怎么RNA逆转录DNA

请教：用Takara的逆转录试剂盒，推荐程序为37度15分钟，85度15秒，PCR仪上设置为37度15分钟，85度15秒，end.逆转录完后晚了20分钟将产物拿出，会影响cDNA 得率吗？

没关系的

变成cDNA后就很稳定了，不像RNA那么容易降解

逆转录为cDNA后可以直接跑，也可以保存起来（长期-80度，短期-20度）

刚学会作反转录，用的是Fermentas的反转录试剂盒，20ul的体系，说可以转录0.1~5ug的总RNA。曾试着用不同个体的RNA样本，每次用50ng、100ng、200ng、300ng、400ng、800ng、1ug、2ug、4ug 的总RNA做反转录，结果得到的cDNA浓度都在2300~2500ng/ul。只有50ng的时候稍微少一些2200ng/ul，另外，个别时候（2ug的一次）到达300

纯度不高时，建议少加一点，因为太多杂质会影响反转录效率。

纯度很高时，就无所谓了。我做的时候都是加1 uL，大约2 ug。

我估计你是用吸光度法测反转录后的浓度，这时候受到逆转录体系中dNTP、RNA、酶和离子等的干扰你测出来的浓度不代表cDNA的浓度，你大多数时候测到的值就应该是一个相对恒定的值。

一般不测cDNA浓度的，加入RNA在试剂盒推荐范围的话就认为完全转录了，1：1变成了cDNA。做定量PCR的时候一般先做一个浓度梯度（一般我1ug总RNA最后做的时候稀释一倍效果比较好）

我是用Trizol提取RNA，最后用10ulDEPC水溶解，然后取2ul按1：50稀释后在分光光度计上测出OD160/280基本是在1.8，浓度是8ug/ml

这样算来我溶解的原液浓度就是0.4ug/ul了？

然后我再去2ul进行RT,那就是等于去了0.8ug的RNA了？

我用的是fermentas的逆转录试剂盒，说明书上要求是可以对0.1-5ug的样品进行逆转录但是其他同学提的RNA浓度都很高，这个对以后的实验有影响吗，我是做半定量RT-PCR

我是从组织中取材，之后直接放-80度保存了半个月，这个会不会有影响呢？按说RNA降解OD比值应该升高啊。

还是我在提取中那一步做的不对呢，我在最后乙醇干燥时时间不长，而且加了DEPC水之后也没有在55--60度中助溶，这个会有影响吗？