包涵体蛋白复性技术研究进展

网络出版时间：2012-04-05 15:13

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包涵体蛋白复性技术研究进展

包义风综述； 应莲芳，蒋琳 审校

（兰州生物制品研究所有限责任公司，兰州730046）

摘要：本文对原核表达的包涵体蛋白的分离，洗涤，溶解及复性方法做了一个简单的总结。同时就国内外

近几年的最新复性方法进行了概述。并分析了各种复性方法的利弊。

关键词：包涵体；溶解；复性；添加剂

中图分类号：R392-33 文献标志码：A 文章编号：1005-5673(2012)

Research Progress in Renaturation of Inclusion Body Protein

BAO Yi-Feng*, YING Lian-Fang , JIANG Lin

*Lanzhou Institute of Biological Products Co., Ltd.，Lanzhou 730046, China

Abstract：The isolation,washing,solubilization,and refolding of the inclusion bodies expressed from E.coli cells

has been introduced in this review .At the same time ,we evaluated some of the new refolding methods at home

and abroad , especially on their .advantages and disadvantages.

Key words：Inclusion bodies ; Solubilization; Refolding; Additives

目前，以基因工程药物为主导的基因工程应用产业已成为全球发展最快的产业之一，具有非常广阔的发展前景。大肠杆菌因其易于操作、遗传背景清楚、生产成本低和表达水平高而被广泛应用

于重组蛋白的表达。然而大肠杆菌中高表达的蛋白常形成无生物活性的包涵体，由于其在溶解过程

中高级结构遭到破坏而失去生物活性，因此有必要对其进行复性。迄今为止，还没有普遍适用于所

有重组蛋白质的复性方案，包涵体蛋白质的复性已成为制约重组蛋白质生产的关键因素之一。通常，

将包涵体蛋白复性变为活性蛋白需要做如下三步处理：第一，收获并洗涤包涵体；第二，溶解包涵

体，得到变性蛋白；第三，复性，逐步去除变性剂，使蛋白恢复正确折叠。前两步收率相对较高，

第三步收率较低，不正确的折叠蛋白构型是主要的限制因素。

迄今为止，还没有发现通用的蛋白复性方法，包涵体蛋白的复性已成为重组蛋白生产面临的最大困难。通过对包涵体复性及蛋白折叠机制的深入研究，近年来已有多种蛋白质复性成功的先例[1]，

本文将近十年来，包涵体蛋白复性的进展作一综述。

1 包涵体收获，洗涤和溶解

包涵体是在某些生长条件下、致密聚集在大肠杆菌胞内水不溶性的颗粒结构，大小为0.1～5 μm。

一般含有50%以上的重组蛋白，其余为核糖体元件、RNA聚合酶、外膜蛋白ompC、ompF和ompA

等，环状或缺口的质粒DNA，以及脂多糖等，只溶于变性剂如尿素、盐酸胍等。包涵体形成的原因

有很多，

有时甚至是多种因素的协同作用。主要原因是重组蛋白在表达过程中缺乏某种辅助因子或环境不适，无法形成正确的次级键。表达量过高超过蛋白折叠的速度、二硫键的错误配对、蛋白质序列本身都

收稿日期：2011-12-18;修回日期：2012-02-14

作者简介：包义风（1986- ），女，硕士研究生，主要从事基因工程疫苗的研究工作。

通信作者： 应连芳，E-mail:yinglf 1965@si na.c o m

可能导致包涵体的形成。

从基因工程菌中收获包涵体，需要通过高压匀浆，超声波，酶溶等方法来破碎菌体，再离心除去可溶性蛋白获得粗制包涵体，这种粗制包涵体含有大量的杂质，如脂类、核酸、脂多糖等。因此，在包涵体溶解之前必须使这些杂质降至最低水平，可以用含有蔗糖、TritonX-100、脱氧胆酸或低浓度尿素缓冲液洗涤包涵体,具体情况因蛋白不同而异。

由于包涵体不溶于水，要恢复其天然构象，首先应使其溶解，这就需要相当强的变性环境，如6～8 mol/L 盐酸胍，7～9 mol/L尿素等。另外，去垢剂SDS，Triton X-100，Sarkosyl（月桂酰-N-甲基氨基乙酸钠）等破坏蛋白的疏水键，可用来辅助溶解包涵体。使用盐酸胍优于尿素，因为盐酸胍是较比尿素强的变性剂，尤其在碱性条件下。极端pH值和高温破坏蛋白的次级键，而使蛋白溶解。然而，即便是变性剂浓度很高，包涵体分子间和分子内的相互作用仍有发生[1]，常常会导致非活性的结构模式，如非活性的链间、链内二硫键的错配，甚至是聚集沉淀。为了避免形成无活性的二硫键干扰后续蛋白复性，加入适当的巯基化合物，如还原性谷胱甘肽、2-巯基乙醇、二硫苏糖醇（DTT）等对蛋白活性的获得非常有效。上述物质的添加浓度一般为1～50 mmol/L[2]。有时，溶解包涵体的缓冲液中还可添加EDTA来螯合金属离子，以防止金属催化的空气对半胱氨酸的氧化作用。

2 传统的包涵体复性方法

经洗涤和溶解的包涵体是不具备生物活性的变性蛋白，通常需要复性。复性原理是通过缓慢去除变性剂使目标蛋白从完全伸展的变性状态恢复到正确的折叠结构[3]，去除还原剂效应，使二硫键正确配对形成正确的空间构象，而产生生物活性。一般尿素浓度在4 mol/L左右时复性过程开始，到2 mol/L 左右时结束。盐酸胍可从4 mol/L开始，到1.5 mol/L 时复性过程结束[4]。一般认为，蛋白质在复性过程中涉及两种分子间的相互作用力，一是分子间疏水作用，这种力使得蛋白正确折叠，另一种是部分折叠的肽链分子间的疏水相互作用，这种力使得蛋白聚集沉淀。所以复性效率的高低，就取决于这两种力作用强度[5]。

2.1 稀释复性

稀释复性是最简单，实用的复性方法，直接加入水或者复性缓冲液，放置一定时间即可。稀释复性又分直接稀释、分段稀释和连续稀释三种方式[6]。直接稀释变性剂稀释太快，不易控制；分段稀释相对较常用，但耗时长；连续稀释需要摸索滴加变性蛋白的时间间隔，稀释时要不断摇动复性缓冲液，由此而产生的剪切力和液面压力容易造成蛋白的聚集沉淀。稀释复性成功的关键因素较多，包括确定复性初始的蛋白浓度、复性缓冲液、pH、添加小分子、温度、复性时间间隔、加样方式等。尽管稀释复性存在缺陷，但这种复性方式的使用率却是最高。目前有许多蛋白用快速稀释成功实现了体外重折叠[7]，如奥地利学者Schlegl等[8]通过一个连续搅拌槽反应器（Continious stirred tank reactor, CSTR）实现了α-乳清蛋白的复性。这一系统由CSTR和一个外联的超滤循环通路组成，在保证连续复性的同时去除变性剂。结果显示，复性效率比批量稀释高。复性蛋白的产量还可以进一步通过出口液体循环进入反应器来提高。

2.2 透析复性

透析复性是将变性溶解的包涵体蛋白溶液置于透析袋内，缓慢连续的降低变性剂的浓度而实现

蛋白复性。透析时可以一次性将外透液的变性剂浓度降至最低，也可以分步透析，逐渐的降低外透液的变性剂浓度。一般来说，分步透析复性效率高于一次透析。该方法操作简单，蛋白溶液体积不变，但也有其局限性，如耗时长，处理体积小，无法应用到规模化生产。

2.3 超滤复性

超滤复性是选择合适截留分子量的膜，使得变性剂能够通过膜孔而目的蛋白不能通过，通过相同的速度补加复性缓冲液来实现蛋白浓度的恒定和液体转换。该方法对变性剂的去除速度和复性液的流加速度都是可控的，因此有利于实现复性控制，生产中使用较多。但是它的缺点是无法操作少量样品，且有些蛋白在超滤过程中会不可逆的变性。

3 新型包涵体复性方法

3.1 色谱复性

色谱技术作为分离纯化蛋白质的手段已经发展的比较成熟，但将其利用于蛋白质复性过程是近几年才发展起来的一项技术。该方法实现复性的基本原理是变性蛋白可逆的吸附于填料上，当缓冲液中变性剂浓度逐渐降低时，利用变性蛋白在填料上的反复分配作用使其逐渐恢复至天然构象[9]。在色谱复性中，固相介质作为一种特殊的分子伴侣来辅助蛋白复性，以此减少蛋白错误折叠和聚合。能够用于蛋白质复性的色谱包括疏水作用色谱（HIC）、离子交换色谱（IEC）、凝胶排阻色谱（SEC）、亲和色谱（AC）、膨胀床吸附复性（EBA)等。

与传统的复性方法比较，其优点是[10, 11]①上样后可以很快除去变性剂；②以提供给变性蛋白一个适宜的、组成连续变化的、可供选择的折叠环境，并不断修正含有错误三维结构的折叠中间体；

③以完全消除变性蛋白质分子脱离变性剂环境后的分子聚集，避免了沉淀的产生，提高蛋白复性的质量和活性回收率；④蛋白复性的同时可使目的蛋白得到一定程度的纯化。

利用色谱方法复性成功的例子不胜枚举，此处不再赘述。

3.2 高压复性

尽管已有数种有助于提高包涵体复性效率的复性策略处于开发中，但是采用高静水压从聚集物中复性蛋白质是唯一的一种复性机制不同于传统方法的新技术，1999年首次报道了蛋白质高压复性[12]在热力学上由伴随蛋白质展开而出现的系统体积（蛋白质体积+周围水溶液体积）减小所驱动。破坏蛋白质内部的离子和疏水结构可以降低系统体积。因复性时空体积和蛋白质内部接触的破坏所带来的综合体积下降较小，所以复性时需要高压[13]。高压复性不像传统化学复性那样依赖于蛋白浓度，蛋白可以在高于20 mg/mL的浓度下从聚集物中分离而不降低产率。另外高压复性不需要化学添加剂，也是其显著的优势。巴西学者Malavasi等[14]用高静水压复性的方法实现了重组绿色荧光蛋白（eGFP）的复性。具有生物活性的绿色荧光蛋白（eGFP）在（0.35～0.69）Kpa压力范围，可在无变性剂的条件下获得活性蛋白产率较高。

3.3 反胶束复性

表面活性剂溶于非极性的有机溶剂中，当其浓度超过临界胶束浓度时，在有机溶剂内形成的胶

束为反胶束。反胶束中，表面活性剂的极性基团排列成一个极性核，可以溶解亲水性物质，如核酸、蛋白等。因此反胶束可作为变性蛋白复性的媒介，利用相转移（液-液，固-液）技术，同时实现蛋白的分离和复性。反胶束复性可以实现高浓度的蛋白复性，但因其无法应用于低分子量蛋白的复性而受到限制[15]。目前，丁二酸二异辛酯磺酸钠（Sodium di-n-octyl sulfosuccinate, AOT）反胶束系统被广泛的应用于蛋白复性中，Goto等[16]利用此系统，成功的实现了核糖核酸酶A (RNase A)的高浓度（4.8 mg/mL）复性。

3.4 沸石吸附复性

日本学者Chiku等[17]报道发现了一种新型的蛋白复性方法，即利用一种无机催化剂β—沸石可以吸附溶解于变性剂中的包涵体蛋白的特性，将变性剂与溶解的包涵体蛋白分开，再用盐和聚乙二醇将蛋白从沸石上洗脱下来，由此方法获得的蛋白具有生物活性。他们用此方法检验了11种不同的包涵体蛋白，结果表明这些蛋白在此方法处理下均可成功复性。该法为规模化的复性提供了可能，但其回收率较低，仍需要不断改进。

3.5 多壁碳纳米管复性

多壁碳纳米管(Multi-walled carbon nanotubes)曾被成功的运用于木聚糖酶(Xylanase)的复性过程[18]。碳纳米管具有疏水表面,可结合、复性、纯化并自发的固定酶。市售的普通疏水介质存在高浓度的疏水配基,容易与折叠的蛋白或部分折叠的蛋白发生强作用,从而改变整个复性过程的自由能,并导致错误的折叠形式,甚至蛋白的变性.多壁碳纳米管因避开了这个缺点,而引起学者们的重视。印度学者Shah等,将其作为复性辅助剂，从8 mol/L尿素的变性蛋白中获得复性的活性蛋白,活力可达92%。3.6 三相分离 (Three phase partitioning) 复性法

三相分离是通过控制硫酸铵和正丁醇加入到蛋白水溶液中的量,最终使蛋白沉淀于水相和有机相中间,形成肉眼可见的三相,从而使蛋白的复性、浓缩、纯化一步完成。印度学者 Roy等[19]通过调整硫酸铵的浓度、水相与有机相的比例和温度等,最终获得了高的分辨率。试验中,最好的结果是纤维素酶以94%活力,74倍浓缩获得,纤维素二糖酶以98%活力,65倍获得,B-葡糖苷酶以90%活力,101倍浓缩获得。

4 复性过程中的添加剂

如果天然蛋白质在选择的复性缓冲液中不能溶解，则复性不会发生。在决定使用何种能够促进溶解的复性缓冲液后，还需要了解可改善天然蛋白质的稳定性和溶解性的缓冲液配方。文献中多处报道可提高蛋白复性效率的化学小分子添加剂，目前还没有发现哪一种添加剂能够普遍提高蛋白的复性效率。复性添加剂种类繁多，包括各种去污剂、氨基酸、氨基酸衍生物、变性剂、有机溶剂、离子液体及多聚物等。近年来，人工合成的添加剂也被提上日程[20]。日本学者Yamamoto等[21]在研究溶菌酶的复性过程中发现，去污剂和有机溶剂共同存在对于复性过程具有协同增强作用。研究中单独添加CTAB(去污剂)复性效率为13%，而后添加DMSO(有机溶剂)可显著的提高复性效率至35%，这一数值高于单独使用这两种添加剂可增加的复性效率和值，这一研究对于复性过程添加剂的加入有一定的指导意义。下面将文献中经常报道的复性过程添加剂做一个粗略汇总（见表1）。

表1可能增强复性过程的添加剂

Tab. 1The additives may enhance general refolding process

添加剂类型 参考文献

精氨酸 [22, 23]

尿素 [23]

盐酸胍 [24]

聚乙二醇 [25]

非去污剂硫代甜菜碱 [26]

糖类

蔗糖 [27]

甘油 [27]

Cu2+促进了氧化胱甘肽和RKCGC

和设计最

参考文献

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改性沥青的研究进展

改性沥青的研究进展 黄　彬,马丽萍,许文娟 (昆明理工大学环境科学与工程学院,昆明650093) 摘要 为了得到性能更优良的改性沥青,越来越多的材料被用作改性沥青改性剂,同时新的评价标准和方法及其他领域的新化学分析方法也被用来更完整准确地评价改性沥青的性能。总结了国内外改性沥青的研究现状及进展,从改性机理、性能影响因素及评价方法等方面来介绍各种改性沥青的概况,并概述了改性沥青的发展方向。 关键词 改性沥青　改性剂　机理　发展Rsearch Development of Modif ied Asphalt HUAN G Bin ,MA Liping ,XU Wenjuan (Faculty of Environmental Science and Engineering ,Kunming University of Science and Technology ,Kunming 650093) Abstract More materials ,as modifier ,are used to improve the properties of modified asphalt.Besides ,the new evaluation standards and methods ,new chemical analysis methods are used to evaluate the properties more com 2pletely and accurately.The situation and development of modified asphalt research at home and abroad are summa 2rized.From the aspcts of modification mechanism ,influencing factors and evaluation methods ,various modified as 2phalts are introduced ,and the development trend of modified asphalt technology is illustrated in the paper. K ey w ords modified asphalt ,modifier ,mechanism ,development 　黄彬:女,1986年生,硕士研究生,主要研究方向为固体废物资源化　E 2mail :binbin_huang @https://www.wendangku.net/doc/561879223.html, 马丽萍:女,1966年生,教 授,主要研究方向为工业废气污染控制、固废综合开发利用　E 2mail :lipingma22@https://www.wendangku.net/doc/561879223.html, 0　前言 普通道路沥青由于自身的组成和结构决定了其感温性能差,弹性和抗老化性能差,高温易流淌,低温易脆裂。而且在过去的10年中,车轴负荷增加、车流量增加、气候条件恶劣,难以满足高级公路的使用要求,必须对其改性以改善使用性能。在沥青或沥青混合料中加入天然或合成的有机或无机材料,熔融或分散在沥青中与沥青发生反应或裹覆在沥青集料表面,可以改善或提高沥青路面性能。 1　改性沥青的分类 在沥青的改性材料中,高分子聚合物是应用最广泛、研究最集中的一种。其他改性材料还有两大类:矿物质填料和添加剂。矿物质填料,如硅藻土、石灰、水泥、炭黑、硫磺、木质素、石棉和炭棉等,对沥青进行物理改性,可提高沥青抗磨耗性、内聚力和耐候性。添加剂,包括抗氧化剂和抗剥落剂,如有机酸皂、胺型或酚型抗氧化剂或阴、阳离子型或非离子型表面活性剂,可提高沥青粘附性、耐老化或抗氧化能力。聚合物改性沥青(PMA 、PMB ),按照改性剂的不同一般可分为3类:①热塑性橡胶类,即热塑性弹性体,主要是嵌段共聚物,如SBS 、SIS 、SE/BS ,是目前世界上最为普遍使用的道路沥青改性剂,并以SBS 最多;②橡胶类,如NR 、SBR 、CR 、BR 、IR 、EP 2DM 、IIR 、SIR 及SR 等,以胶乳形式使用,其中SBR 应用最为广泛;③树脂类,如EVA 、PE 、PVC 、PP 及PS 。 2　各种改性沥青及其发展现状 通过SCI 和EI 分别检索近15年来改性沥青在交通、建筑、材料、能源及环境等学科方面研究的文献情况,检索结果如图1、图2及表1、表2所示。根据表1、表2数据和图1、图2情况可以看出,近几年国内外对改性沥青的研究越来越多,尤其以SBS 和胶粉最为突出,出现了多种新型改性剂。下面 将分别介绍各种改性沥青及其发展现状。 图1　SCI 检索统计表 Fig.1　SCI search results 2.1　矿物质材料改性沥青 矿物质材料作改性剂的研究较少,主要为硅藻土、纳米 碳酸钙、矿渣粉、白炭黑等,可与基质沥青形成均匀、稳定的 共混体系以改善沥青性能[1] 。

包涵体表达的蛋白的复性-生物谷

包涵体表达的蛋白的复性 摘要综述了包涵体形成、包涵体分离和溶解、包涵体折叠复性的方法、复性产率低下的主要因素以及通过分子伴侣、低分子量添加物等的应用而提高了蛋白质复性产率。 关键词包涵体蛋白质复性 Abstract Strategies for decreasing the formation of inclusion bodies, isolation and resolution of inclusion bodies, refolding of inclusion body proteins and the cause of decreased refolding yields were included. Renaturation yield of recombinant protein have been improved by using some additives, such as molecular chaperone, small molecules. Key words inclusion body , protein , renaturation 外源基因在大肠杆菌中的高表达常常导致包涵体的形成，虽然包涵体具有富集目标蛋白质、抗蛋白酶、对宿主毒性小等优点，但包涵体蛋白质的复性率一般都很低,而分子伴侣、低分子量添加物等在复性过程中的应用及新的复性方法的建立都大大提高了重组蛋白质复性产率。 一、包涵体： 1.1包涵体的定义、组成与特性： 包涵体是指细菌表达的蛋白在细胞内凝集，形成无活性的固体颗粒。一般含有50%以上的重组蛋白，其余为核糖体元件、RNA聚合酶、内毒素、外膜蛋白ompC、ompF和ompA等，环状或缺口的质粒DNA，以及脂体、脂多糖等，大小为0.5-1um，具有很高的密度（约1.3mg/ml），无定形，呈非水溶性，只溶于变性剂如尿素、盐酸胍等。NMR等新技术的应用表明包涵体具有一定量的二级结构，他们可能在复性的启动阶段中具有一定的作用。[1] 1.2包涵体的形成： 主要因为在重组蛋白的表达过程中缺乏某些蛋白质折叠的辅助因子，或环境不适，无法形成正确的次级键等原因形成的。 1.2.1、基因工程菌的表达产率过高，超过了细菌正常的代谢水平，由于细菌的δ因子的蛋白水解能力达到饱和，使之表达产物积累起来。研究发现在低表达时很少形成包涵体，表达量越高越容易形成包涵体。原因可能是合成速度太快，以至于没有足够的时间进行折叠，二硫键不能正确的配对，过多的蛋白间的非特异性结合，蛋白质无法达到足够的溶解度等。 1.2.2、重组蛋白的氨基酸组成：一般说含硫氨基酸越多越易形成包涵体，而脯氨酸的含量明显与包涵体的形成呈正相关。 1.2.3、重组蛋白所处的环境：发酵温度高或胞内pH接近蛋白的等电点时容易形成包涵体。 1.2.4、重组蛋白是大肠杆菌的异源蛋白，由于缺乏真核生物中翻译后修饰所需酶类和辅助因子，如折叠酶和分子伴侣等，致使中间体大量积累，容易形成包涵体沉淀。 1.2.5、蛋白质在合成之后，于中性pH或接近中性pH的环境下，其本身固有的溶解度对于包涵体的形成比较关键，即是说，有的表达产率很高，如Aspartase和Cyanase,表达产率达菌体蛋白的30%,也不形成包涵体，而以可溶形式出现。[2] 1.2.6、在细菌分泌的某个阶段，蛋白质分子间的离子键、疏水键或共价键等化学作用导致了包涵体的形成。 1.3包涵体破菌、分离、洗涤及溶解 1.3.1基因工程菌发酵液，经离心浓缩后，可用：机械破碎、超声破碎：单纯超声破碎，在小规模下且菌量较少的情况下效果较好，由于能量传递和局部产热等原因，很难用于大体积细胞悬液的破碎，这样部分未破碎细胞与包涵体混在一起，给后期纯化带来困难。因此，在较大规模纯化时先用溶菌酶破碎细菌的细胞膜，再结合超声破碎方法，可显著提高包涵体的纯度和回收率。以及化学方法破碎使细菌裂解,

包涵体的纯化和复性总结

板块一、大肠杆菌 （这里讨论的大肠杆菌为非分泌到培养基中的重组蛋白，是否有重组蛋白分泌到培养基中的工程菌我没有见过。） 一、关于菌体的量 大肠杆菌表达的基因工程蛋白是纯化人员最方便获得的原料，对纯化工艺开发来说几乎没有原料方面的限制。常看到有战友用个几毫升的菌液去做纯化，对此我十分不解，同样要做，为什么不多做点呢？很少的菌体会给纯化带来一些难以估计的问题，工艺的重复性和放大往往出现问题。因此，要做个好工艺就多发酵表达一些菌体吧。我做纯化时，初始工艺摸索用的菌体量一般为10g左右。 二、关于是否包涵体表达 包涵体的定义我就不讲了。我要讲的是，一个基因工程蛋白是否是包涵体表达的说法本身就不完全准确。至于包涵体在电镜下的晶体颗粒表现等等对我们纯化来说毫无意义，我相信做纯化工艺的人没有谁去看这个电镜，也不关心。我们判断的依据只是SDS-PAGE，目的蛋白在破菌沉淀中，我们就认为是包涵体表达，但这是一个似是而非的结论。看着没问题，实际上是有毛病的。关键在于你用的是什么破菌缓冲液！有些蛋白在用缓冲液A破菌时是在破菌沉淀中，而用缓冲液B破菌时却在破菌上清中。缓冲液A和B的差别可能只是pH上相差1-2个单位。那么它是包涵体表达还是可溶上清表达呢？ 说这个问题主要在于有些战友往往非常在意他的目标蛋白是否包涵体表达。

甚至还有包涵体表达就用专门的包涵体蛋白纯化方法等等。 我们应该关心的是目标蛋白在什么缓冲体系下是可溶的，在什么缓冲体系下是不溶的！不要让包涵体这个概念给你误导。 三、关于表达量 我们常常在发表的文章上看到，我这个工程菌的目标蛋白的表达量达到菌体总蛋白的30%、50%等等。我要说都是文章的作者在忽悠。不知道他们是如何定量的，用的最多的大概就是SDS-PAGE的扫描分析吧。且不说一个SDS-PAGE不能表现出所有的菌体蛋白，电泳的染色方法、染色脱色强度、照片的曝光强度、扫描分析时的条带选择等等无不对这个百分比影响巨大。在公司的QC部门做的对此应该最有体验，20%的条带要它变成30%又有何难？我的观点是对待表达量的描述不可定量，只能定性。如用：很低、较低、中等、较高、很高等来描述。 有一个指标与表达量密切相关，那就是单位体积的菌体量。两者的乘积才是单位体积发酵液的目标蛋白产率。 与表达量相关的指标还有纯化倍数、纯化收率等，这些指标我们也常常在发表的文章中看到。同样，我也认为都是不准确的。除非你用的是活性测定的方法，用蛋白活性收率来表征。 纯化工艺的难易有时候也与表达量相关，表达量高时往往纯化也方便的多。所以，尽量提高你的目标蛋白表达量不只是基因工程上游和产量的问题，还是纯化工艺开发的问题。 四、菌体破碎

改性沥青现状及发展前景

改性沥青现状及发展前景 1、改性沥青应用现状 普通道路石油沥青，由于原油成分及炼制：工艺等原因，其含蜡量较高，导致其具有温度敏感性强，与石料的粘附性差，低温延度小等缺点。用其铺筑的沥青路面，夏季较软，易出现明显车辙壅包等病害；冬季较脆，易出现低温开裂等病害；混合料的抗疲劳性能，抗老化性能较差。同时，由于经济的快速发展，普通沥肯混合料已不能满足高等级道路和特殊地点的重交通，大轴载，快速安全运输的需要。 1．1 改性沥青的应用背景和现状 据相关资料，20世纪60年代以前，沥青路面仅用于城市道路和专用公路，沥青材料主要是煤沥青和用进口原油提炼的石油沥青。20世纪70年代前后，在全国范围内曾采用渣油吹氧稠化，掺配特立尼达(TLA)或阿尔巴尼亚稠沥青等改性的方法，提高结合料稠度，配制成200号沥青铺筑以表面处治为主的沥青面层。1985年国内开展 了沥青中掺丁苯，氯丁橡胶，废轮胎粉等改性沥青和掺金属皂等改善混合料性能的研究试验工作，取得了成功的经验。1992年NovophaltPE现场改性技术的引入，对改性沥青的推广应用起到了促进作用，使改性沥青从研究试验逐步发展到生产应用。 1．2影响改性沥青应用的因素 生产施工工艺在聚合物改性沥青的大规模应用中起到了关

键性的作用。无论是聚合物改性，物理改性还是采用不同的沥青加工工艺都会增加较大的工程成本，在国内经济不发达地区的应用会受到一定的制约。 2、改性沥青的研究现状 目前国内的研究重点在新的改性剂和沥青改性剂的加工工艺上还有一部分研究是面向工程应用的，即研究在沥青集料改性剂确定的情况下，找出合适的级配，最佳沥青用量和改性剂用量以满足实际工程的要求。我国研究改性沥青已有多年的历史，也取得了丰富的成果，但至今仍有两个问题没有很好地解决： (1)没有形成对改性沥青和改性性能统一的评价标准； (2)国内没有形成统一的研究体系。 改性沥青的研究是一项长期的复杂的系统工作，要想取得突破性成果必须综合各研究机构的优势，形成统一的研究体系，比如美国l987年～l992年的大型系统工程SHRP计划等等。而相对于国内，研究工作往往由各高等院校，科研院所独立完成，没有统一的研究规划，配套工作滞后。另外由于各部门的利益关系，沥青改性的关键技术往往是秘而不宣的，在一定程度上造成人财物的巨大浪费。 3、改性沥青的应用前景 由于普通沥青已不能适应现代化路面的要求，性能良好的改性沥青必将在高等级路面中起到越来越重要的作用 3．1 SBS改性沥青将获得更广泛的应用 研究表明，SBS改性的优越性突出表现在具有双向改性作用，

包涵体的纯化和复性总结--最全的前人经验

包涵体的纯化和复性总结 二、包涵体的洗涤? 1、包涵体的洗涤问题? 通常的洗涤方法一般是洗不干净的，我以前是这么做的，先把包涵体用6M盐酸胍溶解充分，过滤除去未溶解的物质，注意留样跑电泳，然后用水稀释到4M,离心把沉淀和上清分别跑电泳，如此类推可以一直稀释到合适的浓度，你可以找到一个合适去除杂质的办法，其实这就是梯度沉淀的方法，我觉得比通常的直接洗脱效果好。? 包涵体一般难溶解，所以你要注意未溶解的部分，你可以跑电泳对比，因为有时候难溶解的就是你的目标蛋白，所以每次处理都要把上清和沉淀跑电泳对比，免得把目标蛋白弄丢了。 此外刚处理完的包涵体好溶解。冷冻后难溶解，溶解也需要长点时间，也需要大量的溶剂。如果说是不少不溶解的不是你要的，那就不用管了。? 2、如何得到比较纯的包涵体? 对于包涵体的纯化，包涵体的前处理是很重要的。 包涵体中主要含有重组蛋白,但也含有一些细菌成分,如一些外膜蛋白、质粒ＤＮＡ和其它杂质。洗涤常用1%以下的中性去垢剂，如Tween、Triton、Lubel和?NP40等加EDTA 和还原剂2-巯基苏糖醇（DTT）、β-巯基乙醇等反复多次进行，因去垢剂洗涤能力随溶液离子强度升高而加强，在洗涤包涵体时可加50?mM?NaCL。这样提取的包涵体纯度至少可达50%以上，而且可保持元结构。也可用低浓度的盐酸胍或尿素/中性去垢剂/EDTA/还原剂等洗去包涵体表面吸附的大部分不溶性杂蛋白。洗涤液pH以与工程菌生理条件相近为宜，使用的还原剂为0.1-5mM。EDTA为0.1-0.3?mM。去垢剂如Triton?X-100、脱氧胆酸盐和低浓度的变性剂如尿素充分洗涤去除杂质,这一步很重要,因为大肠杆菌外膜蛋白Omp?T(37?KDa)在4-8mol/L尿素中具有蛋白水解酶活性,在包涵体的溶解和复性过程中可导致重组蛋白质的降解。? 对于尿素和盐酸胍的选择： 尿素和盐酸胍属中强度变性剂，易经透析和超滤除去。它们对包涵体氢键有较强的可逆性变性作用，所需浓度尿素8-10M，盐酸胍6-8M。尿素溶解包涵体较盐酸胍慢而弱，溶解度为70-90%，尿素在作用时间较长或温度较高时会裂解形成氰酸盐，对重组蛋白质的氨基进行共价修饰，但用尿素溶解具有不电离，呈中性，成本低，蛋白质复性后除去不会造成大量蛋白质沉淀以及溶解的包涵体可选用多种色谱法纯化等优点，故目前已被广泛采用。 盐酸胍溶解能力达95%以上，且溶解作用快而不造成重组蛋白质的共价修饰。但它也有成本高、在酸性条件下易产生沉淀、复性后除去可能造成大量蛋白质沉淀和对蛋白质离子交换色谱有干扰等缺点。? 包涵体最后的纯化，一般是离子交换，疏水，或者是亲和层析，亲和层析尤其是金属螯合层析用得比较广泛，而纯化的效果也不错，通常是一步就能达到纯度为95%以上的包涵体。? 8M高浓度尿素溶解后离心获得的包涵体溶解液，放在4度冰箱过夜后出现沉淀，这种现象我也在实验中遇到过;开始感觉很奇怪，后来发现是我们的冰箱的温控出了问题实

SBS改性沥青的性能与应用

SBS改性沥青的性能与应用 摘要：我国高速公路建设自改革开放以来，经历了从无到有，从起步到建设成高速公路网的翻天覆地变化。与此同时，传统的普通沥青已经很难适应现代对公路的高标准要求，而改性沥青的研制与应用则较好地解决了这一问题。本文主要通过介绍SBS改性沥青在高温、低温条件下的抗车辙、抗裂性能，与水稳定性，抗滑能力等内容，比较得出其对于传统沥青在工程、经济、社会各方面的优越性，探究了加强对SBS改性沥青的学习，开展对SBS改性沥青深入的研究与推广其广泛应用的长远意义。 关键词：SBS改性沥青；改性沥青性能；改性沥青应用；沥青施工；工程效益；应用前景 1 前言 随着交通流量的增长、车载质量的增加以及高温和低温的作用，为适应道路路面的使用性能的要求，保证路面良好的使用状态，延长路面的使用寿命，就必须探寻更高性能的路面材料。SBS改性沥青混凝土具有很好的高温抗车辙能力，低温抗裂能力，改善了沥青的水稳定性，提高了路面的抗滑能力，增强了路面的承载能力，提高了沥青的抗氧化能力，是比较优良的路面材料。自上世纪40年代以来，国内外学者对各类改性沥青的性能进行了大量的研究工作，改性沥青技术得到了越来越多的重视。现有研究结果表明，与其他改性沥青相比，SBS(苯乙烯一丁二烯一苯乙烯)改性沥青的综合性能[1]更为突出，SBS改性沥青必将在未来很长的一段时间内得到更深入的研究和更广泛的应用。 2 SBS改性沥青简介 SBS属于苯乙烯类热塑性弹性体，是苯乙烯—丁二烯—苯乙烯三嵌段共聚物，SBS改性沥青是以基质沥青为原料，加入一定比例的SBS改性剂，通过剪切、搅拌等方法使SBS均匀地分散于沥青中，同时，加入一定比例的专属稳定剂，形成SBS共混材料，利用SBS良好的物理性能对沥青做改性处理。在良好的设计配合比和施工条件下，用SBS改性沥青铺筑的沥青混凝土路面有着传统沥青路面无法比拟的优越性能，具有很好的耐高温、抗低温能力以及较好的抗车辙能力和抗疲劳能力，并极大地改善沥青的水稳定性，提高了路面的抗滑性能。

包涵体复性注意事项和常见问题解析

活性蛋白整体方案包涵体复性注意事项和常见问题解析 包涵体复性注意事项 1)最适pH值范围为8.0-9.0之间； 2)温度适宜选择4℃； 3)复性过程蛋白浓度不宜过大，一般为0.1-0.2mg/mL； 4)复性时间一般为24-36小时； 5)低分子化合物如L-Arg有助于增加复性中间产物的溶解度；脲、盐酸胍、烷基脲、以及碳酸酰胺类等，在 非变性浓度下是很有效的促进剂，都可阻止蛋白聚集；Tris对蛋白质复性有促进作用；EDTA可以防止蛋白降解； 6)首先要获得较高纯度的包涵体； 7)包涵体溶解要彻底，一般应使溶解液体量较大，不要怕蛋白被稀释，要有助溶措施； 8)透析前后均要离心； 9)包含体要彻底洗涤干净，洗涤液中加入适量Triton-X100； 10)包含体溶解后装入透析袋在复性液中复性； 11)复性完毕在低浓度的缓冲液中连续缓慢透析12-24h； 12)复性率的测定时要据变性蛋白和非变性蛋白的光学性质不同测定 13)TritionX100、SDS这一类去垢剂最后不易去除，在制药行业中一般不允许采用。用Triton洗涤有些包涵体 效果不是很好。包涵体洗涤是纯化极为重要的一步，改变培养条件，再洗涤包涵体，有时可以在上柱前已经只剩下3-4条杂带，这样后续的纯化就很方便了。 14)复性时的蛋白浓度一般为0.1-1mg/ml，太高的浓度容易形成聚体沉淀，太低的浓度不经济，而且很多蛋白 在低浓度时不稳定，很容易变性。 包涵体复性常见问题分析 包涵体复性原则 低浓度，平缓梯度，低温。n(O5~0q8D; 怎样洗涤包涵体？ 通常的洗涤方法一般是洗不干净的，可以先把包涵体用6M盐酸胍溶解充分，过滤除去未溶解的物质，注意留样跑电泳，然后用水稀释到4M,离心把沉淀和上清分别跑电泳，如此类推可以一直稀释到合适的浓度，可以找到一个合适去除杂质的办法，其实这就是梯度沉淀的方法，比通常的直接洗脱效果好。 对于尿素和盐酸胍该怎么选择 尿素和盐酸胍属中强度变性剂，易经透析和超滤除去。它们对包涵体氢键有较强的可逆性变性作用，所需浓度

纤维改性沥青混合料研究进展

龙源期刊网 https://www.wendangku.net/doc/561879223.html, 纤维改性沥青混合料研究进展 作者：刘哲 来源：《中国科技纵横》2015年第24期 【摘要】通过对纤维改性沥青混合料研究历史及现状的调研，总结了纤维改性沥青混合 料的主要影响因素以及纤维改性沥青混合料的作用机理；阐述了纤维种类、长度、添加量以及界面粘结对沥青混合料性能的影响情况，不同因素的变化会影响沥青混合料的不同性能；总结了纤维在沥青混合料中的吸附、稳定、桥接以及加筋作用。 【关键词】纤维改性沥青混合料作用机理 1 概述 纤维作为一种新型的增强材料，被广泛的用作复合材料增强体，应用于航空航天、电子机械等尖端领域[1-3]，由于纤维具有高模量、高强度、高长径比以及较强的吸附能力，在道路沥青及沥青混合料中也多有应用。多年来，国内外对纤维改善沥青及其混合料性能进行了大量研究，并根据实际需求，开发出了一系列适用于道路沥青改性的路用纤维，主要包括木质素纤维、矿物纤维、聚合物纤维以及新兴的玄武岩纤维等。本文主要针对道路纤维在沥青混合料中的应用进行调研，分析了纤维对混合料性能影响的主要作用机理及影响因素，对其未来发展进行了展望。 2纤维改性沥青混合料的主要影响因素 2.1 纤维种类及性能 按处理方式划分，纤维可分为天然纤维和化学合成纤维，不同种类的纤维具有不同的性能，包括强度、模量、吸持沥青量、长径比以及表面形貌等等，而这些因素都会对沥青混合料性能产生影响。李智慧[4]等考察了聚丙烯腈纤维、聚酯纤维以及木质素纤维等三类不同的增 强体对沥青混合料性能的影响，同时分析了三类纤维的常规技术性能，建立了纤维性能与外掺纤维沥青混合料路用性能之间的关系。结果表明，掺加聚丙烯腈纤维和聚酯纤维的沥青混合料性能相当，而木质素纤维混合料性能稍差；纤维的种类还影响着其对沥青混合料的主要作用机理。对外掺纤维沥青混合料路用性能影响程度最大的纤维性质因素是抗拉强度与极限拉伸应变，其次是熔融温度，吸持沥青量也有一定程度影响，纤维直径影响最小，在纤维形状特征因素中纤维长度的影响程度大于纤维直径与长径比。T.Serkan[5]采用聚酯纤维对石油沥青进行改性处理，石油沥青混合料的马歇尔稳定度增加而流值降低，同时抗车辙及抗疲劳性能增加，表明聚酯纤维有效提高了石油沥青混合料的路用性能；F.M.Nejad等[6]使用碳纤维增强沥青混凝土，结果显示，碳纤维的加入有效提升了沥青混凝土的强度和抗老化性能。此外，有不少学者采用不同种类的纤维对沥青混合料进行混杂改性，取得了良好的效果[7-8]。

包涵体蛋白的纯化和复性

包涵体蛋白的纯化和复性 1．菌体的收集和破碎 用50 ml离心管分别收集诱导表达后的培养物，8000 rpm 4℃离心10 min。沉淀用适量的超声破菌缓冲液重悬。 【备注】超声破菌缓冲液（20 mmol/L Tris-HCl pH8.0、0.5 mol/L NaCl、1 mmol/L EDTA、1 mg/mL溶菌酶） 重悬后的菌液于冰浴中进行超声波破碎，其条件为：功率为300W，占空比50%，每个循环30 s，总时间20 min。破碎后的匀浆，4℃、12000 rpm离心15 min。分别取上清液和沉淀进行12% SDS-PAGE分析，确定目的蛋白是否以包涵体的形式表达。 2．包涵体的处理 洗涤：沉淀用适量的包涵体洗涤缓冲液重悬后，搅拌洗涤20~30 min，于4℃，12000 rpm离心15 min，弃去上清液。重复一次。再用适量的50 mmol/L Tris pH8.0溶液洗涤一遍（以去除残留的EDTA），于4℃12000 rpm离心15 min，弃去上清液。 【备注】包涵体洗涤缓冲液（20 mmol/L Tris－HCl pH 8.0，0.5 mol/L NaCl，2 mol/L尿素，2％Triton） 2％Triton X-100溶液：量取2mlTriton X-100(聚乙二醇辛基苯基醚)液，加M缓冲液98ml 即可。 溶解：沉淀用适量的包涵体溶解缓冲液重悬，室温搅拌5-6小时或过夜。12000 rpm 4℃离心15 min，收集上清液。 【备注】包涵体溶解缓冲液（20 mmol/L Tris－HCl pH 8.0，0.5 mol/L NaCl，8 mol/L尿素，0.2 mmol/L DTT或100 mmol/L β-巯基乙醇，2％Triton）

重组蛋白包含体的复性

重组蛋白包含体的复性 [摘要]：重组蛋白在大肠杆菌中的高表达往往导致形成包含体。不可溶、无生物活性的包含体必须经过体外变复性才可得到生物活性蛋白。变复性实验是建立在蛋白质体外折叠机制的基础上的。近年来，随着对蛋白质折叠机制的认识，发展了不少促进蛋白折叠和二硫键氧化来提高活性蛋白产率的复性办法。 [关键词]：蛋白折叠、包含体、复性、二硫键形成 Abstract：Expression of recombinant proteins in Escherichia coli often results in the formation of insoluble inclusion bodies. Active protein can be recovered by solubilization of inclusion bodies followed by renaturation of the solubilized protein. The process of renaturation is established in the understanding to the mechanism of protein folding in vitro. In recent years, With the understanding of mechanisms of protein folding, many renaturation methods were developed, which can increase the yield of active proteins. Key word: protein folding、inclusion body 、renaturation 、the forming of disulfide bond 大肠杆菌表达系统以其操作简便，遗传背景清楚，大规模发酵成本低成为目前最常用的外源蛋白表达系统。它为许多具有药用和工业应用价值的真核生物蛋白质的获得提供了方便。但是，重组蛋白的高表达往往导致形成不溶的、没有生物活性的包含体（如人生长激素、人胰岛素和尿激酶）。 包含体的形成意味可溶性重组蛋白质的重大损失，必须经过体外变复性才能得到生物活性蛋白。如果能解决包含体的复性问题，它将是大量生产重组蛋白的最有效的途径之一。近年来对蛋白质折叠过程的深入研究使重组蛋白的体外复性取得了一系列的新进展。文章中，我们在蛋白质折叠机制的基础上，简述了重组蛋白体外复性的研究进展。 1. 蛋白质的体内折叠 细胞内的新生肽链的折叠是分阶段的，从相邻氨基酸的相互作用开始，多肽链的出现引起二级结构的形成，最后形成三级结构。Baldwin综述了蛋白质折叠起始的三种可能因素：疏水作用，二级结构及某些特殊作用力(如二硫键)[1]。实验证明，细胞内二硫键的形成速度要明显快于细胞外，而且在翻译结束之前二硫键也能够形成[2]。 近年来的一些研究表明，很多真核蛋白质的折叠和装配受到其他蛋白或酶的严格调控。在真核细胞中，蛋白可能与分子伴侣（chaperon）或折叠酶（foldase）共表达且表达量很低；也可能进行翻译后修饰分泌出去。现在已知的参与新生肽链折叠的蛋白有两类：一类是催化蛋白特定异构化的酶，限制蛋白质折叠的速度，如催化正确二硫键形成的二硫键异构酶（PDI蛋白）[3]、催化脯氨酸异构反应的脯氨酸顺反异构酶（PPI）[4]等，它们称为折叠酶，另一类辅助蛋白能与多肽链短暂暴露疏水区结合，从而防止不正确的聚集作用和错误的装配，称为分子伴侣。 重组蛋白在大肠杆菌中的折叠环境迥异于它们的天然环境－－真核细胞。蛋白酶、氧化还原电位、PH和蛋白浓度等性质都不同[5]，而且，原核细胞不具备糖基化的功能，也没有

SBS改性沥青机理研究进展

S BS改性沥青机理研究进展 李双瑞,林　青,董声雄 (福州大学化学化工学院,福州　350002) 摘要:介绍了沥青的特性、苯乙烯2丁二烯2苯乙烯三嵌段共聚物(S BS)的性能,分析了S BS与基质沥青之间 的溶胀性和相容性问题,着重论述了S BS改性沥青机理的研究进展,指出机理主要分为物理共混和化学改性两 类:物理共混———S BS微粒受到沥青组分中油分的作用发生溶胀而均匀分散在沥青中,S BS与沥青之间没有发 生化学作用,只是一种分子间作用力;化学改性———加入添加剂使沥青和S BS之间发生加成、交联或接枝等化 学反应,形成较强的共价键或离子键,改善沥青的化学性质。提出化学改性是提高S BS改性沥青路用性能的重 要手段。 关键词:苯乙烯-丁二烯-苯乙烯嵌段共聚物;S BS改性沥青;改性机理 采用聚合物对道路沥青进行改性是提高和改善沥青混合料路用性能的一种重要措施[1～6]。近年来,在聚合物改性材料中,苯乙烯2丁二烯2苯乙烯三嵌段共聚物(S BS)以其优异的性能,成为世界上使用最为广泛的沥青改性剂[7～12]。对S BS改性沥青路用性能的研究[13～17]表明:采用S BS对沥青改性后,改性沥青的低温柔性和高温性能明显提高,温度敏感性大大降低。关于S BS改性沥青的机理,国内外科技人员进行了大量的研究,但并没有形成统一的理论。本文根据国内外相关文献,介绍了沥青和S BS的性能以及S BS在沥青中的溶胀性和相容性问题,着重论述了S BS改性沥青机理的研究进展。 1　沥青的特性 沥青是由多种化学成分极其复杂的烃类所组成。这些烃类为一些带有不同长短侧链的高度缩合的环烷烃和芳香烃,以及这些烃类的非金属元素衍生物[18]。按生产来源划分,沥青主要可分为地沥青(包括天然沥青与石油沥青)、焦油沥青、煤沥青、页岩沥青等。道路中各国目前生产和最常用的是石油沥青。石油沥青是原油加工的重质产品[19]。石油沥青的组分极为复杂,通常用溶剂将沥青通过色层分析法分成饱和分、芳香分、胶质和沥青质四个组分[18]。Hubbard2Stanfield法将沥青划分为油分、树脂和沥青质3个组分[19]。 油分是石油沥青中最轻的馏分,含量在45%～60%。油分是石油沥青可以流动的主要原因,其含量越多,软化点越低,粘度越小,使沥青具有柔软性和抗裂性。树脂的含量在15%～30%。树脂的存在使石油沥青有一定的可塑性、可流动性和粘结性,直接决定着石油沥青的延伸度和粘结力。沥青质是固体无定形物质,含量在5%～30%。沥青质是高分子化合物,它是石油沥青中分子量最高的组分,决定着石油沥青的塑性状态界限、自固态变为液态的程度、粘滞性、温度稳定性、硬度和软化点。此外,石油沥青中还含有一定数量的沥青酸、沥青酸酐、碳化物和似碳物。 沥青的主要结构为胶体结构,即以沥青质为核,表面层被树脂浸润包裹,而树脂又溶于油分中,形成沥青胶团,无数胶团彼此通过油质结合成胶体结构。当沥青中沥青质含量适当,并有较多的树脂作为保护物质时,它所组成的胶团之间有一定的吸引力,这种结构称之为溶胶-凝胶结构。大多数优质的路用沥青都属于这种胶体结构,具有粘弹性和触变性。当沥青质含量较高时,胶粒相互缠结,粘度大、塑性小、 基金项目:中法先进科技合作项目(PRAMX02208); 作者简介:李双瑞(1977-),女,河南南阳人,博士研究生,从事沥青材料改性的研究; 联系人,E2mail:sxdong2004@https://www.wendangku.net/doc/561879223.html,.

蛋白质、包涵体复性

目录 一、脲和盐酸胍在包涵体蛋白质纯化中的作用 二、包涵体变复性 三、包涵体洗涤纯化——7~10 四、包涵体提出、纯化和复性

一、

二、包涵体变复性 包涵体是指细菌表达的蛋白在细胞内凝集，形成无活性的固体颗粒。一般含有50%以上的重组蛋白，其余为核糖体元件、RNA聚合酶、内毒素、外膜蛋白ompC、ompF和ompA等，环状或缺口的质粒DNA，以及脂体、脂多糖等。 基本信息 中文名称 包涵体变复性 复性方法 稀释复性 原因 基因工程菌的表达产率过高 包涵体变性 破菌洗涤溶解 目录 1包涵体 2包涵体变性 3包涵体复性 包涵体是指细菌表达的蛋白在细胞内凝集，形成无活性的固体颗粒。一般含有50%以上的重组蛋白，其余为核糖体元件、RNA聚合酶、内毒素、外膜蛋白ompC、ompF和ompA等，环状或缺口的质粒DNA，以及脂体、脂多糖等，大小为0.5-1μm，具有很高的密度(约1.3mg/mL)，无定形，呈非水溶性，只溶于变性剂如尿素、盐酸胍等。NMR等新技术的应用表明包涵体具有一定量的二级结构，他们可能在复性的启动阶段中具有一定的作用。 包涵体的形成原因 主要因为在重组蛋白的表达过程中缺乏某些蛋白质折叠的辅助因子，或环境不适，无法形成正确的次级键等原因形成的。 1.基因工程菌的表达产率过高，超过了细菌正常的代谢水平，由于细菌的δ因子的蛋白水解能力达到饱和，使之表达产物积累起来。研究发现在低表达时很少形成包涵体，表达量越高越容易形成包涵体。原因可能是合成速度太快，以至于没有足够的时间进行折叠，二硫键不能正确的配对，过多的蛋白间的非特异性结合，蛋白质无法达到足够的溶解度等。 2.重组蛋白的氨基酸组成:一般说含硫氨基酸越多越易形成包涵体，而脯氨酸的含量明显与包涵体的形成呈正相关。 3.重组蛋白所处的环境:发酵温度高或胞内pH接近蛋白的等电点时容易形成包涵体。 4.重组蛋白是大肠杆菌的异源蛋白，由于缺乏真核生物中翻译后修饰所需酶类和辅助因子，如折叠酶和分子伴侣等，致使中间体大量积累，容易形成包涵体沉淀。

包涵体复性(课堂参照)

我用透析法复性蛋白,但出现了好多沉淀,后面我要用Ni柱来纯化,我现在不知道复性后怎么 处理?把沉淀弃掉吗?谁来帮帮我吧! 我用透析法复性蛋白,但出现了好多沉淀,后面我要用Ni柱来纯化,我现在不知道复性后怎么 处理?把沉淀弃掉吗?谁来帮帮我吧! 首先，可以再多加一点透析液看看能否将之溶掉，这样可以减少由于免疫共沉淀的原因而与杂质一起沉淀的蛋白。 再次如果你的蛋白已经复性，并且能很好的溶解的话，那么沉淀要么是杂质，要么是不能复性的蛋白，我认为可以离心去除。 出现絮状沉淀是很正常的现象，因为透析本身就是一个复性的过程，那些出现絮状的沉淀就是一些不能够复性成为天然结构的一些目的蛋白和一些杂蛋白，而这些都是我们所不需要的。所以说出现絮状沉淀是正常的也是我们希望看到的。 至于出现沉淀的原因不外乎条件变化太剧烈了，建议不要让透析的条件变化太剧烈了，主要是PH的浓度的变化和样品中一些其他东西如尿素的浓度变化。 如果楼主透析样品中出现太多的沉淀，甚至于跑胶中基本没有带了，那么建议楼主换一种透析液来用，如用TGE也就是传说中的万金油来试试，我一直用的是这种透析液，效果很不错。TGE配法如下： 50mM Tris 0.5mM EDTA 50mM Nacl 5%或10％甘油 如果有条件加入1％的甘氨酸或精氨酸和谷胱甘肽会更好些。 沉淀可以拿来重溶，但是重溶的可行性不大，也就是重新溶解的可能性不大 谢谢您们的回答,我再试试.我还想问一下是先过柱后复性还是先复性后过柱那种方法好?我查资料怎么都不一样.还有我纯化的蛋白浓度比较底,能不能浓缩一下,我后面作免疫动物实验,怎样保存蛋白较好?包涵体能放多久不出现问题? 如透析液用TGE的话,一次透析,还是也要分步,要不要调PH或是浓度? 046 wrote: 谢谢您们的回答,我再试试.我还想问一下是先过柱后复性还是先复性后过柱那种方法好?我查资料怎么都不一样.还有我纯化的蛋白浓度比较底,能不能浓缩一下,我后面作免疫动物实验,怎样保存蛋白较好?包涵体能放多久不出现问题? 先过柱後复性。 蛋白浓度较低可以浓缩一下，浓缩方法有很多，简单一点的可以用PEG包埋，就是将蛋白

改性沥青的研究现状分析

-144-科学技术创新2019.13 改性沥青的研究现状分析 戚春华赵玉芳高明星 (内蒙古农业大学，内蒙古呼和浩特010()10) 摘要：为了适应交通量的迅猛发展、车辆重载以及复杂的气候变化，对路面材料的性能提出更高的要求，普通沥青已无法满足，必须对沥青进行改性，研发出具有良好路用性能的改性沥青，满足现代道路发展的需要。对改性沥青的起源与发展进行总结分析，归纳现有研究存在的不足以及改性沥青的发展应解决的问题结果表明：多聚磷酸、SBS、环氧树脂、硅藻土、纳米材料等将是今后制备复合改性沥青的重要材料；对改性沥青改性机理认识不足、改性材料与沥青的相容性问题以及改性沥青的存储稳定性问题是制约改性沥青推广应用的重要原因。 关键词:改性沥青；改性材料；制备工艺；发展 中图分类号:U414文献标识码：A文章编号:2096-4390(2019)13-0144-02 近年来，随着交通量的迅猛发展,车辆重载以及复杂的气候变化.对公路路面材料的性能提出了更高的要求。普通沥青路面表面平整无接缝，行车振动小，噪声低,开放交通快,养护简便等优点，但也存在感温性能差,弹性和耐老化性能差，高温易流淌和低温易脆裂等缺点。基于普通沥青路面存在的缺点难以满足现代道路的使用要求,必须对其进行改性研究,使其满足现代道路建设的要求。目前有些改性沥青的制备工艺已经相当成熟,对各种新型材料的使用也进行了大量研究.然而对改性沥青的改性机理的研究还缺少深刻的认识。 本文通过对改性沥青的起源与发展进行分析总结，归纳现有研究存在的不足以及改性沥青的发展应解决的关键问题。 1改性沥青的组成成分研究 研究发现每种改性剂都有各自的优缺点，比如橡胶改性沥青制备工艺简单，稳定性差，不易贮存，多聚磷酸价格低廉，对沥青高温和老化性能的改善效果较为明显，低温性能较差,SBR改性沥青制备工艺简单,价格低廉，但高温稳定性差，多用于高寒高海拔地区,SBS改性沥青的弹性、低温性能、耐老化等性能均有所提高，对于高寒地区来说，低温性能稍显不足，多用于炎热地区，环氧树脂改性沥青能提高沥青材料的粘附力、拉伸强度以及断裂延伸率，有很高的强度，优良的温度稳定性，且高温条件下抗变形能力较好,制备工艺复杂，施工较难。近年来国内外学者开始研究如何将两种或者多种改性剂对沥青进行复合改性，综合其优点.进一步提高改性效果。 张忠明叭黄成武回等人以橡胶粉和SBS为改性剂，通过不同的室内制备工艺制备复合改性沥青，并对制备出的复合改性沥青的性能进行比较研究，为室内制备复合改性沥青(转下页) 接，当检测车在对道路进行检测的时候,将采集到的数据上传到云端与之前对该条道路检测所采集到的数据进行比对，可以分析出该道路路面在最近几年的破损变化速率。将该速率与当地的气候水文条件以及车流量进行分析。 4.2智能检测设备数据共享化 对于路面管理系统本身而言，目前各个地区已经建立的路面管理系统之间彼此是孤立的，没有任何联系，成为“信息孤岛”。 在数据进行共享之前，要将各个地区的评价指标进行标准化处理，由于各个地区路面所处的环境条件是不一样的，交通量和路面结构类型也是不同。评价指标的标准化是相当困难的。 一旦完成智能检测设备数据的共享化，我相信我国的路面力学理论、路面设计施工方法都会有飞跃式的进步。 5结论 随着智能检测设备的发展，尽管我们已经取得了许多方面的成就，比如图像分析处理技术，高精度的图像采集技术以及地理信息技术，但仍然有着广阔的发展空间等待着我们去探索。集成化的智能检测设备,标准化的检测指标,完备的云端数据库以及一些交通运输附属产业都等待着我们进一步的研究。我相信今后中国的交通事业会在新“互联网+”时代蓬勃发展。 参考文献 [1]邢荣军.高速公路路面破损自动识别与智能评价[D].重庆：重庆交通大学,2011,4. [2]喻翔.高速公路路面养护管理系统决策优化研究[D].成都：西南交通大学,2005,5. ⑶庞明宝,魏连雨.系统工程与交通[M].天津:天津人民出版社. 2003. [4]徐东云，张雷，兰荣娟.城市交通拥堵的背景变换分析[J].城市问题,2009⑶. [5|龚建江.公路设计与管理中的工程数据库研究[J].绿色交通. 2018,2,20⑷. 作者简介：朱瑞峰(1995,10,31-),男，汉族，四川省，学历：在读研究生，研究方向：道路规划与线形设计理论与方法。

包涵体的复性总结

包涵体的复性总结 关于包涵体的复性是一个令人头疼的问题，已经成为生物制药的瓶颈，包涵体的复性前期准备工作尤为重要，关于包涵体的处理一般包括这么几步：菌体的破碎、包涵体的洗涤、溶解、复性以及纯化，实验内容比较庞杂、繁琐。 一、菌体的裂解 菌体的破碎方法很多：高速组织捣碎、玻璃匀浆器匀浆、超声波处理法、反复冻融法、化学处理法。无论用哪一种方法破碎组织细胞，都会使细胞内蛋白质或核酸水解酶释放到溶液中，使大分子生物降解，导致天然物质量的减少，不同的菌体蛋白需要加入不同的抑制剂：二异丙基氟磷酸（DFP）可以抑制或减慢自溶作用；碘乙酸可以抑制那些活性中心需要有疏基的蛋白水解酶的活性，苯甲磺酰氟化物（PMSF）也能清除蛋白水解酶活力，但不是全部，而且应该在破碎的同时多加几次；另外，还可通过选择pH、温度或离子强度等，使用这些条件时都要适合于目的物质的提取。 在实验室研究多采用超声波处理法和匀浆器匀浆法。 二、包涵体的洗涤 通常的洗涤方法一般是难以洗干净的，包涵体中主要含有重组蛋白,但也含有一些细菌成分,如一些外膜蛋白、质粒ＤＮＡ和其它杂质。洗涤常用1%以下的中性去垢剂，如Tween、Triton、Lubel和NP40等加EDTA反复多次进行，因去垢剂洗涤能力随溶液离子强度升高而加强，在洗涤包涵体时可加50 mM NaCL。也可用低浓度的盐酸胍或尿素/中性去垢剂/EDTA/还原剂等洗去包涵体表面吸附的大部分不溶性杂蛋白。洗涤液pH以与工程菌生理条件相近为宜。根据不同的菌体选用与之相应的洗涤液，比如：2 M尿素+50mm Tris-HCl+0.2 mM NaCl +1%Triton x-100+2mmEDTA PH8.0，再用缓冲洗涤一次。此外，刚处理完的包含体好溶解，冷冻后难溶解，且溶解时间和比例都会加大。 三、包涵体的溶解 强的变性剂如尿素、盐酸胍，是通过离子间的相互作用，打断包涵体蛋白质分子内和分子间的各种化学键，使多肽伸展，SDS、正十六烷基三甲基铵氯化物等去垢剂，可以破坏蛋白内的疏水键，也可溶解一些包涵体蛋白质。另外，对于含有半胱氨酸的蛋白质，分离的包涵体中通常含有一些链间形成的二硫键和链内的非活性二硫键。还需加入还原剂，如巯基乙醇、二硫基苏糖醇（DTT），常用浓度2—10 mm。 另外，尿素和盐酸胍属中强度变性剂，易经透析和超滤除去。它们对包涵体氢键有较强的可逆性变性作用，所需浓度尿素6—8M，盐酸胍5—6M。一般来讲，盐酸胍优于尿素，因为盐酸胍是较尿素强的变性剂，它能使尿素不能溶解的包涵体溶解，尿素的溶解度为70—90%，而且尿素分解的异氰酸盐能导致多肽链的自由氨基甲酰化，特别是在碱性pH值下长期保温时。但用尿素溶解具有不电离，呈中性，成本低，蛋白质复性后除去不会造成大量蛋白质沉淀以及溶解的包涵体可选用多种色谱法纯化等优点，故目前已被广泛采用。 四、包涵体的复性 包含体的复性是一个非常复杂的过程，除与蛋白质复性的过程控制相关外，还在很大程度上与蛋白质本身的性质有关，有些蛋白非常容易复性，在较宽松的条件