菌落计数
食品微生物学检验菌落总数测定
一、培养基和试剂
1、平板计数琼脂（plate count agar，PCA）培养基
成分
胰蛋白胨 5.0 g
酵母浸膏 2.5 g
葡萄糖 1.0 g
琼脂 15.0 g
蒸馏水 1000 mL
pH 7.0±0.2
制法：将上述成分加于蒸馏水中，煮沸溶解，调节pH。分装试管或锥形瓶，121 ℃高压灭菌15 min。
2、磷酸盐缓冲液
成分
磷酸二氢钾（KH2PO4） 34.0 g
蒸馏水 500 mL
pH 7.2
制法：贮存液：称取34.0 g的磷酸二氢钾溶于500 mL蒸馏水中，用大约175 mL的1 mol/L 氢氧化钠溶液调节pH，用蒸馏水稀释至1 000 mL后贮存于冰箱。
稀释液：取贮存液1.25 mL，用蒸馏水稀释至1 000 mL，分装于适宜容器中，121 ℃高压灭菌15 min。
3、无菌生理盐水
成分
氯化钠 8.5 g
蒸馏水 1 000 mL
制法：称取8.5ｇ氯化钠溶于1 000 mL蒸馏水中，121 ℃高压灭菌15 min。
二、操作步骤
样品的稀释
1、固体和半固体样品：称取25 g 样品置盛有225 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内，8000 r/min～10000 r/min 均质1 min～2 min，或放入盛有225 mL 稀释液的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1 min～2 min，制成1:10 的样品匀液。
2、液体样品：以无菌吸管吸取25 mL 样品置盛有225 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分混匀，制成1:10 的样品匀液。
3、用1 mL 无菌吸管或微量移液器吸取1:10 样品匀液1 mL，沿管壁缓慢注于盛有9 mL 稀释液的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用1 支无菌吸管反复吹打使其混合均匀，制成1:100 的样品匀液。
4、按3操作程序，制备10 倍系列稀释样品匀液。每递增稀释一次，换用1 次1 mL 无菌吸管或吸头。
5、根据对样品污染状况的估计，选择2 个～3 个适宜稀释度的样品匀液（液体样品可包括原液），在进行10 倍递增稀释时，吸取1 mL 样品匀液于无菌平皿内，每个稀释度做两个平皿。同时，分别吸取1 mL 空白稀释液加入两个无菌平皿内作空白对照。
6、及时将15 mL～20 mL 冷却至46 ℃的平板计数琼脂培养基（可放置于46 ℃±1 ℃恒温水浴箱中保温）倾注平皿，并转动平皿使其混合均匀。
培养
1、待琼脂凝固后，将平板翻转，36 ℃±1 ℃培养48 h±2 h。水产品30 ℃±1 ℃培养72 h±3 h。
2、如果样品中可能含有在琼脂培养基表面弥漫生长的菌落时，可在凝固后的琼脂表面覆盖一薄层琼脂培养基（约4 mL），凝固后翻转平板，按6.2.1 条件进行培养。
菌落计数
可用肉眼观察，必要时用放大镜或菌落计数器，记录稀释倍数和相应的菌落数量。菌落计数以菌落形成单位（colony-forming units，CFU）表示。
1、选取菌落数在30 CFU～300 CFU 之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。低于30 CFU 的平板记录具体菌落数，大于300 CFU 的可记录为多不可计。每个稀释度的菌落数应采用两个平板的平均数。
2、其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数；若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘以2，代表一个平板菌落数。
3、当平板上出现菌落间无明显界线的链状生长时，则将每条单链作为一个菌落计数。
三、结果与报告
菌落总数的计算方法
1、若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内，计算两个平板菌落数的平均值，再将平
均值乘以相应稀释倍数，作为每g（mL）样品中菌落总数结果。
2、若有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围内时，按公式（1）计算：
式中：
N——样品中菌落数；
ΣC——平板（含适宜范围菌落数的平板）菌落数之和；
n1——第一稀释度（低稀释倍数）平板个数；
n2——第二稀释度（高稀释倍数）平板个数；
d——稀释因子（第一稀释度）。
3、若所有稀释度的平板上菌落数均大于300 CFU，则对稀释度最高的平板进行计数，其他平板可记录为多不可计，结果按平均菌落数乘以最高稀释倍数计算。
4、若所有稀释度的平板菌落数均小于30 CFU，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数计算。
5、若所有稀释度（包括液体样品原液）平板均无菌落生长，则以小于1 乘以最低稀释倍数计算。
6、若所有稀释度的平板菌落数均不在30 CFU～300 CFU 之间，其中一部分小于30 CFU 或大于300CFU 时，则以最接近30 CFU 或300 CFU 的平均菌落数乘以稀释倍数计算。
菌落总数的报告
1、菌落数小于100 CFU 时，按“四舍五入”原则修约，以整数报告。
2、菌落数大于或等于100 CFU 时，第3 位数字采用“四舍五入”原则修约后，取前2 位数字，后面用0 代替位数；也可用10 的指数形式来表示，按“四舍五入”原则修约后，采用两位有效数字。
3、若所有平板上为蔓延菌落而无法计数，则报告菌落蔓延。
4、若空白对照上有菌落生长，则此次检测结果无效。
5、称重取样以CFU/g 为单位报告，体积取样以CFU/mL 为单位报告。
食品微生物学检验大肠菌群计数（GB，平板法）
培养基和试剂
1、结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）
成分
蛋白胨 7.0 g
酵母膏 3.0 g
乳糖 10.0 g
氯化钠 5.0 g
胆盐或3号胆盐 1.5 g
中性红 0.03 g
结晶紫 0.002 g
琼脂 15 g～18 g
蒸馏水 1 000 mL
pH 7.4±0.1
制法：
将上述成分溶于蒸馏水中，静置几分钟，充分搅拌，调节pH。煮沸2 min，将培养基冷却至45 ℃～50 ℃倾注平板。使用前临时制备，不得超过3 h。
2、磷酸盐缓冲液
成分
磷酸二氢钾（KH2PO4） 34.0 g
蒸馏水 500 mL
pH 7.2
制法
贮存液：称取34.0 g的磷酸二氢钾溶于500 mL蒸馏水中，用大约175 mL的1 mol/L氢氧化钠溶液调节pH，用蒸馏水稀释至1 000 mL后贮存于冰箱。
稀释液：取贮存液1.25 mL，用蒸馏水稀释至1 000 mL，分装于适宜容器中，121 ℃高压灭菌15 min。
3、无菌生理盐水
成分
氯化钠 8.5 g
蒸馏水 1 000 mL
制法：
称取8.5ｇ氯化钠溶于1 000 mL蒸馏水中，121 ℃高压灭菌15 min。
操作步骤
样品的稀释
1、同菌落总数测定中的处理方法
平板计数
1、选取2个～3个适宜的连续稀释度, 每个稀释度接种2个无菌平皿，每皿1 mL。同时取1 mL 生理盐水加入无菌平皿作空白对照。
2、及时将15 mL～20 mL冷至46 ℃的结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）约倾注于每个平皿中。小心旋转平皿，将培养基与样液充分混匀，待琼脂凝固后，再加3 mL～4 mLVRBA覆盖平板表层。翻转平板，置于36 ℃±1 ℃培养18 h～24 h。
平板菌落数的选择
选取菌落数在15 CFU～150 CFU 之间的平板，分别计数平板上出现的典型和可疑大肠菌群菌落。典型菌落为紫红色，菌落周围有红色的胆盐沉淀环，菌落直径为0.5 mm 或更大。证实试验
从VRBA 平板上挑取10 个不同类型的典型和可疑菌落，分别移种于BGLB 肉汤管内，
36 ℃±1 ℃培养24 h～48 h，观察产气情况。凡BGLB 肉汤管产气，即可报告为大肠菌群阳性。
大肠菌群平板计数的报告
经最后证实为大肠菌群阳性的试管比例乘以8.3中计数的平板菌落数，再乘以稀释倍数，即为每g（mL）样品中大肠菌群数。例：10-4样品稀释液1 mL，在VRBA平板上有100个典型和可疑菌落，挑取其中10个接种BGLB肉汤管，证实有6个阳性管，则该样品的大肠菌群数为：100×6/10×104/g（mL）=6.0×105CFU/g（mL）。
食品微生物学检验霉菌和酵母计数
培养基和试剂
马铃薯-葡萄糖-琼脂培养基
成分
马铃薯(去皮切块) 300 g
葡萄糖 20.0 g
琼脂 20.0 g
氯霉素 0.1 g
蒸馏水 1000 mL
制法：
将马铃薯去皮切块，加1000mL 蒸馏水，煮沸10 min～20 min。用纱布过滤，补加蒸馏水至1000 mL。加入葡萄糖和琼脂，加热溶化，分装后，121 ℃灭菌20 min。倾注平板前，用少量乙醇溶解氯霉素加入培养基中。
孟加拉红培养基
成分
蛋白胨 5.0 g
葡萄糖 10.0 g
磷酸二氢钾 1.0 g
硫酸镁（无水） 0.5 g
琼脂 20.0 g
孟加拉红 0.033 g
氯霉素 0.1 g
蒸馏水 1000 mL
制法：
上述各成分加入蒸馏水中，加热溶化，补足蒸馏水至1000 mL，分装后，121℃灭菌20 min。倾注平板前，用少量乙醇溶解氯霉素加入培养基中。
操作步骤
样品的稀释
1、固体和半固体样品：称取25 g 样品至盛有225 mL 灭菌蒸馏水的锥形瓶中，充分振摇，即为1:10稀释液。或放入盛有225 mL 无菌蒸馏水的均质袋中，用拍击式均质器拍打2min，制成1:10 的样品匀液。
2、液体样品：以无菌吸管吸取25 mL 样品至盛有225 mL 无菌蒸馏水的锥形瓶（可在瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分混匀，制成1:10 的样品匀液。
3、取1 mL 1:10 稀释液注入含有9 mL 无菌水的试管中, 另换一支1 mL 无菌吸管反复吹吸,此液为1:100 稀释液。
4、按3操作程序，制备10 倍系列稀释样品匀液。每递增稀释一次，换用1 次1 mL 无菌吸管。
5、根据对样品污染状况的估计，选择2 个～3 个适宜稀释度的样品匀液（液体样品可包括原液），在进行10 倍递增稀释的同时，每个稀释度分别吸取1 mL 样品匀液于2 个无菌平皿内。同时分别取1 mL样品稀释液加入2 个无菌平皿作空白对照。
6、及时将15 mL～20 mL 冷却至46 ℃的马铃薯-葡萄糖-琼脂或孟加拉红培养基(可放置于46℃±1℃恒温水浴箱中保温)倾注平皿，并转动平皿使其混合均匀。
培养
待琼脂凝固后，将平板倒置，28℃±1℃培养5d，观察并记录。
菌落计数
肉眼观察，必要时可用放大镜，记录各稀释倍数和相应的霉菌和酵母数。以菌落形成单位（colonyforming units，CFU）表示。选取菌落数在10 CFU～150 CFU 的平板，根据菌落形态分别计数霉菌和酵母数。霉菌蔓延生长覆盖整个平板的可记录为多不可计。菌落数应采用两个平板的平均数。
结果与报告
1、计算两个平板菌落数的平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数计算。
2、若所有平板上菌落数均大于150 CFU，则对稀释度最高的平板进行计数，其他平板可记录为多不可计，结果按平均菌落数乘以最高稀释倍数计算。
3、若所有平板上菌落数均小于10 CFU，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数计算。
4、若所有稀释度平板均无菌落生长，则以小于1 乘以最低稀释倍数计算；如为原液，则以小于1计数。
报告
1、菌落数在100 以内时，按“四舍五入”原则修约，采用两位有效数字报告。
2、菌落数大于或等于100 时，前3 位数字采用“四舍五入”原则修约后，取前2 位数字，后面用0 代替位数来表示结果；也可用10 的指数形式来表示，此时也按“四舍五入”原则修约，采用两位有效数字。
3、称重取样以CFU/g 为单位报告，体积取样以CFU/mL 为单位报告，报告或分别报告霉菌和/或酵母数。
平板菌落计数法操作步骤
平板菌落计数法 一、目的要求 学习平板菌落计数的基本原理和方法。 二、基本原理 平板菌落计数法是将等测样品经适当稀释后，其中的微生物充分分散为单个细胞，取一定量的稀释液接种到平板上，经过培养，由每个单细胞生长繁殖而形成的肉眼可见的菌落，即一个单菌落应代表原样品中的一个单细胞。统计菌落数，根据其稀释倍数和取样接种量即可换算出样品中的含菌数。但是，由于待测样品往往不易完全分散成单个细胞，所以，长成的一个单菌落也可能来自样品中的2~3或更多个细胞。因此平板菌落计数的结果往往偏低。现在常使用菌落形成单位。 该计数法的缺点是操作较繁，结果需要培养一段时间才能取得，而且测定结果易受多种因素的影响，但是这种计数方法最大的优点是可以获得活菌的信息，所以被广泛用于生物制品检验，以及食品、饮料和水等含菌指数或污染度的检测。 三、器材 大肠杆菌悬液，LB琼脂培养基，1mL、5mL无菌吸管，无菌平皿，无菌水，无菌试管，试管架和记号笔等。 四、操作步骤 1、编号 取无菌平皿9套，分别标明为10-4、10-5、10-6各三套，另取6支无菌试管分别标记为10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6。 2、稀释 用1mL无菌吸管吸取1mL已充分混匀的大肠杆菌菌悬液，精确地放0.5mL至10-1的试管中，此即为10倍稀释，将多余的菌液放回原菌液中。 将10-1试管充分振荡、混匀。另取一支1ml吸管插入10-1试管中来回吹吸菌液三次，进一步将菌体分散、混匀。动作不要太猛太快，吸时插入，吹时提出，再用此吸管吸取10-1菌液1mL，精确地放0.5mL至10-2试管中，此即为100倍稀释，依次类推， 3、取样
平板菌落计数法
平板菌落计数法 农资101 1031240125 周瑶 实验原理 平板菌落计数法是将待测样品经适当稀释之后，其中的微生物充分分散成单个细胞，取一定量的稀释样液接种到平板上，经过培养，由每个单细胞生长繁殖而形成肉眼可见的菌落，即一个单菌落应代表原样品中的一个单细胞。统计菌落数，根据其稀释倍数和取样接种量即可换算出样品中的含菌数。但是，由于待测样品往往不易完全分散成单个细胞，所以，长成的一个单菌落也可能来自样品中的2—3或更多个细胞。因此平板菌落计数的结果往往偏低。为了清楚地阐述平板菌落计数的结果，现在已倾向使用菌落形成单位(cfu)而不以绝对菌落数来表示样品的活菌含量。 平板菌落计数法虽然操作较繁，结果需要培养一段时间才能取得，而且测定结果易受多种因素的影响，但是，由于该计数方法的最大优点是可以获得活菌的信息，所以被广泛用于生物制品检验（如活菌制剂），以及食品、饮料和水〔包括水源水〕等的含菌指数或污染程度的检测。 实验方法 1、样品稀释液的制备 准确称取待测样品l0g，放入装有90ml无菌水并放有小玻璃珠的250ml三角瓶中，用手或置摇床上振荡20 min，使微生物细胞分散，静置20-30s，即成10-1稀释液；再用1ml 无菌吸管，吸取10-1稀释液lml，移入装有9ml无菌水的试管中，吹吸3次，让菌液混合均匀，即成10-2稀释液；再换一支无菌吸管吸取10-2稀释液1 ml，移入装有9ml无菌水的试管中，也吹吸三次，即成l0-3稀释液；以此类推，连续稀释，制成10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9等一系列稀释菌液。放菌液时吸管尖不要碰到液面，即每一支吸管只能接触一个稀释度的菌悬液，否则稀释不准确，结果误差较大。 用稀释平板计数时，待测菌稀释度的选择应根据样品确定。样品中所含待测菌的数量多时，稀释度应高，反之则低。通常测定细菌菌剂含菌数时，采用10-7、10-8、10-9稀释度，测定土壤细菌数量时，采用10-4、10-5、10-6稀释度，测定放线菌数量时，采用l0-3、10-4、10-5稀释度，测定真菌数量时，采用10-2、10-3、10-4稀释度。 2、平板接种培养平板接种培养有浇注平板培养法和涂布平板培养法两种方法。 (1) 浇注平板培养法（以细菌为例） 1) 取样 用三支1ml无菌吸管分别吸取10-4、10-5、和10-6的稀释菌悬液各1ml，对号放入编好号的无菌平皿中，每个平皿放0.2ml。 不要用1ml吸管每次只靠吸管尖部吸0.2ml稀释菌液放入平皿中，这样容易加大同一稀释度几个重复平板间的操作误差。
(完整版)稀释平板计数法
实验十一稀释平板计数法 实验目的 学习稀释平板菌落计数的基本原理和方法。 实验内容 用稀释平板菌落计数法对菌悬液进行计数。 实验原理 平板菌落计数法是将待测样品经适当稀释之后，其中的微生物充分分散成单个细胞，取一定量的稀释样液接种到平板上，经过培养，由每个单细胞生长繁殖而形成肉眼可见的菌落，即一个单菌落应代表原样品中的一个单细胞。统计菌落数，根据其稀释倍数和取样接种量即可换算出样品中的含菌数。但是，由于待测样品往往不易完全分散成单个细胞，所以，长成的一个单菌落也可能来自样品中的2—3或更多个细胞。因此平板菌落计数的结果往往偏低。为了清楚地阐述平板菌落计数的结果，现在已倾向使用菌落形成单位(cfu)而不以绝对菌落数来表示样品的活菌含量。 平板菌落计数法虽然操作较繁，结果需要培养一段时间才能取得，而且测定结果易受多种因素的影响，但是，由于该计数方法的最大优点是可以获得活菌的信息，所以被广泛用于生物制品检验（如活菌制剂），以及食品、饮料和水〔包括水源水〕等的含菌指数或污染程度的检测。 实验器材 酿酒酵母菌悬液 马铃薯培养基 1m1吸管，平皿，试管，试管架，恒温培养箱等。 实验步骤 1．无菌器材的准备 (1) 无菌培养皿：取培养皿9套，包扎、灭菌。 (2) 无菌移液管的准备：取1m1移液管，在后部管口处用铁丝塞入棉花少许（长约1~1.5cm ），以防将菌液吸出，同时也可避免将外面的微生物吹入。棉花要塞得松紧适宜吹时能通气但不使棉花滑下为准。然后将移液管尖端放在4~5cm宽的长纸条一端呈45o角折叠纸条包住尖端，用左手捏住管身，右手将吸管压紧，在桌面上向前滚动，以螺旋式包扎起来，上端剩余纸条折叠打结后干热灭菌。 (3) 无菌水：取6支试管，分别装入4.5m1蒸馏水，加棉塞，灭菌。 2．样品稀释液的制备 (1) 编号 取无菌平皿9套，分别用记号笔标明10-4、10-5、10-6(稀释度)各3套。另取6支盛有4.5m1无菌水的试管，依次标是10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6。
细菌、霉菌及酵母菌计数方法验证1份ok(内容充实)
一、目的：当建立微生物限度检查法时，应进行细菌霉菌及酵母菌计数方法的验证，以确认所采用的方法适合于该药品的细菌霉菌及酵母菌数的测定。 二、适用范围：细菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证。 三、责任者：质量标准分析方法验证小组。 四、正文： 1、验证申请 2、验证立项申请表 3、验证方案 4、验证方案的批复 5、验证报告 6、验证报告的审批 7、验证证书
细菌、霉菌及酵母菌计数方法验证申请 细菌、霉菌及酵母菌计数方法验证申请。我公司细菌、霉菌及酵母菌计数方法严格按照《中华人民共和国兽药典》2005年版质量标准分析方法验证指导原则进行，今拟对细菌、霉菌及酵母菌计数方法进行验证。请予以批准！ 附：细菌、霉菌及酵母菌计数方法验证小组成员名单 组长： 成员： 申报单位：质量标准分析方法验证小组 申报日期：年月日
验证申请批复
细菌、霉菌及酵母菌计数方法验证方案 一、概述： 1、名称：微生物限度检查法细菌霉菌及酵母菌计数方法的验证报告。 2、目的：当建立微生物限度检查法时，应进行细菌霉菌及酵母菌计数方法的验证，以确认所采用的方法适合于该药品的细菌霉菌及酵母菌数的测定。 3、验证判断标准：《中华人民共和国兽药典》2005年版附录XIJ 4、验证人员： 质保部：负责对验证结果进行评价。 化验室：负责验证情况的检测和监督。 总经理：负责对验证结果进行评价。 5、验证日期： 二、验证 1、验证依据：《中华人民共和国兽药典》2005年版附录XIJ微生物限度检查法。 按供试液的制备和细菌霉菌及酵母菌计数所规定的薄膜过滤法及其有关要求进行。 2、内容： （1）菌液所用的菌株传代次数为3 代，接种大肠埃希菌，金黄色葡萄球菌，枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养琼脂培养基中，培养24小时， 接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁琼脂培养基中，培养48小时，上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数为60cfu的菌悬液。接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基中，培养7天，加入5ml0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。然后吸出孢子悬液（用管口带有薄的无菌沙布能过滤菌丝的无菌毛细吸管）至无菌试管内，用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含孢子数60cfu的孢子悬液。 （2）验证方法验证试验进行了3次独立的平行试验。 A、试验组供试液（Ⅰ）纯化水1ml（Ⅱ）药品名称（1：100）10g，取供试液
菌落计数及报告方法
菌落计数及报告方法 1、目的 建立微生物实验中菌落计数及报告规范，从实际生长的菌落数中计算出较为科学的结果 2、方法说明本文件采用平板计数法，产品中污染的细菌种类不同，每种细菌都有它一定的生理特性，培养时对营养要求，培养温度、培养时间、pH值、需氧性质等均有所不同。在实际工作中，不可能做到满足所有菌的要求，因此所测定的结果，只包括在本方法所使用的条件下生长的微生物总数。 3、参考文件GB7918.2-1987化妆品微生物标准检验方法细菌总数测定 4、菌落计数方法先用肉眼观察，点数菌落数，然后再用放大5～10倍的放大镜检查，以防遗漏。记下各平皿的菌落数后。求出同一稀释度各平皿生长的平均菌落数。若平皿中有连成片状的菌落或花点样菌落蔓延生长时，该平皿不宜计数。若片状菌落不到平皿中的一半，而其余一半中菌落数分布又很均匀，则可将此半个平皿菌落计数后乘2，以代表全皿菌落数。 5菌落计数及报告方法 5.1 首先选取平均菌落数在30～300之间的平皿，作为菌落总数侧定的范围。当只有一个稀释度的平均菌落数符合此范围时，即以该平皿菌落数乘其稀释倍数(见表中例1) , 5.2 若有两个稀释度，其平均菌落数均在30～300个之间，则应求出两者菌落总数之比值来决定。若其比值小于或等于2 ，应报告其平均数，若大于2则报告其中较小的菌落数( 见表中例2及例3), 5.3 若所有稀释度的平均菌落数均大于300 个，则应按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数报告之(见表中例4)， 5.4 若所有稀释度的平均菌落数均少于30个，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数报告之(见表中例5), 5.5 若所有稀释度的平均菌落数均不在30～300个之间，其中一个稀释度大于300个，而相邻的另一稀释度小于30个时，则以接近30 或300的平均菌落数乘以稀释倍数报告之(见表中例6), 5.6 若所有的稀释度均无菌生长，报告数为每克或每毫升小于10 个。
细菌平板计数法
操作步骤 l．编号取无菌平皿9套，分别用记号笔标明10-4、10-5、10-6。(稀释度)各3套。另取6支盛有4.5mL无菌水的试管，依次标是10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6。 2．稀释用lmL无菌吸管吸取lmL已充分混匀的大肠杆菌菌县液(待测样品)，精确地放0.5ml 至10-1的试管中，此即为10倍稀释。将多余的菌液放回原菌液中。将10-1试管置试管振荡器上振荡，使菌液充分混匀。另取一支lml吸管插入10- 1试管中来回吹吸菌悬液三次，进一步将菌体分散、混匀。吹吸菌液时不要太猛太快，吸时吸管伸人管底，吹时离开液面，以免将吸管中的过滤棉花浸湿或使试管内液体外溢。用此吸管吸取10-1菌液lmL，精确地放0.5mL至10-2试管中，此即为100倍稀释。……其余依次类推。放菌液时吸管尖不要碰到液面，即每一支吸管只能接触一个稀释度的菌悬液，否则稀释不精确，结果误差较大。 3.取样用三支1mL无菌吸管分别吸取10-4、10-5和10-6的稀释菌悬液各lmL，对号放入编好号的无菌平皿中，每个平皿放0.2mL。不要用lmL吸管每次只靠吸管尖部吸0.2mL稀释菌液放入平皿臼，这样容易加大同一稀释度几个重复平板间的操作误差。 4．倒平板．尽快向上述盛有不同稀释度菌液的平皿中倒入融化后冷却至45℃左右的牛肉膏蛋白胨培养基约15毫升/平皿，置水平位置迅速旋动平皿，使培养基与菌液混合均匀，而又不使培养基荡出平皿或溅到平皿盖上。由于细菌易吸附到玻璃器皿表面，所以菌液加入到培养皿后，应尽快倒入融化并于已冷却至45℃左右的培养基，立即摇匀，否则细菌将不易分散或长成的菌落连在一起，影响计数。待培养基凝固后，将平板倒置于37℃恒温培养箱中培养。 5．计数培养48h后，取出培养平板，算出同一稀释度三个平板上的菌落平均数，并按下列公式进行计算，每毫升中菌落形成单位(cfu)=同一稀释度三次重复的平均菌落数×稀释倍数×5。一般选择每个平板上长有30~300个菌落的稀释度计算每毫升的含菌量较为合适。同一稀释度的三个重复对照的菌落数不应相差很大，否则表示试验不精确。实际工作中同一稀释度重复对照平板不能少于三个，这样便于数据统计，减少误差。 由10-4、10-5、10-6三个稀释度计算出的每毫升菌液中菌落形成单位数也不应相差太大。平板菌落计数法，所选择倒平板的稀释度是很重要的。一般以三个连续稀释度中的第二个稀释度倒平板培养后所出现的平均菌落数在50个左右为好，否则要适当增加或减少稀释度加以调整。 平板菌落计数法的操作除上述倾注倒平板的方式以外，还可以用涂布平板的方式进行。二者操作基本相同，所不同的是后者先将牛肉膏蛋白胨培养基融化后倒平板，待凝固后编号，并于37℃左右的温箱中烘烤30min，或在超静工作台上适当吹干，然后用无菌吸管吸取稀释好的菌液对号接种于不同稀释度编号的平板上，并尽快用无菌玻璃涂棒将菌液在平板上涂布均匀，平放于实验台上20～30min，使菌液渗入培养基表层内，然后倒置37℃的恒温箱中培养24～48h。涂布平板用的菌悬液量一般以0.1ml较为适宜，如果过少菌液不易涂布开，过多则在涂布完后或在培养时菌液仍会在平板表面流动，不易形成单菌落。五、实验报告1．结果2．将培养后菌落计数结果填入下表2．思考题(1)为什么融化后的培养基要冷却至45℃左右才能倒平板? (2)要使平板菌落计数准确，需要掌握哪几个关键?为什么? (3)试比较平板菌落计数法和显微镜下直接计数法的优缺点及应用。(4)当你的平板上长出的菌落不是均匀分散的而是集中在一起时，你认为问题出在哪里? (5)用倒平板法和涂布法计数，其平板上长出的菌落有何不同?为什么要培养较长时间(48h)后观察结果?
实验六 细菌计数法
实验六细菌计数法 菌落总数就是指在一定条件下（如需氧情况、营养条件、pH、培养温度和时间等）每克（每毫升）检样所生长出来的细菌菌落总数。按国家标准方法规定，即在需氧情况下，37℃培养48h，能在普通营养琼脂平板上生长的细菌菌落总数，所以厌氧或微需氧菌、有特殊营养要求的以及非嗜中温的细菌，由于现有条件不能满足其生理需求，故难以繁殖生长。因此菌落总数并不表示实际中的所有细菌总数，菌落总数并不能区分其中细菌的种类，所以有时被称为杂菌数，需氧菌数等。 目录 菌落总数介绍 检验方法 说明（一）样品的处理和稀释： （二）倾注培养 （三）计数和报告 菌落总数介绍 菌落是指细菌在固体培养基上生长繁殖而形成的能被肉眼识别的生长物，它是由数以万计相同的细菌集合而成。当样品被稀释到一定程度，与培养基混合，在一定培养条件下，每个能够生长繁殖的细菌细胞都可以在平板上形成一个可见的菌落。菌落总数测定是用来判定食品被细菌污染的程度及卫生质量，它反映食品在生产过程中是否符合卫生要求，以便对被检样品做出适当的卫生学评价。菌落总数的多少在一定程度上标志着食品卫生质量的优劣。 检验方法 菌落总数的测定，一般将被检样品制成几个不同的10倍递增稀释液，然后从每个稀释液中分别取出1mL置于灭菌平皿中与营养琼脂培养基混合，在一定温度下，培养一定时间后（一般为48小时），记录每个平皿中形成的菌落数量，依据稀释倍数，计算出每克（或每ml）原始样品中所含细菌菌落总数。基本操作一般包括：样品的稀释－－倾注平皿－－培养48小时－－计数报告。国内外菌落总数测定方法基本一致，从检样处理、稀释、倾注平皿到计数报告无何明显不同，只是在某些具体要求方面稍有差别，如有的国家在样品稀释和倾注培养进，对吸管内液体的流速，稀释液的振荡幅度、时间和次数以及放置时间等均作了比较具体的规定。检验方法参见：GB4789.2-94 《中华人民共和国国家标准食品卫生微生物学检验菌落总数测定》SN0168-92 《中华人民共和国进出口商品检验行业标准出口食品菌落计数》 说明 （一）样品的处理和稀释： 1．操作方法：以无菌操作取检样25g（或25ml)，放于225mL灭菌生理盐水或其他稀释液的灭菌玻璃瓶内（瓶内预置适当数量的玻璃珠)或灭菌乳钵内，经充分振要或研磨制成1：10的均匀稀释液。固体检样在加入稀释液后，最好置灭菌均质器中以8000~10000r/min的速度处理1min，制成1：10的均匀稀释液。用1ml灭菌吸管吸取1：10稀释液1ml，沿管壁徐徐注入含有9ml灭菌生理盐水或其他稀释液的试管内，振摇试管混合均匀，制成1：100的稀释液。另取1ml灭菌吸管，按上项操作顺序，制10倍递增稀释液，如此每递增稀释一次即换用1支1ml灭菌吸管。2．无菌操作：操作中
菌落总数实验报告
检验报告 实验名称：菌落总数的检验 实验方法：平板计数法 商品名称：夸夸唔、有友、奇爽、乐棒棒、香猪脆、香脆肚。 参照标准：GB4789-17 2011 总负责人：熊经理 检验人员:徐恒琴、崔艳霞、游惠 检验时间： 2011年7月26—8月6号
2011年8月8日 菌落总数的检测 平板计数法 一、实验目的 为了进一步了解与熟悉我们产品的操作规范和关键点的控制，掌握菌落总数的检验方法和了解超净工作台的操作规范。 二、实验仪器设备和所需试剂及试剂的配制。 1、实验仪器及设备 杀菌锅YXQ—LS—SU 编号5090、无菌超净工作台SW—CJ—IC 编号24、JJ-Z型组织捣碎机、隔水或智能恒温培养箱GHP—9080、出厂编号13475、烘箱ZFD—5040(全自动型鼓风干燥箱）、蒸馏水制备机、灭菌过的250ml锥形瓶、1ml吸量管、10ml的吸量管、酒精灯、锥形瓶1000ml、培养皿、电子天平AL104、电磁炉、锅、锅铲、PH试纸、恒温水浴锅HH —4 出厂标号。 2、试验试剂及配制 主要试剂：琼脂、无菌生理盐水、无菌水、75%的酒精、1moL/L氢氧化钠、1moL/L的盐酸。 药品试剂 琼脂：准确称取胰蛋白胨、酵母浸膏、葡萄糖、琼脂、蒸馏水2500ml，加入至锅中煮沸溶解，先加入琼脂将其熬化，在加入其它样品，直至样品熬化即可关掉火，冷却后调解PH值（左右即可）。酸性用氢氧化钠调节、
碱性用盐酸进行调节，将在1200C高压灭菌15min即可。 无菌生理盐水：准确称取氯化钠溶于1000ml蒸馏水中。 无菌水：吸取1000ml的蒸馏水，将在1200C高压灭菌15min即可。 1moL/L氢氧化钠：称取40g的氢氧化钠溶于1000ml的蒸馏水中在1200C高压灭菌15min即可。 75%的酒精：分别吸取400ml的95%的无水乙醇和100ml的蒸馏水与500ml的容量瓶中。 1moL/LDE 盐酸：移取浓盐酸90ml，用蒸馏水稀释至1000ml，在1200C 高压灭菌15min即可。 三．试验步骤 1 、样品的稀释 固体和半固体样品：称取25 g 样品置盛有225 ml 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内，8000 r/min～10000 r/min 均质1 min～2 min，或放入盛有225 ml 稀释液的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1 min～2 min，制成1:10 的样品匀液。 液体样品：以无菌吸管吸取25 ml样品置盛有225 ml 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分混匀，制成1:10 的样品匀液。36 ℃±1 ℃ 48 h±2 h. 2、检样与接种：25 g(ml)样品+225 ml稀释液，均质，10 倍系列稀释选择2 个～3 个适宜稀释度的样品匀液，各取1 ml 分别加入无菌培养皿内。 用1 ml 无菌吸管或微量移液器吸取1:10 样品匀液1 ml，沿管
大肠菌群平板计数法的注意事项
大肠菌群是经常用来衡量食品卫生情况的重要指标，绝大部分食品都会要 求检测的项目。在食品微生物实验室里，大肠菌群和菌落总数的检测频次应该是最高的，但检测过程中总会有一些小问题困扰着大家，以下来讲解一下大肠 菌群平板计数法的注意事项。 方法选择 相比于MPN计数法，平板计数法更适用于大肠菌群含量较高的食品。但大肠菌群多少算是含量较高呢国标里没有明确规定，但通常认为，产品大肠菌群以100CFU/g（mL）为界，超过这个含量一般认为是含量较高。但具体什么时候选用平板计数法进行大肠菌群的检测，大部分情况还是要看你的产品执行的标准。假如产品标准要求大肠菌群含量的单位为CFU/g（mL），那必须选用平板计数法。若是/g(mL)或者MPN/100g(mL)，就应选择MPN计数法，MPN法具体选用哪版国标 此处不再赘述。因此，根据自己产品的情况选择适当的检测方法。 培养基的要求 平板计数法使用的培养基为结晶紫中性胆盐琼脂培养基，简称VRBA。无论是国标，还是培养基的使用说明中都明确表示，VRBA是不需要进行灭菌的，煮沸2min即可使用。特地点出这一点是因为很多朋友都在问VRBA的灭菌条件，对不灭菌的培养基不信任，害怕出现检测异常，那是因为这些小伙伴们对其中的原理不清楚。大肠菌群的定义是在一定培养条件下能够在发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌，因此大肠菌群是不能形成芽孢的，在VRBA培养基煮沸的过程中，即使有大肠菌群存在也会被杀灭，所以从培养基带入污染的可能性是没有的。当然盛装培养基的容器是需要进行灭菌的，以免容器引入污染。另外，VRBA是一种选择性的培养基，含有的结晶紫对革兰氏阳性菌有比较强的抑制作用而对革兰氏阴性菌几乎没有作用，而且平板培养产生的菌落还需要进行复发酵的验证，因此VRBA培养基就不需要进行灭菌了。但值得注意 的是，VRBA需要现配现用，配制出的培养基应当在3h之内使用完毕。 稀释度的确定 国标中要求选择2-3个适宜的连续稀释度。什么样的稀释度是合适的呢这要根据计数来决定。计数环节要求选择菌落数在15CFU-150CFU的平板进行计数，
实验四 微生物平板菌落计数法
实验四微生物平板菌落计数法 一、实验目的 学习并掌握平板菌落计数的基本原理和方法。 二、实验原理 平板菌落计数法是将待测样品经适当稀释之后，其中的微生物充分分散成单个细胞，取一定量的稀释样液接种到平板上，经过培养，由每个单细胞生长繁殖而形成肉眼可见的菌落，即一个单菌落应代表原样品中的一个单细胞。统计菌落数，根据其稀释倍数和取样接种量即可换算出样品中的含菌数。但是，由于待测样品往往不易完全分散成单个细胞，所以，长成的一个单菌落也可能来自样品中的2～3或更多个细胞。因此平板菌落计数的结果往往偏低，为了清楚地阐述平板菌落计数的结果，现在已倾向使用菌落形成单位（cfu）而不以绝对菌落数来表示样品的活菌含量。 平板菌落计数法虽然操作较繁，结果需要培养一段时间才能取得，而且测定结果易受多种因素的影响，但是该计数方法的最大优点是可以获得活菌的信息，所以被广泛用于生物制品检验（如活菌制剂），以及食品、饮料和水（包括水源水）等的含菌指数或污染程度的检测。 三、实验器材 1 ．菌种：酵母菌。 2 ．培养基：YEB培养基。 3 ．仪器或其他用具： 1ml 无菌吸管，无菌平皿，盛有 4.5ml 无菌水的试管，试管架，恒温培养箱等。 四、实验步骤 1 ．编号 取无菌平皿 9 套，分别用记号笔标明 10-4、 10-5、 10-6（稀释度）各 2 套，另取 6 支盛有 4.5ml 无菌水的试管，依次标是 10-1、 10-2、 10-3、 10-4、 10-5、 10-6。 2 ．稀释 用 1ml 无菌吸管吸取 1ml 已充分混匀的大肠杆菌菌悬液（待测样品），精确地放0.5ml 至 10-1的试管中，此即为 10 倍稀释。将多余的菌液放回原菌液中。
菌落总数计数实验应选取什么样的平板进行计数和数据处理
菌落总数计数实验应选取什么样的平板进行计数和数据处理？ 计数和报告 1．操作方法：培养到时间后，计数每个平板上的菌落数。可用肉眼观察，必要时用放大镜检查，以防遗漏。在记下各平板的菌落总数后，求出同稀释度的各平板平均菌落数，计算处原始样品中每克（或每ml）中的菌落数，进行报告。 2．到达规定培养时间，应立即计数。如果不能立即计数，应将平板放置于0－4℃，但不得超过24h。 3．计数时应选取菌落数在30~300之间的平板（SN标准要求为25~250 个菌落），若有二个稀释度均在30~300之间时，按国家标准方法要求应以二者比值决定，比值小于或等于2取平均数，比值大于2则其较小数字。 4．若所有稀释度均不在计数区间。如均大于300，则取最高稀释度的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。如均小于30，则以最低稀释度的平均菌落数乘稀释倍数报告之。如菌落数有的大于300，有的又小于30，但均不在30~300之间，则应以最接近300或30的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。如所有稀释度均无菌落生长，则应按小于1乘以最低稀释倍数报告之。有的规定对上述几种情况计算出的菌落数按估算值报告。 5．不同稀释度的菌落数应与稀释倍数成反比（同一稀释度的二个平板的菌落数应基本接近），即稀释倍数愈高菌落数愈少，稀释倍数愈低菌落数愈多。如出现逆反现象，则应视为检验中的差错（有的食品有时可能出现逆反现象，如酸性饮料等），不应作为检样计数报告的依据。 6．当平板上有链状菌落生长时，如呈链状生长的菌落之间无任何明显界限，则应作为一个菌落计，如存在有几条不同来源的链，则每条链均应按一个菌落计算，不要把链上生长的每一个菌落分开计数。如有片状菌落生长，该平板一般不宜采用，如片状菌落不到平板一半，而另一半又分布均匀，则可以半个平板的菌落数乘2代表全平板的菌落数。 7．当计数平板内的菌落数过多（即所有稀释度均大于300时），但分布很均匀，可取平板的一半或1/4计数。再乘以相应稀释倍数作为该平板的菌落数。 8．菌落数的报告，按国家标准方法规定菌落数在1~100时，按实有数字报告，如大于100时，则报告前面两位有效数字，第三位数按四舍五入计算。固体检样以克（g)为单位报告，液体检样以毫升（ml）为单位报告，表面涂擦则以平方厘米（cm）报告。
平板计数法
稀释平板计数法 实验目的 学习稀释平板菌落计数的基本原理和方法。 实验内容 用稀释平板菌落计数法对菌悬液进行计数。 实验原理 平板菌落计数法是将待测样品经适当稀释之后，其中的微生物充分分散成单个细胞，取一定量的稀释样液接种到平板上，经过培养，由每个单细胞生长繁殖而形成肉眼可见的菌落，即一个单菌落应代表原样品中的一个单细胞。统计菌落数，根据其稀释倍数和取样接种量即可换算出样品中的含菌数。但是，由于待测样品往往不易完全分散成单个细胞，所以，长成的一个单菌落也可能来自样品中的2—3或更多个细胞。因此平板菌落计数的结果往往偏低。为了清楚地阐述平板菌落计数的结果，现在已倾向使用菌落形成单位(cfu)而不以绝对菌落数来表示样品的活菌含量。 平板菌落计数法虽然操作较繁，结果需要培养一段时间才能取得，而且测定结果易受多种因素的影响，但是，由于该计数方法的最大优点是可以获得活菌的信息，所以被广泛用于生物制品检验（如活菌制剂），以及食品、饮料和水〔包括水源水〕等的含菌指数或污染程度的检测。 实验器材 酿酒酵母菌悬液 马铃薯培养基 1m1吸管，平皿，试管，试管架，恒温培养箱等。 实验步骤 1．无菌器材的准备 (1) 无菌培养皿：取培养皿9套，包扎、灭菌。 (2) 无菌移液管的准备：取1m1移液管，在后部管口处用铁丝塞入棉花少许（长约1~1.5cm ），以防将菌液吸出，同时也可避免将外面的微生物吹入。棉花要塞得松紧适宜吹时能通气但不使棉花滑下为准。然后将移液管尖端放在4~5cm宽的长纸条一端呈45o角折叠纸条包住尖端，用左手捏住管身，右手将吸管压紧，在桌面上向前滚动，以螺旋式包扎起来，上端剩余纸条折叠打结后干热灭菌。 (3) 无菌水：取6支试管，分别装入4.5m1蒸馏水，加棉塞，灭菌。 2．样品稀释液的制备 (1) 编号 取无菌平皿9套，分别用记号笔标明10-4、10-5、10-6(稀释度)各3套。另取6支盛有4.5m1无菌水的试管，依次标是10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6。
细菌的各种计数法
1、计数器测定法： 即用血细胞计数器进行计数。取一定体积的样品细胞悬液置于血细胞计数器的计数室内，用显微镜观察计数。由于计数室的容积是一定的(O.1mm3)，因而根据计数器刻度内的细菌数，可计算样品中的含菌数。本法简便易行，可立即得出结果。 本法不仅适于细菌计数，也适用于酵母菌及霉菌孢子计数。 2、电子计数器计数法: 电子计数器的工作原理是测定小孔中液体的电阻变化，小孔仅能通过一个细胞，当一个细胞通过这个小孔时，电阻明显增加，形成一个脉冲，自动记录在电子记录装置上。 该法测定结果较准确，但它只识别颗粒大小，而不能区分是否为细菌。因此，要求菌悬液中不含任何碎片。 3、活细胞计数法 常用的有平板菌落计数法，是根据每个活的细菌能长出一个菌落的原理设计的。取一定容量的菌悬液，作一系列的倍比稀释，然后将定量的稀释液进行平板培养，根据培养出的菌落数，可算出培养物中的活菌数。此法灵敏度高，是一种检测污染活菌数的方法，也是目前国际上许多国家所采用的方法。使用该法应注意：①一般选取菌落数在30～300之间的平板进行计数，过多或过少均不准确；②为了防止菌落蔓延，影响计数，可在培养基中加入O．001％2，3，5一氯化三苯基四氮唑(TTC)；③本法限用于形成菌落的微生物。 广泛应用于水、牛奶、食物、药品等各种材料的细菌检验，是最常用的活菌计数法。 4、比浊法 比浊法是根据菌悬液的透光量间接地测定细菌的数量。细菌悬浮液的浓度在一定范围内与透光度成反比，与光密度成正比，所以，可用光电比色计测定菌液，用光密度(OD值)表示样品菌液浓度。 此法简便快捷，但只能检测含有大量细菌的悬浮液，得出相对的细菌数目，对颜色太深的样品，不能用此法测定。 5、测定细胞重量法 此法分为湿重法和干重法。湿重法系单位体积培养物经离心后将湿菌体进行称重；干重法系单位体积培养物经离心后，以清水洗净放人干燥器加热烘干，使之失去水分然后称重。 此法适于菌体浓度较高的样品，是测定丝状真菌生长量的一种常用方法。 6、测定细胞总氮量或总碳量 氮、碳是细胞的主要成分，含量较稳定，测定氮、碳的含量可以推知细胞的质量。此法适于细胞浓度较高的样品。 7、颜色改变单位法（colour change unit,简称CCU） 这种方法通常用于很小，用一般的比浊法无法计数的微生物，比如支原体等，因为支原体的液体培养物是完全透明的，呈现为清亮透明红色，因此无法用比浊法来计数，由于支原体固体培养很困难，用cfu法也不容易计数，因此需要用特殊的计数方法，即CCU法。它是以微生物在培养基中的代谢活力为指标，来计数微生物的相对含量的，下面以解脲脲原体为例，简单介绍其操作： （1）.取12只无菌试管，每一管装1.8ml解脲脲原体培养基。 （2）.在第一管加入0.2ml待测解脲脲原体菌液，充分混匀，从中吸取0.2ml加入第二管，依次类推，10倍梯度稀释，一直到最末一管 （3）.于37度培养，以培养基颜色改变的最末一管作为待测菌液的CCU，也就是支原体的最大代谢活力，比如第六管出现颜色改变，他的相对浓度就是10的6次方CCU/ml. 一般来说，比浊法和菌落计数法就可以满足绝大多数细菌的计数，但是对支原体这样比较特殊的微生物，用CCU法比较合适。
菌落计数器计数方法详解
菌落计数器计数方法详解 菌落计数器由计数器、探笔、计数池等部分组成，计数器采用CMOS集成电路精心设计，LED数码管显示，字高13mm，清晰明亮，配合专用探笔，计数灵敏准确，菌落对比清楚。便于观察。可广泛用于食品、饮料、药品、生物制品、化妆品、卫生用品、饮用水、生活污水、工业废水、临床标本中细菌数的检验。那么菌落计数器都是怎样进行计数的呢？上海巴玖来为您详细讲解菌落计数器的计数方法。 1.计数器测定法 即用血细胞计数器进行计数。取一定体积的样品细胞悬液置于血细胞计数器的计数室内，用显微镜观察计数。由于计数室的容积是一定的(O.1mm3)，因而根据计数器刻度内的细菌数，可计算样品中的含菌数。本法简便易行，可立即得出结果（本法不仅适于细菌计数，也适用于酵母菌及霉菌孢子计数）。 2.电子计数器计数法 电子计数器的工作原理是测定小孔中液体的电阻变化，小孔仅能通过一个细胞，当一个细胞通过这个小孔时，电阻明显增加，形成一个脉冲，自动记录在电子记录装置上。 该法测定结果较准确，但它只识别颗粒大小，而不能区分是否为细菌。因此，要求菌悬液中不含任何碎片。 3.活细胞计数法 常用的有平板菌落计数法，是根据每个活的细菌能长出一个菌落的原理设计的。取一定容量的菌悬液，作一系列的倍比稀释，然后将定量的稀释液进行平板，根据培养出的菌落数，可算出培养物中的活菌数。此法灵敏度高，是一种检测污染活菌数的方法，也是目前国际上许多国家所采用的方法。使用该法应注意：①一般选取菌落数在30～300之间的平板进行计数，过多或过少均不准确；②为了防止菌落蔓延，影响计数，可在培养基中加入O．001％2，3，5一氯化三苯基四氮唑(TTC)；③本法限用于形成菌落的微生物。 广泛应用于水、牛奶、食物、药品等各种材料的细菌检验，是常用的活菌计数法。 4.比浊法 比浊法是根据菌悬液的透光量间接地测定细菌的数量。细菌悬浮液的浓度在一定
菌落计数
食品微生物学检验菌落总数测定 一、培养基和试剂 1、平板计数琼脂（plate count agar，PCA）培养基 成分 胰蛋白胨 5.0 g 酵母浸膏 2.5 g 葡萄糖 1.0 g 琼脂 15.0 g 蒸馏水 1000 mL pH 7.0±0.2 制法：将上述成分加于蒸馏水中，煮沸溶解，调节pH。分装试管或锥形瓶，121 ℃高压灭菌15 min。 2、磷酸盐缓冲液 成分 磷酸二氢钾（KH2PO4） 34.0 g 蒸馏水 500 mL pH 7.2 制法：贮存液：称取34.0 g的磷酸二氢钾溶于500 mL蒸馏水中，用大约175 mL的1 mol/L 氢氧化钠溶液调节pH，用蒸馏水稀释至1 000 mL后贮存于冰箱。 稀释液：取贮存液1.25 mL，用蒸馏水稀释至1 000 mL，分装于适宜容器中，121 ℃高压灭菌15 min。 3、无菌生理盐水 成分 氯化钠 8.5 g 蒸馏水 1 000 mL 制法：称取8.5ｇ氯化钠溶于1 000 mL蒸馏水中，121 ℃高压灭菌15 min。 二、操作步骤 样品的稀释 1、固体和半固体样品：称取25 g 样品置盛有225 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内，8000 r/min～10000 r/min 均质1 min～2 min，或放入盛有225 mL 稀释液的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1 min～2 min，制成1:10 的样品匀液。 2、液体样品：以无菌吸管吸取25 mL 样品置盛有225 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分混匀，制成1:10 的样品匀液。 3、用1 mL 无菌吸管或微量移液器吸取1:10 样品匀液1 mL，沿管壁缓慢注于盛有9 mL 稀释液的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用1 支无菌吸管反复吹打使其混合均匀，制成1:100 的样品匀液。 4、按3操作程序，制备10 倍系列稀释样品匀液。每递增稀释一次，换用1 次1 mL 无菌吸管或吸头。 5、根据对样品污染状况的估计，选择2 个～3 个适宜稀释度的样品匀液（液体样品可包括原液），在进行10 倍递增稀释时，吸取1 mL 样品匀液于无菌平皿内，每个稀释度做两个平皿。同时，分别吸取1 mL 空白稀释液加入两个无菌平皿内作空白对照。 6、及时将15 mL～20 mL 冷却至46 ℃的平板计数琼脂培养基（可放置于46 ℃±1 ℃恒温水浴箱中保温）倾注平皿，并转动平皿使其混合均匀。 培养
菌落计数器的计数方法
菌落计数器的计数方法 菌落计数器由计数器、探笔、计数池等部分组成，计数器采用CMOS集成电路精心设计，LED数码管显示，字高13mm，清晰明亮，配合专用探笔，计数灵敏准确，菌落对比清楚。便于观察。可广泛用于食品、饮料、药品、生物制品、化妆品、卫生用品、饮用水、生活污水、工业废水、临床标本中细菌数的检验。那么菌落计数器都是怎样进行计数的呢？上海巴玖来为您详细讲解菌落计数器的计数方法。 1.计数器测定法 即用血细胞计数器进行计数。取一定体积的样品细胞悬液置于血细胞计数器的计数室内，用显微镜观察计数。由于计数室的容积是一定的(O.1mm3)，因而根据计数器刻度内的细菌数，可计算样品中的含菌数。本法简便易行，可立即得出结果（本法不仅适于细菌计数，也适用于酵母菌及霉菌孢子计数）。 2.电子计数器计数法 电子计数器的工作原理是测定小孔中液体的电阻变化，小孔仅能通过一个细胞，当一个细胞通过这个小孔时，电阻明显增加，形成一个脉冲，自动记录在电子记录装置上。 该法测定结果较准确，但它只识别颗粒大小，而不能区分是否为细菌。因此，要求菌悬液中不含任何碎片。 3.活细胞计数法 常用的有平板菌落计数法，是根据每个活的细菌能长出一个菌落的原理设计的。取一定容量的菌悬液，作一系列的倍比稀释，然后将定量的稀释液进行平板，根据培养出的菌落数，可算出培养物中的活菌数。此法灵敏度高，是一种检测污染活菌数的方法，也是目前国际上许多国家所采用的方法。使用该法应注意：①一般选取菌落数在30～300之间的平板进行计数，过多或过少均不准确；②为了防止菌落蔓延，影响计数，可在培养基中加入O．001％2，3，5一氯化三苯基四氮唑(TTC)；③本法限用于形成菌落的微生物。 广泛应用于水、牛奶、食物、药品等各种材料的细菌检验，是常用的活菌计数法。 4.比浊法
微生物计数方法
1．操作方法：以无菌操作取检样25g（或25ml)，放于225mL灭菌生理盐水或其他 稀释液的灭菌玻璃瓶内（瓶内预置适当数量的玻璃珠)或灭菌乳钵内，经充分振摇或研磨制 成1：10的均匀稀释液。 固体检样在加入稀释液后，最好置灭菌均质器中以8000~10000r/min的速度处理1min，制成1：10的均匀稀释液。 用1ml灭菌吸管吸取1：10稀释液1ml，沿管壁徐徐注入含有9ml灭菌生理盐水或其他稀释液的试管内，振摇试管混合均匀，制成1：100的稀释液。 另取1ml灭菌吸管，按上项操作顺序，制10倍递增稀释液，如此每递增稀释一次即换用1支1ml灭菌吸管。 2．无菌操作：操作中必须有“无菌操作”的概念，所用玻璃器皿必须是完全灭菌的，不得残留有细菌或抑菌物质。所用剪刀、镊子等器具也必须进行消毒处理。样品如果有包装，应用75%乙醇在包装开口处擦拭后取样。 操作应当在超净工作台或经过消毒处理的无菌室进行。琼脂平板在工作台暴露15分钟，每个平板不得超过15个菌落。 3．采样的代表性：如系固体样品，取样时不应集中一点，宜多采几个部位。固体样品必须经过均质或研磨，液体样品须经过振摇，以获得均匀稀释液。 4．样品稀释误差：为减少样品稀释误差，在连续递次稀释时，每一稀释液应充分振摇，使其均匀，同时每一稀释度应更换一支吸管。 在进行连续稀释时，应将吸管内液体沿管壁流入，勿使吸管尖端伸入稀释液内，以免 吸管外部粘附的检液溶于其内。 为减少稀释误差，SN标准采用取10mL稀释液，注入90mL缓冲液中。 5．稀释液：样品稀释液主要是灭菌生理盐水，有的采用磷酸盐缓冲液（或0.1%蛋白 胨水），后者对食品中已受损伤的细菌细胞有一定的保护作用。如对含盐量较高的食品（如酱油）进行稀释，可以采用灭菌蒸馏水。 倾注培养 1．操作方法：根据标准要求或对污染情况的估计，选择2~3个适宜稀释度，分别在制10倍递增稀释的同时，以吸取该稀释度的吸管移取1ml稀释液于灭菌平皿中，每个稀释度做两个平皿。 将凉至46℃营养琼脂培养基注入平皿约15ml，并转动平皿，混合均匀。同时将营养 琼脂培养基倾入加有1ml稀释液（不含样品）的灭菌平皿内作空白对照。 待琼脂凝固后，翻转平板，置36±1℃温箱内培养48±2h，取出计算平板内菌落数目，乘以稀释倍数，即得每克（每毫升）样品所含菌落总数。 2．倾注用培养基应在46℃水浴内保温，温度过高会影响细菌生长，过低琼脂易于凝 因而不能与菌液充分混匀。如无水浴，应以皮肤感受较热而不烫为宜。
平板菌落计数法
平板菌落计数法 （一）目的要求 学习平板菌落计数的基本原理和方法。 （二）基本原理 平板菌落计数法是将待测样品经适当稀释之后，其中的微生物充分分散成单个细胞，取一定量的稀释样液接种到平板上，经过培养，由每个单细胞生长繁殖而形成肉眼可见的菌落，即一个单菌落应代表原样品中的一个单细胞。统计菌落数，根据其稀释倍数和取样接种量即可换算出样品中的含菌数。但是，由于待测样品往往不易完全分散成单个细胞，所以，长成的一个单菌落也可来自样品中的2～3或更多个细胞。因此平板菌落计数的结果往往偏低。为了清楚地阐述平板菌落计数的结果，现在已倾向使用菌落形成单位(colony-forming units，cfu)而不以绝对菌落数来表示样品的活菌含量。 平板菌落计数法虽然操作较繁，结果需要培养一段时间才能取得，而且测定结果易受多种因素的影响，但是，由于该计数方法的最大优点是可以获得活菌的信息，所以被广泛用于生物制品检验(如活菌制剂)，以及食品、饮料和水(包括水源水)等的含菌指数或污染程度的检测。
（三）器材 1．菌种大肠杆菌菌悬液。 2．培养基牛肉膏蛋白陈培养基。 3．仪器或其他用具1mL无菌吸管，无菌平皿，盛有4.5ml无菌水的试管，试管架，恒温培养箱等。 （四）操作步骤 l．编号 取无菌平皿9套，分别用记号笔标明10-4、10-5、10-6。(稀释度)各3套。另取6支盛有4.5mL无菌水的试管，依次标是10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6。 2．稀释 用lmL无菌吸管吸取lmL已充分混匀的大肠杆菌菌县液(待测样品)，精确地放0.5mL至10-1的试管中，此即为10倍稀释。将多余的菌液放回原菌液中。 将10-1试管置试管振荡器上振荡，使菌液充分混匀。另取一支lml吸管插入10 1试管中来回吹吸菌悬液三次，进一步将菌体分散、混匀。吹吸菌液时不要太猛太快，吸时吸管伸人管底，吹时离开液面，以免将吸管中的过滤棉花浸湿或使试管内液体外溢。用此吸管吸取10-1菌液lmL，精确地放0.5mL至10-2试管中，此即为100倍
MMFSCNJ出口食品平板菌落计数
MM_FS_CNJ_03出口食品平板菌落计数 MM_FS_CNJ_0333 出口食品平板菌落计数 1. 适用范围本方法适用于各种出口食品及其原料，有专门规定检验方法的除外。 2. 主要试剂和仪器 . 主要试剂（包括培养基） 平板计数琼脂； 75％乙醇； 稀释剂：磷酸盐缓冲稀释液。 . 仪器 工作台：超净工作台或放于清洁、光线充足的实验室里的水平工作台。琼脂 平板在工作台上暴露15mi n,每平板不得超过15个菌落； 恒温培养箱：36 ±「C； 恒温水浴箱：45 土1C； 均质器； 振荡器； 吸管：1、10和25mL具刻度； 平皿：直径为90mm； 稀释瓶：广口瓶或三角烧瓶，容量为200mL和500mL 玻璃珠：直径为5mm左右； 天平：感量。 3. 过程简述 . 样品制备 以无菌操作取有代表性的样品盛于灭菌容器内。如有包装，则用75％乙醇在包 装开口处擦拭后取样。 制备样品匀液 .固体或半固体食品：以无菌操作取25g样品，放入装有225mL稀释剂的灭菌均质杯内，于8000r/min均质1?2min,制成1 : 10的样品匀液。如样品均质时间超过 2min,应在均质杯外加冰水冷却。 .干燥或干粉食品以无菌操作取25g样品，放入装在225mL稀释剂和适量玻璃珠的500mL稀释瓶中，迅速振摇，将样品混匀，制成1 : 10的样品匀液。振摇时，幅度为30cm，7s 内振摇25 次，也可用机械振荡器振荡15s 代替手摇。 .液体食品：用灭菌吸管吸取25mL样品，放入装有225mL稀释剂的500mL稀释瓶中，按?条中所述方法迅速振摇，制成1 : 10的样品匀液。吸取样品时，吸管插入液面下不要超过。吸管内液体要在2?4s 内完全排入稀释剂中。不要在稀释剂中吹洗吸管。 . 稀释样品匀液 用10mL灭菌吸管准确吸取1 : 10的样品匀液10mL放入装有90mL稀释剂的200mL 稀释瓶中。按条中所述的方法，迅速振摇。制成 1 : 100的样品液。从容器中吸 取样品匀液和以后的稀释操作中，吸管尖不要碰着瓶口。吸入的液体应先高于所要求的刻度，然后提起吸管使其尖端离开液面并贴在容器内壁将液体调至所要求 的刻度。 分别用10mL灭菌吸管按条所述方法将样品匀液制成10倍递增稀释的样品液，如10_3、