喜炎平注射液对人肝微粒体P450酶活性的影响_叶林虎
大鼠肝微粒体的制备
2.1.3 大鼠肝微粒体的制备 大鼠肝微粒体制备全过程： 1．购买实验动物SD 大鼠，20 只，雌雄各半，体重（180-220）g，广州中医药大学实验动物中心提供。合格证号：0055706 2．大鼠肝脏灌流购买的大鼠当天腹腔注射3%戊巴比妥钠（30 mg2kg-1 ），使其麻醉，利用酒精进行常规消毒后，打开腹腔暴露肝脏，肝门静脉处进行插管并 固定。结扎上腔静脉，剪破下腔静脉用磷酸盐缓冲液进行灌流，直至肝脏颜色呈土 黄色。 3．灌流好的肝脏取出后按1：4 比例放入装有磷酸盐缓冲液（含1mM EDTA ,0.25M 蔗糖）的匀浆管内，剪碎，匀浆。 4．将匀浆液倒入50mL 高速离心管中在4℃条件下9000g 离心20 min。 5．保留上清并转移到超速离心管中，在4℃条件下100000g 离心60min。 6．保留沉淀并重新混悬于磷酸盐缓冲液（含0.9%的NaCL）中, 4℃条件下100000g 再离心60 min，得到的沉淀即为肝微粒体。 7．将肝微粒体重悬于0.1M 磷酸缓冲液（PH7.4，20%甘油，1mM EDTA，0.25M 蔗糖）中于-70℃冰箱保存，其中留取一小管用于蛋白浓度测定。 8．微粒体蛋白浓度测定依据的是Lowry et. al.方法(Lowry et al.,1951)，首先用牛血清白蛋白标准溶液配置成不同浓度的蛋白标准溶液，与斐林试剂混匀发生反应 后测定蛋白浓度，根据吸光度A 和蛋白浓度C 进行线性回归并绘制标准曲线。同 样的方法测定肝微粒体的吸光度，根据标准曲线线性回归方程计算肝微粒体蛋白浓 度。 9．肝微粒体中P450 酶含量测定根据Omura and Sato 的方法(Omura and Sato,1964)，用Tris-HCl 缓冲液把肝微粒体样品稀释至0.3?0.5 mg/mL，取两份肝微 粒体分别放于参比池和样品池，400 nm～500 nm 扫描基线；参比池和样品池都加 入少量Na2S2O4，轻微搅拌，并给样品池通CO 气体30 s，再次扫描，记录450 nm 和490 nm 处的吸光度，按Beer 定律（公式2.1）计算CYP450 的含量。 CYP450 (nmol/mg protein) = (A(450－490) ×1000)/(91 ×C) (2.1) 其中，A(450－490)为450 nm 和490 nm 处的吸光度之差，91 为CYP450-CO 结合物的摩尔消光系数，C 为肝微粒体样品的蛋白浓度（mg/mL。 实验五肝细胞微粒体的制备和细胞色素P450 氧化酶活性测定 一、目的要求
微粒体制备
微粒体制备 一、工作原理 微粒体是指在细胞匀浆和差速离心过程中获得的由破碎的内质网自我融合形成的近似球形的膜囊泡状结构,这些小囊泡的直径大约100nm左右, 是异质性的集合体。它包含内质网膜和核糖体两种基本成分，在体外实验中具有蛋白质合成、蛋白质糖基化和脂类合成等内质网的基本功能。肝脏或其他组织磨碎 (均质化)之后，微粒体能够在不同的离心速度之下，从其他的细胞胞器区隔出来、浓缩并分离。组织匀浆中未破碎的细胞、细胞核与线粒体在9000g的离心速度下可以被沉淀并分离，而P450、内质网碎片及其他可溶性酵素则保留在上清中。取上清在更快速的100,000g离心旋转之下，P450、内质网会沉淀成粒状或块状，而可溶性酵素则保留在上清中，将沉淀重悬即可得到微粒体。因此，微粒体在细胞生物学中定义为从内质网的碎片所得到的小型囊泡。微粒体含有细胞色素P450 (CYP)，由于P450中的辅助因子、血基质含有铁元素，微粒体常呈现红褐色。肝（或其他组织）微粒体体外温孵实验是采用从肝脏（或其他组织）中提取的微粒体，加入还原型辅酶II(NADPH)再生系统，在体外模拟生理环境下进行代谢反应，采用高效液相色谱(HPLC)、高效液相色谱质谱联用法(HPLC-MS)等测定方法对原型药及代谢产物进行测定的一种体外代谢的实验方法. 二、实验准备 以制备肝微粒体为例： 1、器材：匀浆机、大剪刀（断头）、手术剪、眼科剪3个、眼科镊3个、头皮针、注射器20ml、烧杯（500ml）4个、冰盒、冰板、匀浆管（5/10ml）、离心管（生科院借）、冻存管N个、培养皿N个。 2、试剂：冰生理盐水 PBS 缓冲液：1000ml缓冲液中含磷酸钾缓冲盐0.1mol·L-1、KCl 0.15 mol·L-1和1mmol·L-1EDTA,即1000ml超纯水中含K2HPO4 (228.23)18.304g、KH2PO4 (136.09)2.695g、KCl(74.55) 11.2g和EDTA0.372g，分装，4℃保存。 含20%甘油的PBS缓冲液200ml：40ml甘油+160ml上述PBS（存争议）三、实验步骤
药物体外肝代谢研究方法
药物体外肝代谢研究方法 摘要：对近几年的文献资料进行分析、综合、归纳。介绍肝微粒体体外温孵法、肝细胞体外温孵法、离体肝灌流及器官组织切片法。其中，肝细胞体外温孵法是当今药物体外肝代谢研究的热点，对新药研究与开发及正确指导临床合并用药有着巨大的推动作用，将对其进行重点论述。 关键词：体外肝代谢；肝微粒体；肝细胞；离体肝灌流；组织切片 广义的药物代谢指药物在体内吸收、分布、代谢、排泄等一系列过程［1］。狭义的药物代谢是指药物的生物转化。生物转化后，药物的理化性质发生变化，从而引起其药理和毒理活性的改变。因此，研究药物的生物转化，明确其代谢途径［2］，对制定合理的临床用药方案，剂型设计及新药开发工作都具有重要的指导意义。当前，国内外对药物代谢的研究主要集中在代谢产物生成和确定代谢途径。在分子生物学技术推动下，药物代谢酶［3］领域的研究因其对临床药物间相互作用的研究有着积极的推动意义，已得到广泛的重视。 肝脏是药物代谢的重要器官，是机体进行生物转化的主要场所，富含参与药物代谢的一个庞大的依赖细胞色素P450的混合功能氧化酶系统［4］，大多数药物的Ⅰ相反应及Ⅱ相反应都依赖于肝脏酶系统而发生。以肝脏为基础的体外代谢模型以其特有的优势在药物代谢研究中得到广泛应用，现概述如下。 1 肝微粒体体外温孵法 肝微粒体法［5］是由制备的肝微粒体辅以氧化还原型辅酶［6］，在模拟生理温度及生理环境条件下进行生化反应的体系，制备肝微粒体一般用差速离心法。 肝微粒体体外温孵法和其它的体外肝代谢方法相比较，其酶制备技术简单，代谢过程快，结果重现性好，易大量操作，便于积累代谢样品供结构研究；同时，该方法可用于对药酶的抑制及体外代谢清除等方面的研究，因而在实际工作中应用较为普遍。但肝微粒体体外温孵法同其它体外肝代谢方法相比，在体内情况的一致性方面存在不足，因而其实验结果用于预测体内情况仍需进一步的确证。 2 肝细胞体外温孵法 肝细胞体外温孵法同肝微粒体法相似，即以制备的肝细胞辅以氧化还原型辅酶，在模拟生理温度及生理环境条件下进行生化反应的体系，适于研究蛋白及mRNA水平药物代谢酶诱导及酶活性，在评估药物代谢过程中药物间的相互作用时，该方法得到广泛的应用。但肝细胞制备技术较复杂，目前以胶原酶灌注技术为主［7］，且体外肝细胞活性仅能维持4h，不利于储存和反复使用。 3 离体肝灌流法
肝药酶(1)
各临床科室： 根据科室有关肝药酶诱导剂与抑制剂的咨询，现药剂科对此类药物做简单说明。 肝药酶是人体内一种重要的代谢酶，进入血液循环的药物基本上是经肝药酶代谢，所以对肝药酶有影响的药物，也会影响到药物的代谢。有些药物可使肝药酶的活性增强，有些药物则使其活性降低。 1 对肝药酶有诱导作用的药物 可使肝药酶活性增强或酶的合成速度加快的药物称之为药酶诱导剂。此类药物可使肝微粒体酶活性增强或酶的合成速度加快，药物的生物转化加快，活性药物的浓度迅速降低，常需增加剂量才能维持疗效。长期使用某种药物使机体产生耐受性，就可用药酶诱导来解释。如饮酒者，由于小量乙醇可诱导药酶活性增高，而使同服的甲苯磺丁脲的代谢加速；苯巴比妥被认为是药酶的强诱导剂，若与口服降糖药、保泰松、苯妥英钠、双香豆素、洋地黄、氢化可的松等合用，均可加速其代谢，半衰期缩短，药理作用减弱。药酶诱导作用不仅能解释连续用药后产生的耐受性，交叉耐受性，也是产生停药敏化、遗传差异和性别差异的原因之一。此外，药酶诱导剂还可利用其诱导作用来加速药物和毒物的代谢而解毒，如小剂量苯巴比妥可治疗地高辛中毒，也可治疗某些体质性黄疽及预防新生儿黄疽。 2对肝药酶有抑制作用的药物 能使肝药酶活性减弱的药物称肝药酶抑制剂，此类药物若与其他药物合用时，由于药酶受到抑制使得联用药物代谢减慢，血中药物浓度增高，可引起中毒反应。如氯霉素、对氨基水杨酸、异烟肼、保泰松等可强烈抑制肝药酶的活性，可使同用的苯妥英钠、巴比妥类、甲苯磺丁脲和双香豆素等在肝内的生物转化减慢、
药理作用和毒性增强。 目前已发现的具有酶诱导作用或酶抑制作用的药物约200余种，临床常用的酶诱导剂与酶抑制剂如下： 1具有药酶诱导作用的药物： 巴比妥类（苯巴比妥*、司可巴比妥、异戊巴比妥等）、水合氯醛、氨基比林、苯妥英钠，扑米酮，卡马西平*，保泰松，尼可刹米*，灰黄霉素，利福平*，螺内酯*、多西环素、格鲁特、氨鲁米特、甲丙氨酯、和乙醇等。 2具有药酶抑制作用的药物： 氯霉素、西咪替丁*、氟西汀、胺碘酮*、丙戊酸钠*、红霉素*、甲硝唑*、咪康唑、氟康唑*、维拉帕米*、地尔硫草*、奎尼丁、美托洛尔*、环丙沙星*、依诺沙星、酮康唑*、磺胺类药（磺胺异噁唑、磺胺嘧啶、磺胺甲噁唑、柳氮磺吡啶*、甲氧卞定等）、氯丙嗪*、丙米嗪、奋乃静、硫利达嗪、双香豆素、阿司匹林*、去甲替林、别嘌醇*、伯氨喹、甲苯磺丁腮、泼尼松*、氢化泼尼松*、乙醇等。 有些药物如乙醇和保泰松具有酶促和酶抑双向活性作用。少量乙醇在体内呈酶促作用，大量则呈酶抑作用。保泰松与一种药物联用呈酶抑作用，与另一种联用又呈酶促作用。有些酶促药物与酶抑药物对药酶的影响存在交叉情况，有时酶促药物可影响抑药物的代谢，有时酶抑药物又可以影响酶促药物的代谢。这种情况既可能与药的性质有关，也可能与药物进人人体的先后、使用时间的长短、用量大小有关。 上述内容供各科室参考学习，如有异议可与本科室共同讨论学习。 注：*表示本院住院药房有此药品。 部门：药剂科
体外药物肝代谢研究进展
体外药物肝代谢研究进展 （作者:___________单位: ___________邮编: ___________） 【摘要】目的：介绍药物体外肝代谢方法的最新进展. 方法：根据近几年的文献资料进行分析、综合、归纳. 分别按肝微粒体体外温孵法、肝细胞体外温孵法、肝匀浆体外孵育法进行介绍. 结果：体外肝代谢研究方法发展迅速. 结论：目前主要的药物体外肝代谢方法各有利弊，但对于新药开发来都是必不可少的研究手段. 【关键词】肝代谢;微粒体，肝;肝细胞;药代动力学 0 引言 肝脏是药物主要的和重要的代谢器官，是药物生物转化的主要场所，是富含参与药物代谢的一个庞大的依赖细胞色素P450的混合功能氧化酶系统，大多数药物的Ⅰ相和Ⅱ相代谢反应都是在肝药酶系统的参与下发生的，因此药物的体外代谢模型主要是以肝脏为基础的，并以其特有的优势和特点在药物代谢的研究中得到广泛的应用. 体外药物的肝代谢研究已经发展很长时间，与体内代谢研究相比，体外代谢研究有许多优点，①体外代谢研究可以排除体内诸多的干扰因
素，直接观察到代谢酶对底物的选择性代谢，为体内代谢研究提供重要的线索和依据. ②对于体内代谢转化率低且缺乏灵敏检测手段的药物来说，体外代谢不失为一种很好的研究手段. ③体外代谢研究具有快速简便的特点，适合大量化合物的药动学筛选. ④不需要消耗大量的样品和实验动物，因而研究费用相对较低［1］. 我们从体外肝代谢模型入手，综述了近年来药物体外肝代谢的文献. 1 肝微粒体体外温孵法 肝微粒体体外温孵实验是采用从肝脏中提取的肝微粒体，并加入还原型辅酶II(NADPH)再生系统，在体外模拟生理环境下进行代谢反应，采用高效液相色谱(HPLC)、高效液相色谱质谱联用法(HPLC MS)等测定方法对原型药及代谢产物进行测定的一种体外代谢的实验方法. 1.1 Ⅰ相代谢Ⅰ相代谢又称为官能团反应，包括氧化、还原、水解、水合等反应. NADPH为还原型酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸，是许多药物生物转化反应中不可缺少的辅助因子，它在这些反应中起到还原剂的作用，体系中只要NADPH浓度达到1 mmol/L时，便足以维持药物代谢反应进行，但NADPH价格较高，且不易长时间保存. 因此常采用NADPH再生系统来代替NADPH. 即利用相对稳定和廉价的辅酶II(NADP)与6磷酸葡萄糖在6磷酸葡萄糖脱氢酶的作用下生成NADPH. 6磷酸葡萄糖＋NADP 6磷酸葡萄糖脱氢酶
实验六.肝微粒体的制备及细胞色素P-450含量测定
院系：理学院专业：农药学学号：0931******* 姓名：王熠肝微粒体的制备及细胞色素P-450含量测定 1 实验目的 本实验通过超速离心法制备肝微粒体，利用Bradford法，学习并掌握了细胞色素P-450含量的测定。 2 实验原理 研究体外药物代谢常用的方法是制备肝微粒体或线粒体后部分，将肝组织制备成20％匀浆，按1g肝组织加0.25mol/L蔗糖溶液或pH7.4 Tris-HCl缓冲液3mL ，磨成匀浆，用低温高速离心制备线粒体后上清液和超速离心法制备微粒体（内质网部分）-差速离心法。 细胞色素P-450是微粒体混合功能氧化酶中最主要的功能成分，其含量的高低基本可以反映混合功能氧化酶的活力大小。细胞色素P-450是一种血红蛋白，当铁蛋白的铁离子被还原并与一氧化碳形成复合物时出现一种特异吸收峰，在波长450nm处呈现最大吸收峰，在490nm处为最低吸收。根据两者的差值和吸收系数，可定量细胞色素P-450含量。 3 实验材料 3.1实验动物 大鼠：健康，体重200～250g，禁食过夜（24h） 3.2实验器材与试剂 器材：低温高速离心机、洁净工作台、匀浆器、注射器、手术剪、低温冰箱、液氮罐等 试剂：1.17% KCl 溶液 Tris-HCl缓冲液： Tris 6.05 g ；蔗糖 68.4 g； 水 500 ml；浓盐酸调 pH 7.4；补水至 1000 ml 4.实验方法 4.1动物处理与匀浆制备 断头处死，放尽血液，迅速剖开胸、腹腔，取出肝脏，用冰冷1.17% KCl 溶液洗净血污，并用滤纸吸干表面水分。肝脏称重，置烧杯中剪碎，按每克肝脏3ml的比例加入0.25mol/L蔗糖溶液或pH7.4 Tris-HCl缓冲液，匀浆，将匀浆
代谢稳定性研究中肝微粒体与肝细胞的差异
代谢稳定性作为化合物重要的ADME性质，其影响着化合物在机体内的清除率、半衰期和口服生物利用度。由此，代谢稳定性研究常作为早 期化合物筛选的重要环节，其对于优势化合物的筛选、指导结构修饰、预测体内清除率、构建IVIVC和预估剂量等具有重要意义。目前常用 于代谢稳定性研究的高通量方法主要包括肝微粒体、肝细胞和肝S9，其中肝微粒体代谢稳定性（LMS）和肝细胞代谢稳定性（HMS）最为常见。而化合物在LMS和HMS中结果存在差异的现象时有发生，那么针 对这种情况，我们难免会产生一些疑问，导致差异存在的内在因素是 什么？找到差异的原因是否可以对化合物结构改造有利？选择哪个数 据作为评价化合物的标准值？该采用哪个数据去预测人体清除率？下 文将带着这些疑问进行阐述。 1 肝微粒体与肝细胞的差别 要想弄清楚化合物LMS和HMS的差异，首先我们必须要了解肝微粒体和肝细胞本身。肝脏组织匀浆后高速离心上清液即为S9，再经超高速离心后底部沉淀重悬即为微粒体，肝微粒体酶主要源于肝细胞内质网，包含CYP、水解酶和UGT。由肝微粒体的制备过程可知肝微粒体失去了细胞完整结构，药物可直接暴露于代谢酶中。另外肝细胞胞质中还存在部分肝微粒体缺失的代谢酶，如醛氧化酶（AO）、黄嘌呤氧化酶（XO）、谷胱甘肽-S-转移酶（GST）等，下表附有各类药物代谢酶在肝细胞中的定位。此外，由于肝细胞完整的细胞结构，其细胞膜表面表达有各类药物相关转运体蛋白，如OATP1B1、OATP1B3、
OATP2B1、BCRP、BSEP等摄入或外排转运体，下图附有肝细胞中转运体表达情况。 (摘至《Donglu Zhang,Sekhar Surapaneni - ADME-Enabling Technologies in Drug Design and Development》一书)
微粒体提取及酶促
微粒体提取及酶促挑取单克隆(菌斑)至10mLSD-His（2%Glucose）中，30℃，250rpm，48h至stationaryphase；取10mL，4000rpm离心5min，用10mlddH2O重悬菌体，4000rpm 离心5min；重复步骤3两次；加入50mL诱导表达培养基YPL（1%的yeastextract，2%的peptone，2%的galactose半乳糖），30℃，12-16h；4000g，离心5min，用5mLTE+KCl（0.1MKCl溶于TE）重悬细胞（1/10YPL体积），室温放置5min；离心收集细胞，用500uL冰浴的TESB（0.6M 山梨醇溶于TE）（1mLTESB/100mLYPL体积）重悬，转入15ml离心管；小心加入玻璃珠，使其刚好接触细胞悬浮液表面，4度用力摇打破碎细胞（离心管的体积至少是细胞悬浮液的4倍），直至细胞完全破碎（约半小时）；破碎好的细胞置于冰上，加入1mL的TESB，洗玻璃珠，回收上清，重复2-4次收集上清至新管。4度，12000rpm离心15min；取上清加入2倍体积(TESB+0.225MNaCl+0.15g/mlPEG4000)，冰浴15min；4度，12000rpm离心15min，弃上清；加入300-500uLTEG溶解沉淀；每500ug蛋白，加入50mMTris-HCl(pH7.4),1mMNADPH，5μMflavinadeninedinucleotide(FAD),5μMflavinmono-nucleotide(FMN),5mMglucose -6-phosphate,1unitglucose-6-phosphatedehydrogenase）,加底物至100μM，30℃反应至少1h；加入等体积乙酸乙酯混匀，12000rpm离心2min，取上层，氮气吹干，用50ul乙酸乙酯溶解，用于HPLC分析。
3种方法测定大鼠肝微粒体蛋白含量的比较
万方数据
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3种方法测定大鼠肝微粒体蛋白含量的比较 作者：简暾昱， 徐帆， 廖春龙， 徐贵丽， Jian Tunyu， Xu Fan， Liao Chunlong， Xu Guili 作者单位：简暾昱,Jian Tunyu(昆明医学院成都军区昆明总医院第一临床学院,昆明,650032)， 徐帆,徐贵丽,Xu Fan,Xu Guili(成都军区昆明总医院)， 廖春龙,Liao Chunlong(大理学院) 刊名： 中国药师 英文刊名：CHINA PHARMACIST 年，卷(期)：2011,14(3) 参考文献(5条) 1.金科涛;王宇光;徐彭HPLC测定大鼠肝微粒体P450活性方法学研究进展[期刊论文]-药物分析杂志 2006(03) 2.孙忠实;朱珠药物代谢性相互作用研究进展 2000(01) 3.李海玲;彭书明;李凛4种常用蛋白浓度测定方法的比较[期刊论文]-中国生化药物杂志 2008(04) 4.许家喜蛋白质的检测方法与乳制晶中蛋白含量测定[期刊论文]-大学化学 2009(01) 5.Cinti DL;Moldeua P;Schenkman JB Kinetic parametera of drug-metabolizing enzymes in Ca2+-sedimented microsomea from rat liver[外文期刊] 1972(24) 本文读者也读过(1条) 1.LI Hai-ling.彭书明.LI Lin.张雪梅.LI Hai-ling.PENG Shu-ming.LI Lin.ZHANG Xue-mei4种常用蛋白浓度测定方法的比较[期刊论文]-中国生化药物杂志2008,29(4) 本文链接：https://www.wendangku.net/doc/4f12757845.html,/Periodical_zgys201103012.aspx
药物代谢酶
药物代谢酶的分子遗传学* 蔡卫民张银娣1 (南京军区南京总医院临床药理科,南京210002) 中国图书分类号R345;R966;R968 文献标识码A文章编号100121978(1999)0620491206 摘要综述近10年来国内外有关药物代谢酶的分子遗传学进展,介绍药物代谢酶的基本概念并重点探讨了具有遗传多态性的两种氧化酶(细胞色素P450酶CYP2D6,CYP2C19)和一种结合酶(N2乙酰化转移酶)的个体和种族差异。最后主要讨论了表型分型和基因分型在药物代谢酶研究中的一些应用。 关键词药物代谢;分子遗传学;细胞色素P450;N2乙酰化 1998212223收稿,1999203212再修回 *国家人事部留学回国人员基金资助课题 1南京医科大学临床药理研究所,南京210029 作者简介:蔡卫民,男,40岁,博士生,副主任药师; 张银娣,女,62岁,教授,博士生导师,临床药理专业委员 会委员,药物代谢专业委员会委员转移酶;遗传多态性;表型分型;基因分型;人类 分子遗传学与药理学尤其是药物代谢研究有着密切的关系,药物代谢酶活性在不同种族、不同人群中的个体差异受遗传因素和环境因素共同影响。其中遗传因素影响表现在体内关键代谢酶的基因发生变化,导致其表达的蛋白质在结构、功能和活性上发生改变。本文就近10年来国内外分子遗传学在药物代谢酶研究的一些最新进展作一回顾。 1药物代谢与药物代谢酶 大多数药物为脂溶性的弱电解质化合物,进入体内后均需进行生物转化,生成极性较大的化合物而易于从肾脏和胆汁排泄。生物转化一般为灭活反应,使药物的作用和毒性减弱或消失;但也有些药物的代谢物仍有活性或活性更强;还有些药物本身并无活性,只有经过体内代谢后生成活性代谢物起作 Calcium2activated chloride channel on smooth muscle cell membrane WANG Ze2Jun,YU De2Jie,DENG Yan2Chun,BAO Guang2Hong (I nstitute of Basic Me dic a l Sciences Chine se Academy o f Medical Sciences Schoole of Basic Medicine Peking Union Medical Colle ge,Beijing100005) A BSTRACT Calcium2activated chloride channel ex2 isted on several kind of smooth muscle cells.The nec2 essary condition for activating calcium activated chlorede channel is intracellular calcium[Ca2+]i level rising.Both potassium channel and chloride channel are activated by several kind of activators induced cal2 cium releasing from calcium store.The threshold val2 ues for activating I Cl(Ca)are differente from animal categories and https://www.wendangku.net/doc/4f12757845.html,ing flourometric measure2 ment of[Ca2+]i of rat portacaval smooth muscle cells get that least[Ca2+]i value of activated I K(Ca)should be considered more than70~80nmol#L-1.This val2 ue is smaller than the least[Ca2+]i of180nmol#L-1 of I Cl(Ca),therefore considered that I K(Ca)is more sensitive than that of I Cl(Ca)for[Ca2+]i.I Cl(Ca)is ac2 tivated by[Ca2+]i rising resulting from extracellular calcium pass through the voltage dependent calcium channels.Because of IP3is activated by G protein coupling with some receptor,so that I Cl(Ca)is activat2 ed.According to analyse whole cell currents,the conductance of I Cl(Ca)should be considered smaller than10pS.The chloride equilibrium potential(ECl) of smooth muscle cells is more positive than resting membrane potential.The chloride outflow from chlo2 ride channels opening,which promote membrane po2 tential approaching to ECl,therefore membrane de2 polarizing.When the calcium activated cholride chan2 nels are opening the cell membrane depolarized,so that induced cells exciting.This channel plays an im2 portant role during smooth muscle cells exciting which induced by hormones and neuro2transmiters. KEY WORDS smooth muscle cell;calcium2activated chloride channel # 491 # 中国药理学通报Chines e P har macological Bulletin1999D ec;15(6):491~6
鼠伤寒沙门氏菌哺乳动物微粒体酶试验
鼠伤寒沙门氏菌/哺乳动物微粒体酶试验 1 主题内容与适用范围 本标准规定了Ames试验的基本技术要求。 本标准适用于检测环境有害物质的致突变作用。 2 原理 鼠伤寒沙门氏菌的突变型(即组氨酸缺陷型)菌株在无组氨酸的培养基上不能生长，在有组氨酸的培养基上可以正常生长。但如在无组氨酸的培养基中有致突变物存在时，则沙门氏菌突变型可回复突变为野生型(表现型)，因而在无组氨酸培养基上也能生长，故可根据菌落形成数量，检查受试物是否为致突变物。某些致突变物需要代谢活化后才能使沙门氏菌突变型产生回复突变，代谢活化系统可以用多氯联苯(PCB)诱导的大鼠肝匀浆(S－9)制备的S－9混合液。 3 仪器 3.1 实验室常用设备。 3.2 低温高速离心机，低温冰箱(－80℃)或液氮罐，洁净工作台，恒温培养箱，恒温水浴，蒸气压力锅，匀浆器等。 4 培养基制备及试剂的配制 培养基成分或试剂除说明外至少应是化学纯，无诱变性。避免重复高温处理，选择适当保存温度和期限，如肉汤保存于4℃不超过六个月，其他详见下述各培养基及溶液说明。 4.1 营养肉汤培养基 牛肉膏 2.5g 胰胨(或混合蛋白胨) 5.0g 氯化钠 2.5g 磷酸氢二钾(K2HPO4·3H2O)1.3g 蒸馏水500mL 加热溶解，调PH至7.4，分装后0.103MPa20min灭菌，普通冰箱保存备用，保存期不超过半年。 4.2 营养肉汤琼脂培养基：用作a.基因型鉴定的结晶紫敏感试验，抗氨节青霉素和四环素试验，紫外线敏感性试验。b.细菌活力鉴定。 琼脂粉 1.5g 营养肉汤培养基100mL 加热融化后调pH为7.4，0.103MPa 20 min灭菌。 4.3 底层培养基所需试剂及配制方法如下： 4.3.1 磷酸盐贮备液 磷酸氢钠铵(NaNH4HPO4·4H2O) 17.5g 柠檬酸(C6H8O7·H2O) 10.0g 磷酸氢二钾(K2HPO4) 50.0g 硫酸镁1)(MgSO4·7H2O) 1.0g 加蒸馏水至100mL，0.103MPa 20min灭菌。 注：1)待其他试剂完全溶解后再将硫酸镁缓慢放入其中继续溶解，否则易析出沉淀。 4.3.2 40%葡萄糖溶液 葡萄糖40.0g 加蒸馏水至100mL，0.055MPa 20min灭菌。 4.3.3 1.5%琼脂培养基 琼脂粉 6.0g 蒸馏水 400mL 融化后0.103MPa 20min灭菌。 4.3.4 底层培养基(无菌操作) 趁热(80℃)，在灭菌琼脂培养基中(400mL)依次加入：
药物代谢
药物代谢 一、概述 代谢是在酶参与之下的生物转化过程。药物的代谢产物通常比原形药物的极性增大，更适于肾脏排泄和胆汁排泄。多数药物代谢后其活性减弱或失去活性，但也有些药物经代谢转变成药理活性物质。例如百浪多息生物转化为磺胺、可待因转化为吗啡等。 二、药酶和药物代谢部位 （一）药酶与药物代谢酶系 参与药物体内代谢的酶统称为药酶。体内的药酶主要有微粒体药物代谢酶系与非微粒体药物代谢酶系。 1.微粒体药物代谢酶系微粒体是指肝组织匀浆、离心、除去细胞核和线粒体并再离心后沉淀下来的内质网囊泡碎片。哺乳动物肝微粒体中存在一类氧化反应类型极为广泛的氧化酶系，称为肝微粒体混合功能氧化酶系统或称单加氧酶。它是肝微粒体中最重要的一组氧化酶，不是一组特异性很强的酶系统，除肝脏之外还主要存在于肾脏、胃肠道、皮肤和肺等组织细胞的内质网的亲脂性膜上，催化氧化、还原和水解反应。 2.非微粒体药物代谢酶系非微粒体酶系又称Ⅱ型酶，除肝脏外也存在于血液及其他组织，主要催化葡萄糖醛酸化、硫酸化或乙酰化反应。非微粒体酶在肝脏和血浆、胎盘、肾、肠黏膜及其他组织中均有存在。通常，凡是结构类似于体内正常物质、脂溶性较小、水溶性较大的药物都由这组酶系代谢。 有些药物能影响肝药酶的活性，使药物代谢诱导或抑制。如苯巴比妥可诱导肝微粒体P450酶系，使口服降血糖药、糖皮质激素类、保泰松等代谢加速，作用减弱；肝药酶抑制药如异烟肼、氯霉素、西咪替丁等能减慢肝转化药物，使药效加强或延长。 （二）药物代谢的部位 1.肝脏肝脏是药物代谢的最主要器官。肝脏的代谢以氧化反应为主。药物代谢的第I相反应如氧化、还原、水解和第Ⅱ相反应中的葡萄糖醛酸结合与甲基化通常在微粒体中进行。脱氨基氧化、氨基酸结合等反应主要在线粒体中进行。 2.其他部位包括消化道、肺、皮肤、脑、肾脏、鼻黏膜等。 （三）首过效应 经胃肠道吸收的药物，在到达体循环前，首先经过门静脉进入肝脏，在首次通过肝脏的过程中，有相当大的一部分药物在肝组织被代谢或与肝组织结合，使进入体循环的原形药物量减少的现象，称为“首关效应”。有首关效应的药物生物利用度低。 三、药物代谢反应的类型 1.第一相反应是药物代谢过程的第一阶段，包括氧化反应、还原反应和水解反应。第1相反应通常是脂溶性药物通过反应生成极性基团，比如药物结构中增加了羟基、羧基、氨基、亚氨基、硫醇基等极性基团，分子的水溶性增大，利于排泄。 2.第二相反应第Ⅱ相反应包括葡萄糖醛酸结合、硫酸结合、谷胱甘肽结合、氨基酸结合、甲基化、乙酰化等。通常形成水溶性更大、极性更大、药理活性通常降低的化合物，更易于排出体外。 四、影响药物代谢的因素 1.给药途径“首关效应”是导致药物体内代谢差异的主要原因。 2.给药剂量和剂型 （1）剂量对代谢的影响：当体内药物量增加到一定程度，达到药物代谢酶的最大代谢能力时，代谢反应会出现饱和现象，不再随剂量增加而增加。此时可导致体内血药浓度异常升高，引起中毒反应。有些药物在治疗剂量范围内，就会产生代谢饱和现象。 （2）剂型对代谢的影响：剂型对代谢的影响主要针对一些会在胃肠道代谢的药物。 3.酶抑或酶促作用
肝药酶
一、肝药酶： 肝细胞的平滑内质网脂质中的微粒体酶是药物代谢最重要的酶系统，称为“肝药酶”，影响药物的药效。肝药酶是动物体内一种重要的代谢酶，进入血液循环的药物基本上是经肝药酶代谢的，所以对肝药酶有影响的药物，也会影响到药物的代谢。许多药物或其他化合物可以改变肝药酶的活性，能提高活性的药物称为“药酶诱导剂”，反之称为“药酶抑制剂”。 大多数药物在肝脏进行生物转化，因肝细胞内存在有微粒体混合功能酶系统，而该系统能促进多种药物发生转化，故称肝药酶。少数药物的生物转化是靠非微粒体酶的催化，如线粒体中的单胺氧化酶（MAO），血浆中的胆碱酯酶（ACHE）等。 1、肝药酶抑制剂： 其中使肝药酶活性增强的药物称肝药酶诱导剂；使肝药酶活性减弱的药物称肝药酶抑制剂。许多药物能对肝微粒体中酶产生抑制作用，从而使其他药物代谢减慢，导致药理活性及毒副作用增加。 常见的肝药酶抑制剂有：氯丙嗪、西咪替丁、环丙沙星、甲硝唑、氯霉素、异烟肼、磺胺药。 氯丙嗪 西米替丁与茶碱、咖啡因、氨茶碱、华法林钠、地西泮、苯妥英钠、等同用时上述药物减量
甲哨唑与华法林钠、等药同用时上述药物减量 氯霉素与苯妥英钠、甲苯磺丁脲、香豆素类、等同用时上述药物减量 异烟肼与苯妥英钠等同用时上述药物减量 2、肝药酶诱导剂： 是指有些药物长期使用后能加速肝药酶的合成并增强其活性，这类药物就称为肝药酶诱导剂。酶诱导的结果是促进代谢，通常可降低大多数药物的药理作用，包括诱导剂本身和一些同时应用的药物。其中它的自身诱导作用使其用量越来越大而成为这些药物产生耐受性的原因。 常见的肝药酶诱导剂 巴比妥类（苯巴比妥为最）、卡马西平、乙醇（嗜酒慢性中毒者）、氨鲁米特、灰黄霉素、氨甲丙酯、苯妥英、格鲁米特、利福平、地塞米松、磺吡酮（某些情况下起酶抑作用）等。 （学习的目的是增长知识，提高能力，相信一分耕耘一分收获，努力就一定可以获得应有的回报）
药物在肝脏内的代谢
药物在肝脏内的代谢 药物在肝脏内的代谢 一、药物在肝内的生物转化 肝脏在药物(或外源性毒物)的代谢与处置中起着十分重要的作用,大多数药物与毒物在肝内经生物转化作用而排出体外。肝脏的病理状态可以影响药物在体内的代谢过程,从而影响药物的疗效与不良反应。另一方面,药物的代谢过程中的产物,可以造成肝损害。药物在肝内所进行的生物转化过程,可分为两个阶段:①氧化、还原与水解反应;②结合作用。 (一)第一相反应 多数药物的第一相反应在肝细胞的光面内质网(微粒体)处进行。此系由一组药酶(又称混合功能氧化酶系)所催化的各种类型的氧化作用,使非极性脂溶性化合物产生带氧的极性基因(如羟基),从而增加其水溶性。有时羟化后形成的不稳定产物还可进一步分解,脱去原来的烷基或氨基等。其反应可概括如下: D+A→DA NADPH+DA+H+→DAH2+NADP- DAH2+O2+HADPH→A+DOH+H2O+NADP- (注:D=药物;A=细胞色素P450) 药酶就是光面内质网上的一组混合功能氧化酶系,其中最重要的就是细胞色素P450,其她有关的酶与辅酶包括:NADPH细胞色素P450还原酶、细胞色素b5、磷脂酰胆碱与NADPH等。细胞色素P450(以下简称P450)就是一种铁卟啉蛋白,能进行氧化与还原。当外源性化学物质进入肝细胞后,即在光面内质网上与氧化型P450结合,形成一种复合物,再在NADPH细胞色素P450还原酶作用下,被NADPH所提供的电子还原,并形成还原型复合物。后者与分子氧(O2)作用,产生含氧复合物,并接受NADPH所提供的电子,与O2形成H2O,同时药物(或毒物)被氧化成为氧化产物。 细胞色素P450:药物代谢的第一相反应,主要在肝细胞的光面内质网(微粒体)进行,此过程系由一组混合功能氧化酶系(又称药酶)所催化促进,其中最重要的就是P450与有关的辅酶类。P450酶系包括二个重要的蛋白质组分:含铁的血红素蛋白与黄素蛋白,后者能从NADPH将电子转移至P450底物复合体。药物与P450结合位点与血红素分子非常接近,有利于电子的转移。药物与氧化型P450结合,此时血红素的铁为三价铁(Fe3+),通过NADPH还原酶的作用,将NADPH的电子转移给P450,使其还原,血红素铁成二价(Fe2+)。还原型的P450药物复合物与氧分子作用,成为含氧复合物,并接受NADPH所提供的电子,与氧生成H2O,同时药物也被氧化,P450又成为氧化型(Fe3+)。如此反复循环,使药物进行第一相的代谢。 P450实际上为同一家庭的多种异构型。迄今为止,人类P450的基因已发现有27种,编码多种P450。基本上分成至少4个基因族,又可进一步区分为不同亚族。其分类为CYP1,CYP2,CYP3与CYP4,亚族的分类按英语A、B、C……与阿拉伯数字1,2,3,……进一步分类。按其功能,人类的P450可分成二类。CYP1,2,3,主要代谢外源性化合物,如药物、毒物等,有交叉的底物特异性,常可被外源性物质诱导,在进化过程中,其保守性差。GYP4则主要代谢内源性物质,有高度特异性,通常不能被外源性物质诱导,在进行过程中相对保守。此类P450在类固醇、脂肪酸与前列腺素代谢中起作用。在药物代谢中起重要作用的P450。 表39-1具有代表性药物代谢CYP1,CYP2与CYP3亚家族 P450亚族代谢的底物(药物) CYP1A2 氧阿米替林,咖啡因,氟哌啶醇,茶碱,她克林,西咪替丁 CYP2B6 环磷酰胺 CYP2C 卡马西平,环磷酰胺,地西泮,布洛芬,奈普生,奥美拉唑,苯妥英,普奈洛尔,甲苯磺西脲 CYP2D6 异喹胍,大多数β受体拮抗剂,氧阿米替林,氯丙嗪,可待因,右美沙芬,恩卡尼,氟哌啶醇,去甲替林,维拉帕米 CYP2E 对乙酰氨基酚,乙醇,氟烷 CYP3A 胺碘酮,卡马西平,西沙必利,可卡因,皮质醇,环孢素,氨苯砜,地塞米松,地尔硫草,红霉素,丙米嗪,利多卡因,洛伐她汀,硝苯地平,孕酮,她克莫司,她莫昔芬,睾丸酮,丙戊酸盐,维拉帕米,长春新碱,华法令 一般说来,药物经过第一相的氧化、还原等作用,变为极性与水溶性较高而活性低的代谢物,再经过第二相的结合作用,通过胆汁或尿液排到体外。但有些药物,在P450药酶作用下,转化为对肝细胞肝毒性的代谢物。 (二)第二相反应
肝微粒体的提取及其含量测定
人肝微粒体的提取及其含量测定 第一部分：人肝微粒体的提取 一、仪器及试剂： 仪器：内切式匀浆机，高速离心机，超速离心机，表面皿数个，冰袋数个，碎冰，装碎冰烧杯，匀浆用玻璃管，不锈钢剪刀 试剂：含0.15M KCl的100mM磷酸钾缓冲液（PH＝7.4）,100mM磷酸钾缓冲液 材料：8号人肝（称取重量29.95g） 二、实验流程： 组织（记录死亡时间、储运条件） 37度水浴解冻 含0.15 M KCl 的100 mM磷酸钾缓冲液（pH 7.4）漂洗，除去表面血迹及组织液（缓冲液事先已置于冰箱中冷藏） 将组织置于下垫冰块的表面皿中，用剪刀手动剪碎 内切式均浆机匀浆（过程中注意将组织置于冰块包围住，保持低温环境） 9000 ×g离心20 min，取上清，即得S9 超速离心机105,000 ×g 超速离心60 min 取沉淀（过程中防止上清表面的油膜粘附到沉淀表面，应用吸管将油膜慢慢吸出，而不能倾倒） 重悬于100 mM磷酸钾缓冲液（pH 7.4）中（重悬过程中应注意不要产生气泡） 105,000 ×g 超速离心60 min 取沉淀，用100mM磷酸钾缓冲液（pH7.4）重悬得微粒体（此次重悬时应使用尽量少的缓冲盐体积，以防止微粒体浓度被过于稀释，重悬过程同样注意油膜与气泡） 磷酸盐缓冲液中，分装塑料小管中，-80°C贮存
三、实验结果： 一共称取8号人肝组织29.95g，提取出肝微粒体23mL，经蛋白含量测定，微粒体二次重悬液蛋白含量以牛血清白蛋白计为37.4mg/mL，加入100mM磷酸盐缓冲液（pH=7.4）稀释至86mL，得10mg/mL的微粒体储备液，分装保存于-80度待用。 第二部分微粒体中蛋白含量测定 一、仪器和材料： 0.1 N NaOH(2g NaOH溶于500mL水), 1%酒石酸钾（1.342g四水合酒石酸钾溶于100mL 水），2 %无水碳酸钠（溶剂为0.1 N NaOH），0.5 %硫酸酮（溶剂为1%酒石酸钾），甲液（2 %无水碳酸钠50 ml，加0.5 %硫酸酮1 ml，混匀，临用时现配），牛血清蛋白标准液500 μg / ml(溶剂为0.1 N NaOH) Folin酚(福林试剂)试剂：1份Folin酚原液用蒸馏水稀释3倍得工作液，Folin酚试剂原液配制方法如下： 1000mL磨口回流装置内,加入 钨酸钠(Na2WO4·2H2O) 50 g 钼酸钠(Na2MoO4·2H2O) 12.5 g 蒸馏水350 mL 85%磷酸25 mL 浓盐酸50 mL 文火回流10h。取去冷凝器,加入 硫酸锂(Li2SO4) 25 g 蒸馏水50 mL 混匀,加入几滴液体溴,再煮沸15min,以驱逐残溴及除去颜色,溶液应呈黄色而非绿 色。若溶液仍有绿色,需要再加几滴溴液,再煮沸除去之。 冷却后,定容至500mL, 混合均匀过滤。试剂呈金黄色贮于棕色试剂瓶内。 二、实验方法： 1、测定原理： 利用Folin酚试剂与蛋白质的酪氨酸与色氨酸残基反应在680nm处产生吸收 2、实验过程： 1）样品测定：
药物代谢酶的分子遗传学
药物代谢酶的分子遗传学3 蔡卫民 张银娣1 (南京军区南京总医院临床药理科,南京 210002) 中国图书分类号 R345;R966;R968 文献标识码A 文章编号100121978(1999)0620491206 摘要 综述近10年来国内外有关药物代谢酶的分子遗传学进展,介绍药物代谢酶的基本概念并重点探讨了具有遗传多态性的两种氧化酶(细胞色素P450酶CYP2D6,CYP2C19)和一种结合酶(N2乙酰化转移酶)的个体和种族差异。最后主要讨论了表型分型和基因分型在药物代谢酶研究中的一些应用。 关键词 药物代谢;分子遗传学;细胞色素P450;N2乙酰化1998212223收稿,1999203212再修回 3国家人事部留学回国人员基金资助课题 1南京医科大学临床药理研究所,南京 210029 作者简介:蔡卫民,男,40岁,博士生,副主任药师; 张银娣,女,62岁,教授,博士生导师,临床药理专业委员 会委员,药物代谢专业委员会委员转移酶;遗传多态性;表型分型;基因分型;人类 分子遗传学与药理学尤其是药物代谢研究有着密切的关系,药物代谢酶活性在不同种族、不同人群中的个体差异受遗传因素和环境因素共同影响。其中遗传因素影响表现在体内关键代谢酶的基因发生变化,导致其表达的蛋白质在结构、功能和活性上发生改变。本文就近10年来国内外分子遗传学在药物代谢酶研究的一些最新进展作一回顾。 1 药物代谢与药物代谢酶 大多数药物为脂溶性的弱电解质化合物,进入体内后均需进行生物转化,生成极性较大的化合物而易于从肾脏和胆汁排泄。生物转化一般为灭活反应,使药物的作用和毒性减弱或消失;但也有些药物的代谢物仍有活性或活性更强;还有些药物本身并无活性,只有经过体内代谢后生成活性代谢物起作 C alcium2activated chloride channel on smooth muscle cell membrane WAN G Ze2J un,YU De2Jie,DEN G Yan2Chun,BAO Guang2Hong (Instit ute of B asic Medical Sciences Chi nese A cadem y of Medical Sciences Schoole of B asic Medici ne Peki ng U nion Medical College,Beiji ng 100005) ABSTRACT Calcium2activated chloride channel ex2 isted on several kind of smooth muscle cells.The nec2 essary condition for activating calcium activated chlorede channel is intracellular calcium[Ca2+]i level rising.Both potassium channel and chloride channel are activated by several kind of activators induced cal2 cium releasing from calcium store.The threshold val2 ues for activating I Cl(Ca)are differente from animal categories and https://www.wendangku.net/doc/4f12757845.html,ing flourometric measure2 ment of[Ca2+]i of rat portacaval smooth muscle cells get that least[Ca2+]i value of activated I K(Ca)should be considered more than70～80nmol?L-1.This val2 ue is smaller than the least[Ca2+]i of180nmol?L-1 of I Cl(Ca),therefore considered that I K(Ca)is more sensitive than that of I Cl(Ca)for[Ca2+]i.I Cl(Ca)is ac2 tivated by[Ca2+]i rising resulting from extracellular calcium pass through the voltage dependent calcium channels.Because of IP3is activated by G protein coupling with some receptor,so that I Cl(Ca)is activat2 ed.According to analyse whole cell currents,the conductance of I Cl(Ca)should be considered smaller than10pS.The chloride equilibrium potential(ECl) of smooth muscle cells is more positive than resting membrane potential.The chloride outflow from chlo2 ride channels opening,which promote membrane po2 tential approaching to ECl,therefore membrane de2 polarizing.When the calcium activated cholride chan2 nels are opening the cell membrane depolarized,so that induced cells exciting.This channel plays an im2 portant role during smooth muscle cells exciting which induced by hormones and neuro2transmiters. KEY WORDS smooth muscle cell;calcium2activated chloride channel ? 1 9 4 ? 中国药理学通报 Chinese Pharm acological B ulletin 1999Dec;15(6):491～6