PCR技术的原理和方法
PCR技术的原理和方法
1.PCR定义
PCR（Polymerase Chain Reaction）即聚合酶链式反应，是指在DNA聚合酶催化下，以母链DNA为模板，以特定引物为延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA的过程。是一项DNA体外合成放大技术，能快速特异地在体外扩增任何目的DNA。可用于基因分离克隆，序列分析，基因表达调控，基因多态性研究等许多方面。
2.PCR技术的基本原理
即在高温（95℃）下，待扩增的靶DNA双链受热变性成为两条单链DNA模板；而后在低温（37～55℃）情况下，两条人工合成的寡核苷酸引物与互补的单链DNA模板结合，形成部分双链；在Taq酶的最适温度（72℃）下，以引物3’端为合成的起点，以单核苷酸为原料，沿模板以5’→3’方向延伸，合成DNA新链。这样，每一双链的DNA模板，经过一次解链、退火、延伸三个步骤的热循环后就成了两条双链DNA分子。如此反复进行，每一次循环所产生的DNA均能成为下一次循环的模板，每一次循环都使两条人工合成的引物间的DNA特异区拷贝数扩增一倍，PCR产物得以2n的批数形式迅速扩增，经过25～30个循环后，理论上可使基因扩增109倍以上，实际上一般可达106～107倍。
PCR基本原理示意图
假设扩增效率为“X”，循环数为“n”，则二者与扩增倍数“y”的关系式可表示为：y=(1+X)n。扩增30个循环即n=30时，若X=100%，则y=230=1073741824(>109)；而若X=80%时，则y=1.830=45517159.6(>107)。由此可见，其扩增的倍数是巨大的，将扩增产物进行电泳，经溴化乙锭染色，在紫外灶照射下（254nm）一般都可见到DNA的特异扩增区带。
3.PCR反应基本步骤
3.1 变性(denaturation)：通过加热使模板DNA的双链之间的氢键断裂，双链分开而成单链的过程（94℃，30s）。
3.2 退火(annealling)：当温度降低时，引物与模板DNA中互补区域结合成杂交分子（55℃，30s）。如下图所示
3.3 延伸(extension)：在DNA 聚合酶、dNTPs 、 Mg2+存在下，DNA 聚合酶催化引物按5’→3’方向延伸，合成出与模板DNA 链互补的DNA 子链（70～72℃，30～60s ）。
以上述三个步骤为一个循环，每一循环的产物均可作为下一个循环的模板，经过n 次循环后，目的DNA 以2n 的形式增加。
4. PCR 扩增的基本方法
4.1 PCR 反应体系
4.2 PCR 反应的成分和作用
总体积：一般为25μl ～100 μl
（1）无Mg 2+buffer ：由纯水、kcl 、Tris 组成。Tris 用于调节反应体系pH 值，使Taq 酶在偏碱性环境中反挥活性。kcl 可降低退火温度，但不能超过50 mmol/L ，否则会抑制DNA 聚合酶活性。
（2）Mg 2+：终浓度为1.5～2.0 mmol/L ，其对应dNTP 为200 μmol/L ，注意Mg 2+与dNTPs 之间的浓度关系，由于dNTP 与Taq 酶竟争Mg 2+，当dNTP 浓度达到1 mmol/L 时会抑制Taq 酶的活性。 Mg 2+能影响反应的特异性和产率。
（3）BSA ：一般用乙酰化的BSA ，起着减少PCR 管对Taq 酶的吸附作用，对Taq 酶有保护作用。
（4）底物（dNTPs ）：dNTPs 具有较强酸性，其储存液用NaOH 调pH 值至7.0～7.5，一般存储浓度为 10 mmol/L ，各成份以等当量配制，反应终浓度为20～200μmol/L 。高浓度可加速反应，但同时增加错误掺入和实验成本；低浓度可提高精确性，而反应速度会降低。
（5）Taq 酶：能耐95℃高温而不失活，其最适pH 值为8.3～8.5，最适温度为75～80℃，一般用72℃。能催化以DNA 单链为模板，以碱基互补原则为基础，按5’→3’方向逐个将dNTP 分子连接到引物的3’端，合成一条与模板DNA 互补的新的DNA 子链。无3’→5’的外切酶活性，没有校正功能。某种dNTP 或Mg2+浓度过高,会增加其错配率。用量一般为0.5～5`——GGA TCTAGCGTA TGCTTGAAA ——3`
3`——CCTAGA TCGCATACGAACTTT ——5`
模板DNA
3’ — GAACTTT — 5’
引物1
5’—GGA TCTA — 3’ 引物2
PCR 引物与模板结合示意图
5个单位/100μl
（6）模板：PCR对模板DNA的纯度不要求很高，但应尽量不含有对PCR反应有抑制作用的杂质存在，如蛋白酶、核酸酶、TqaDNA聚合酶抑制剂、能与DNA结合的蛋白质。模板DNA的量不能太高，否则扩增可能不会成功，在此情况下可适当稀释模板。
（7）引物：引物浓度一般为0.1～0.5μmol/L，浓度过高会引起错配和非特异扩增，浓度过低则得不到产物或产量过低。引物长度一般15～30个碱基，引物过长或过短都会降低特异性。其3’末端一定要与模板DNA配对，末位碱基最好选用A、C、G（因T错配也能引发链的延伸）。
引物G+C约占45～55%，碱基应尽量随机分布，避免嘧啶或嘌呤堆积，两引物之间不应有互补链存在，不能与非目的扩增区有同源性。
5.PCR反应条件的选择（影响因素）
5.1 温度参数
5.1.1 变性：模板变性完全与否是PCR成功的关键，一般先于94℃（或95℃）变性3～10 min，接着94℃变性30～60 s。
5.1.2 退火：退火温度一般低于引物本身变性温度5℃。引物长度在15～25 bp可通过公Tm=(G+C)×4℃+(A+T)×2℃计算退火温度，一般退火温度在40～60℃之间，时间为30～45s。如果(G+C)低于50%，退火温度应低于55℃。较高的退火温度可提高反应的特异性。
5.1.3 延伸：延伸温度应在Taq酶的最适温度范围之内，一般在70～75℃。延伸时间要根据DNA聚合酶的延伸速度和目的扩增片段的长度确定，通常对于1 kb以内的片段1 min 是够用的。
5.2 循环数
PCR的循环数主要由模板DNA的量决定，一般20～30次循环数较合适，过多的循环数会增加非特异扩增产物，具体要多少循环数可通过预试验确定。
5.3 PCR产物积累规律
反应初期产物以2n呈指数形式增加，至一定的循环数后，引物、模板、DNA聚合酶形成一种平衡，产物进入一个缓慢增长时期（“停滞效应”），即“平台期”。到达平台期所需PCR 循环数与模板量、PCR扩增效率、聚合酶种类、非特异产物竟争有关。
6 PCR常见问题
6.1没有扩增产物
A循环温度：变性温度、退火温度
B 引物设计
C DNA聚合酶活性
D 抑制性成份(蛋白酶、核酸酶、其它抑制聚合酶活性的成份)
E DNA样品
6.2 非特异产物及电泳呈涂布状
A Mg2+浓度
B 调整引物、模板、聚合酶的用量
C 适当减少循环数
D 适当提高退火温度，缩短退火或延伸时间
6.3 引物二聚体的形成
A检查引物的序列
B 提高退火温度
C 调整引物与模板浓度
D 增加引物长度
6.4 假阳性结果的预防
A实验器材应一次性使用(吸咀、PCR管)
B 注意操作环境，戴一次性手套
C 严格PCR操作规程
D 多次取样的试剂应分装
E 设置阴性对照和阳性对照