蛋白质芯片技术

蛋白质芯片技术
钟春英　彭蓉　彭建新　洪华珠
(华中师范大学昆虫学研究所,武汉　430079)
摘　要:　以前对蛋白质的研究集中在一次研究一种蛋白质,通常费时费力;而蛋白质芯片技术是研究蛋白质
组的新技术,是高通量、微型化和自动化的蛋白质分析技术。它可以用来研究蛋白质的亚细胞定位和蛋白质与蛋
白质之间的相互作用,以及对蛋白质的功能进行生物化学分析,将对蛋白质组研究及医学生物学的发展有很大的
推动作用。较系统地介绍了蛋白质芯片的概念、制作及检测方法;同时也讨论了蛋白质芯片的两种功能形式、存在
问题和应用前景。
关键词:　蛋白质芯片　蛋白质微阵列　蛋白质组
Protein Chip Technology
Zhong Chunying　Peng Rong　Peng Jianxin　Hong Huazhu
(Institute of Entomology,Central China Normal University,Wuhan　430079)
Abstract:　In the past,studies of protein activities have focused on studying a single protein at a time,which is often
time-consuming and expensive. Protein chip technology is a new technology in proteome research...The advantages of the
technology are high-throughtput, miniaturized and automated. Protein chip have been used for the determination of sub-
cellular localization, analysis of protein-protein interactions and biochemical analysis of protein function. It will propel the
proteome research and medical biology enormously. The definition,manufature and detection methods of this technology
are discribled in this article. The two functional classes,limitations and future applications are also discussed.
Key words:　Protein chip　Protein microarray　Proteome
在过去的10年里,大规模和高通量的生物学研
究领域有着惊人的发展,从而开拓了技术发展和信
息收集分析的新时代。目前,以高度并行性、高通
量、微型化和自动化为特点的DNA芯片技术已经
发展为一种强有力的可靠的方法,它在基因检测和
单核苷酸多态性检测方面经常被用到。但是,蛋白
质才是生命活动的执行者和体现者,通过蛋白质芯
片技术可以高效地大规模获取生物体中蛋白质的信
息,将会对蛋白质组研究及医学生物学的发展有很
大的推动作用。因此,目前国外有很多学者,特别是
一些国家的政府和研究机构投入了大量的人力、物
力进行蛋白质芯片的开发和应用研究。
1　蛋白质芯片的概念及原理
蛋白质芯片又称蛋白质微阵列。它是一种固相
支持物表面按照预先设计的方法固定大量的探针蛋
白,形成高密度排列的探针蛋白点阵。一个蛋白质
芯片可以容纳一个蛋白质家族所有成员或一种蛋白
质的所有变异体。实验时,将带有特殊标记(如荧光
染料标记)的蛋白质分子(如抗体或配体)与该芯片
进行孵育反应,探针可以捕获样品中

的待测蛋白质
并与之结合,然后通过检测器对标记物进行检测,计
算机分析计算出待测样品的结果。在此基础上,可
发展到对各种蛋白质、抗体及配体的检测,弥补了基
因芯片检测中不能检测的空缺。
2　蛋白质芯片的制作
2.1　载体的制备
因为蛋白质要比DNA难合成,更难在载体表
面合成,所以制备蛋白质芯片比DNA芯片复杂得
多。而且固定于载体表面的蛋白质易失去原有的空
间构象,从而失去原有的活性,所以制备蛋白质芯片
作者简介:钟春英,女,硕士生。E-mail: chyzhong@https://www.wendangku.net/doc/443479168.html,
通讯作者:洪华珠,男,教授,博士生导师,主持多项国家级项目。E-mail: hzhong@https://www.wendangku.net/doc/443479168.html,
生物技术通报
·技术与方法· BIOTECHNOLOGY　BULLETIN 2004年第2期的关键是保持蛋白质的活性状态;另外,为了让芯片
适合高通量的分析,必须要使蛋白质在芯片上高密
度的排列。因此,在传统的生化分析(如免疫杂交、
噬菌体展示)中已经用来连接蛋白质的软基质,如聚
苯乙烯、PVDF膜和尼龙膜等通常不适合蛋白质芯
片[1~3]。因为这些物质的表面通常不适合高密度的
蛋白质,被点样的物质可能在这些物质的表面扩散,
或者它们不允许有良好的信噪比。因此,大多数蛋
白质芯片以玻片或其它衍生的材料作为载体。这些
载体的表面可以高密度地点样蛋白质,并且有较低
的荧光背景,适合大多数检测。
目前,蛋白质芯片的种类很多。根据载体的性
质不同,可将其分为三维基质载玻片芯片、微孔板芯
片、载玻片芯片。
三维基质载玻片芯片,是将蛋白质固定在位于
玻璃表面微小的聚丙烯酰胺凝胶[4]或琼脂糖凝胶[5]
的内面,因为聚丙烯酰胺和琼脂糖都是有孔的亲水
性基质,捕获的分子如DNA、蛋白质和抗体能够轻
易地扩散到它们的孔里,并且能够与被修饰的重新
激活的基质交叉连接而被固定在基质中。这种芯片
可以用于筛选抗原、抗体、酶动力学反应的研究。由
于三维支持物的应用,使得本方法具有一些重要的
优点:第一,胶垫中蛋白质固化的能力比两维玻璃和
塑料表面高得多;第二,胶中均一的水环境减少了干
燥,因而也最大限度地减少了蛋白质的变性;第三,
固化的蛋白质可以很好地被分离,不会相互作用。
三维芯片的缺点,首先是改变缓冲液以及恢复胶中
的分子较为困难,其次是制备载玻片芯片的任务更
加繁重。
与三维芯片相比,Zhu等人在由玻片支持的聚
二烷基硅氧烷(polydialkysiloxane,PDMS)表面制造
出了一个开放的结构,也即微孔。微孔蛋白质芯片
特别适合生物化学测定[6],它具有以下优点:第一,
微孔中的蛋白质可以很好地分离,而使交叉污染可
降到最小;第二,

孔中的蛋白质可以保存在液体中,
从而减少样品的干燥;第三,这种技术很灵敏,每次
测定仅需要极小量的样品;第四,在微孔中很容易改
变缓冲液或加组分到不同的孔中而不会有交叉污
染;第五,蛋白质芯片成本很低,一旦做好了模子,许
多芯片都可以重复使用;第六,容易自动化,与喷墨
印刷技术结合,一次平行分析106~107个生物化学
反应是完全可以的。这个技术最大的缺点是它需要
具体的设备来高密度地装载微孔。
现在许多人直接将蛋白质、抗体/抗原点在水平
玻璃表面,为了保持蛋白质在点样过程中处于湿润
的环境中,样品缓冲液中加入了高比例的甘氨酸
(30%~40%),而且点样可在湿润的环境中进行[7]。
2.2　表面化学
为了使蛋白质固定在基质上,基质的表面必须
被修饰,从而获得最大限度连接能力。一个方法是
利用蛋白质固有的连接力如范德华力、疏水力和氢
键,将蛋白质固定在疏水性(硝酸纤维膜、聚苯乙
烯)的或带正电荷(多聚赖氨酸、氨基乙烷)的表面。
但是,这种连接是非特异性的,背景水平总是很高,
并且容易影响蛋白质的活性。
为了获得更特异性的和更强的蛋白质连接,一
个最好的方法是在除了连接点附近的区域外,在没
有大幅度地改变蛋白质结构的情况下,在蛋白质和
表面之间有一种很强的连接力[8]。通常用一种具有
两个功能基团的硅烷连接分子来形成一种自组装的
单层膜(self-assembled monolayer,SAM),这种连接
分子的一个功能团能与玻璃表面的羟基反应,另外
的一个功能团(如醛基或还氧基)能直接与蛋白质的
氨基反应或者能够进一步进行化学修饰来达到最大
程度的特异化。镀上金膜的玻片则使用另一种方
法[9],为了在表面形成SAM,通常用具双功能基团
的硫代烷基,它含有一个SH-基与金膜反应,另外一
个自由基能与捕获的分子反应。使用金膜表面的优
势在于SPR和质谱能结合成一个整体去监测反应
的动力学或者分别鉴定捕获的分子。它提供了一种
高通量地研究生化反应动力学的方法,并且在药物
和靶药物的发现及生化研究中具有很大的潜力[10]。
2.3　蛋白质点样系统
最初设计用来进行DNA点样的设备已经被用
来在表面进行蛋白质点样,这个技术的一个缺点是
耗时,同时,因为点在表面的点的体积很小,一般会
导致蛋白质点干燥。为了改进这个问题,MacBeth
和Schreiber使点样孔潮湿,同时加了一些甘油到蛋
白质溶液中。其它的点样技术包括用沾有蛋白质溶
液的水凝胶探头来沉积蛋白质的技术,喷墨打印技
352004年第2期 钟春英等:蛋白质芯片技术术,通过绝缘网格的电喷雾技术和通过微液滴网络
直接应用蛋

白质溶液的技术。应用这些技术的挑战
是使蛋白质始终保持水化状态和用各种材料的装置
及液气界面来减少蛋白质的变性。
3　蛋白质芯片的检测方法
目前,对吸附到蛋白质芯片表面的靶蛋白的检
测主要有两种方式。一种是蛋白质标记法。样品中
的蛋白质预先用荧光物质或同位素等标记,结合到
芯片上的蛋白质就会发出特定的信号,用CCD
(charge-coupled device)照相技术及激光扫描系统等
对信号进行检测。Zhu等已经利用放射性同位素标
记来分别研究蛋白质与蛋白质,蛋白质与DNA,蛋
白质与药物之间的相互作用以及微孔中激酶与底物
的相互作用。另一种是以质谱技术为基础的直接检
测法,Ciphergen Biosystems公司采用表面增强激光
解吸离子化-飞行时间质谱技术(SELDI-TOF-MS),
使靶蛋白离子化,以分析蛋白质的分子量和相对含
量。该公司通过该项技术,成功地检测到了纳摩尔
的淀粉样β蛋白(Aβ),而且定量地评价了Aβ40和
Aβ42的比例,为进一步研究老年痴呆症的发病机理,
发展生物标志物及γ-1-42分泌酶的特异抑制剂提供
了基础[11]。
为了研究抗原、抗体相互作用的动力学,可利用
实时监测法。作为一种利用广泛的分子质量、亲和
力和连结率来研究受体-补体相互作用的多向监测
工具,SPR技术已经成熟。但是,商业可用的SPR
芯片局限于很少的系统。Myszka和Rich[12]描述了
一种在一个单独的流式小室里有64个独立的固定
位点的传感芯片。与此同时,Sapsford[13]等发明了一
种抗体生物传感芯片,利用平面波导管作为监测手
段来研究抗体连接的动力学。更重要的是,他们证
明能够从直径为200μm那样小的点中获得有效的
信号强度。因此,这种方法有望适合高通量和比较
动力学研究。
4　蛋白质芯片的两种功能形式
Kodadek[14]根据制作方法和应用的不同,将蛋
白质芯片分为两种:一种是蛋白质检测芯片,研究者
无需点布天然蛋白本身,而是可以将能够识别复杂
生物溶液(如细胞提取液)中靶多肽的高度特异性配
体进行点阵;另一种是细胞中的每一种蛋白质占据
芯片上一个确定的点,称之为蛋白质功能芯片,主要
应用于高度平行检测天然蛋白质活性。例如,假定
你想了解所有与蛋白质×相关的蛋白,那么就可以
将一种荧光标记的蛋白质×与蛋白质功能芯片共孵
育。“发亮”的斑点即可以认为是蛋白质×结合靶蛋
白的理想候选物。
3.1　蛋白质检测芯片
蛋白质检测芯片最普遍的形式是抗体或抗体模
拟物芯片。在这个芯片里,能结合具体抗原的抗体
(或模拟物)高密度地排列在芯片上,裂解液经过芯
片后,将芯片洗涤,连结的抗体能被监测。通常是通
过标记了的裂解液

或是能识别感兴趣的抗原的二抗
来进行监测。这种方法的最大挑战是产生能够高特
异性和高通量识别兴趣蛋白的试剂。
抗体是监测复杂混合物中蛋白质的传统试剂。
但是,涉及到生产、费用和常规应用方面,单克隆和
多克隆抗体有许多局限性。杂交瘤细胞常规连续繁
殖生产单克隆抗体为无限制提供反应物创造了条
件。但是,多克隆抗体的供应却受到了限制;同时,
生产单克隆抗体通常耗时、耗力,且费用很高。这些
局限性可以通过分子生物学方法,如噬菌体展示、核
糖体展示、SELEX(systematic evolution of ligands by
exponential enrichment,指数富集式配体系统进化)
来克服[15,16]。其它形式的连结分子如支架分子和
aptamer能够被用来生产高亲和力连结物。
Haab[17]等人在抗体—抗原芯片上采用了双色
标记。他们用110对确定的抗原、抗体制造了微免
疫芯片,对不同的蛋白质进行分析。固定抗体或抗
原在芯片上,然后对在复合溶液(如血清)中的相应
目标分子进行荧光标记。一种含有抗原的样品用一
种荧光团进行标记,另一种含有不同浓度抗原的样
品用另一种不同的荧光团进行标记,混合两种样品
并立即与同一块芯片反应,双色标记检测系统能够
立即检测出捕捉分子的不同浓度。由于与抗体有高
亲和力,此种芯片可检测至皮摩的抗原。
除了抗体型芯片,其它检测型芯片已经有所发
展,例如病人血清抗体图谱芯片。Hitler[18]等人将
94种纯化的包括最普遍的过敏原的过敏分子排列在
玻片上,使过敏反应测试微型化。这些过敏原分子
36 生物技术通报Biotechnology　Bulletin 2004年第2期没有限制为蛋白质,也包括肽和小分子。通过简单
的检测,这些过敏反应芯片可以用来特异性地鉴定
和监测过敏病人的IgE对引起疾病的大量过敏原的
反应图谱。这种方法只需要少量的血清,就揭示了
造成过敏性疾病的潜在新因素,而这其中的一些因
素通过传统的皮肤检测被证实了。
3.2　蛋白质功能芯片
在这种芯片里,许多蛋白质甚至是整个蛋白质
组被排列,从而对生化活性作一个大规模的分析,因
而在蛋白质组学的研究上有着广阔用途。Zhu[19]运
用蛋白质组芯片成功的对涵盖酵母80%的蛋白质进
行了研究,构建了含有5 800种酵母蛋白的芯片,其
中包含了大约80%的全长的酵母蛋白,并用钙调蛋
白来筛选酵母蛋白芯片。钙调蛋白是一种非常保守
的结合钙的蛋白,它有很多配偶体并参与许多钙控
制的细胞过程。通过此方法除鉴定出6种已知的钙
调蛋白的配偶体外,还找到了3种另外的钙调蛋白
可能的配偶体,这是其它方法很难做到的。
酶是生

物体内维持生命活动的重要物质,研究
酶及其底物对我们理解生命活动的本质有着重大的
价值。利用蛋白质功能芯片检测酶和底物的作用,
将会为酶及其底物的研究开辟一个新的领域。
Zhu[20]等将119种酵母蛋白激酶制作成蛋白质芯
片,运用17种特异性底物与之作用。这个实验有他
们未曾料到的发现:他们发现32种酶能磷酸化12
种没有谷氨酸、酪氨酸结构的底物,27种酶能完全磷
酸化有此结构的底物。酵母的蛋白激酶中,除了2
种属组氨酸家族外,其余的都属于丝氨酸/苏氨酸家
族。
4　存在的问题和应用前景
蛋白质芯片将为生物化学和分子生物学提供强
有力的工具,相对于DNA芯片研究的进展速度,蛋
白质芯片的研究进展显得相对滞后。主要有以下问
题亟待解决:(1)寻找材料表面的修饰方法;(2)简化
样品制备和标记操作;(3)增加信号检测的灵敏度,
如低拷贝蛋白质的检测和难溶蛋白质的检测;(4)高
度集成化样品的制备及检测仪器的研制和开发。这
些问题不仅为蛋白质芯片技术增加了难度,同时也
是蛋白质芯片能否从实验室推向临床应用的关键所
在。随着技术的不断深入和更加完善,如表面化学
修饰技术的进步,可以做到在载体上固定多种活性
蛋白质;蛋白质工程可获得大量重组高特异性蛋白
质用于芯片制作;纳米标记的引入,可提高芯片检测
的灵敏度;近期也有望开发出简便可靠的检测系统,
这些技术难题将逐渐被解决。
蛋白质芯片提供了一种高通量的蛋白质分析技
术,能够进行受体-配体检测,多种感染因素筛查和
肿瘤的诊断,了解蛋白质同包括药物在内的小分子
相互键合的作用,从基因水平上寻找靶目标和靶药
物。因此,蛋白质芯片在整个蛋白质组分析以及在
多蛋白质表达异常的遗传病诊断、治疗和新的药物
发现方面具有广阔的应用前景。
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