称：SOD。SOD 是一种源于生命体的活性物质，能消除生物体在新陈代谢过程中产生的有害物质。对人体不断地补充SOD 具有抗衰老的特殊效果。是生物体内重要的抗氧化酶，广泛分布于各种生物体内，如动物，植物，微生物等。SOD具有特殊的生理活性，是生物体内清除自由基的首要物质。SOD在生物体内的水平高低意味着衰老与死亡的直观指标；现已证实，由氧自由基引发的疾病多达60多种。它可对抗与阻断因氧自由基对细胞造成的损害，并及时修复受损细胞，复原因自由基造成的对细胞伤害。

细胞凋亡蛋白的研究进展

【摘要】细胞凋亡是当前生物学领域中研究的最新课题之一。细胞凋亡是个体发育过程中由一系列蛋白调控的细胞主动死亡过程，在保证多细胞生物健康生存的过程中扮演着关键角色，对个体的正常发育具有重要作用。它在多细胞生物的组织分化、器官发育、机体稳态的维持中有着重要意义。其中bcl-2家族、caspase 家族、p53蛋白、survivin蛋白都是重要的凋亡调节因子，在细胞凋亡中相互联系，相互作用，从而调控细胞凋亡．本文探讨了bcl-2家族、caspase家族、p53蛋白、survivin蛋白对细胞凋亡的调控机制。 【关键词】细胞凋亡、 bcl一2家族、caspase家族、p53 蛋白、survivin 蛋白 引言 细胞凋亡是细胞的一种基本生物学现象，在多细胞生物去除不需要的或异常的细胞中起着必要的作用。它在生物体的进化、内环境的稳定以及多个系统的发育中起着重要的作用。细胞凋亡是多蛋白严格控制的过程，随着分子生物学技术的发展对多种细胞凋亡的过程有了较为深入的认识，但是迄今为止凋亡过程确切机制尚不完全清楚。而凋亡过程的紊乱可能与许多疾病的发生有直接或间接的关系。细胞凋亡是一个主动过程，它涉及一系列蛋白的激活、表达以及调控等的作用。其中caspase家族蛋白、Bcl-2家族蛋白和p53蛋白、survivin等在凋亡的信号转导中扮演着重要角色。 一、caspase家族蛋白 1.1 caspase家族蛋白介绍 caspase是半胱氨酸基天冬氨酸一特异性蛋白酶(cystei-nyl aspartate specific proteinase)即半胱氨酸天冬氨酸酶的缩写。Caspase半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶(Cysteinyl aspartate specific proteinase，Caspase)家族，也称为ICE/CED-3家族，是美丽线虫(Caenorhabditis elegans)死亡基因CED-3的同源物。这类蛋白酶与细胞凋亡形态学特征变化(如细胞膜空泡形成、核膜破裂、染色质聚集和边聚及DNA断裂等)以及一些生化改变关系密切。它们是一组存在于胞浆中的半胱氨酸蛋白酶，其共同特点是特异性断开天冬氨酸残基后的肽键。到目前为止，在小鼠和人类中，已经发现caspase家族至少有14个成员。细胞中合成的caspase以无活性的酶原状态存在，经活化后方能执行其功能。 1.2 Caspase分类 Caspase分为三大类：凋亡启动因子(apoptotic initiators)、凋亡执行因子(apoptotic executioners)和炎症介导因子(inflammatory mediators)，构成了级联放大效应。凋亡启动因子在级联反应的上游，包括Caspase-2、Caspase-8、Caspase-9、Caspase-10等,能在其它蛋白辅助下发生自我活化并识别和激活下游的Caspase。如Caspase-8几乎能激活所有凋亡级联反应下游的Caspase而诱发凋亡。凋亡执行因子在级联反应的下游，包括Caspase-3、Caspase-6和Caspase-7等，作用于其特异性底物并导致细胞凋亡。如Caspase-3，是Caspase家族中的最重要的凋亡执行者之一，是细胞凋亡过程中的主要效应因子。它的活化是凋亡进入不可逆阶段的标志。炎症介导因子包括

细胞周期与细胞凋亡检测试剂盒(PI法)

细胞周期与细胞凋亡检测试剂盒(PI法) 产品简介： Leagene细胞周期与细胞凋亡检测试剂盒(Cell Cycle and Apoptosis Analysis Kit)是一种采用经典的碘化丙啶染色(PI staining)方法进行细胞周期与细胞凋亡分析的检测试剂盒。碘化丙啶(Propidium Iodide, PI)是一种可以嵌合到双链DNA和RNA的碱基对中与直接和的荧光染料，无碱基特异性。碘化丙啶与双链DNA结合后可以产生荧光，并且荧光强度和双链DNA的含量成正比。细胞内的DNA被Propidium Iodide染色后，可以用流式细胞仪对细胞进行DNA含量测定，然后根据DNA含量的分布情况，可以进行细胞周期和细胞凋亡分析。 碘化丙啶染色后，假设G0/G1期细胞的荧光强度为1，那么含有双份基因组DNA的G2/M期细胞的荧光强度的理论值为2，正在进行DNA复制的S期细胞的荧光强度为1-2之间。凋亡细胞由于细胞核发生浓缩以及发生DNA片段化(DNA fragmentation)导致部分基因组DNA片断在染色过程中丢失，因此凋亡细胞碘化丙啶染色后呈现明显的弱染，即荧光强度小于1，在流式检测的荧光图上出现所谓的sub-G1峰，即凋亡细胞峰。 细胞凋亡时，流式细胞检测可呈现亚二倍体核型的特征，根据光散射的特点，PI染色可以区分细胞凋亡和细胞坏死的细胞峰型。细胞凋亡时，出现凋亡细胞皱缩、染色质浓缩、核碎裂，产生凋亡小体，使细胞的前向光散射低于正常。在细胞凋亡的早期，细胞对前向角光散射的能力显著降低，对侧向光散射的能力增加或没有变化。在细胞凋亡的晚期，前向和侧向光散射的信号均降低。细胞坏死时细胞多表现为细胞肿胀，因此前向光散射高于正常，对侧向光散射高于正常。 Leagene Cell Cycle and Apoptosis Analysis Kit经常用于培养的贴壁或悬浮细胞的细胞周期与细胞凋亡检测，亦可用于区分细胞凋亡和细胞坏死。该试剂盒检测细胞含量范围一般为0.1～1×106之间。 主要成分：

Elesclomol (STA-4783)_氧化应激细胞凋亡诱导剂_488832-69-5_Apexbio

产品名: Elesclomol (STA-4783)修订日期: 6/30/2016产品说明书 化学性质 产品名: Elesclomol (STA-4783) Cas No.: 488832-69-5 分子量: 400.5 分子式: C19H20N4O2S2 别名: STA 4783, STA4783 化学名: 1-N',3-N'-bis(benzenecarbonothioyl)-1-N',3-N'-dimethylpropanedihy drazide SMILES: CN(C(=S)C1=CC=CC=C1)NC(=O)CC(=O)NN(C)C(=S)C2=CC=CC=C2 溶解性: >20.15mg/mL in DMSO 储存条件: Store at -20°C 一般建议: For obtaining a higher solubility , please warm the tube at 37°C and shake it in the ultrasonic bath for a while.Stock solution can be stored below -20°C for several months. 运输条件: Evaluation sample solution : ship with blue ice All other available size: ship with RT , or blue ice upon request 生物活性 靶点 : Proteases 信号通路: HSP 产品描述: Elesclomol （STA-4783），最初是在用于促凋亡活性鉴定的基于细胞的表型筛选中获得的，是一种新型小分子，通过快速产生氧化应激（ROS ）和诱导难以应对的氧化应激水平，从而有效诱导癌细胞凋亡。在人类肿瘤异种移植模型中，elesclomol 对广谱类型的癌细胞均具有抗肿瘤活性，通过产生过量的ROS 和升高氧化应激水平，从而导致癌细胞死亡。Elesclomol 目前正作为一种新的癌症治疗方法用于研究，已证明，elesclomol 具有延长研究对象中无进展

细胞凋亡的研究进展

细胞凋亡的研究进展 姓名：郝先行 学号：10000821 学院：通达学院

摘要：细胞凋亡(apoptosis)是机体正常细胞在受到生理和病理性刺激后出现的一种自发的死亡过程,是一个主动、高度有序、基因控制及一系列酶参与的过程。细胞凋亡在保证多细胞生物健康生存过程中扮演着关键角色,对个体的正常发育具有重要作用。机体在产生新生细胞的同时,衰老和突变的细胞通过凋亡机制而被清除,使器官和组织得以正常地发育和代谢。细胞凋亡发生异常会导致疾病的发生,如肿瘤、自身免疫性疾病、病毒感染等。本文概述了细胞凋亡的特征、分子机理、2条主要信号途径、检测方法、生物学意义及与疾病的关系。 关键词：细胞凋亡；分子机理；信号通路；检测方法；疾病 参考文献： 1.潘耀谦高丰.细胞凋亡与细胞坏死比较的研究进展[J].动物医学进展，2000，21(4)：5-8. 2.唐兆新高洪.细胞凋亡的生化特征和生物学意义[J].动物医学进展，1998，19(4)：1- 3. 3.高利波高洪.细胞凋亡与疾病防治[J].动物医学进展，2001，22(2)：37-38. 4.宋建领王金萍等.细胞凋亡的研究近况[J].云南畜牧兽医，2003(1)：5-7. 5.Kerr J FR., Winterford CM, Harmon BV. Apoptosis Its significance in cancer and cancer therapy[J]. Cancer ,1994 ,73 :2013～202 6. 6.Vaux DL. . Apoptosis timeline[J]. Cell Death Differ ,2002 ,9 :349～354. 7.杨宇泽师如意谷传慧.细胞凋亡的特征、检测方法及生物学意义[J].上海畜牧兽医通讯，2008(5)：67-67.

线粒体与细胞凋亡

线粒体与细胞凋亡 苑金香(潍坊学院生物系山东潍坊261043) 摘要 细胞凋亡是一种由基因控制的自主性死亡过程。近年来研究发现,线粒体在细胞凋亡过程中起重要作用,它可以通过改变膜通透性、释放凋亡活性物质等介导细胞凋亡。 关键词 线粒体 细胞凋亡 线粒体作为真核细胞能量代谢中心已为人熟知,然而近年来的研究发现,线粒体在细胞的另一重要生理活动 细胞凋亡中还扮演着重要角色。细胞凋亡即细胞程序性死亡(programmed cell death),是一种由基因编程调控的细胞主动自杀过程,细胞凋亡在胚胎发育、机体内环境的稳定、细菌和病毒感染细胞的清除过程中起重要作用,许多疾病的发生与细胞凋亡失控有关,而线粒体在细胞凋亡过程中起着重要作用。 1 线粒体膜的通透性改变与细胞凋亡 线粒体起着启动细胞凋亡的重要作用,其主要机制与线粒体渗透性转换孔(mitochondrial permeability transi tion pore,mtPTP)开放有关,mtPTP位于线粒体内膜和外膜的交界处,是一种由多种蛋白组成的复合体。mtPTP参与调节线粒体基质中的Ca2+、pH值电荷等,维持线粒体内环境的稳定性,保持氧化还原通路的畅通。mtPTP平时允许不大于0.15 104的小分子物质通过。当线粒体内Ca2+超载、自由基对线粒体膜造成氧化损伤,或者是能量产生下降时,均可引起mtPTP开放。在细胞凋亡发生早期,线粒体膜mtPTP打开,线粒体内膜电位( m)降低,一方面使得线粒体内的死亡促进因子(deathe-promoting factor,DPF)释放出来,促进凋亡的进行;另一方面,又使得细胞质进入线粒体基质,由此引起膜质子的转运异常,导致线粒体处于高渗状态,线粒体基质扩张,细胞骨架蛋白受压,直接导致细胞凋亡。 2 线粒体释放物与细胞凋亡 研究发现,线粒体内含有许多促死亡因子,包括细胞色素C,凋亡诱导因子(apoptosis-inducing factor,AIF),胱冬酶原及其他线粒体蛋白等。这些因子从线粒体中释放出来以后,以不同的方式参与到细胞凋亡的过程,影响细胞凋亡的进程。 2.1 细胞色素C的释放与细胞凋亡 1996年德克萨斯西南医学院研究中心王晓东研究小组发现细胞色素C参与细胞凋亡的过程。当细胞受凋亡信号刺激后,细胞色素C能迅速从线粒体释放到胞浆中,在细胞色素C含量丰富的细胞中,细胞将进入快速凋亡机制,释放出来的细胞色素C参与激活凋亡的酶通路,细胞内仍有许多未释放的细胞色素C,它们维持电子传递和有氧呼吸,从而产生足够的ATP,为细胞凋亡提供足够的能量。而在细胞色素C含量较少的细胞中,由于细胞色素C的大量释放,使电子传递链受阻,ATP产量骤减,无法提供足够的能量,因而使细胞走向与凋亡完全不同的坏死过程。 72h,凋亡细胞数从6.65%增加到16.42%;若处理96h 后,凋亡细胞数从4.71%增加到21.94%,这说明染料木黄酮可诱导前裂腺癌细胞的凋亡,通过这种办法可预防前列腺癌的发生。 另外,许多不同种类的化学物质(如亚硝胺类、杂环胺类、多环氮氢化物和糖醛核呋喃等)、外界微生物的侵袭、高温和放射线等化学的、物理的和生物的因素是影响癌细胞的生长和凋亡的外源性调节因素。还有一些常规使用的肿瘤化疗药物(如顺铂、维甲酸、羟基脲等)和 射线都可诱导多种肿瘤细胞凋亡。 4 结论 在正常机体内,细胞增殖和细胞凋亡处于一种动态平衡。故癌的发生和细胞的生与死密切相关。一方面,细胞的过度增殖导致了癌的发生,一些化学预防剂抑制癌发生的一个重要机制就是抑制细胞增殖;另一方面,细胞凋亡过程的失调也是癌发生的另一原因。研究细胞凋亡与癌发生的关系,进而诱导细胞凋亡对癌的预防具有重要的意义。 参考文献 1 Davis JN et al.Nutr Cancer,1998,32:123 131. 2 Li M et al.Cancer Epidemiol Biom Prev,2000,9(6):545 550. 3 方福德等.分子生物学前沿技术.北京医科大学、中国协 和医科大学联合出版社,1998,76 174. 4 贾旭东.细胞增殖和细胞凋亡和癌的发生和预防.国外 医学卫生学分册,2001,28(2):65 68. (B H) 17 2003年第38卷第5期 生 物 学 通 报

细胞凋亡的结构生物学研究进展

文章编号 ：1004-0374(2010)03-0224-05 细胞凋亡的结构生物学研究进展 施一公 （清华大学生命科学学院，北京 100084） 摘　要：在多细胞生物体内，细胞会发生编程性死亡(即细胞凋亡)，使得细胞数量得到精确调控。细胞凋亡调控的异常与癌症、自身免疫病、神经退行性疾病等疾病密切相关。在过去的二十年里，人们详细地研究了参与细胞凋亡调控的分子机制。该文综述了近年来利用结构生物学手段，对参与细胞凋亡调控的分子，主要是Ca spa se和与Ca spa se活性调控直接相关的蛋白功能的研究进展。 关键词：细胞凋亡；机制；结构生物学；Cas pas e 中图分类号：Q255; Q617 文献标识码：A Mechanisms of programmed cell death through structural biology SHI Yi-gong (College of Life Sciences, Tsinghua University, Beijing 100084, China) Ab stra c t: C e lls und e rg o p ro g ra m m e d c e ll d e a th (a p o p o sis) in a ll m ultic e llula r o rg a nism s. Alte rna tio ns in a p o p to tic p a thw a ys ha ve b e e n im p lic a te d in m a ny typ e s of d ise a se s in hum a n, inc lud ing c a nc e rs, a utoim m une d ise a se s, a nd ne urod e g e ne ra tive d isord e rs. I n the p a st tw o d e c a d e s, the m ole c ula r m e c ha nism s of a p op tosis ha ve b e e n e xte nsive ly stud ie d. I n this p a p e r, a utho r re vie w s the p ro g re ss in the stud ie s o f m ole c ula r func tions of p rote ins involve d in a p op tosis re g ula tions, m a inly C a sp a se s a nd C a sp a se-re g ula ting p rote ins, using struc tura l b iolog y a pproa c he s. K e y word s: apoptosis; mechanism; structural biology; Caspase 1　细胞凋亡调控机制研究背景 在动物体内，细胞数量需要被精确控制。如果细胞增殖过度，则造成癌症；如果细胞凋亡过度，则可引起神经退行性疾病诸如阿尔茨海默氏症。 细胞凋亡的有关知识，了解得最清楚的就是在秀丽隐杆线虫(C a e norha b d itis e le g a ns，C. e le g a ns)中。人们可以精确描述线虫中1 090个细胞的发育命运和其中的凋亡事件，其中有131个细胞在特定的位置和时间发生编程性死亡，留下成体线虫共959个细胞。在20世纪80~90年代，麻省理工的Ho rvitz研究组进行的遗传学研究表明，有4个基因共同严格控制了线虫中的细胞编程性死亡，它们是e g l-1、c e d-9、c e d-4和c e d-3[1]。c e d-3编码一个半胱氨酸蛋白酶C E D-3，特异性针对天冬氨酸残基，称为C a spa se。与所有的C a spa se一样，CE D-3的 这种活性必须受到调控，它被CE D-4激活，发生自身切割。C E D-4的功能又被C E D-9所抑制，而C E D-9又被E GL-1抑制，这样就形成了一个精确的调控系统。 在哺乳动物细胞中，凋亡的机制更为复杂。有两种被详细研究了的细胞凋亡途径：一条是外源性的途径，由胞外“死亡配体”(de a th l i g a nd)触发“死亡受体”(de a th re c e ptor)，进而通过级联反应激活C a sp a se-8——外源性途径的起始C a sp a se；另一方面，许多细胞凋亡由细胞内部事件，如DNA 损伤等压力而触发(内源性途径)，激活C a sp a se-9。在它们被激活后，Ca spa se-8、-9将激活下游效应C a sp a se，如C a sp a se-3、-7等。下游的这些C a sp a se 被激活，进而最终杀死细胞。 本文主要集中讨论另外一条途径——内源性途

细胞凋亡的途径

按照起始caspase的不同，可将哺乳细胞的凋亡分为三种基本的途径。 一种称为外在途径（extrinsic pathway），由细胞表面的死亡受体如Fas和肿瘤坏死因 子受体家族（tumour necrosis factor receptor，TNF-R）引发; 另一种称为内在途径（intrinsic pathway）或线粒体途径（mitochondrial pathway），由许多应激条件、化学治疗试剂和药物所起始（Nicholson, 1999；Denault和Salvesen，2003）; 第三种途径是内质网应激所导致的caspase-12的活化，从而导致凋亡。 细胞凋亡的途径 摘要细胞凋亡是机体维持自身稳定的一种基本生理机制，是有许多基因产物及细胞因子参与的一种有序的细胞自我消亡形式。通过细胞凋亡，机体可消除损伤、衰老与突变的细胞来维持自身的稳态平衡和各种器官及系统的正常功能。由于细胞凋亡是一种复杂的生理及病理现象，所以在其发生的3个阶段中涉及不同的信号转导途径及其调控。 关键词细胞凋亡线粒体内质网caspase家族NO 疾病 细胞凋亡（apoptosis）是一种有序的或程序性的细胞死亡方式，是受基因调控的细胞主动性死亡过程，是细胞核受某些特定信号刺激后进行的正常生理应答反应，然后凋亡的细胞将被吞噬细胞吞噬。经研究发现，不管是单细胞生物还是多细胞生物，细胞凋亡被称为细胞程序性死亡（programmed cell death，PCD）[1]。是因为细胞死亡往往受到细胞内的某种遗传机制决定的“死亡程序”控制的。也会因为它的失调，机体也会失去稳定性，引发人类疾病如肿瘤、免疫系统等疾病[2]。由于它保证多细胞生物的健康生存过程中的重要性，引起了人们对其途径的广泛深入的研究，成为目前生命科学研究的热点之一。但其凋亡的途径不是很清楚，本文从多个方面概述了细胞凋亡途径。 1 细胞凋亡形态学上的特征 细胞凋亡（apoptosis）是1972年由Kerr教授根据形态学特征最先提出的[3],主要强调的是这种细胞凋亡是自然界中的生理学过程，是受基因调控的主动的生理性细胞自杀行为。

细胞凋亡研究进展_阎海

中山大学研究生学刊（自然科学、医学版） 第33卷第3期JOURNAL OF THE GRADUATES VOL.33?3 2012SUN YAT-SEN UNIVERSITY（NATURAL SCIENCES、MEDICINE）2012 细胞凋亡研究进展* 阎海 (中山大学生命科学学院，广州510006) 【内容提要】细胞凋亡是当前生物学领域中研究的最新课题之一。细胞凋亡 在保证多细胞生物健康生存的过程中扮演着关键角色，对个体的正常发育具有 重要作用。它在多细胞生物的组织分化、器官发育、机体稳态的维持中有着重 要意义。目前对与细胞凋亡的研究已进入分子水平，在细胞凋亡的机制、相关 基因及其应用方面都取得了不小的进展。 【关键词】细胞凋亡;基因;应用;机制 引言 生物体内环境的稳定，不但依赖细胞的增殖和分化，也依赖于细胞的凋亡。细胞凋亡（apoptosis）是1972年由Kerr教授根据形态学特征首先提出的［1］，是一种由基因控制的细胞自主性死亡方式，是一种主动的、程序性的、细胞固有的生物学过程，又称细胞程序性死亡［2］（programmed cell death，PCD）。凋亡主要是形态学的概念，不同于主要功能性概念的死亡，是细胞程序性死亡的形式之一，与组织器官的发育、机体正常生理活动的维持、某些疾病的发生以及细胞恶变等过程均有密切关系［3，4］。从80年代末期开始，细胞凋亡成为了肿瘤病因学、病理学研究热点，人们对凋亡的认识逐渐深人，对凋亡发生分子机制的了解越来越透彻，然而也发现这一过程远非原来想象的那样简单，而是包含了复杂的调控机制。自90年代发现哺乳动物的细胞凋亡基因以来，细胞凋亡的研究引起了广大生物医学工作者的兴趣，近几年的研究在凋亡信号转导途径、凋亡的生化反应机制以及凋亡的基因调控等方面都取得了显著的进展。细胞凋亡已成为当今生物学研究最新热点之一。 1细胞凋亡的形态学特征 细胞凋亡具有独特的形态学特征，在光镜下，凋亡细胞主要表现为：细胞凝缩，染 *收稿日期：2012－09－27 作者简介：阎海，女，1990年出生，祖籍山西，中山大学生命科学学院09级逸仙班本科生，目前从事端粒及端粒酶相关研究，联系方式:1073194120@https://www.wendangku.net/doc/3016307386.html,

组织中的细胞周期和凋亡检测方法之一--PI法

组织中的细胞周期和凋亡检测方法之一－－PI法 schoman 无论是肿瘤或其它正常新鲜组织均可用PI（碘化丙啶）的方法来检测，这是一种常见而且便宜的方法。主要操作步骤如下： 1、组织块用0.25%胰酶消化30min－1h。 2、200－400目筛网过滤细胞，获得单细胞悬液。 3、75％乙醇（－20度预冷）固定细胞1h。 4、加入PI（终浓度50ug／ml）和无DNA酶污染的RNA酶（终浓度50ug／ml）1ml染色30min－1h。 5、流式细胞仪检测细胞周期和凋亡。 注意事项： 1、组织消化后使细胞形成单个细胞悬液是本检测方法的关键。如组织难以消化，可加入适量胶原酶。另外，消化前，用剪刀将组织剪成小块也不要忘了。 2、细胞可尽量的多准备（at least 100 thousand），这样流式检测方便，结果可靠。 3、每次消化的时间等条件应尽量一致，否则使实验结果CV值偏大。 4、细胞用乙醇固定后可以访置48小时（4度保存）后检测，便于无法立即检测的实验者，对实验结果基本没有影响。 其它也有一些检测凋亡的方法，均有商品化试剂盒。在此不赘述。yanzishenyang：我看相关的说明：碘化丙啶（propidium iodide,PI）检测早期死亡细胞膜通透性状态的不同是区分细胞凋亡和坏死的一个重要指标，凋亡细胞在进入最终溶解阶段前，胞膜通透性无明显改变，相对分子质量大的与DNA 结合的荧光染料（如PI）不能时入凋亡细胞内，而相对分子质量小的荧光染料（如Hoechest 3342或33258等）仍能被细胞摄取。应用流式细胞仪或荧光显微镜可区分和坏死细胞，细胞内DNA出现Hoechest 3342标记而不出现PI标记的为凋亡细胞。 偶得细胞是用PI染色的，经过流氏细胞仪检测出现一个亚二倍体峰，是否能和坏死区别？因为偶用的作用细胞的蛋白本身可以造成细胞膜的损伤，所以PI可以进入细胞，这是否意味着我检测的结果无法区分凋亡和坏死？ hdhdhd0000：用PI法识别凋亡时，有一种方法叫SUB-G1法，这种方法需要在染PI前加入适量的破膜剂（磷酸盐－枸橼酸盐缓冲盐），我们称之为PC液，它会让晚期凋亡所形成的DNA小碎片部分出膜而使胞内的DNA总含量减少，从而使流式上的DNA直方图的G0/G1峰前出现一个亚二倍体峰，也就是SUB－G1峰（凋亡峰）！ 用荧光2的面积做直方图可以清楚的看见凋亡峰，但是要区分APo和Nec需要少量的经验，而在荧光2高度图上，因为是用的是对数，所以可以把凋亡和坏死拉开，凋亡峰在不同的细胞周期特异性细胞凋亡时，都特异性的出现在10的2次方荧光道数处，坏死在10的1次方处，从而可以清楚的分清它们。 核染色剂（核染料） yuanaiyu：用流式细胞仪测脑组织细胞悬液中细胞线粒体的膜电位，需先将细胞与细胞碎片区分开来，现考虑用一种亲细胞核的染料将细胞分选出来，已尝试用过PI，但pI分子量大，过分破坏细胞膜而影响了线粒体膜电位。请问有没有一种小分子的核染料，既能进入细胞核又对对细胞膜的影响很小？何处能买到？

线粒体和细胞凋亡

无论从原始的生物线虫到高级的哺乳动物乃至人类，还是从生物体外周器官到中枢神经系统，细胞凋亡都广泛存在。它作为生命的基本现象之一，可以发生在生理或病理条件下[1]。最初人们仅从形态学表现的特征上加以认识，如胞膜对称性丧失、染色质凝集、细胞皱缩、DNA破碎、线粒体肿胀和凋亡小体形成。随着科学的发展，人们开始发现线粒体在细胞凋亡中的起着重要的作用。随着对细胞凋亡研究的深入，人们对线粒体与体细胞凋亡的关系有了新的认识。

2.1细胞凋亡的概念 细胞凋亡是细胞程序性死亡（programmed cell death, PCD）是一种细胞自身有基因控制的主动性死亡过程，其形态特征为核染色体固缩、DNA片段化、胞质浓缩、胞膜皱缩并形成凋亡小体，生化上表现为DNA梯形条带。而最新研究表明人类许多疾病都与其相关，如爱滋病、神经变性性疾病、骨髓发育不全综合征、酒精中毒性肝病、缺血性损伤, 尤其宫内窘迫所致胎儿缺血缺氧性脑损伤。神经细胞的凋亡，更是目前关的焦点，凋亡程度与胎儿乃至新生儿的脑发育、智力发育密切相关[2]。而科学家们发现，用溴化乙锭除去线粒体DNA(mtDNA)诱导一株人成纤维细胞凋亡，表明线粒体在细胞凋亡中起作用[3]。现在认为，细胞凋亡有胞核和胞质两条途径，随着对细胞凋亡研究的深入，人们对线粒与体细胞凋亡的关系有了新的认识。 2.2细胞凋亡与细胞坏死区别 细胞凋亡是细胞受基因调控的一种自然死亡过程，同细胞生长分化一样是生命活动中重要的细胞学事件。细胞凋亡与坏死不同，是一种细胞遵循自身程序结束其生命的主动的细胞学过程，对机体清除衰老或受损细胞具有重要意义[4]。细胞凋亡与坏死在形态特征上有明显的区别，凋亡细胞表现为染色质固缩，常聚集于核周边，呈境界分明的颗粒块状或新月形小体；细胞浆浓缩，密度增高；细胞核裂解为碎片，而线粒体形态结构保持完整（凋亡细胞细胞膜和线粒体的动态变化）。坏死是一种由多种刺激所引起的非特异性细胞死亡。如补体作

细胞凋亡途径

细胞的凋亡 凋亡抑制蛋白(inhibitors of apoptosis , IAPs)是细胞内一类独特的抗凋亡蛋白家族,包括XIAP，c-IAP1，c-IAP2，神经元凋亡抑制蛋白(NIAP) ,ML-IAP, Apollon和survivin。IAPs通过在体外或体内抑制不同的caspases而抗细胞凋亡。与其他的可抑制上游 caspases的蛋白不同, IAPs是唯一的内源性 caspase 抑制物【1】。 Survivin(生存素)是凋亡抑制蛋白家族中的成员，是迄今发现最强的凋亡抑制因子，于1997年由耶鲁大学Alfieri【2】等用效应细胞蛋白酶受体1(effector-cell protease receptor 1, ERP-1)在人类基因库的杂交中分离出来，Survivin大量表达于胚胎及婴幼儿组织中，在正常的分化组织中几乎检测不到【3】，然而却在60余种肿瘤细胞株和大部分人体肿瘤组织过度表达。 1.Survivin的分子结构 IAP家族蛋白一般在N末端含有 2～3个串联的含有 Cys/ His的保守冠状病毒IAP重复序列结构域(Baculovirus IAP Repeat, BIR)，发挥着极为重要的凋亡抑制作用。IAPs家族发挥抗凋亡作用的机理是通过BIR功能区之间的连接序列直接与Caspases家族蛋白结合，抑制细胞凋亡的发生。多数IAPs的C末端还含有一个环指状结构域(RING-finger domain)能够与两个锌原子形成配位键。这一锌指结构对于IAPs家族蛋白抗凋亡的功能密切相关。只有包含BIR2功能区的IAPs蛋白分子才具有结合和抑制死亡蛋白酶的功能，单一BIR1， BIR3或环指结构以及它们的任意组合蛋白体均无此效应。 Ambrosini 等【4】测定并绘出了Survivin基因完整的基因图谱，全长14796 bp，位于距离端粒约3%的位置。Survivin 基因与EPR-1 基因的编码区序列高度互补，位于染色体17q25的同一基因族，含有3个内含子和4个外显子，编码产生1个由142个氨基酸组成的胞浆蛋白，分子量约为16. 5kD。Survivin只含有一个BIR区域，C末端有一个α卷曲螺旋结构，不含环指状结构域【5】。 Survivin是唯一具有剪接异构体的IAP基因，一个是序列中缺少外显子3的survivin-ΔEX3；另一个是把部分内含子2作为隐蔽的外显子的survivin-2B。两者序列的改变导致了相应蛋白质结构和功能发生了显著变化，survivin-ΔEX3仍保留抗凋亡特性，survivin-2B抗凋亡功能则显著下降[6]。2004年Badran A等[7]发现survivin的另一新剪接异构体survivin-3B，survivin-3B 含有5个外显子，比survivin多3B外显子， survivin-3B包含单一的BIR，这对于其抗调亡作用致关重要。最近，包含两个外显子，3'为197bp的内含子的survivin-2α发现【8】。其终止密码在第2内含子，编码产生74个氨基酸的蛋白质。survivin的剪接异构体的功能尚不清楚，初步认为survivin-ΔEX3与线粒体依赖性凋亡通路有关，另外，证实survivin-2α能减弱survivin的抗凋亡活性[7]。 Survivin的异构体如图1。