DNA非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳银染配方及步骤
DNA非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳银染配方及步骤
最近需要做DNA非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,需要用银染显示条带,但是找不到具体的配方和步骤,不知和蛋白PAGE电泳银染有什么差别,哪位师兄师姐有配方可否发一份,十分感谢!一、电泳试剂：
1、30％聚丙烯酰胺(29:1)
丙稀酰胺29克，Bis1克，水100ml。
2、10％过硫酸胺
过硫酸胺1克，水10ml。
3、TEMED
4、5xTBE
Tris 27克，硼酸13.75克，0.5M EDTA(pH 8.0) 10ml，定容至500ml。
二、银染试剂
1、固定液：100ml无水乙醇，5ml冰醋酸，定容至1000ml。
2、0.2% AgNO3：AgNO3 1克，水500ml。
3、1.5% NaOH：NaOH 7.5克，水500ml。
4、37％甲醛。
三、配胶(6%)：
30％聚丙烯酰胺(29:1) 8ml，5xTBE 8ml，定容至40ml，加10％过硫酸胺 200ul；T EMED 20ul。室温凝固时间>1小时。
四、银染：
1、固定液固定10m。
2、水洗2m x3次。
3、0.2% AgNO3 100ml ＋37％甲醛50ul，混匀，避光染色30～50m。
4、水洗 20秒x2次。
5、1.5% NaOH 100ml，加37％甲醛 0.5ml，混匀，显色3～10m。
6、水洗若干次，终止显色。
电泳时间：150v x 3h，溴酚兰的位置相当于40bp。
银染后胶面积将膨胀10％。
在终止显色过程中，将依惯性继续显色，所以不等显色到位即可进行终止显色。
显色到位后立即拍摄，水浸泡过夜将使背景加深转贴！！！
聚丙烯酰胺凝胶电泳是分子生物学常用的一种技术。我们实验室应用该项技术进行基因组甲基化的筛选，取得了一定结果。因为全基因组的筛选需要很高的灵敏度，背景干扰降到最低，因此在对凝胶进行染色时，往往采用同位素法或银染法，而且配制的胶往往很大，我们配制的是大约40×35cm的胶，0.4mm厚。同位素十分灵敏，特异，但是由于其操作的复杂性，许多实验室开展有一定困难。银染法相对简便易行，便于一般的实验室开展。
需要指出的是，应用与筛选基因组的银染往往采用测序胶的染色方法，这样才能保证灵敏性，我们在长期的工作中积累了一些银染的经验，与大家分享。
下面是网上的一个银染方法，我们使用后觉得效果不错，然后以此为基础，介绍一下我们的经验
测序凝胶的银染
染色过程要求凝胶浸在塑料盘中。因而至少使用两个盘子，大小与玻璃板类似。在盘中加入新鲜溶液之前须用高质量的水洗涤盘子。
1. 电泳完毕后用一个塑料片子小心地分开两板，凝胶应该牢固地附着在短玻璃板上。
2. 固定凝胶：将凝胶(连玻璃板)放入塑料盘，用固定/停止溶液浸没,充分振荡20分钟或直至样品中染料完全消失，胶可在固定/停止溶液中保存过夜(不振荡)。保留固定/停止溶液，用于终止显影反应。
3. 洗胶：用超纯水振荡洗胶3次，每次2分钟。从水中取出, 当转移至下一溶液时拿着胶板边沿静止10-20秒，使水流尽。
4. 凝胶染色：把凝胶移至染色溶液充分摇动30分钟。
5. 凝胶显影：
(1). 在显影溶液中加入甲醛(3ml)和硫代硫酸钠溶液(400μl)以完成显影液的配制。
(2). 从染色溶液中取出凝胶放入装有超纯水的盘中浸洗5-10秒。注重，把凝胶从超纯水转移到显影溶液的总时间不能长于5-10秒。浸泡时间过长则导致信号微弱或丧失信号。若浸泡时间过长,可重复第五步用染色液浸泡。
(3). 马上将凝胶转移至1升(总量的一半)预冷的显影液充分振荡直至模板带开始显现或开始出现第一批条带,把凝胶移入剩下的1升显影液中继续显影2--3分钟,或直至所有条带出现。
6. 固定凝胶：在显影液中直接加入等体积的固定/停止溶液。停止显影反应,固定凝胶。
7. 在超纯水中浸洗凝胶两次，每次2分钟，注重在本操作中戴手套拿着胶板边缘避免在胶上印上指纹。
8. 将凝胶置于室温干燥或用抽气加热法干燥。在可见光灯箱或亮白，黄色背景(如纸)上观察凝胶，若需永久保存的记录, 则可用EDF胶片保留实验结果。
经验分享：
（1）固定液：网上有好几种固定液的配制方法，我们采用的是10％的冰乙酸，用蒸馏水稀释即可，简便易行。可提前配制，室温放置。
（2）染色液：我们用的是0.1％的硝酸银溶液，加入3ml甲醛。硝酸银要现用现配，时间长了硝酸银会分解，一般在固定的时候配制，要有一段时间让硝酸银充分溶解。（3）显影液：用10％碳酸钠，北化的质量就不错，完全不用买进口的，显影液要提前配制，放入4度冰箱预冷。这一步很重要，假如没有充分预冷，显色时很难控制显色时间，不是染过了导致背景很高，就是染的很浅。因此在固定前就要把显影液配好。
（4）在2L显影溶液中加入甲醛(3ml)和硫代硫酸钠溶液(400μl)以完成显影液的配制，这一步要在显影前加，不要提前加。原理忘记了，但是一般都是这样做的。
甲醛将银离子还原为金属银，硫代硫酸钠防止自由银离子还原为金属银，否则会增加背景。甲醛和硫代硫酸钠溶液的量是变化的，根据凝胶染色的效果决定。当时我是把甲醛调整为2.7ml，硫代硫酸钠改为420μl，两者作用不一样，所以调整的时候一个多，一个少，而且要微调。具体什么方向调整忘记了，需要摸索最合适的条件。
（5）也是比较重要的，即一定要分两次显色，第一次显色出现条带后马上转移至剩
下的显影液中。显色时间第一次大概是5分钟左右，操作中一定要在边上看着。显色后马上放入终止液（10％的冰乙酸）中，两分钟后放入纯水中即可，两分中后取出即可。
（6）对我来说教训最为惨痛的，即显色时间的控制。第二次显色时不要等所有条带都出来后再终止，因为显色有一个延续效应。当时我染色时，忽然走神了，就走神5秒钟，胶全黄了，背景奇高。我两天的工作因为5秒钟全部over了，当时差点疯了。
我的经验是：当染色离自己期望的效果还差那么两点时马上终止，具体时间需要摸索，但一定要提前终止。再加一句：万一染色浅了是可以复染的，效果差不太多。十分感谢!顶下,不错求助：DNA变性聚丙烯酰胺凝胶电泳银染配方及步骤aifuhong 你好，我想请教下：我在做DNA变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，我看到文献中显影液中有的加硫代硫酸钠，有的文献上没有加，我第一次做这实验不清楚，到底这个加不加会影响很大吗？aifuhong你好，我想请教下：我在做DNA变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，我看到文献中显影液中有的加硫代硫酸钠，有的文献上没有加，我第一次做这实验不清楚，到底这个加不加会影响很大吗？
RNA的变性电泳原理
RNA的琼脂糖凝胶电泳 实验原理 RNA电泳可以在变性及非变性两种条件下进行。非变性电泳使用1.0%--1.4%的凝胶，不同的RNA条带也能分开，但无法判断其分子量。只有在完全变性的条件下，RNA的泳动率才与分子量的对数呈线性关系。因此要测定RNA分子量时，一定要用变性凝胶。在需快速检测所提总RNA样品完整性时，配制普通的1%琼脂糖凝胶即可。 基本过程同DNA电泳一样，但应明确一点的是，因为RNA分子对RNA酶的作用非常敏感，因此必须用对RNA酶有抑制作用DEPC水来配置所有溶液，所有与RNA接触的仪器和装置都要严格处理以尽量减少RNA酶对样品的降解；另外，因为RNA分子有二、三级结构可以影响其电泳结果，因此电泳时应在变性剂存在下进行，常用的变性剂为甲醛和戊二醛。 RNA非变性琼脂糖凝胶检测 实验材料、器具及药品 蘑菇的总RNA溶液。电泳仪，电泳槽，电子天平，移液器，枪头，微波炉，紫外透射检测仪等。琼脂糖，1XTAE电泳缓冲液，0.5μg/ml溴化乙锭（EB）10X载样缓冲液。 实验步骤 （1）用1×TAE电泳缓冲液制作琼脂糖凝胶，加1×TAE电泳缓冲液至液面覆盖凝胶。（2）在超净工作台上，用移液器吸取总RNA样品4 ul于封口膜上。在实验台上再加入5 ul 1×TAE电泳缓冲液及1 ul 的10X载样缓冲液，混匀后，小心加入点样孔。 （3）打开电源开关，调节电压至100V，使RNA由负极向正极电泳，约30min后将凝胶放入EB染液中染色5min,用清水稍微漂洗。在紫外透射检测仪上观察RNA电泳结果。
非变性电泳：上样量超过3ug，电压超过6V/cm，电泳缓冲液时间太长，均可能导致28S 和18S 条带分不开。使用2ug 上样量，电压小于6V/cm，使用新鲜的电泳缓冲液并且频繁混匀两极的缓冲液，是获得好的电泳结果的前提。(以DNA 标准为参照，28S 和18S 分别位于2.0kb 和0.9kb 左右。) 变性电泳条带变淡：EB 与单链的结合能力要差一些，故同样的上样量，变性电泳比非变性电泳要淡一些。另外的可能是甲醛的质量不高。 RNA的变性琼脂糖凝胶检测 试剂： （1）MOPS缓冲液（10*）:0.4mol/L 吗啉代丙烷磺酸（MOPS）(PH7.0)，0.1mol/L NaAc, 10mol/L EDTA。 （2）上样染料：50%甘油，1mmol/L EDTA ,0.4%溴酚蓝，0.4%二甲苯蓝。 （3）甲醛。 （4）去离子甲酰胺。
非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native-PAGE)
非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native-PAGE)的分类 有三种常用的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳方法：blue native（BN-PAGE），clear native （CN-PAGE），quantitative preparative native continuous（QPNC-PAGE）。 在一个典型的native PAGE方法中，复合物被CN-PAGE或BN-PAGE分离。然后可以用其它分离方法如SDS-PAGE或等电聚焦做进一步分离。随后切割凝胶，蛋白复合物每一个部 分都被分开。蛋白的每个条带可以消化后做肽链指纹图谱或重新测序。这样就可以提供一个蛋白复合物中单个蛋白的重要信息。 1. Blue Native PAGE Blue Native PAGE是最古老的Native-PAGE技术。是以考马斯亮蓝作为电泳分离后蛋白 质鉴定染料的一种电泳方法。这种方法的缺点是：考马斯亮蓝与蛋白的结合起到了去垢剂的作用，可能导致复合物的分离；并对化学发光或蛋白质辅基的荧光或荧光染料的标记具有潜在的猝灭作用。 Blue Native PAGE在分析蛋白质-蛋白质相互作用以及膜蛋白复合物方面有很大的优势，其分离范围在100KDa-10MDa。在Blue native PAGE过程中，最重要的化合物就是考马斯亮蓝，除了增溶作用以外，蛋白质表面结合了大量的考马斯亮蓝染料而带上负电荷，这会导致即使碱性蛋白在pH7.5条件下也会向阴极迁移。但是，蛋白质虽然带有大量的负电荷，然而其分离依据的根本还是根据不连续的凝胶梯度-凝胶孔径的逐渐减小，蛋白质最终迁移 到其自身大小与凝胶孔径相近似的位置而停止。并且在分离膜蛋白的过程中，由于带有负电荷，而不会引起蛋白聚合，与酸性染料的结合，膜蛋白也由疏水性变成亲水性，溶解性大大提高。 1.2 Clear Native PAGE Clear Native PAGE是通过除染色以的其它方法如SLS鉴定蛋白的电泳技术。然而，这种方法最大的应用还是研究蛋白质-蛋白质相互作用，特别是和质谱联用。 Clear Native PAGE是在聚丙烯酰胺凝胶中分离酸性水溶性蛋白和膜蛋白（PI<7）的电泳
聚丙烯酰胺凝胶电泳 (1)
聚丙烯酰胺凝胶电泳 (Polyacrylamide gel electrophoresis,PAGE) 聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺(acrylamide,Acr)单体相互聚合成多条长链，再与N,N-甲叉双丙烯酰胺(methylene-bisacrylamide,Bis)在引发剂和加速剂的作用下交联而成的凝聚胶多孔聚合物。凝胶孔径的大小可通过控制单体和交联剂的浓度来调节，从而满足不同分子量物质的分离要求。不同浓度的聚丙烯酰胺非变性凝胶的有效分离范围如表所示： 表1 DNA在聚丙烯酰胺凝胶中的有效分离范围 丙稀酰胺[%(w/v)]a有效分离范围（bp）二甲苯青FF b溴酚蓝b 3.51000－2000 460 100 5.080－500 260 65 8.060－400 160 45 12.040－200 70 20 15.025－150 60 15 20.0 6－100 45 12 a．N,N′-亚甲双丙稀酰胺占丙稀酰胺浓度的1/30 b．给出的数字是迁移率与染料相同的双链DNA片段的粗略大小（核苷酸对）。 聚丙烯酰胺凝胶的制备和电泳都比琼脂糖凝胶更为费事。聚丙烯酰胺凝胶几乎总是铺于两块玻璃板之间，两块玻璃板由间隔片隔开冰封以绝缘胶布。在这种配置形式下，大多数丙烯酰胺溶液不会与空气接触，所以氧对聚合的抑制仅限于凝胶顶部的一个窄层里。聚丙烯酰胺凝胶一律是进行垂直电泳，根据分离的需要，其长度可以在10-100cm之间。聚丙烯酰胺凝胶与琼脂糖凝胶相比有3个主要优点：（1）分辨力强，长度仅仅相差０.2%（即500bp中的1bp）的DNA分子即可分开;(2)所能装载的DNA分子量远远琼脂糖凝胶：多达10μg的DNA可以加样于聚丙烯酰胺凝胶的一个标准样品槽（1cm×1mm）而不致显著影响分辨力；(3)从聚丙烯酰胺凝胶中回收的DNA 纯度很高，可适用于要求最高的实验（如鼠胚胎微注射）。 常用的是两种聚丙烯酰胺凝胶： （1）用于分离和纯化双链DNA片段非变性聚丙烯酰胺凝胶 （2）用于分离、纯化单链DNA的变性聚丙烯酰胺凝胶
聚丙烯酰胺凝胶电泳
一、目的要求 1．学习电泳原理和技术 2．学习和掌握SDS-聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分离蛋白质技术 二、实验原理 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）：蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶电泳时，它的迁移率取决于它所带净电荷以及分子的大小和形状等因素。如果在丙烯酰胺凝胶系统中加入阴离子去污剂十二烷基磺酸钠（sodium dodecyl sulfate，简称SDS），则蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于它的分子量，而与所带电荷和形状无关。因此可以利用SDS-PAGE测定蛋白质分子量。 三、试剂与器材 试剂：10%SDS、30%凝胶贮液（29%ACr-1%Bis）、分离胶缓冲液、浓缩胶缓冲液、10%过硫酸铵、TEMED、pH8.3Tris-Gly电极缓冲液、上样缓冲液、蛋白质maker、0.25%考马斯亮兰R250染色液、甲醇：醋酸脱色液、异丙醇、tris-HCl（PH6.8）缓冲液、二硫苏糖醇、去离子水 器材：垂直板电泳槽、稳压稳流电泳仪、脱色摇床、50ml小烧杯、移液枪、枪头、玻璃棒、滤纸、表面皿、手套、 四、实验步骤 1 SDS聚丙烯酰胺的灌制 ⑴按说明安装玻璃板，橡胶条放在两玻璃板之间，确定不漏液，玻璃板放入电泳槽时，有凹槽的一侧向里，时刻保持玻璃片间的压力。 ⑵根据表1制备分离胶溶液，加入TEMED后迅速旋转混合物，用1ml移液枪将其注入两块玻璃板之间的间隙中（灌制红色板的上边缘）。用枪在聚丙烯酰胺溶液上小心的覆盖一层异丙醇。将凝胶垂直放于室温下。（丙烯酰胺有神经毒性，故操作时应注意不要吸入其粉末，实验时应戴手套，剩余的聚丙烯酰胺溶液不要乱扔，待聚合后再处理） ⑶待聚合后（40min），倒掉覆盖层，用去离子水清洗凝胶顶部，尽可能倒掉凝胶上的液体，用滤纸吸干水分。 ⑷按表1配置浓缩胶，加完TEMED后迅速旋转混合，注满玻璃板间隙，插入梳子（写有1.5mm 的一侧向里，先插入一侧，在从一侧向另一侧压着插入，以排除气泡）将胶垂直放置于室温下。约30min聚合完成，拔出梳子（平行拔出），用去离子水冲洗胶孔，再用滤纸吸干水。取出玻璃板，取下橡胶条。 表1分离胶与浓缩胶配制
最新省时6 %变性聚丙烯酰胺凝胶电泳
6 ％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 实验试剂及配制： a, 40 %丙烯酰胺单体凝胶贮存液。丙烯酰胺38 g，甲叉双丙烯酰胺 2 g，加双蒸水定容至 100mL，过滤，贮存于棕色瓶中。 b,变性剂。1 M NaOH 1 mL，甲酰胺 95 mL，溴酚蓝 0. 05 g，二甲苯青 0. 05 g，加双蒸水定容至100 mL。 C, 固定液。100 mL 冰醋酸溶于双蒸水定容至1 000 mL。 d, 银染液。硝酸银 1 g， 37 甲醛 1. 5 mL，加双蒸水定容至1000 mL。 f, 显影液。无水碳酸钠 30 g， 37 甲醛 1. 5mL， 10 mg /mL 硫代硫酸钠 200 μL，加双蒸水定容至 1 000 mL。 DNA 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳的操作流程 6 ％变性凝胶的制备：40 %的凝胶贮存液 11. 2 mL，尿素36.36g， 5 × TBE 15mL，加双蒸水定容至 75 mL。预冷至 4 ℃后，加入500 μL 10 过硫酸铵和 50 μL TEMD 混合均匀，灌胶。灌胶完毕，插入样品梳，在室温下聚合 30 ～60 min。聚合完全后，梳齿下可见二条折光线。 电泳:安装电泳装置，在电泳槽中加入1 × TBE缓冲液，使缓冲液覆盖样品孔。拔出样品梳，用移液器吸取适量缓冲液冲洗样品孔。打开变压器，恒定功率 60 W 预电泳 15 ～30 min。预电泳结束后，用移液器将 DNA 样品小心注入样品孔中( 加样量为 3 ～ 5 μL) ，电泳直至带型分开。
固定:关闭电源，卸下玻璃板，剥离玻璃板，将胶板置于固定液中固定 30 min，直到指示剂颜色褪去。 漂洗:将胶板转移到双蒸水中漂洗三遍， 每次 2 ～ 3 min。 染色:转移胶板至染色液中，在摇床上摇 动染色 30 ～ 40 min。 显影:将胶板在双蒸水中漂洗 5 ～ 10 s 后 立即放入预冷为 4 ℃～ 10 ℃的显影液中，摇动显 影直到带型完全出现。 定影:将出现带型的胶板放入固定液中定 影 2 ～ 3 min，再用双蒸水漂洗两次 ( 每次 2 min) 。 干胶:胶板置于室温自然干燥。 带型统计 改良方法：a,银染 0.5%HNO+0.1 %AgNO b,漂洗蒸馏水2-3s C,显影 1.5% NaOH+0.2%Na_CO+0.5%HCHO 2-5 min d, 终止 5%无水乙醇+ 0.5 %HNO1 m后用自来水冲洗1 min。
变性梯度凝胶电泳(DGGE)
变性梯度凝胶电泳(DGGE)实验 【实验目的】 掌握变性梯度凝胶电泳检测新的突变，以及测定高度多态基因的基因型的技术方法。 【实验原理】 在现代遗传学中DNA 序列突变的分析占有十分重要的地位。由于在较大DNA 序列中检测一个细微的突变非常困难，因而现在人们建立了几种方法来解决这一难题。变性梯度凝胶电泳(DGGE)能把长度相同而核苷酸顺序不同的双链DNA 片段分开。这种方法利用了DNA 分子从双螺旋型变成局部变性型时电泳迁移率会下降的现象。不同的DNA 片段发生这种变化所需梯度不同。DGGE 的凝胶中沿电场方向变性剂(甲醛和尿素)含量递增，当DNA 片段通过这种变性剂递增的凝胶时，不同分子的电泳迁移率在不同区域会发生降低。这就可使核苷酸顺序不同DNA 片段分开。此方法可作为测序的初始步骤在杂合个体中分离等位基因。许多研究表明变性递度凝胶电泳分离能力很强，它可以把相差仅1bp 的DNA 片段分开。 【仪器、材料与试剂】 1.50×TAE 缓冲液(2mol/LTris 乙酸盐，0.05mol/L EDTA pH8.0)1L 体积：242gTris碱，57.1mL 冰醋酸，100mL 0.5mol/L EDTA pH8.0，加水至lL。 2.丙烯酰胺贮存液：40%丙烯酰胺(38:2 丙烯酰胺:双丙烯酰胺)。 3.过硫酸铵贮存液(10%)：10mL 配制：1g 过硫酸铵加水至10mL。TEMED(N，N，N＇，N＇，—四甲基乙二胺)。 4.变性剂贮存液：(0%)6%丙烯酰胺TAE 溶液。250mL 溶液：37.5mL 丙烯酰胺贮存液，5mL50×TAE 缓冲液，加水至250mL，过滤和排气。 5.变性剂贮存液(100%)：6%丙烯酰胺，7mol/L 尿素，40%甲醛TAE 溶液。250mL配制：37.5mL 丙烯酰胺贮存液，5mL50×TAE 缓冲液，105g 尿素，100mL 甲醛，加水至250mL，过滤并排气。 6.染料：40%(W/V)蔗糖，0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯青和30%甘油。 7.塑料胶框、梳子和垫片，两个用于固定胶框中玻璃片的塑料支架。 8.一有柄和一无柄的两片玻璃板(尺寸：17.78cm 宽×20.32cm 长×0.635cm 厚)，有柄的玻璃板有一个13.97cm 宽，2.54cm 厚的突出。
聚丙烯酰胺凝胶电泳原理及方法
聚丙烯酰胺凝胶电泳原理及方法 发布时间：11-06-01 来源：点击量：10032 字段选择：大中小聚丙烯酰胺凝胶电泳原理及方法 聚丙烯酰胺凝胶电泳是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的电泳方法。在这种支持介质上可根据被分离物质分子大小和分子电荷多少来分离。 聚丙烯酰胺凝胶有以下优点： ①聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺和N，N'甲叉双丙烯酰胺聚合而成的大分子。凝胶有格子是带有酰胺侧链的碳-碳聚合物，没有或很少带有离子的侧基，因而电渗作用比较小，不易和样品相互作用。 ②由于聚丙烯酰胺凝胶是一种人工合成的物质，在聚合前可调节单体的浓度比，形成不同程度交链结构，其空隙度可在一个较广的范围内变化，可以根据要分离物质分子的大小，选择合适的凝胶成分，使之既有适宜的空隙度，又有比较好的机械性质。一般说来，含丙烯酰胺7-7.5%的凝胶，机械性能适用于分离分子量范围不1万至100 万物质，1万以下的蛋白质则采用含丙烯酰胺15-30%的凝胶，而分子量特别大的可采用含丙烯酰胺4%的凝胶，大孔胶易碎，小孔胶则难从管中取出，因此当丙烯酰胺的浓度增加时可以减少双含丙烯酰胺，以改进凝胶的机械性能。 ③在一定浓度范围聚丙烯酰胺对热稳定。凝胶无色透明，易观察，可用检测仪直接测定。 ④丙烯酰胺是比较纯的化合物，可以精制，减少污染。合成聚丙
的总克数称凝胶浓度，常用T%表达；凝胶溶液中交联剂占单体和交联体总量的百分数称为交联度，常用C%表示，可用下式计算： 公式 a：丙烯酰胺克数；b：甲撑双丙烯酰胺克数；m：缓冲液体积（毫升）凝胶浓度过高时，凝胶硬而脆，容易破碎；凝胶浓度太低时，凝胶稀软，不易操作。 交联度过高，胶不透明并缺乏弹性；交联度过低，凝胶呈糊状。聚丙烯酰胺凝胶具有较高的粘度，它不防止对流减低扩散的能力，而且因为它具有三度空间网状结构，某分子通过这种网孔的能力将取决于凝胶孔隙和分离物质颗粒的大小和形状，这是凝胶的分子筛作用。由于这种分子筛作用，这里的凝胶并不仅是单纯的支持物，因此，在电泳过程中除了注意电泳的基本原理以外，还必须注意与凝胶本身有关的各种性质（网孔的大小和形状等）。可通过下式计算来选择适当的凝胶网孔。 公式 式中：P为网孔平均直径，C为多聚体浓度，d为该多聚体分子直径（若不是卷曲的分子应为5A），K为常数，K值取决于涨胶的几何构型，假如多聚体的链是以近似于直角交联的，则约为1.5根据此式，我们可以通过多聚体浓度C近似地计算出网孔直径，例如已知多聚体浓度为5%，其网孔平均直径应为： 公式
非变性凝胶电泳技术
Native-PAGE原理 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native-PAGE)是在不加入SDS 疏基乙醇等变性剂的条件下，对保持活性的蛋白质进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，常用于同工酶的鉴定和提纯。未加SDS的天然聚丙烯酰胺凝胶电泳可以使生物大分子在电泳过程中保持其天然的形状和电荷，它们的分离是依据其电泳迁移率的不同和凝胶的分子筛作用，因而可以得到较高的分辨率，尤其是在电泳分离后仍能保持蛋白质和酶等生物大分子的生物活性，对于生物大分子的鉴定有重要意义，其方法是在凝胶上进行两份相同样品的电泳，电泳后将凝胶切成两半，一半用于活性染色，对某个特定的生物大分子进行鉴定，另一半用于所有样品的染色，以分析样品中各种生物大分子的种类和含量。 实验方法 非变性聚丙烯酰胺凝胶和变性sds-page电泳在操作上基本上是相同的，只是非变性聚丙烯酰胺凝胶的配制和电泳缓冲液中不能含有变性剂如SDS等。 一般蛋白进行非变性凝胶电泳要先分清是碱性还是酸性蛋白。分离碱性蛋白时候，要利用低pH凝胶系统，分离酸性蛋白时候，要利用高pH凝胶系统。 酸性蛋白通常在非变性凝胶电泳中采用的pH是8.8的缓冲系统，蛋白会带负电荷，蛋白会相阳极移动；而碱性蛋白通常电泳是在微酸性环境下进行，蛋白带正电荷，这时候需要将阴极和阳极倒置才可以电泳分离酸性蛋白。 工作液配制 1.40%胶贮液(Acr:Bis=29：1）； 2.4×分离胶Buf(1.5 M Tris-HCl，pH 8.8)：18.2 g Trisbase 溶于ml 水，用浓HCl调pH 8.8，加水定容到100ml，4℃贮存； 3. 4×堆积胶Buf(0.5 M Tris-HCl，pH 6.8)：6g Trisbase 溶于80ml 水，用浓HCl调pH 6.8，加水定容到100ml，4℃贮存； 4.10×电泳Buf（pH8.8 Tris-Gly）:30.3 g Trisbase，144g 甘氨酸，加水定容到L，4℃贮存； 5.2×溴酚蓝上样Buf:1.25ml pH 6.8, 0.5M Tris-Cl，3.0ml甘油，.2ml 0.5% 溴酚蓝，5.5ml dH2O；-20℃贮存；
变性聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染实验
变性聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染实验 一变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 配制溶液： 1、30% Acrylamide（14.5 g 丙烯酰胺，0.5g 双丙烯酰胺，加水溶解，定容至50 ml，4℃，棕色瓶中储存） 2、10% 过硫酸铵（0.5g APS，溶于5ml 去离子水中，4℃可储存数个月） 3、10 ×TBE 缓冲液（10.8g Tris,0.744g EDTA,5.5g 硼酸，定容到100ml） 4、TEMED 5、20-200 DNA marker 6、尿素 实验步骤： 1、配置10%的胶10ml：8M*10ml*60g/mol=4.8g 尿素 6.1ml water 3.3ml 30% Acrylamide 1ml 10 ×TBE 0.11ml APS 0.01mlTEMED 2、立即将胶倒入两块板间并插好梳子，放置，待凝固30min，时间可以适当延长。 3、向电泳槽加入1×TBE，拔出梳子并用注射针筒多次洗涤点样孔，尽可能排除未聚合 的丙烯酰胺。 4、将DNA marker 加到点样孔中，以120V（10V/cm）进行电泳直到燃料走到靠近底部 的三分之一处，大约需要60-90分钟。 二银染实验 银染溶液的配置：实验之前准备4℃水 1、固定液（10%醋酸）：20ml冰醋酸，180mlddH2O混匀（通风厨中进行） 2、染色液：将0.1g AgNO3溶解于100 ml ddH2O中，使用前加1.5ml37%甲醛溶液，必须 储存于避光瓶中，防止接触皮肤（通风厨中进行） 3、显影液：将30gNa2CO3溶解于ddH2O中，冷却至4℃，使用前加1.5ml37%甲醛溶液 （通风厨中进行），0.1M五水硫代硫酸钠150μl；（0.1M Na2S2O3。5H2O：将2.48g Na2S2O3。5H2O溶于100mlddH2O）。 注意事项： 1、染色液和显影液要现用现配； 2、显影液必须在4℃使用且必须保存在4℃； 3、甲醛蒸汽致癌，在通风厨内操作； 4、实验室中柔和的背景光线有利于降低背景颜色； 5、显色不能在透光的盒子中进行； 6、溶液不能直接倒在胶面上，应使盘倾斜后将溶液倒在盘的角上，或者将每种溶液各方 一盘，然后将胶从一个盘转到另一个盘； 7、溶液的体积必须足够将胶全部浸没；
琼脂糖凝胶电泳技术
电泳检测技术是指利用带电颗粒在电场中能向异性电极泳动这一现象来分离、纯化或分析检测供试品的一种生物化学技术。 原理：许多生物分子都带有电荷，在电场作用下可发生移动，由于混合物中各组分所带电荷性质、数量以及相对分子质量各不相同，使在同一电场作用下，各组分的泳动方向和速率也各有差异，所以在一定时间内，它们移动距离不同，从而可达到分离鉴定的目的。 DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，包括电荷效应和分子筛效应。 琼脂糖是由天然的琼脂加工制得，是一种直链杂聚多糖，溶于热水，形成溶胶，冷却后成为孔径范围从50nm到大于200nm的大网孔径凝胶。由于孔径较大，对一般蛋白质不起分子筛作用，该电泳技术是目前分离、分析DNA片段的标准方法。 DNA琼脂糖凝胶电泳的原理 DNA 分子是两性电解质，在高于其等电点的溶液（pH8.0~pH8.3 DNA分子本身的大小和构型、凝胶浓度决定了DNA分子的迁移速度。）中，碱基几乎不解离，磷酸基团全部解离，DNA 分子带负电荷，在电场中向正极移动。 DNA分子大小对迁移速率的影响：相对分子质量大，迁移慢；相对分子质量小，迁移快。DNA分子构型对迁移速率的影响：迁移速度：闭环﹥直链DNA﹥开环DNA。 琼脂糖凝胶浓度的影响：同样大小的线性DNA片段，在不同浓度的琼脂糖凝胶中的迁移速度不同，浓度越大，迁移的越慢 常用的电泳上样缓冲液含溴酚蓝，有的还含有二甲苯青，这些指示剂可以指示电泳的速度。溴化乙淀（EB）是核酸的染色剂，能插入DNA分子中形成荧光结合物，EB在紫外线照射下的发射荧光。荧光的强度与DNA的含量成正比，从而可以确定DNA片段在凝胶中的位置及估计出待测样品的浓度。 EB是强致癌剂。 电泳操作步骤(整个过程要求带一次性手套 1、胶槽准备 ①将凝胶托盘放入制胶盒中; ②将加样梳垂直插入到制胶盒的小凹槽内，梳齿底端和凝胶托盘有1mm的间隙; ③将制胶盒放在调整好的水平台上。 2、凝胶准备用1×TAE配制1％琼脂糖凝胶。 ①称0.15g琼脂糖置三角瓶中，加15ml 1×TAE; ②微波炉加热大约1分钟，熔化琼脂糖; ③熔化的琼脂糖自然冷却到60～70℃时，加入DNA染料，并轻轻混匀。 3、倒胶：将冷却致60℃的凝胶倒入准备好的制胶盒内，凝胶厚度3～5mm,室温下静置半小时左右冷却，凝胶固化。 4、轻轻拔出固定在凝胶中的加样梳。将带凝胶的凝胶托盘置于电泳槽中，并使样品孔位于电场负极，向电泳槽中加入1×TAE电泳缓冲液，越过凝胶表面即可,出去样品孔的气泡。 6、样品准备：向核酸样品中加入约为样品体积1/10的上样缓冲液，用加样器轻轻混匀。 7、上样：用加样器吸取样品，轻轻的加入到凝胶的样品孔中。加样量一般5-7μl。 8、盖上电泳槽，接通电源，开始电泳。 开始电泳前，再次确认凝胶样品孔处于电场的负极。 电泳条件：5v/cm；时间20-30分钟左右 9、电泳结束后，切断电源，取出凝胶。
DNA非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳银染配方及步骤
DNA非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳银染配方及步骤 最近需要做DNA非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,需要用银染显示条带,但是找不到具体的配方和步骤,不知和蛋白PAGE电泳银染有什么差别,哪位师兄师姐有配方可否发一份,十分感谢!一、电泳试剂： 1、30％聚丙烯酰胺(29:1) 丙稀酰胺29克，Bis1克，水100ml。 2、10％过硫酸胺 过硫酸胺1克，水10ml。 3、TEMED 4、5xTBE Tris 27克，硼酸13.75克，0.5M EDTA(pH 8.0) 10ml，定容至500ml。 二、银染试剂 1、固定液：100ml无水乙醇，5ml冰醋酸，定容至1000ml。 2、0.2% AgNO3：AgNO3 1克，水500ml。 3、1.5% NaOH：NaOH 7.5克，水500ml。 4、37％甲醛。 三、配胶(6%)： 30％聚丙烯酰胺(29:1) 8ml，5xTBE 8ml，定容至40ml，加10％过硫酸胺 200ul；T EMED 20ul。室温凝固时间>1小时。 四、银染： 1、固定液固定10m。 2、水洗2m x3次。 3、0.2% AgNO3 100ml ＋37％甲醛50ul，混匀，避光染色30～50m。 4、水洗 20秒x2次。 5、1.5% NaOH 100ml，加37％甲醛 0.5ml，混匀，显色3～10m。 6、水洗若干次，终止显色。 电泳时间：150v x 3h，溴酚兰的位置相当于40bp。 银染后胶面积将膨胀10％。 在终止显色过程中，将依惯性继续显色，所以不等显色到位即可进行终止显色。 显色到位后立即拍摄，水浸泡过夜将使背景加深转贴！！！ 聚丙烯酰胺凝胶电泳是分子生物学常用的一种技术。我们实验室应用该项技术进行基因组甲基化的筛选，取得了一定结果。因为全基因组的筛选需要很高的灵敏度，背景干扰降到最低，因此在对凝胶进行染色时，往往采用同位素法或银染法，而且配制的胶往往很大，我们配制的是大约40×35cm的胶，0.4mm厚。同位素十分灵敏，特异，但是由于其操作的复杂性，许多实验室开展有一定困难。银染法相对简便易行，便于一般的实验室开展。 需要指出的是，应用与筛选基因组的银染往往采用测序胶的染色方法，这样才能保证灵敏性，我们在长期的工作中积累了一些银染的经验，与大家分享。 下面是网上的一个银染方法，我们使用后觉得效果不错，然后以此为基础，介绍一下我们的经验 测序凝胶的银染
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳 该技术首先在1967年由Shapiro建立，1969年由Weber和Osborn进一步完善。 一、原理 聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺(简称Acr) 和交联剂N，N’—亚甲基双丙烯酰胺（简称Bis）在催化剂作用下，聚合交联而成的具有网状立体结构的凝胶，并以此为支持物进行电泳。聚丙烯酰胺凝胶电泳可根据不同蛋白质分子所带电荷的差异及分子大小的不同所产生的不同迁移率将蛋白质分离成若干条区带，如果分离纯化的样品中只含有同一种蛋白质，蛋白质样品电泳后，就应只分离出一条区带。SDS是一种阴离子表面活性剂能打断蛋白质的氢键和疏水键，并按一定的比例和蛋白质分子结合成复合物，使蛋白质带负电荷的量远远超过其本身原有的电荷，掩盖了各种蛋白分子间天然的电荷差异。因此，各种蛋白质-SDS 复合物在电泳时的迁移率，不再受原有电荷和分子形状的影响，而只是棒长的函数。这种电泳方法称为SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（简称SDS—PAGE）。由于SDS-PAGE 可设法将电泳时蛋白质电荷差异这一因素除去或减小到可以略而不计的程度，因此常用来鉴定蛋白质分离样品的纯化程度，如果被鉴定的蛋白质样品很纯，只含有一种具三级结构的蛋白质或含有相同分子量亚基的具四级结构的蛋白质，那么SDS—PAGE 后，就只出现一条蛋白质区带。SDS—PAGE 可分为圆盘状和垂直板状、连续系统和不连续系统。本实验采用垂直板状不连续系统。所谓“不连续”是指电泳体系由两种或两种以上的缓冲液、pH 和凝胶孔径等所组成。 1．样品的浓缩效应 在不连续电泳系统中，含有上、下槽缓冲液(Tris—Gly，pH8.3)、浓缩胶缓冲液(Tris—HCl，pH6.8)、分离胶缓冲液(Tris—HCl，pH8.8)，两种凝胶的浓度(即孔径)也不相同。在这种条件下，缓冲系统中的HCl 几乎全部解离成Cl－，两槽中的Gly (pI＝6.0，pK a=9.7)只有很少部分解离成Gly 的负离子，而酸性蛋白质也可解离出负离子。这些离子在电泳时都向正极移动。C1—速度最快(先导离子)，其次为蛋白质，Gly 负离子最慢(尾随离子)。由于C1—很快超过蛋白离子，因此在其后面形成一个电导较低、电位梯度较陡的区域，该区电位梯度最高，这是在电泳过程中形成的电位梯度的不连续性，导致蛋白质和Gly 离子加快移动，结
变性梯度凝胶电泳
变性梯度凝胶电泳 摘要：变性梯度凝胶电泳（DenaturingGradientGelE1ectrophoresiS，DGGE）是由Fisher 和Lerman发明用于检测DNA突变的技术，其主要是基于突变型和野生型棱酸序列的不同而导致其变性浓度的差异，利用变性梯度凝胶进行分离, 该手段分辨率达一个碱基。恒定变性凝胶电泳(CDGE)、瞬时温度梯度电泳(TTGE)和温度梯度凝胶电泳(TGGE)是由DGGE经改进而成。它们在突变分析上都有着重要的作用。 关键词：变性梯度凝胶电泳、恒定变性凝胶电泳、瞬时温度梯度电泳、温度梯度凝胶电泳 1、前言： 随着结构基因组计划接近尾声，人类基因神秘的面纱已逐步揭开，GenBank中已知基因的数目也与日俱增，各种遗传病的相关基因也了解得越来越多。但是，在找到了候选基因后，还需要在相关的遗传病病人中进行突变检测，只有找到了相应的突变。才能真正确定该基因与疾病的关系，从而服务于临床。变性梯度凝胶电泳就是一种很有实用价值的突变分析方法。该方法经改进，又发展出了恒定变性凝胶电泳(constant denaturant gel elec—trophoresis，CDGE)、瞬时温度梯度电泳(temporaltemperature gradient electrophoresis，TTGE)和温度梯度凝胶电泳(temperature gradient gel elec—trophoresis，TGGE)。现在上述方法已经广泛应用于遗传病的诊断、突变分析和肿瘤相关基因的筛查等许多方面。 2、基本原理 2.1变性梯度凝胶电泳 由Fisher和Izrman口3于1983年创立，以后该技术和PCR技术相结合被广泛应用于各种突变分析。它主要是利用梯度变性胶来分离DNA片段。电泳开始时，DNA在胶中的迁移速率仅与分子太小有关，而一旦DNA泳动到某一点时，即到达该DNA变性浓度位置时，使得DNA双链开始分开，从而大大降低了迁移速率。由于不同的DNA片段的碱基组成有差异，使得其变性条件产生差异，从而在凝胶上形成不同的条带。目前常用的变性荆有尿素(urea)和甲酰胺(formamide)。根据DGGE变性梯度方向与电泳方向是否一致，可将其分为两种形式的DGGE：垂直DGGE和平行DGGE。垂直DGGE的变性梯度方向与电泳方向垂直，可用于优化样本的分离条件，也可用于分析PCR产物的组成；平行DGGE的变性梯度方向与电泳方向一致，可用于同时分析多个样本。检测某种突变的变性剂浓度一般通过变性
凝胶电泳
凝胶电泳
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论文题目：凝胶电泳 专业：化学 年级：10级 学号：10101550203 姓名：马慧 摘要 凝胶电泳（Gel electrophoresis）或称胶体电泳，也可称为扁平式电泳法，是一大类技术，被科学工作者用于分离不同物理性质（如大小、形状、等电点等）的分子。它是以淀粉胶、琼脂或琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶等作为支持介质的区带电泳法。凝胶电泳通常用于分析用途，但也可以作为制备技术，在采用某些方法，如质谱、聚合酶链式反应、克隆、DNA测序或者 免疫印迹检测之前，进行部分提纯分子。通过学习，了 解凝胶电泳的类别、原理、特点及其应用范围。 关键词：制备，类别，定义，原理，特点，应用范围 正文 一、凝胶制备 1、设备与试剂：琼脂糖凝胶电泳分为垂直及水平型两种。其中水平型可制备低浓度琼脂糖凝胶，而且制胶与加样都比较方便，故应用比较广泛。核酸分离一般用连续缓冲体系，常用的有TBE（0.08mol/L Tris?HCl，pH8.5，0.08mol/L硼酸，0.0024mol/L EDTA）和THE（0.04mol/L Tris?HCl。pH7.8，0.2mol/L醋酸钠，0.0018mol/L EDTA）。 2、凝胶制备：用上述缓冲液配制0.5％-0.8％琼脂糖凝胶溶液，沸水浴或微波炉加热使之融化，冷至55℃时加入溴化乙锭（EB）至终浓度为0.5μg/ml，然后将其注入玻璃板或有机玻璃板组装好的模子中，厚度依样品浓度而定。注胶时，梳齿下端距玻璃板0.5-1.0mm，待脱凝固后，取出梳子，加入适量电极缓冲液使板胶浸没在缓冲液下1mm处。
PAGE电泳原理与步骤
PAGE 电泳的操作步骤及试剂配方 聚丙烯酰胺凝胶电泳作为检测DNA 序列差异的有效手段，变性凝胶电泳在我室广泛使用，但是也有其使用范围。在我室还有一种常用的非变性凝胶电泳技术，简称SSCP （Single Strand Conformation Polymorphism ，单链构象多态性）。 原理：在SSCP 测定中，双链DNA （dsDNA ）被变性成为单链DNA （ssDNA ），每一条单链DNA 都基于它们的内部序列而呈现出一种独有的折叠构象，即使同样长度的DNA 单链因其碱基顺序不同、甚至单个碱基的不同会形成不同的构象。这些单链DNA 在非变性条件下，用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，单链DNA 的迁移率和带型，都取决于其折叠构象和电泳时的温度。 SSCP 与变性凝胶电泳基本一致，不同之处有以下几点：a ．SSCP 使用非变性凝胶进行电泳，即在凝胶配制中不加入变性剂。我室常用8%非变性胶（丙烯酰胺80g ，N-N ，-亚甲双丙烯酰胺 2.76g ，10×TBE 50ml ，加水定容到1L ）b ．工作环境，由于SSCP 受温度影响，所以在电泳过程中应防止温度的升高，所以电泳环境为电压400V ，电流50mA ，单板电泳功率为9W ，不用预热。缓冲液最好用新配制的。c ．由于电泳功率较低，所以电泳时间较长，通常需要10小时以上，因此一般电泳需要过夜。室温在25。C 以下。 1.聚丙烯酰胺凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳适宜分离鉴定低分子量的蛋白质，小于1kb 的DNA 片段和DNA 序列。分析装载的样品容量大，可回收，DNA 纯度高。在催化剂TEMED （N-N-N ，-N ，-四甲基乙二胺）和过硫酸胺的作用下，丙烯酰胺聚合成长链，聚丙烯酰胺链在交联剂，N-N ，-亚甲双丙烯酰胺的参与下，聚丙烯酰胺链与链之间交叉联结形成凝胶。 1.1配制30%丙烯酰胺：丙烯酰胺29g 、N-N ，-亚甲双丙烯酰胺1g 、加水至100ML ，40C 棕色瓶可保存1.2配制5×TBE 缓冲液：TRIS 碱54克、硼酸27.5克、EDTA 3.72克、加水至1L 1.3制备聚丙烯酰胺凝胶所用试剂体积 1.4DNA 在聚丙烯酰胺凝胶中有效分离范围 丙烯酰胺（%） 有效分离范围（bp ） 二甲苯氰FF 溴酚蓝3.51000-20004601005.080-500260658.060-4001604512.040-200702015.025-150601520.0 6-100 45 12 2.聚丙烯酰胺凝胶电泳具体步骤 2.1从NaOH 池中捞出浸泡的玻璃板，取出上面的残胶2.2把玻璃板拿到流动水处洗刷干净2.3洗干净的玻璃板至于玻璃板架上晾干2.4用乙醇擦洗玻璃板 试剂制备不同浓度（%）凝胶所用试剂体积（ml ） 3.5 5.08.012.020.030%丙烯酰胺 11.616.626.640.066.6水67.762.752.739.312.75×TBE 20.020.020.020.020.010%过硫酸铵 0.7 0.7 0.7 0.7 0.7
变性与非变性聚丙烯酰胺的区别
非变性和变性聚丙烯酰胺凝胶的区别？“变性”体 现在哪里？ 作者: 墨池(站内联系TA)收录: 2011-07-31 发布: 2011-07-21 1 非变性和变性聚丙烯酰胺凝胶的区别？“变性”体现在哪里？ 2 SRAP标记用6%聚丙烯酰胺凝胶电泳，是变性还是非变性？配方是什么？配胶时，过硫酸铵是不是要最后加入？ 谢谢(*^__^*) 嘻嘻 收、蛋白质分子量测定会使用变性PAGE，而DNA跑PAGE通常是采用非变性PAGE，另外回收活性蛋白也有用非变性PAGE的。 2. SRAP（貌似叫什么...相关序列扩增多态性）标记这个应该是非变性PAGE，6%的PAGE胶配方就不用发了吧，google一下一大堆。TEMED和过硫酸铵都是最 Originally posted by holyala at 2011-07-21 2121: 1. 变性胶加尿素或者其他变性剂，非变性胶是不加的。一般做RNA分离或回收、蛋白质分子量测定会使用变性PAGE，而DNA跑PAGE通常是采用非变性PAGE，另外回收活性蛋白也有用非变性PAGE的。 2. SRAP（貌似叫什么...相 ... Originally posted by 墨池 at 2011-07-21 2138: TEMED和过硫酸铵的先后呢？ Originally posted by 墨池 at 2011-07-21 2019: 1 非变性和变性聚丙烯酰胺凝胶的区别？“变性”体现在哪里？
2 SRAP标记用6%聚丙烯酰胺凝胶电泳，是变性还是非变性？配方是什么？配胶时，过硫酸铵是不是要最后加入？ 谢谢(*^__^*) 嘻嘻 1. “变性”体现在聚丙烯酰胺凝胶中加入尿素(一般跑DNA)或SDS(一般跑蛋白)，另外，如果样品也要变性(DNA的loanding buffer也与普通的琼脂糖电泳所用的不同，同理所用Marker也不同；蛋白也要变性)。 2.SRAP一般用变性的聚丙烯酰胺，毕竟片段还是比较小。 3.配胶时不用加入过硫酸铵，灌胶前同时加入过硫酸铵(注意有毒！低温保存)和TEMED（也有毒，特臭）。 另外，这些问题貌似分子克隆那本书非常详细，只不过SRAP标记较新而已，没 Originally posted by changes at 2011-07-21 2107: 1. “变性”体现在聚丙烯酰胺凝胶中加入尿素(一般跑DNA)或SDS(一般跑蛋白)，另外，如果样品也要变性(DNA的loanding buffer也与普通的琼脂糖电泳所用的不同，同理所用Marker也不同；蛋白也要变性)。 2.SRAP一般 ... Originally posted by 墨池 at 2011-07-21 2104: 你说SRAP是变性的，我看师姐的配胶过程没有一点体现变性的物质。 非变性胶也可以，但是分辨率会低些。另外，你是用SRAP标记做什么的，多态 Originally posted by 冼亮淀粉酶 at 2011-07-22 0727: APS和TEMED虽然不好，但也比不上丙烯酰胺有神经毒性，可随皮肤渗入人体，所以我是什么东西都加完之后最后加丙烯酰胺。 ...额~~话说我们一般都是把丙烯酰胺和甲叉丙烯酰胺配成40%的母液，用的时候根据所需要的浓度加一定量的母液即可。要是每次都搞丙烯酰胺来配，那谁
聚丙烯酰胺凝胶电泳的基本原理及常见问题分析
聚丙烯酰胺凝胶电泳的基本原理及常见问题分析 聚丙烯酰胺凝胶电泳简称为PAGE（Polyacrylamide gel electrophoresis），是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的一种常用电泳技术。聚丙烯酰胺凝胶由单体丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺聚合而成，聚合过程由自由基催化完成。催化聚合的常用方法有两种：化学聚合法和光聚合法。化学聚合以过硫酸铵（AP）为催化剂，以四甲基乙二胺（TEMED）为加速剂。在聚合过程中，TEMED催化过硫酸铵产生自由基，后者引发丙烯酰胺单体聚合，同时甲叉双丙烯酰胺与丙烯酰胺链间产生甲叉键交联，从而形成三维网状结构。 PAGE根据其有无浓缩效应，分为连续系统和不连续系统两大类，连续系统电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷和分子筛效应。不连续系统中由于缓冲液离子成分，pH，凝胶浓度及电位梯度的不连续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应，分子筛效应，还具有浓缩效应，因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者佳。不连续体系由电极缓冲液、浓缩胶及分离胶所组成。浓缩胶是由AP催化聚合而成的大孔胶，凝胶缓冲液为pH6.7的Tris-HC1。分离胶是由AP催化聚合而成的小孔胶，凝胶缓冲液为pH8.9 Tris-HC1。电极缓冲液是pH8.3 Tris-甘氨酸缓冲液。2种孔径的凝胶、2种缓冲体系、3种pH值使不连续体系形成了凝胶孔径、pH值、缓冲液离子成分的不连续性，这是样品浓缩的主要因素。
蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中电泳时，它的迁移率取决于它所带净电荷以及分子的大小和形状等因素。如果加入一种试剂使电荷因素消除，那电泳迁移率就取决于分子的大小，就可以用电泳技术测定蛋白质的分子量。1967年，Shapiro等发现阴离子去污剂十二烷基硫酸钠（SDS）具有这种作用。当向蛋白质溶液中加入足够量SDS 和巯基乙醇，SDS可使蛋白质分子中的二硫键还原。由于十二烷基硫酸根带负电，使各种蛋白质—SDS复合物都带上相同密度的负电荷，它的量大大超过了蛋白质分子原的电荷量，因而掩盖了不同种蛋白质间原有的电荷差别，SDS与蛋白质结合后，还可引起构象改变，蛋白质—SDS复合物形成近似“雪茄烟”形的长椭圆棒，不同蛋白质的SDS复合物的短轴长度都一样，约为18A，这样的蛋白质—SDS复合物，在凝胶中的迁移率，不再受蛋白质原的电荷和形状的影响，而取决于分子量的大小由于蛋白质－SDS复合物在单位长度上带有相等的电荷，所以它们以相等的迁移速度从浓缩胶进入分离胶，进入分离胶后，由于聚丙烯酰胺的分子筛作用，小分子的蛋白质可以容易的通过凝胶孔径，阻力小，迁移速度快；大分子蛋白质则受到较大的阻力而被滞后，这样蛋白质在电泳过程中就会根据其各自分子量的大小而被分离。因而SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳可以用于测定蛋白质的分子量。当分子量在15KD到200KD之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：logMW=K-bX，式中：MW为分子量，X为迁移率，k、b均为常数，若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋
总RNA的变性琼脂糖凝胶检测
实验19 总RNA的变性琼脂糖凝胶检测 【实验目的】 掌握总RNA变性胶电泳的原理和方法。 【实验原理】 RNA电泳可以在变性及非变性两种条件下进行。非变性电泳使用1.0-1.4%的凝胶，不同的RNA条带也能分开，但无法判断其分子量。只有在完全变性的条件下，RNA的泳动率才与分子量的对数呈线性关系。因此要测定RNA分子量时，一定要用变性凝胶。如需快速检测提取总RNA的质量，可用普通的1% (m/V)琼脂糖凝胶监察。 判断RNA提取物的完整性是进行电泳的主要目的之一。完整的未降解的RNA制品的电泳图谱应可清晰看到28s rRNA、18s rRNA、5s rRNA的三条带，且28s rRNA的亮度应为18s rRNA的两倍。 【器材与材料】 1．器材 水平式琼脂糖凝胶电泳系统、电子天平、移液器、Tip头、电炉、紫外透射检测仪 2. 试剂 (1) 0.1% (V/V) DEPC水 200ml 双蒸去离子水加0.2ml DEPC（焦炭酸二乙酯），充分搅拌混匀，室温放置过夜，高压灭菌。 (2) 10×电泳缓冲液 吗啉代丙烷磺酸（MOPS）0.4mol/L（pH 7.0） NaAc 0.1mol/L 乙二胺四乙酸(EDTA) 10mmol/L (3) 50mL变性琼脂糖凝胶1% (m/V) 10×电泳缓冲液 5 ml 琼脂糖0.5 g 0.1% (V/V) DEPC水36.5 ml 加热溶解，稍冷却，加入8.5 ml 37%(V/V)甲醛。
(4) 上样缓冲液：50% (V/V) 甘油，1mmol/L EDTA，0.4% (m/V) 溴酚蓝，0.4% (m/V)二甲苯蓝。 (5) 甲酰胺（去离子）。 3．材料 植物或动物的总RNA溶液。 【操作步骤】 1．电泳槽，制胶用具的清洗：去污剂洗干净（一般浸泡过夜），水冲洗后用，3% H2O2灌满电泳槽，室温放置10min，用0.1% (V/V) DEPC水冲洗，晾干备用。2．制胶：称取0.5g琼脂糖粉末，加入放有36.5ml的DEPC水的锥形瓶中，加热使琼脂糖完全溶解。稍冷却后加入5ml的10x电泳缓冲液、8.5ml的甲醛。然后在胶槽中灌制凝胶，插好梳子，水平放置待凝固后使用。 3．加样：在一个洁净的小离心管中混合以下试剂：2μl 10×电泳缓冲液、3.5ml 甲醛、10ml甲酰胺、3.5μl RNA样品。混匀，置60℃保温10min，冰上速冷。加入3μl的上样缓冲液混匀，取适量加样于凝胶点样孔内。同时点RNA标准样品。4．电泳：打开电泳仪，稳压7.5V/cm电泳。 5．电泳结束后通过紫外透视仪观察。 【要点提示】 1. 本实验中必须防止RNase污染，以免RNA降解。所有试剂需用DEPC水配制，用具也用DEPC水冲洗，并灭菌。 2. RNA的非变性琼脂糖凝胶电泳与DNA的操作相同。 【思考题】 如何判断RNA提取物的质量？