RNA文库建立的详细版SOP--陆芳 - 副本
RNA文库构建SOP操作流程
Ⅰ样品质检
本实验仪器与试剂：
电泳仪、电泳槽、紫外凝胶成像仪、nanodrop、掌型离心机、微波炉
琼脂糖、1xTAE缓冲液、Rnase-Free water、Maker DL2000
实验流程：
1.首先观察客户提供RNA样品是否足量(目测样本体积不少于20ul)。如果足量，取4ul
至新EP管中，用来进行质检，剩余样品进行封口，于-80°冰箱里储存。
2.取1ul样品进行nanodrop定量，确定浓度。如果浓度超过1000ng/ul，要稀释至500ng/ul
左右，重新检测浓度。
3.电泳检测：上样2-3ul跑胶检测。
4.实验结果：
OD值要在1.8-2.0之间，证明没有蛋白污染或RNA降解。
胶图上要有28s，18s，5s三条带。
胶图如下：
Ⅱ提取mRNA
本实验所用仪器与试剂：
超净台、PCR仪或水浴锅、磁力架
Magnetic mRNA Isolation Kit
实验流程：
1.准备磁珠
取100ul Oligo d(T)磁珠至干净的Rnase Free的1.5ml离心管中，放磁力架1min，待液体澄清后，保持离心管在磁力架上，弃上清，再加入500ul的Binding Buffer，轻轻摇晃混匀两分钟进行清洗。放在磁力架1min，待液体澄清后，弃上清，加入500ul Binding Buffer 以备用（在加入样本之前弃上清）。
2、根据浓度确定建库加入量，范围在5-15ug。确定样品量后，向样品中加入500ul Binding Buffer，准备好的磁珠里加入样品，轻轻混匀，常温孵育10min。然后将离心管放磁力架上1min，吸附磁珠，待液体澄清后，吸取上清于新的EP管中（不能完全吸走，留部分液体保存磁珠）。
3、上述离心管中加入500ul Wash buffer1，混匀1min。然后将离心管放磁力架1min，吸附磁珠，待液体澄清后，弃上清。重复一次此步骤。
4、上述离心管中加入500ul Wash buffer2，混匀1min。然后将离心管放磁力架1min，吸附磁珠，待液体澄清后，弃上清。重复一次此步骤。
5、上述离心管中加入500ul Low Salt buffer，混匀1min。然后将离心管放磁力架1min，吸附磁珠，待液体澄清后，弃上清。
6、上述离心管中加入18-100ul Elution buffer（或者Nuclease-Free Water），轻轻颠倒使珠子悬浮。然后50℃孵育2min（水浴），立即放在冰上（2min以上）。将离心管放磁力架1min，
吸附磁珠，待液体澄清后，取上清至新的RNase-free PCR管中，置于冰上，立即定量或-80℃冰箱保存。
7、
ⅢmRNA片断化及抽提
本实验所用仪器及试剂：
超净台、PCR仪、冷冻离心机、-80℃冰箱
NEBNext TM mRNA Sample Prep Reagent Set 1试剂盒、Ethanol（100%、70%）
3M sodium acetate PH5.2 (配1ml所需Sodium Acetate0.2487g)
实验流程：
1、将PCR仪预热至94℃，将下列各组分混在一个RNase-free PCR管中：
将上述体系轻轻混匀，震荡离心。然后94℃孵育5min（热盖严格按照时间），使mRNA 断裂成200pb左右的片段，放置冰上5min。然后加入2ul 10XRNA Fragmentation Stop Solution，用枪吹打混匀，终止片段化反应。
2、将下列各组分混在一个RNase-free 1.5ml离心管，冰上操作：
. 混匀后放入-80℃孵育30min，离心机预冷至4℃；
冷冻离心机4℃，12000rpm离心25min.，小心弃去乙醇。
加入70%乙醇300ul，小心吹打管底固体，4℃，12,000rpm离心10min，小心弃去70%乙醇。
在室温下风干10min,挥发残留乙醇，重新加入13.5ul Nuclease-Free Water溶解mRNA。.Ⅳ cDNA第一条链的合成
本实验所用仪器及试剂：
超净台、PCR仪、掌型离心机
NEBNext TM mRNA Sample Prep Reagent Set 1试剂盒
实验流程：
1、预热PCR仪至65℃。
2、反应体系（PCR管，冰上操作）：
反应条件：混匀后放入PCR仪，65°C孵育5min，立即放入冰上；
3、在上述管中继续加入：
4
反应条件：
混匀后放入PCR仪，25°C孵育2min;
在管中加入1ul的SuperScript II Reverse Transcriptase ;
按照以下程序进行：
25°C孵育10min
42°C孵育50min
70°C孵育15min
4°C 保存
将管放入冰中。
Ⅴ cDNA第二条链的合成
本实验所用仪器及试剂：
超净台、PCR仪、掌型离心机
NEBNext TM mRNA Sample Prep Reagent Set 1试剂盒
PCR纯化试剂盒
实验流程：
1.向合成第一条链的管中加入48ul Nuclease-Free Water。
2.反应体系：
反应条件：轻摇使之混匀，混匀后放入16°C孵育2.5h（4°C可过夜）;
3.用一个PCR纯化试剂盒纯化cDNA ,将纯化的样品放入一个管中，用50ul（柱子本身有
吸附，可以多加2ul） sterile water 或elution buffer溶解。
PCR纯化具体步骤如下：
●向离心管中加入5倍体积的PB混匀，混匀转移至柱子，静置2min。然后8000rpm，
离心1min，弃液。
●向柱子中加入750ulPE，静置2min。然后8000rpm，离心1min，弃液。
●空甩柱子，12000rpm，离心1min。然后柱子室温下晾干2min（开盖）。
●加入52ul的EB buffer，静止溶解2min。然后12000rpm，离心1min，（可重复溶
解一次）。
●将离心所得液体转移到1.5ml离心管中，进行后续实验。
Ⅵ末端修复
本实验所用仪器及试剂：
PCR仪、掌型离心机
NEBNext TM mRNA Sample Prep Reagent Set 1试剂盒
PCR纯化试剂盒
预热PCR仪至20℃。
1、混匀后放入20°C孵育30min:
2、用一个PCR纯化试剂盒纯化c DNA ,将纯化的样品放入一个管中，用32ul sterile water 或elution buffer溶解，步骤同上步纯化。
Ⅶ 3' 末端加A
本实验所用仪器及试剂：
PCR仪、掌型离心机
NEBNext TM mRNA Sample Prep Reagent Set 1试剂盒
PCR纯化试剂盒
反应条件：
1、混匀后放入37℃孵育30min后置于冰上；
2、用一个PCR纯化试剂盒纯化dA –Tailed c DNA ,将纯化的样品放入一个管中，用23ul sterile water 或elution buffer溶解。
Ⅷ、连接接头
本实验所用仪器及试剂：
掌型离心机
NEBNext TM mRNA Sample Prep Reagent Set 1试剂盒
PCR纯化试剂盒
反应体系：（1.5ml离心管混匀下列组分）
1.室温下孵育15min;
2.用一个PCR纯化试剂盒纯化已接接头的 cDNA ，用10ul sterile water 或elution buffer溶解。
Ⅸ、纯化连接产物
本实验所用仪器及试剂：
电泳仪、电泳槽、nanodrop仪
低熔点琼脂糖、1xTAE、EB指示剂、MarkerI、胶回收试剂盒
实验流程：
1、在2%的低熔点琼脂糖胶上或正常琼脂糖凝胶上做200-300bp大小的片断回收；
具体步骤为：
●加入6倍体积的QG（6ul/mg），（或在50°C下10min），将胶块彻底溶解，然
后加入等体积的异丙醇混匀。
●转移柱子，8，000rpm 离心1min，弃液。
●向柱子中加入750ulPE, 静置2min，8,000rpm,离心1min，弃液。
●空甩柱子12000rpm,1min。然后将柱子在室温晾干2min。
●加入29ul（实际31ul）的EB buffer，静止溶解2min,12，000rpm 离心1min
（可重复溶解一次），取离心所得液体。
胶图如下：
2、nanodrop检测纯化连接产物浓度。
Ⅹ、PCR扩增
本实验所用仪器及试剂：
电泳仪、电泳槽、PCR仪
1xTAE、EB指示剂、MarkerI、胶回收试剂盒
实验流程：
1
（实验时，回收的cDNA取部分进行PCR扩增）
2、PCR反应条件：
预变性：98°C 10s
变性 98°C 10s
退火 65°C 30s 18个循环（根据结果可能多加几个循环）
延伸 72°C 30s
延伸 72°C 5min
保存 4°C
5、用一个PCR纯化试剂盒纯化富集cDNA ,将纯化的样品放入一个管中，用30ul sterile
water 或elution buffer溶解。
6、然后将30ulPCR产物进行跑胶，然后切胶回收，用20ul洗脱。
具体步骤：
在2%的低熔点琼脂糖胶或正常琼脂糖凝胶上做片断回收；
具体步骤为：
●加入6倍体积的QG（6ul/mg），将胶块彻底溶解，然后加入等体积的异丙醇混
匀。
●转移柱子，8，000rpm 离心1min，弃液。
●向柱子中加入750ulPE, 静置2min，8,000rpm,离心1min，弃液。
●空甩柱子12000rpm,1min。然后将柱子在室温晾干2min。
●加入20ul（实际22ul）的EB buffer，静止溶解2min,12，000rpm 离心1min
（可重复溶解一次），取离心所得液体。
6、ND进行浓度检测。
什么是sop文件sop模式sop意义
什么是sop文件sop模式sop意义 标准操作流程(简称SOP)是近年来在管理领域出现的一种技术方法,它在技术及管理功能领域的发展和应用使之成为保障企业流程质量管理体系成功的一个必要的组成部分。下面是整理的什么是sop文件，欢迎阅读。 什么是sop文件(标准操作程序) SOP是Standard Operating Procedure三个单词中首字母的大写，即标准作业程序，就是将某一事件的标准操作步骤和要求以统一的格式描述出来，用来指导和规范日常的工作。 SOP是标准操作程序(Standard Operating Procedure) 的英文首字母缩写。从对SOP的上述基本界定来看，SOP具有以下一些内在的特征： SOP是一种标准的作业程序。所谓标准，在这里有最优化的概念，即不是随便写出来的操作程序都可以称作SOP，而一定是经过不断实践总结出来的在当前条件下可以实现的最优化的操作程序设计。说得更通俗一些，所谓的标准，就是尽可能地将相关操作步骤进行细化，量化和优化，细化，量化和优化的度就是在正常条件下大家都能理解又不会产生歧义。 SOP不是单个的，是一个体系，虽然我们可以单独地定义每一个SOP，但真正从企业管理来看，SOP不可能只是单个的，必然是
一个整体和体系，也是企业不可或缺的。余世维在他的讲座中也特别提到：一个公司要有两本书，一本书是红皮书，是公司的策略，即作战指导纲领;另一本书是蓝皮书，即SOP，标准作业程序，而且这个标准作业程序一定是要做到细化和量化。 sop起源在十八世纪或作坊手工业时代，制做一件成品往往工序很少，或分工很粗，甚至从头至尾是一个人完成的，其人员的培训是以学徒形式通过长时间学习与实践来实现的。随着工业革命的兴起，生产规模不断扩大，产品日益复杂，分工日益明细，品质成本急剧增高，各工序的管理日益困难。如果只是依靠口头传授操作方法，已无法控制制程品质。采用学徒形式培训已不能适应规模化的生产要求.因此，必须以作业指导书形式统一各工序的操作步骤及方法。 sop模式1、明确职责 明确职责：包括负责者、制定者、审定者、批准者。 2、格式 每页SOP页眉处注明“标准操作规程”字样; 制定SOP单位全称; 反映该份SOP属性的编码、总页数、所在页码; 准确反映该项目SOP业务的具体题目; 反映该项SOP主题的关键词，以利计算机检索; 简述该份SOP的目的、背景知识和原理等; 主体内容：具体内容简单明确，可操作性强，以能使具备专业知识和受过培训的工作人员理解和掌握为原则; 列出制定该份SOP的主要参考文献; 每份SOP 的脚注处有负责者、制定者、审定者、批准者的签名和签署日期; 标明该份SOP的生效日期。
最新汽车项目管理中对SOP的深层次理解资料
汽车项目管理中对SOP的深层次理解 我想无论是对整车的项目经理还是零部件的项目经理，甚至所有的项目参与人员，对“SOP”这个词都不陌生。它也是所有项目管理人员所期待的结果，因为SOP意 味着项目的结束，尽管大部分公司都规定SOP+3个月才能正式移交项目，但是一 但进入SOP阶段，就基本上说明项目已经大功告成，剩下的也只是一些扫尾的工作，以及向生产部门的移交。 SOP这个节点之所以很重要，不仅仅是因为它是项目成功的标志，而且它是界定 项目生命期结束的一个重要里程碑。比如前面所说的，研发部门向生产部门的责任转移；零部件的采购系统和价格的转换（有的主机厂的样件采购和批量零件的采购系统是有很大区别的，包括订单的编码都不同，更不用说价格了）；SOP也常常 是开发费用结算的节点（开发合同约定，量产后或量产以后多长时间内付清所有的开发费用）。 如果要问大家SOP是什么意思，估计绝大部分人都会回答：“量产”，这个回答没 有什么大的问题，因为英文的原意是“Start Of Production”,也就是“开始（批量）生产”的意思。但是如果要追问：“什么时候算是SOP，也就是在整个项目周期中，SOP的节点如何界定？”，估计答案就不会那么统一了。 可能产生不同理解的原因是多方面的，首先从整车和零部件的项目节点差异这个角度来说。对于整车项目来说，项目的结束是以这个车型在市场上正式销售为标志的，也就是“上市时间”（对媒体公开宣布上市，通常会有一个上市仪式或者媒体发布会），这个节点不是零部件供应商所关心的，因为在这个节点之前，通常还会有媒体试驾活动、4S店的宣传和展示，以及内销车评价等活动。
再加上从生产到销售有一个周期，所以零部件项目更关心的是什么时候开始生产用于销售的车，这个时间就决定了要什么时候提供量产的零件，也就是零件的量产时间。这个时间和车辆的上市时间相差可达半年之久！这个时间点在整车的项目计划上通常被定义为投产签署（LS），也就是所有的零部件、模具达到量产状态（以 零部件的PSW签署为标志），而且整车的所有试验验证结束、整车生产工装、夹 具达到量产的状态。 上面所说的整车和零部件的项目节点差异也可以理解成产品的成熟度这个角度的不同，因为产品的成熟度是随着项目的进度而递进的。 如果我们再深入分析一下，就会发现对不同的零部件这个量产时间也会有很大的差异，尽管从流程上要求所有的零部件在LS节点前必须签署PSW或者说达到SOP 的状态，但是对于关键零件（比如发动机、传动系统、悬架、底盘等零件，以及和安全相关的零件），可能要求远早于LS节点就要达到SOP的状态，因为这些关 重零件，要么和行车安全相关，要么对整车的性能有重大影响，这些零件如果没有达到量产的状态，就没有办法保证整车性能的验证、法规相关的测试以及内销评价、媒体评价等活动。 相反，对于外观件、内饰件以及和安全无关的电子件，甚至在正式上市之后仍然允许做一些优化和改进。由此可见，对于零部件量产状态的要求是因零件的不同而有所不同的。 现在我们再从的“量”的差异来分析量产（SOP）的不同理解，这里之所会引起迷惑，是因为大多主机厂在时间进度表里都有小批量生产节点（PP、PVS、0-Series、Pre-series，以及小排量、预批量等），各个主机厂对小批量的数量定义不尽相同，有的一两百台，多则上千台。这个量的不同，最大的影响就是产能和原材料的准备，还有就是从小批量到大批量之间工程变更的风险。
什么是sop文件sop模式sop意义
什么是sop 文件sop 模式sop 意义 标准操作流程（简称SOP）是近年来在管理领域出现的一种技术方法,它在技术及管理功能领域的发展和应用使之成为保障企业流程质量管理体系成功的一个必要的组成部分。下面是整理的什么是sop文件，欢迎阅读。 什么是sop文件（标准操作程序） SOP是Standard Operating Procedure 三个单词中首字母的大写，即标准作业程序，就是将某一事件的标准操作步骤和要求以统一的格式描述出来，用来指导和规范日常的工作。 SOP 是标准操作程序（Standard Operating Procedure）的英文首字母缩写。从对SOP的上述基本界定来看，SOP具有以下一些内在的特征： SOP是一种标准的作业程序。所谓标准，在这里有最优化的概念，即不是随便写出来的操作程序都可以称作SOP，而一定是经过 不断实践总结出来的在当前条件下可以实现的最优化的操作程序设计。说得更通俗一些，所谓的标准，就是尽可能地将相关操作步骤进行细化，量化和优化，细化，量化和优化的度就是在正常条件下大家都能理解又不会产生歧义。 SOP不是单个的，是一个体系，虽然我们可以单独地定义每一个SOP，但真正从企业管理来看，SOP不可能只是单个的，必然是一个整体
和体系，也是企业不可或缺的。余世维在他的讲座中也特别提到：一个公司要有两本书，一本书是红皮书，是公司的策略，即作战指导纲领；另一本书是蓝皮书，即SOP，标准作业程序，而且这个标准作业程序一定是要做到细化和量化。 sop起源在十八世纪或作坊手工业时代，制做一件成品往往工序很少，或分工很粗，甚至从头至尾是一个人完成的，其人员的培训是以学徒形式通过长时间学习与实践来实现的。随着工业革命的兴起，生产规模不断扩大，产品日益复杂，分工日益明细，品质成本急剧增高，各工序的管理日益困难。如果只是依靠口头传授操作方法，已无法控制制程品质。采用学徒形式培训已不能适应规模化的生产要求.因此，必须以作业指导书形式统一各工序的操作步骤及方法。 sop模式1、明确职责 明确职责：包括负责者、制定者、审定者、批准者。 2、格式 每页SOP页眉处注明“标准操作规程”字样；制定SOP单位全称；反映该份SOP属性的编码、总页数、所在页码；准确反映该项目SOP业务的具体题目；反映该项SOP主题的关键词，以利计算机检索；简述该份SOP的目的、背景知识和原理等；主体内容：具体内容简单明确，可操作性强，以能使具备专业知识和受过培训的工作人员理解和掌握为原则；列出制定该份SOP的主要参考文献；每份SOP 的脚注处有负责者、制定者、审定者、批准者的签名和签署日期；标明该份SOP的生效日期。
SOP的作用与重要性
SOP的作用與重要性 什麼是SOP 1〃定義 2〃SOP的作用 3〃SOP的重要性 3〃1從生產現實的需要角度 3〃2從品質管理需要的角度 4〃製造單位責任 5〃品管單位責任 所謂SOP即標準作業指導書，就是將某一事件的標準操作步驟和要求以統一的格式描述出來，用來指導和規範日常的工作，用簡單的話來說就是對某一程式中的關鍵控制點規範化 SOP是一種標準作業程式，是對一個過程的描述，不是一個結果的描述，SOP不是表單，也不是制度。他是對工作程式的規範。 一、定義 標準作業指導書 -------是以檔的形式描述作業員在生產作業過程中的操作步驟，和應遵守的事項。--------是檢驗員用於指導工作的依據 二、SOP的作用 1．將企業積累下來的技術、經驗、記錄檔中，以免因技術人員的流動而使技術流失。
2．使操作人員經過短期培訓，快速掌握較為先進合理的操作技術。 3．根據作業標準，易於追杳不良品產生之原因 4．樹立良好的生產形象，取得客戶信賴滿意 5．實現生產管理規範化、生產流程條理化、標準化、形象化、簡單化。 6．是企業最基本、最有效的管理工具和技術資料 三SOP的重要性 有這樣一個問題：品質是 1設計出來的2管理出來的 3製造出來的4檢驗出來的 答案是3。 不錯我們不能否認其他三個方面對產品的品質有很大的影響、但是工廠中最重要的人不是廠長，也不是工程師，而是最普通的員工，正是這些最最普通的人，支撐起這個企業。 三、SOP的重要性（從生產現實的需要角度） 產品要一次性做好，關鍵就在這裏，若是等到錯了再來返工，損失巨大而無謂！因此需管制好 1、每一個作業員的動作 2、每一個站的管理值（如：烙鐵使用/設備參數） 3、每一個站的材料無誤 四、SOP的重要性（4.2從品質管理需要的角度） 品質管制的精髓是:“寫你所做，做你所寫”它要求員工的操作必須按檔進行,這樣,可便於檢驗員及生產管理人員監控,也便於新員工很快掌握操作要領.