蛋白质相互作用数据库和分析方法
蛋白质相互作用数据库和分析方法
1. 蛋白质相互作用的数据库 蛋白质相互作用数据库见下表所示： 数据库名 说明
网址
BIND 生物分子相互作用数据库
http://bind.ca/
DIP 蛋白质相互作用数据库
https://www.wendangku.net/doc/5b1913900.html,/
IntAct 蛋白质相互作用数据库
https://www.wendangku.net/doc/5b1913900.html,/intact/index.html InterDom 结构域相互作用数据库
https://www.wendangku.net/doc/5b1913900.html,.sg/ MINT 生物分子相互作用数据库
http://mint.bio.uniroma2.it/mint/ STRING 蛋白质相互作用网络数据库
http://string.embl.de/ HPRD 人类蛋白质参考数据库
https://www.wendangku.net/doc/5b1913900.html,/
HPID 人类蛋白质相互作用数据库
http://wilab.inha.ac.kr/hpid/ MPPI 脯乳动物相互作用数据库
http://fantom21.gsc.riken.go.jp/PPI/ biogrid
蛋白和遗传相互作用数据，主要来自于酵母、线虫、果蝇和人 https://www.wendangku.net/doc/5b1913900.html,/
PDZbase 包含PDZ 结构域的蛋白质相互作用数据库 https://www.wendangku.net/doc/5b1913900.html,/services/pdz/start Reactome
生物学通路的辅助知识库
https://www.wendangku.net/doc/5b1913900.html,/
2. 蛋白质相互作用的预测方法
蛋白质相互作用的预测方法很非常多，以下作了简单的介绍
1) 系统发生谱
这个方法基于如下假定：功能相关的(functionally related)基因，在一组完全测序的基因组中预期同时存在或不存在，这种存在或不存在的模式(pattern)被称作系统发育谱；如果两个基因，它们的序列没有同源性，但它们的系统发育谱一致或相似．可以推断它们在功能上是相关的。
2)基因邻接
这个方法的依据是，在细菌基因组中，功能相关的基因紧密连锁地存在于一个特定区域，构成一个操纵子，这种基因之间的邻接关系，在物种演化过程种具有保守性，可以作为基因产物之间功能关系的指示。这个方法似乎只能适用于进化早期的结构简单的微生物。所以在人的蛋白质相互作用预测时不采用这个方法。
3)基因融合事件
这个方法基于如下假定：由于在物种演化过程中发生了基因融合事件，一个物种的两个(或多个)相互作用的蛋白，在另一个物种中融合成为一条多肽链， 因而基因融合事件可以作为蛋白质功能相关或相互作用的指示。
4)镜像树
这个方法的思想是，功能相关的蛋白质或同一个蛋白的域之间，受功能约束，其进化过程应该保持一致， 即呈现共进化(CO—evolution)特征，通过构建和比较它们的系统发育树，如果发现树的拓扑结构显示相似性，这种相似的树被称作镜像树，那么，可以推测建树基因的功能是相关的。
5)突变关联
物理上相互接触的蛋白质， 比如处在同一个结构复合物中的蛋白质，其中一个蛋白质在进化过程中累计的残基变化，通过在另一个蛋白质中发生相应的变化予以补偿，这种现象被称作关联突变。
6)序列信号关联
通过检查实验上已经证实的相互作用蛋白质对，发现序列特征信号
(sequence-signatures)在不同对的相互作用蛋白中重复地出现，这一现象被称作序列信号关联。利用序列域信号关联作为相互作用蛋白质的识别指示，可以预测未知功能蛋白与已知蛋白的相互作用，减少直接实验的搜索空间。
7)保守的蛋白间相互作用
相互作用的蛋白质在物种演化过程中具有保守性，因此，可以通过在一个物种中建立的蛋白质相互作用网络，预测其它物种的蛋白质间相互作用。这是后基因组时代产生的一个分子进化概念，使人们联想到直系同源基因（orthologs）和平行同源基因(paralogs)两个概念。Walhout首先提出了”interologs”这个新概念,后由Matthews等利用酵母双杂交法分析了1195个酿酒酵母相互作用蛋白在线虫(C.elegans)中的保守性,获得了
16%-31%线虫保守相互作用蛋白，它们主要集中在核心代谢过程（core metabolic
processes）并预期随着亲缘关系的远近，保守性作相应变化。
8)同源结构复合物
设想三维结构已知的蛋白质复合物，各自的同家族成员以同样的方式发生相互作用.
9)进化速率关联
蛋白质的进化速率由这个蛋白质同其它蛋白质发生相互作用的数量决定，并呈负相关，即相互作用的数量越多进化速率越低，而不是通常设想的蛋白质的进化速率由这个蛋白质对机体的重要性决定，这是一个极重要的概念。Fraser等13Ol利用一组实验上证实的酵母相互作用蛋白，量化分析了进化速率、适合度(fitness)和序列共进化(sequence CO —evolution)之间的关系；统计分析显示，在酵母蛋白质相互作用网络中，连接点越多的蛋白质进化速率进化越低，可能的原因是，这些蛋白质需要与更多的相互作用伴体(partner)共进化。
10)共鸣识别模型MRRM预测蛋白质相互作用
从蛋白质一级结构预测蛋白质相互作用，它假设生物分子(包括蛋白质和DNA)之间的相互作用是通过共鸣能量的传递来实现的，RRM恰当地引入了一些蛋白质的物理参数，并且运用了信号分析方法(Digital Signal Analysis，DSP)使得对于蛋白质和基因的分析脱离了局部性。
11)通过Domain相互作用来预测蛋白质相互作用
Domain是蛋白质最小的功能单元，它们之间的相互作用一定程度上就决定了蛋白质之间的相互作用。按照这个方法将所有的氨基酸序列进行聚类，如果类与类之间的相互作用的序列对的个数超过了一定阈值，则表示与两个类的代表序列同源的蛋白质之间都可能会发生相互作用。
12)根据蛋白结构来预测蛋白相互作用
Lappe等人认为，虽然蛋白质之间的相互作用并不能直接用作预测，但是在结构上相似的蛋白质将有可能具有相似的功能，至少会给出一定的功能提示。分类的原则可按照SCOP给出的层次进行，分类方法是将已知序列的蛋白质相互作用对分别与SCOP的典型结构进行匹配，使之对应到每一个类中。预测已知与其他蛋白相互作用关系的蛋白的序列结构可以列出该蛋白结构组成的最大可能情况。
3.蛋白质相互作用数据分析
3.1蛋白质相互作用可靠性评价
对于实验数据而言，由于大规模蛋白质相互作用实验如酵母双杂交实验存在较高的假阳性，所以一般会对产生的数据做一个评价。对于预测的数据更需要一个打分系统进行评估。常用
的评估打分方法有下以几种：
1）基于拓扑结构的证据
该方法通过其他模式生物酵母、线虫、果蝇、小鼠等的实验蛋白质相互作用，通过基因ortholog关系预测到所分析物种的蛋白质相互作用，然后与分析的网络合并，对于重叠的或者三或四个蛋白相互作用回形模体中的相互作用给予高分。这个方法对于数据量过于庞大的网络数据因为大部分都会是三或四个蛋白相互作用回形模体，以致于效果不太好。
2）基于GO term的证据
蛋白质相似的细胞功能和定位与蛋白质相互作用成簇是相关的，在蛋白质相互作用对上如果两个蛋白质的功能在同一个GO term上，认为该蛋白质相互作用对有更好的可靠性。
3）共表达数据参考证据
如果有实验证据证明两个蛋白质共表达，那么他们之间相互作用的可能性就高。
4）贝叶斯理论的应用
基于贝叶斯理论收集一个正数据集和一个负数据集通过技术对所选择的方法进行评估。
3.2蛋白质相互作用网络分析
1）度分布和Hub蛋白
度是指顶点所连接的边的数量。计算蛋白质相互作用网络上所有蛋白质的度，可以作一个度分布，如果度分布服从幂率的网络称为无尺度（scale-free）网络。以此可以判断网络是随机网还是无尺度（scale-free）网络，见下图。对于无尺度网络大多数顶点的度都是低的，只有少数顶点的度较高，这些少数顶点在蛋白质相互作用网络上就是Hub蛋白。
2）最短路计算，平均路长，路分布
网络中两顶点间的距离用最短路来度量，即从一个顶点到另一个顶点所需要通过的最少边的数目。平均路长指网络中所有顶点对间最短路的平均值。路分布指对所有路长做一个分布，
见下图。
3）聚集系数及其分布
聚集系数描述其邻接点之间的连接程度，即网络的局部集团化程度，其数学定义如下：
其d(v)是顶点v的度， |N（v）|代表顶点v的d(v)个邻接点之间的真接连线的数目。CC （v）的值介于0-1之间。由此定义可知，若v的任意两个邻居间都有连线，CC（v）等于1，若v的所有邻居之间都无连线，CC(V)等于0。聚集系数分布见下图：
5）拓扑系数的度分布
拓扑系数(topological coefficients)的数学定义是TCp=average(J(p, j)/kp , 其中J(p, j)是指顶点p和j 之间的所有顶点数，kp是指顶点p的度。拓扑系数的度分布参考下图：
除了以上所说的之外，蛋白质相互作用网络还可以计算Eigenvector centrality、Center、Barycenter以其模块分析，采用的还是数学方法，这里就不一一介绍了。
4.Pajek的应用介绍
4.1 Pajek简要介绍
Pajek在斯洛文尼亚语中是蜘蛛的意思，是一个用来做大型网络分析和软件，它运行在window环境下，软件可以在官方网站下载:(http://vlado.fmf.uni-lj.si/pub/networks/pajek/)。它被应用于与网络相关的各个领域的研究，如社会关系研究、情报分析等。本文介绍该软件在蛋白质相互作用网络研究中的一些应用。
在官方网站除了pajek主程序之外，还有一些用来做格式转化的小程序，例如txt2pajek, Excel2pajek是非常实用的程序。
Pajek官方网站
Pajek具有很强大的网络分析能力，如下图所示，pathway有多种方法去处理一个大型网络，包括了层次化（hierarchy），简约化（reduction）, 抽取前后关系（context）, 抽取部分网络（cut-out）。它的主要目标有三个：
1）从大网络中抽提有意义的小网络；
2）网络的图形化显示；
3）实现一系列的大型网络的分析算法。
4.2 Pajek的输入文件
Pajek有6种数据对象，如下所示
1）Network:主要对象，用来定义顶点和边，输入文件的扩展名为.net。蛋白质相互作用主要用的就是该数据对象。
2）Partitions: 用来定义每个顶点属于哪一个类别，文件扩展名为.clu。
3）Permutations: 顶点的重新排列，文件扩展名为.per。
4）Clusters: 顶点的子集，文件扩展名为.cls。
5）Hierarchies: 层次结构排列的顶点，文件扩展名为.hie。
6）Vectors: 定义每一个顶点的一些数字化属性，文件扩展名为.vec
Pajek操作窗口
Pajek主窗口 Pajek图形显示窗口
菜单 简要说明
File 六种数据对象的输入/输出操作
Net 对单个网络的操作
Nets 两个网络的运算
Operations 对网络或者其它数据的操作
Transform 依据分类、集聚和向量的网络变换
Partition 对分类的操作
Partitions 在两个分类上操作
Vector 对网络和向量的操作
Vectors 对两个向量的操作
Permutation 排序相关的操作
Cluster 对类进行操作
Hierarchy 层次相关的操作
Options 对软件的一些设置
Draw 画图相关的选项
Macro 与宏相关的操作
Info 查询信息
Tools 调用第三方软件
最简单的Pajek network输入文件（1-mode network），如下所示：
文件内容（https://www.wendangku.net/doc/5b1913900.html,） 网络图
*Vertices 6
1 "a"
2 "b"
3 "c"
4 "d"
5 "e"
6 "f"
*Edges
1 2
1 3
2 3
*Arcs
4 5
4 6
5 6
*Vertices 6 表示以下开始在对顶点的定义，总的顶点数是6个。接下去就是顶点的定义，第一列是一个从1开始的流水号，空格后面紧跟的顶点的名称。边有两种，一种是Edges，指的是没有方向的边，用于无向网络图；另一种是Arcs, 指的是有方向的边，用于有向网格图。
4.3 如何生成.net文件用与网络构建
以上我们所看到的.net文件格式有些特殊，对于少量的蛋白质相互作用数据可能手工输入可以完成，但当数据量多的时候，手工输入将会是一个巨大的工作量。Pajek网站提供了txt2pajek和Excel2pajek辅助将文本文件或excel中的蛋白质相互作用关系对转成net文件。1）txt2pajek的使用
已有蛋白质相互作用对文件列表，见testA.txt，如下所示：
a b
a c
a e
b c
b e
c e
b f
其中第一列与第二列之间是相互作用的关系，之间用空格分隔。
打开txt2pajek之后，如下图所示，在Input File选择需要转换的文件；Separator选择blank；选择1-mode network; 选择undirected(*Edges)；其它参数默认；点击Create Pajek File 生成Pajek文件。
运行会生成一个输出文件，如https://www.wendangku.net/doc/5b1913900.html,, 文件内容如下所示：
*Vertices 5
1 "a"
2 "b"
3 "c"
4 "e"
5 "f"
*Edges
1 2
1 3
1 4
2 3
2 4
3 4
2 5
2）Excel2pajek的使用
存在蛋白质相互作用文件的excel格式文件testA.xls，如下面所示，A列与B列是一对相互作用关系。
双击打开createpajek.exe之后，如下图所示，选择输入文件为testA.xls;Worksheet选Sheet1; 选1-mode network和undirected，点击Create Pajek File会生成https://www.wendangku.net/doc/5b1913900.html,。结果与txt2pajek是一样的。
4.4 如何查看.net文件
如下图所示打开Pajek目录。
打开pajek.exe，如下图所示，打到.net文件导入。
点击菜单中Draw->draw，可以看到生成的图络图，如下图所示。
对于图形的显示在菜单Options中有许多选项进行修改，这里不一一讲述，在培训课程中进行上机介绍。
网络图可以通过菜单Export中的2D选项导出成EPS/PS，SVG，Bitmap格式。
4.6 网络图的个性化制定
Pajek的.net文件提供了许多选项来调整网络图在的顶点的形状、大小、颜色，以及边的形状、粗细、颜色等属性，使用网络图更加美观。下面是Pajek提供的一个例子：
,net文件：
*Vertices 4
1 "ellipse" 0.120 0.285 0.5 ellipse x_fact 5 y_fact 3 fos 20 ic LightYellow lc Red
2 "box" 0.818 0.246 0.5 box x_fact 5 y_fact
3 fos 20 ic LightCyan lc Blue
3 "diamond" 0.368 0.779 0.5 diamond x_fact 7 y_fact 3 fos 20 ic LightGreen lc Black
4 "triangle" 0.83
5 0.833 0.5 triangle x_fact 9 y_fact 3 fos 20 ic LightOrange lc Brown lr 30 lphi 200
*Arcs
1 1 1 h
2 0 w
3 c Blue s 2 a1 -130 k1 0.6 a2 -130 k2 0.6 ap 0.25 l "Bezier loop" lc
OliveGreen fos 20 lr 13 lp 0.5 la 360
2 1 1 h2 1 a1 120 k1 1 a2 10 k2 0.8 ap 0 l "Bezier arc" lphi 270 la 180 lr 1
3 lp 0.5
1 2 1 h2 -1 a1 40 k1 2 a2 -30 k2 0.8 ap 0 l "Bezier arc" lphi 90 la 0 lp 0.75
4 2 -1 l "Straight dotted arc" p Dots c Red
*Edges
1 3 1 l "Straight edge" lp 0.4
3 4 1 l "Straight edge"
网络图形（注意：这个结果只有导出图形后才能看到）
顶点设置格式：
Vertex_num label [x y z] [shape] [changes of default parameters]
Vertex_num: 流水号1，2，3,..., n
Label: 顶点的标识
[x y z]: 顶点的坐标
shape – 顶点的形状. 定义在SHAPES.CFG文件中(包括了ellipse, box, diamond, triangle, cross, empty)
shapes.cfg文件中的参数:
s_size – 默认的顶点大小
x_fact – x轴放大倍率
y_fact – y轴放大倍率
phi –正向旋转度数(0..360)
r – 在使用rectangle和diamond形态顶点时角的描述半径(r = 0 – rectangle, r > 0 –
roundangle)
q – 使用diamonds形态时 –diamond的顶边与中间边的比率(try q 0.01, q 0.5, q 2, ...)
ic – 顶点的内部颜色.
bc – 顶点的边的颜色
bw –顶点的边的线的宽度
lc – 标识的颜色
la – 标识的角度 (0..360)
lr – 从顶点的中心到顶点的启始的距离
lphi – 标识位置的角度 (0..360)
fos – 字体尺寸
font –字体设定 (Helvetica, Courier,...)
HOOKS –边连接到顶点的位置. 有三种不同方法:
(a) CART – x y – 笛卡尔坐标系中的位置
(b) POLAR – r 极坐标系中的位置，phi是位置的角度(0..360)
(c) CIRC – r phi1 – 在极坐标中的位置的迭代 r– radius, phi = k *phi1, k = 1, 2, ..;
k*phi1≤ 360
边（Arcs or Edges）设置格式
v1 v2 value [additional parameters]
v1是起始顶点的号
V2是终止顶点的号
Value是从v1到v2的边的值
如果不指定其他参数边默认是黑色，直线，实线。如果value是负值则用虚线代替。
其他参数：
? w – 线的宽度
? c – 线的颜色
? p – 线的类型 (Solid, Dots)
? s – 箭头的大小
? a – 箭头的外型(A or B)
? ap – 箭头的位置
– ap = 0 箭头在末端
– 0 < ap < 1 根据线长度按比例分配箭头的位置
– ap > 1 绝对长度的箭头位置
? l – 线的标识
? lp – 线的标识的位置，与ap参数一样
? lr – 标识的半径(position of center text from point on edge )
? lphi –标识的半径(angle of center text according to point on edge ) (lr
and lphi are polar coordinates)
? lc – 标识的颜色
? la – 标识的角度(0 < la < 360 – relative to edge, la >=360 – absolute angle according to x axis)
? fos – 标识字体大小
? font – 输出PostScript字体(Helvetica, Courier, ...)
? h1 – 在起始顶点上的弯曲(0 – center, -1 the closest, 1, 2.. user defined)
? h2 – 在终止顶点上的弯曲
? a1 – 在起始顶点上的角度(Bezier)
? a2 – 在终止顶点上的角度(Bezier)
? k1 – 在起始顶点上的速率(Bezier)
? k2 – 在终止顶点上的速率(Bezier)
5.Pajek的操作实例
测试数据文件为test_data1.xls。
第一步，采用createpajek.exe生成Pajek能读的文件。
点InputFile从目录中选择测试文件，输出文件默认是同一目录下后缀为.net的文件；选择1st column和2nd column；因为第一行为标题行，所以line(s) from top to ignore设为1；蛋白质相互作用网络为无向网络可以选1-mode network，undirected(*Edges). 设置完成后点Create Pajek File 生成文件。运行完成后，可以看到Output File所示文件
第二步，打开test_https://www.wendangku.net/doc/5b1913900.html,
基于这一个网络采用Pajek可以进行很多分析，下面将介绍常用的几种：
获得子网络
选择Net -> Components -> Weak, Minimum size of components 设为1
通过Draw->Draw-Partition查看，经过Layers->In y direction显示得到如下所示
由图发现不同的子网络已经用不同的颜色区分开来。通过Options->Mark Vertices Using->Partition clusters可以查看每个顶点的cluster号。
通过Pajek操作窗口的Operations->Extract from Network->Partition, 填入再选择的cluster, 如1.
用Draw->Draw-Partitiont得到如下的图
Degree计算
Net->Partitions->Degree->All
双击Partition栏中3.All Degree partition of N2(342), 显示第一个顶点的度
可以用Draw->Draw-Partition-Vector来查看结果，如下面所示
其中点越大连接度越高，从而可以找出Hub蛋白。
通过Layers->In y direction可以显示连接度高的蛋白。
K-core计算
K-core是给定网络的一个子集，在子集中每一结点至少有k个近邻
计算方法： Net->Paritions->Core->All
从一个蛋白到另一个蛋白的路径问题
一个最短距离：Net ->Paths between 2 vertices->One Shortest
全部最短距离：Net->Paths between 2 vertices->All Shortest
找出两顶点间具有限定最大长度的所有行长路径：Net->Paths between 2 vertices->Walks with Limited Length
可以用于新的转录调控途径的探索。
网络直径（网张两结点间的最长最短路径的长度）:Net->Paths between 2 vertices->Diameter
最小路径长度的分布： Net->Paths between 2 vertices->Distrbution of Distances->From All Vertices
Closeness与closeness Centrality计算
Net-> Vector->Centrality->Closeness->All, 将计算得到的Vector值导出，值高的几个即为Closeness Centrality
Betweenness Centrality计算
Net->Vector->Centrality->Betweenness, 将计算得到的Vector值导出，值高的几个既为Betweenness Centrality, 也可以从图中体现，见下图。
Hub与Authorities查找
Net->Vector->Important Vertices->1-Mode:Hub/Authorities
一个结点被认为是很好的集线中心，如果它指向许多好的权威结点。而如果它被许多集线结点连接，那么它就是一个好的权威。在获得的分类值“1”表示该结点是权威结点，值“2”表示该结点既是权威结点也是集线结点，值“3”表示该结点是一个集线结点。
聚集系数计算
聚集系数是研究网络的一个重要参数, 用来描述其邻接点之间的连接程度。
CC1：只有1个邻居的结点的聚集度Net->Vector->Clustering Coefficients->CC1
CC2：2 个邻居的结点的聚集度 Net->Vector->Clustering Coefficients->CC2
检测两种蛋白质之间相互作用
检测两种蛋白质之间相互作用得实验方法比较 1、生化方法 ●免疫共沉淀免疫共沉淀就是以抗体与抗原之间得专一性作用为基础得用于研究蛋白质相互作用得经典方法.改法得优点就是蛋白处于天然状态,蛋白得相互作用可以在天然状态下进行，可以避免认为影响;可以分离得到天然状态下相互作用得蛋白复合体。缺点:免疫共沉淀同样不能保证沉淀得蛋白复合物时候为直接相互作用得两种蛋白。另外灵敏度不如亲与色谱高。 ●Fａr—Ｗestｅrｎ 又叫做亲与印记。将PAGE胶上分离好得凡百样品转移到硝酸纤维膜上,然后检测哪种蛋白能与标记了同位素得诱饵蛋白发生作用，最后显影。缺点就是转膜前需要将蛋白复性。2?、等离子表面共振技术（Surfacｅｐｌasmoｎｒｅsoｎance)该技术就是将诱饵蛋白结合于葡聚糖表面,葡聚糖层固定于几十纳米厚得技术膜表面。当有蛋白质混合物经过时,如果有蛋白质同“诱饵”蛋白发生相互作用，那么两者得结合将使金属膜表面得折射率上升，从而导致共振角度得改变。而共振角度得改变与该处得蛋白质浓度成线性关系,由此可以检测蛋白质之间得相互作用。该技术不需要标记物与染料，安全灵敏快速,还可定量分析。缺点:需要专门得等离子表面共振检测仪器。 ３、双杂交技术原理基于真核细胞转录因子得结构特殊性,这些转录因子通常需要两个或以上相互独立得结构域组成．分别使结合
域与激活域同诱饵蛋白与猎物蛋白形成融合蛋白，在真核细胞中表达,如果两种蛋白可以发生相互作用,则可使结合域与激活域在空间上充分接近,从而激活报告基因．缺点：自身有转录功能得蛋白会造成假阳性.融合蛋白会影响蛋白得真实结构与功能。不利于核外蛋白研究,会导致假隐性. 5、荧光共振能量转移技术指两个荧光法色基团在足够近（〈100埃)时，它们之间可发生能量转移得现象。荧光共振能量转移技术可以研究分子内部对某些刺激发生得构象变化,也能研究分子间得相互作用。它可以在活体中检测,非常灵敏,分辩率高,能够检测大分子得构象变化,能够定性定量得检测相互作用得强度。缺点此项技术要求发色基团得距离小于100埃。另外设备昂贵,还需要融合ＧFP给蛋白标记。?此外还有交联技术(ｃrｏsｓ－ｌｉnＫing)，蛋白质探针技术,噬菌体展示技术(Pｈａgｅ dｉsｐｌaｙ）以及生物信息学得方法来检测蛋白质之间相互作用。 1，酵母双杂交 1-5 酵母双杂交系统就是将待研究得两种蛋白质得基因分别克隆到酵 体,从表达产物分析两种蛋白质相互作用得系统 酵母双杂交得原理就是,把报告基因HIS３与l a c Z 整合到酵母细胞基因组中,并受转录因子
研究蛋白质与蛋白质相互作用方法总结-实验步骤
研究蛋白质与蛋白质相互作用方法总结-实验步骤 蛋白质与蛋白质之间相互作用构成了细胞生化反应网络的一个主要组成部分，蛋白-蛋白互作网络与转录调控网络对调控细胞及其信号有重要意义。把原来spaces空间上的一篇蛋白质与蛋白质间相互作用研究方法转来，算是实验技巧分类目录的首篇。(另补充2：检测两种蛋白质之间相互作用的实验方法比较) 一、酵母双杂交系统 酵母双杂交系统是当前广泛用于蛋白质相互作用组学研究的一种重要方法。其原理是当靶蛋白和诱饵蛋白特异结合后，诱饵蛋白结合于报道基因的启动子，启动报道基因在酵母细胞内的表达，如果检测到报道基因的表达产物，则说明两者之间有相互作用，反之则两者之间没有相互作用。将这种技术微量化、阵列化后则可用于大规模蛋白质之间相互作用的研究。在实际工作中，人们根据需要发展了单杂交系统、三杂交系统和反向杂交系统等。Angermayr等设计了一个SOS蛋白介导的双杂交系统。可以研究膜蛋白的功能，丰富了酵母双杂交系统的功能。此外，酵母双杂交系统的作用也已扩展至对蛋白质的鉴定。 二、噬茵体展示技术 在编码噬菌体外壳蛋白基因上连接一单克隆抗体的DNA序列，当噬菌体生长时，表面就表达出相应的单抗，再将噬菌体过柱，柱上若含目的蛋白，就会与相应抗体特异性结合，这被称为噬菌体展示技术。此技术也主要用于研究蛋白质之间的相互作用，不仅有高通量及简便的特点，还具有直接得到基因、高选择性的筛选复杂混合物、在筛选过程中通过适当改变条件可以直接评价相互结合的特异性等优点。目前，用优化的噬菌体展示技术，已经展示了人和鼠的两种特殊细胞系的cDNA文库，并分离出了人上皮生长因子信号传导途径中的信号分子。 三、等离子共振技术 表面等离子共振技术(Surface Plasmon Resonance，SPR)已成为蛋白质相互作用研究中的新手段。它的原理是利用一种纳米级的薄膜吸附上“诱饵蛋白”，当待测蛋白与诱饵蛋白结合后，薄膜的共振性质会发生改变，通过检测便可知这两种蛋白的结合情况。SPR技术的优点是不需标记物或染料，反应过程可实时监控。测定快速且安全，还可用于检测蛋白一核酸及其它生物大分子之间的相互作用。
检测两种蛋白质之间相互作用
检测两种蛋白质之间相互作用的实验方法比较 1. 生化方法 ●免疫共沉淀免疫共沉淀是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。改法的优点是蛋白处于天然状态，蛋白的相互作用可以在天然状态下进行，可以避免认为影响；可以分离得到天然状态下相互作用的蛋白复合体。缺点：免疫共沉淀同样不能保证沉淀的蛋白复合物时候为直接相互作用的两种蛋白。另外灵敏度不如亲和色谱高。 ●Far-Western 又叫做亲和印记。将PAGE胶上分离好的凡百样品转移到硝酸纤维膜上，然后检测哪种蛋白能与标记了同位素的诱饵蛋白发生作用，最后显影。缺点是转膜前需要将蛋白复性。 2. 等离子表面共振技术（Surface plasmon resonance）该技术是将诱饵蛋白结合于葡聚糖表面，葡聚糖层固定于几十纳米厚的技术膜表面。当有蛋白质混合物经过时，如果有蛋白质同“诱饵”蛋白发生相互作用，那么两者的结合将使金属膜表面的折射率上升，从而导致共振角度的改变。而共振角度的改变与该处的蛋白质浓度成线性关系，由此可以检测蛋白质之间的相互作用。该技术不需要标记物和染料，安全灵敏快速，还可定量分析。缺点：需要专门的等离子表面共振检测仪器。 3. 双杂交技术原理基于真核细胞转录因子的结构特殊性，这些转录因子通常需要两个或以上相互独立的结构域组成。分别使结合域和
激活域同诱饵蛋白和猎物蛋白形成融合蛋白，在真核细胞中表达，如果两种蛋白可以发生相互作用，则可使结合域和激活域在空间上充分接近，从而激活报告基因。缺点：自身有转录功能的蛋白会造成假阳性。融合蛋白会影响蛋白的真实结构和功能。不利于核外蛋白研究，会导致假隐性。
蛋白质相互作用
蛋白质相互作用的概述 一、为什么要研究蛋白质相互作用 二、蛋白质相互作用亲和力：K d=[A][B]/[AB] 三、蛋白质相互作用的应用 A、利用抗原和抗体的相互作用：Western blot，免疫共沉淀，染色质沉淀，抗体筛库 B、利用已知的相互作用建立tag：GST pull down，Biotin－Avidin结合， C、直接利用蛋白质的相互作用：蛋白质亲和层析，酵母双杂交，phage display，Bait蛋白质筛表达库，蛋白质组 四、相互作用的生物学意义：蛋白质间的相互作用是细胞生命活动的基础。 五、生物学功能的研究：获得功能或失去功能 I、一些常用蛋白质相互作用技术 ?Traditional co-purification (chromatography co-purification and co-sedimentation) ?Affinity chromatography：GST pull down，Epitope-tag ?(co-)Immunoprecipitation ?Western和Far-Western blot Surface Plasmon Resonance Two-Hybrid System Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) （实验过程及原理，注意事项，优缺点） III、研究实例讨论 一、酵母双杂交系统 作用：发现新的相互作用蛋白质；鉴定和分析已有的蛋白质间的相互作用；确定蛋白质相互作用的功能基团 具体过程：见书本 优点：是酵母细胞的in vivo相互作用；只需要cDNA，简单；弱的相互作用也能检测到 缺点：都是融合蛋白，万一融合出新的相互作用；酵母的翻译后修饰不尽相同，尤其是蛋白质的调控性修饰；自身激活报告基因；基因库德要求比较高，单向1/3是in frame 蛋白质毒性；第三者Z插足介导的相互作用；假阳性 酵母双杂交系统是当前广泛用于蛋白质相互作用组学研究的一种重要方法。其原理是当靶蛋白和诱饵蛋白特异结合后，诱饵蛋白结合于报道基因的启动子，启动报道基因在酵母细胞内的表达，如果检测到报道基因的表达产物，则说明两者之间有相互作用，反之则两者之间没有相互作用。将这种技术微量化、阵列化后则可用于大规模蛋白质之间相互作用的研究。在实际工作中，人们根据需要发展了单杂
蛋白质分析数据库
表1蛋白质相互作用分析相关数据库及网站 208
v/Entrez）； （2）在Search后的选择栏中选择protein； （3）在输入栏输入homo sapiens adiponectin； （4）点击go后显示序列接受号及序列名称； （5）点击序列接受号NP_004788 （adiponectin precursor；adipose most abund ant gene transcript 1 [Homo sapiens]）后显示序列详细信息； （6）将序列转为FASTA格式保存（参考上述步骤使用SRS信息查询系统检索人脂联素蛋白质序列）； 2、使用BioEdit软件对人脂联素蛋白质序列进行分子质量、氨基酸组成和疏水性等基本性质分析： 打开BioEdit软件→将人脂联素蛋白质序列的FASTA格式序列输入分析框→点击左侧序列说明框中的序列说明→点击sequence栏→选择protein→点击Amino Acid Composi tion→查看该蛋白质分子质量和氨基酸组成；或者选择protein后，点击Kyte & Doolittle Mean Hydrophobicity Profile→查看该蛋白质分子疏水性水平； 3、人脂联素蛋白质序列的蛋白质同源性分析： （1）进入NCBI/Blast网页； （2）选择Protein-protein BLAST （blastp）； （3）将FASTA格式序列贴入输入栏； （4）点击BLAST； （5）查看与之同源的蛋白质； 4、人脂联素蛋白质序列的motif结构分析： （1）进入http://hits.isb-sib.ch/cgi-bin/PFSCAN网页； （2）将人脂联素蛋白质序列的FASTA格式序列贴入输入栏； （3）点击Scan； （4）查看分析结果（注意Prosite Profile中的motif information）； 5、人脂联素蛋白质序列的二级结构预测： （1）进入下列蛋白结构预测服务器网址： http://www.embl-heidelberg.de/predictprot ein//predictprotein.html （The PredictProtein Server）； （2）在You can栏点击default； （3）填写email地址和序列名称； （4）将人脂联素蛋白质序列的FASTA格式序列贴入输入栏点击Submit； （5）从email信箱查看分析结果；
蛋白质相互作用的主要研究方法
蛋白质相互作用的主要研究方法 细胞接受外源或是内源的信号，通过其特有的信号途径，调节其基因的表达，以保持其生物学特性。在这个过程中，蛋白质占有很重要的地位，它可以调控, 介导细胞的许多生物学活性。虽然有一些蛋白质可以以单体的形式发挥作用，但是大部分的蛋白质都是和伴侣分子一起作用或是与其他蛋白质形成复合物来发挥作用的。因此，为了更好地理解细胞的生物学活性，必须很好地理解蛋白质单体和复合物的功能，这就会涉及到蛋白质相互作用的研究。在现代分子生物学中，蛋白质相互作用的研究占有非常重要的地位。 研究蛋白质相互作用时要根据不同的实验目的及条件选择不同的实施策略。研究已知蛋白间的相互作用人们关注的是蛋白间能否发生结合，实验本身更趋向于验证性，因此，应选择操作性强、可信度高、接近生理条件的技术方法，尽量减少实验本身带来的假阴性或假阳性。蛋白质相互作用方面的研究方法主要有免疫共沉淀、Far Western blotting、生物信息学、酵母双杂交系统、噬菌体展示、表面等离子共振、荧光能量转移等几种。 1 免疫共沉淀 免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。其基本原理是:细胞裂解液中加入抗体，与抗原形成特异免疫复合物，经过洗脱，收集免疫复合物，然后进行SDS-PAGE及Western blotting分析。免疫共沉淀既可以用于检验已知的两个蛋白质在体内的相互作用，也可以找出未知的蛋白质相互作用，不管是两者的哪个，其原则都是一样的，都需要用特异性的抗体与其中的一种蛋白质结合，之后通过蛋白质A或蛋白质G琼脂糖微珠将复合物沉淀下来，然后用SDS-PAGE鉴定。免疫共沉淀中设置正确的对照非常重要，因为该方法可能出现假阳性的概率比较高，设置的对照包括：在对照组中使用对照抗体，以缺失目的蛋白的细胞系作为阴性对照等等。 在免疫共沉淀试验中要保证试验结果的真实性应注意以下几点：（1）确保共沉淀的蛋白是由所加入的抗体沉淀得到的，而并非外源非特异蛋白。单克隆抗体的使用有助于避免污染的产生。（2）要确保抗体的特异性。即在不表达抗原
基于蛋白_蛋白相互作用网络预测靶点可药性_余小娟
基于蛋白-蛋白相互作用网络预测靶点可药性 余小娟，李洪林* 上海市新药设计重点实验室，华东理工大学药学院, 200237 邮箱：hlli@https://www.wendangku.net/doc/5b1913900.html, 网络药理学是系统生物学和多向药理学快速发展的基础上提出的药物设计新学科，网络 计算方法和药物相关数据库的不断完善也为其应用提供相应的平台。根据蛋白质-蛋白质相 互作用数据信息，采用Cytoscape软件构建其相互作用网络，通过统计和支持向量机分析， 我们得出药物靶点，非药物靶点及必要性靶点等在蛋白质相互作用网络中的拓扑性质，从而 为寻找可药性靶点，药物设计提高药效和安全性提供了一个新的思路和途径。 Tab.1Drug and non-drug targets topological properties drug targets non-drug targets mean property mean 7.5391 degree 14.622 cluster coefficient 0.0812 0.1035 topology coefficient 0.1621 0.1959 shortest path 3.7176 4.0962 neighborhood connectivity 31.599 35.8627 关键词：网络药理学, 药物靶标，网络拓扑 参考文献： [1]Hopkins AL..Nat Chem Biol, 2008, 4: 682?690. [2]Mingzhu Zhu, Lei Gao, Xia Li, et al. Journay of Drug Targeting,2009,17(7):524-532. Predicting Druggable Targets Based on Protein-Protein Interaction Network Xiao-Juan Yu, Hong-Lin Li* Shanghai Key Laboratory of New Drug Design, School of Pharmacy, East China University of Science and Technology, 200237 Network pharmacology is a new drug design subject that based on the rapid development of network biology and polypharmacology, while continuously perfect network methods and drug-related databases give a platform for its application. According to protein-protein interaction data information, by using Cytoscape software to build interaction network as well as statistics and SVM analysis, we obtain topological properties of drug targets, non-drug targets, essential targets in protein interaction network. The survey supports a new method for finding druggable target as well as safety and efficiency of drugs. Keywords : network pharmacology, drug-target, network topology
蛋白质功能-结构-相互作用预测网站工具合集
蛋白质组学 蛋白质是生物体的重要组成部分，参与几乎所有生理和细胞代谢过程。此外，与基因组学和转录组学比较，对一个细胞或组织中表达的所有蛋白质，及其修饰和相互作用的大规模研究称为蛋白质组学。 蛋白质组学通常被认为是在基因组学和转录组学之后，生物系统研究的下一步。然而，蛋白质组的研究远比基因组学复杂，这是由于蛋白质内在的复杂特点，如蛋白质各种各样的翻译后修饰所决定的。并且，研究基因组学的技术要比研究蛋白质组学的技术强得多，虽然在蛋白质组学研究中，质谱技术的研究已取得了一些进展。 尽管存在方法上的挑战，蛋白质组学正在迅速发展，并且对癌症的临床诊断和疾病治疗做出了重要贡献。几项研究鉴定出了一些蛋白质在乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌和食道癌中表达变化。例如，通过蛋白质组学技术，人们可以在患者血液中明确鉴定出肿瘤标志物。表1列出了更多的蛋白质组学技术用于研究癌症的例子。 另外，高尔基体功能复杂。最新研究表明，它除了参与蛋白加工外，还能参与细胞分化及细胞间信号传导的过程，并在凋亡中扮演重要角色，其功能障碍也许和肿瘤的发生、发展有某种联系。根据人类基因组研究，约1000多种人类高尔基体蛋白质中仅有500~600种得到了鉴定，建立一条关于高尔基体蛋白质组成的技术路线将有助于其功能的深入研究。 蛋白质组学是一种有效的研究方法，特别是随着亚细胞器蛋白质组学技术的迅猛发展，使高尔基体的全面研究变为可能。因此研究人员希望能以胃癌细胞中的高尔基体为研究对象，通过亚细胞器蛋白质组学方法，建立胃癌细胞中高尔基体的蛋白质组方法学。 研究人员采用蔗糖密度梯度的超速离心方法分离纯化高尔基体，双向凝胶电泳（2-DE）分离高尔基体蛋白质，用ImageMaster 2D软件分析所得图谱，基质辅助激光解吸离子化飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）鉴定蛋白质点等一系列亚细胞器蛋白质组学方法建立了胃癌细胞内高尔基体的蛋白图谱。 最后，人们根据分离出的纯度较高的高尔基体建立了分辨率和重复性均较好的双向电泳图谱，运用质谱技术鉴定出12个蛋白质，包括蛋白合成相关蛋白、膜融合蛋白、调节蛋白、凋亡相关蛋白、运输蛋白和细胞增殖分化相关蛋白。通过亚细胞器分离纯化、双向电泳的蛋白分离及MALDI-TOF MS蛋白鉴定分析，研究人员首次成功建立了胃癌细胞SGC7901中高尔基体的蛋白质组学技术路线。 蛋白质功能预测工具 也许生物信息学方法在癌症研究中最常用的就是基因功能预测方法，但是这些数据库只存储了基因组的大约一半基因的功能。为了在微阵列资料基础上完成功能性的富集分析，基因簇的功能注解是非常重要的。近几年生物学家研发了一些基因功能预测的方法，这些方法旨在超越传统的BLAST搜索来预测基因的功能。基因功能预测可以以氨基酸序列、三级结构、与之相互作用的配体、相互作用过程或基因的表达方式为基础。其中最重要的是基于氨基酸序列的分析，因为这种方法适合于微阵列分析的全部基因。 在表3中，前三项列举了三种同源搜索方法。FASTA方法虽然应用还不太广泛，但它要优于BLAST，或者至少相当。FASTA程序是第一个使用的数据库相似性搜索程序。为了达到较高的敏感程度，程序引用取代矩阵实行局部比对以获得最佳搜索。美国弗吉尼亚大学可以提供这项程序的地方版本，当然数据库搜索结果依赖于要搜索的数据库序列。如果最近的序列数据库版本在弗吉尼亚大学不能获得，那么就最好试一下京都大学（Kyoto University）的KEGG 站点。PSI-BLAST（位点特异性反复BLAST）是BLAST的转化版本，PSI-BLAST的特色是每次用profile搜索数据库后再利用搜索的结果重新构建profile，然后用新的profile再次搜索数据库，如此反复直至没有新的结果产生为
蛋白质数据库
生物芯片北京国家工程研究中心 湖南中药现代化药物筛选分中心 暨湖南涵春生物有限公司 常用数据库名录 1、蛋白质数据库 PPI - JCB 蛋白质与蛋白质相互作用网络 ?Swiss-Prot - 蛋白质序列注释数据库 ?Kabat - 免疫蛋白质序列数据库 ?PMD - 蛋白质突变数据库 ?InterPro - 蛋白质结构域和功能位点 ?PROSITE - 蛋白质位点和模型 ?BLOCKS - 生物序列分析数据库 ?Pfam - 蛋白质家族数据库 [镜像： St. Louis (USA), Sanger Institute, UK, Karolinska Institutet (Sweden)] ?PRINTS - 蛋白质 Motif 数据库 ?ProDom - 蛋白质结构域数据库 (自动产生) ?PROTOMAP - Swiss-Prot蛋白质自动分类系统 ?SBASE - SBASE 结构域预测数据库 ?SMART - 模式结构研究工具 ?STRING - 相互作用的蛋白质和基因的研究工具
?TIGRFAMs - TIGR 蛋白质家族数据库 ?BIND - 生物分子相互作用数据库 ?DIP - 蛋白质相互作用数据库 ?MINT - 分子相互作用数据库 ?HPRD - 人类蛋白质查询数据库 ?IntAct - EBI 蛋白质相互作用数据库 ?GRID - 相互作用综合数据库 ?PPI - JCB 蛋白质与蛋白质相互作用网络 2、蛋白质三级结构数据库 ?PDB - 蛋白质数据银行 ?BioMagResBank - 蛋白质、氨基酸和核苷酸的核磁共振数据库?SWISS-MODEL Repository - 自动产生蛋白质模型的数据库 ?ModBase - 蛋白质结构模型数据库 ?CATH - 蛋白质结构分类数据库 ?SCOP - 蛋白质结构分类 [镜像: USA | Israel | Singapore | Australia] ?Molecules To Go - PDB数据库查询 ?BMM Domain Server - 生物分子模型数据库 ?ReLiBase - 受体/配体复合物数据库 [镜像： USA] ?TOPS - 蛋白质拓扑图 ?CCDC - 剑桥晶体数据中心 (剑桥结构数据库 (CSD))
蛋白质相互作用数据库和分析方法
蛋白质相互作用数据库和分析方法 1. 蛋白质相互作用的数据库 蛋白质相互作用数据库见下表所示： 数据库名 说明 网址 BIND 生物分子相互作用数据库 http://bind.ca/ DIP 蛋白质相互作用数据库 https://www.wendangku.net/doc/5b1913900.html,/ IntAct 蛋白质相互作用数据库 https://www.wendangku.net/doc/5b1913900.html,/intact/index.html InterDom 结构域相互作用数据库 https://www.wendangku.net/doc/5b1913900.html,.sg/ MINT 生物分子相互作用数据库 http://mint.bio.uniroma2.it/mint/ STRING 蛋白质相互作用网络数据库 http://string.embl.de/ HPRD 人类蛋白质参考数据库 https://www.wendangku.net/doc/5b1913900.html,/ HPID 人类蛋白质相互作用数据库 http://wilab.inha.ac.kr/hpid/ MPPI 脯乳动物相互作用数据库 http://fantom21.gsc.riken.go.jp/PPI/ biogrid 蛋白和遗传相互作用数据，主要来自于酵母、线虫、果蝇和人 https://www.wendangku.net/doc/5b1913900.html,/ PDZbase 包含PDZ 结构域的蛋白质相互作用数据库 https://www.wendangku.net/doc/5b1913900.html,/services/pdz/start Reactome 生物学通路的辅助知识库 https://www.wendangku.net/doc/5b1913900.html,/ 2. 蛋白质相互作用的预测方法 蛋白质相互作用的预测方法很非常多，以下作了简单的介绍 1) 系统发生谱 这个方法基于如下假定：功能相关的(functionally related)基因，在一组完全测序的基因组中预期同时存在或不存在，这种存在或不存在的模式(pattern)被称作系统发育谱；如果两个基因，它们的序列没有同源性，但它们的系统发育谱一致或相似．可以推断它们在功能上是相关的。
蛋白质-蛋白质相互作用
蛋白质-蛋白质相互作用 蛋白质与蛋白质之间相互作用构成了细胞生化反应网络的一个主要组成部分，蛋白-蛋白互作网络与转录调控网络对调控细胞及其信号有重要意义。把原来spaces空间上的一篇蛋白质与蛋白质间相互作用研究方法转来，算是实验技巧分类目录的首篇。(另补充2：检测两种蛋白质之 间相互作用的实验方法比较) 一、酵母双杂交系统 酵母双杂交系统是当前广泛用于蛋白质相互作用组学研究的一种重要方法。其原理是当靶蛋白和诱饵蛋白特异结合后，诱饵蛋白结合于报道基因的启动子，启动报道基因在酵母细胞内的表达，如果检测到报道基因的表达产物，则说明两者之间有相互作用，反之则两者之间没有相互作用。将这种技术微量化、阵列化后则可用于大规模蛋白质之间相互作用的研究。在实际工作中，人们根据需要发展了单杂交系统、三杂交系统和反向杂交系统等。Angermayr等设计了一个SOS蛋白介导的双杂交系统。可以研究膜蛋白的功能，丰富了酵母双杂交系统的功能。此外，酵母双杂 交系统的作用也已扩展至对蛋白质的鉴定。 二、噬茵体展示技术 在编码噬菌体外壳蛋白基因上连接一单克隆抗体的DNA序列，当噬菌体生长时，表面就表达出相应的单抗，再将噬菌体过柱，柱上若含目的蛋白，就会与相应抗体特异性结合，这被称为噬菌体展示技术。此技术也主要用于研究蛋白质之间的相互作用，不仅有高通量及简便的特点，还具有直接得到基因、高选择性的筛选复杂混合物、在筛选过程中通过适当改变条件可以直接评价相互结合的特异性等优点。目前，用优化的噬菌体展示技术，已经展示了人和鼠的两种特殊细胞系的cDNA文库，并分离出了人上皮生长因子信号传导途径中的信号分子。 三、等离子共振技术 表面等离子共振技术(Surface Plasmon Resonance，SPR)已成为蛋白质相互作用研究中的新手段。它的原理是利用一种纳米级的薄膜吸附上“诱饵蛋白”，当待测蛋白与诱饵蛋白结合后，薄膜的共振性质会发生改变，通过检测便可知这两种蛋白的结合情况。SPR技术的优点是不需标记物或染料，反应过程可实时监控。测定快速且安全，还可用于检测蛋白一核酸及其它生物大分子之间 的相互作用。 四、荧光能量转移技术
蛋白质相互作用教学提纲
蛋白质相互作用
蛋白质相互作用的概述 一、为什么要研究蛋白质相互作用 二、蛋白质相互作用亲和力：K d=[A][B]/[AB] 三、蛋白质相互作用的应用 A、利用抗原和抗体的相互作用：Western blot，免疫共沉淀，染色质沉淀，抗体筛库 B、利用已知的相互作用建立tag：GST pull down，Biotin－Avidin结合， C、直接利用蛋白质的相互作用：蛋白质亲和层析，酵母双杂交，phage display，Bait蛋白质筛表达库，蛋白质组 四、相互作用的生物学意义：蛋白质间的相互作用是细胞生命活动的基础。 五、生物学功能的研究：获得功能或失去功能 I、一些常用蛋白质相互作用技术 ?Traditional co-purification (chromatography co-purification and co-sedimentation) ?Affinity chromatography：GST pull down，Epitope-tag ?(co-)Immunoprecipitation ?Western和 Far-Western blot Surface Plasmon Resonance Two-Hybrid System Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) （实验过程及原理，注意事项，优缺点） III、研究实例讨论 一、酵母双杂交系统 作用：发现新的相互作用蛋白质；鉴定和分析已有的蛋白质间的相互作用；确定蛋白质相互作用的功能基团 具体过程：见书本 优点：是酵母细胞的in vivo相互作用；只需要cDNA，简单；弱的相互作用也能检测到 缺点：都是融合蛋白，万一融合出新的相互作用；酵母的翻译后修饰不尽相同，尤其是蛋白质的调控性修饰；自身激活报告基因；基因库德要求比较高，单向1/3是in frame 蛋白质毒性；第三者Z插足介导的相互作用；假阳性 酵母双杂交系统是当前广泛用于蛋白质相互作用组学研究的一种重要方法。其原理是当靶蛋白和诱饵蛋白特异结合后，诱饵蛋白结合于报道基因的启动子，启动报道基因在酵母细胞内的表达，如果检测到报道基因的表达产物，则说明两者之间有相互作用，反之则两者之间没有相互作用。将这种技术微量化、阵列化后则可用于大规模蛋白质之间相互作用的研究。在实际工作中，人们根据需要发展了单杂交系统、三杂交系统和反向杂交系统等。 （1）原理： 将编码某一蛋白X的DNA序列与DNA结合域BD的编码序列融合形成一个杂交体，将编码另一蛋白Y的DNA序列与DNA激活域AD 的编码序列融合形成另一个杂交体，当两个杂交体共转化酵母细胞（此酵母细胞上游有DNA结合位点的报告基因），若X和Y没有相互作用，则单独不能激活报告基因的转录；若X和Y可相互作用，则使BD和AD靠近形成一个有效的转录激活子，激活报告基因的转录。因此可通过检测报告基因的转录来研究蛋白质X和Y的相互作用。 (2)应用范围 1）已知蛋白之间相互作用的检测： 2）蛋白质的功能域研究：通过对其中某一个蛋白质作缺失或定点突变，再用此系统检测是否还存在相互作用，可阐明其功能域或关键氨基酸； 3）克隆新基因和新蛋白：将感兴趣的蛋白质基因与BD基因构建成“诱饵”表达质粒，将某一器官或组织的cDNA文库与AD基因构建成“猎物”基因库，共转化酵母细胞，可筛到与感兴趣蛋白质相互作用的蛋白质的cDNA序列，并推测其蛋白质序列。 1）二、噬茵体展示技术 2）
研究蛋白质与蛋白质相互作用方法总结
研究蛋白质与蛋白质相互作用方法总结 蛋白质与蛋白质之间相互作用构成了细胞生化反应网络的一个主要组成部分，蛋白-蛋白互作网络与转录调控网络对调控细胞及其信号有重要意义。 一、酵母双杂交系统 酵母双杂交系统是当前广泛用于蛋白质相互作用组学研究的一种重要方法。其原理是当靶蛋白和诱饵蛋白特异结合后，诱饵蛋白结合于报道基因的启动子，启动报道基因在酵母细胞内的表达，如果检测到报道基因的表达产物，则说明两者之间有相互作用，反之则两者之间没有相互作用。将这种技术微量化、阵列化后则可用于大规模蛋白质之间相互作用的研究。在实际工作中，人们根据需要发展了单杂交系统、三杂交系统和反向杂交系统等。Angermayr等设计了一个SOS蛋白介导的双杂交系统。可以研究膜蛋白的功能，丰富了酵母双杂交系统的功能。此外，酵母双杂交系统的作用也已扩展至对蛋白质的鉴定。 二、噬茵体展示技术 在编码噬菌体外壳蛋白基因上连接一单克隆抗体的DNA序列，当噬菌体生长时，表面就表达出相应的单抗，再将噬菌体过柱，柱上若含目的蛋白，就会与相应抗体特异性结合，这被称为噬菌体展示技术。此技术也主要用于研究蛋白质之间的相互作用，不仅有高通量及简便的特点，还具有直接得到基因、高选择性的筛选复杂混合物、在筛选过程中通过适当改变条件可以直接评价相互结合的特异性等优点。目前，用优化的噬菌体展示技术，已经展示了人和鼠的两种特殊细胞系的cDNA文库，并分离出了人上皮生长因子信号传导途径中的信号分子。 三、等离子共振技术 表面等离子共振技术(Surface Plasmon Resonance，SPR)已成为蛋白质相互作用研究中的新手段。它的原理是利用一种纳米级的薄膜吸附上“诱饵蛋白”，当待测蛋白与诱饵蛋白结合后，薄膜的共振性质会发生改变，通过检测便可知这两种蛋白的结合情况。SPR技术的优点是不需标记物或染料，反应过程可实时监控。测定快速且安全，还可用于检测蛋白一核酸及其它生物大分子之间的相互作用。 四、荧光能量转移技术
人类细胞表面IgSF相互作用组揭示蛋白质-蛋白质相互作用的复杂网络
人类细胞表面IgSF相互作用组揭示蛋白质-蛋白质相互作 用的复杂网络 导读 细胞表面蛋白的相互作用（PPIs）对于介导细胞间的通讯、识别和应答具有重要作用。本研究开发了一套高通量基于ELISA的细胞外相互作用组分析平台并整合自动池化蛋白策略，对564种人细胞表面蛋白和分泌蛋白（大部分为免疫球蛋白超家族（IgSF）蛋白）进行相互作用组分析，检测了所有318,096个PPI组合。进一步的系统进化同源性分析，发现约380个以前未报告的PPIs，并利用表面等离振子共振和细胞结合实验验证了其中一个子集。PPIs揭示了生物系统内部和生物系统之间相互作用的复杂庞大的网络，同时确定了与受体以及“孤儿”受体结合的新型PPIs。这些PPIs包括在多种细胞类型上表达的蛋白质，并参与多种过程（如免疫和神经系统的发育和功能、分化/增殖、代谢、血管生成和增殖），有助于进一步的功能相关性研究和药物靶点的发现。 实验设计如下
结果 1 用于PPI筛选的蛋白质的选择和生产 为鉴定人类IgSF蛋白，研究者利用HUGO基因命名委员会（HGNC）、人蛋白质图谱和UniProt 数据库，通过“诱饵”和“猎物”多聚结构域将感兴趣的458个IgSF和106个非IgSF蛋白的胞外结构域（ECDs）和分泌蛋白聚集到细胞上清中（图1A和1B），并通过Western blot验证其表达。本研究及其它团队都已证明基于ELISA的细胞外相互作用组测定（ECIA）和其他基于ELISA的结合实验均能在蛋白量表达很低的情况下检测到PPIs。因此认为无论是否检测到蛋白质，所有诱饵和猎物都包括在筛选中。 2 自动汇集猎物ECIA平台的开发 ECIA和其他基于ELISA的检测方法允许直接从培养基中检测诱饵和猎物蛋白的结合（图1B），对每孔的猎物-诱饵对进行分析。为增加通量，研究者池化三组猎物，并在筛选后对阳性孔去卷积化以鉴定PPIs（图1B）。用一组已知的PPIs进行池化实验显示，猎物经过3倍稀
检测蛋白质与蛋白质之间相互作用的实验技术
一、检测蛋白质与蛋白质相互作用 ① FRET技术（in vivo） FRET，Fluorescence resonance energy transfer，即荧光共振能量转移技术。该技术的原理是用一种波长的光激发某种荧光蛋白后，它释放的荧光刚好又能激发另一种荧光蛋白，使其释放另一波长的荧光，如下图所示： 以下图为例，若要利用FRET检测两种蛋白是否有相互作用，需将两种蛋白的基因分别与这两种荧光蛋白的基因融合，并在细胞内表达出两种融合蛋白。然后只需用紫外光对CFP进行激发，并检测GFP是否放出绿色荧光。如果能检测到绿色荧光，那么可以说明这两种蛋白可能有相互作用；反之，则是这两种蛋白没有相互作用。 ②酵母双、三杂交技术（in vivo） 酵母双杂交系统主要用于考察两种蛋白是否有相互作用，其原理是典型的真核生长转录因子，如GAL4、GCN4等都含有二个不同的结构域，即AD和BD。这些转录因子只有同时具有这两个结构域时才能起始转录。由此，设计不同的两个载体，一个含有AD基因（假设为A载体），另一个含有BD基因（假设为B载体）。 一般将一个已知蛋白的基因连在B载体上，作为诱饵(Bait)，将未知蛋白的基因连在A载体上，将这两个载体都转到特定的酵母细胞内，看未知蛋白与已知蛋白是否有相互作用。如果两者有相互作用，那么就可以启动报告基因的转录，从而使这个酵母细胞能在选择培养基上显现出来或者生存下来；如果两者无相互作用，那么报告基因就无法表达，那么这个酵母细胞就无法在择培养基上显现出来或者生存下来，如下图所示：
由于酵母双杂交系统不能鉴定膜蛋白间的相互作用，因此又发展出了分离泛素酵母双杂交系统。该系统的原理如下图所示： 如图所示，将泛素蛋白拆分为两个片段，即C端段(Cub)和N端段(NubG)，并在C端段的N端接上一个LexA-VP16转录因子，此时它并不能激活基因转录（因为它被限制在了C端段上，不能进入细胞核发挥作用）。 将该C端段连到一个膜蛋白上，将N端段连接到另一个膜蛋白上。若两个膜蛋白有相互作用，那么两个膜蛋白在相互靠近时会使泛素蛋白的N端段和C端段靠近结合，形成一个完整的泛素蛋白。此时泛素蛋白酶体会将这一段被泛素标记的片段降解，那么连接C端段的LexA-VP16转录因子掉落，即可进入细胞核启动标记基因的表达。 酵母三杂交的原理与双杂交一样，只是它研究的是两个蛋白和第三个成分间的相互作用，通过第三个成分使两个蛋白相互靠近。第三个成分可以是：蛋白、RNA或小分子，如下图所示： 如上图所示，在加入第三种成分前，蛋白X与蛋白Y之间并无直接相互作用，因此无法使BD和AD靠近，报告基因不能表达；当加入第三种成分后，蛋白X与蛋白Y的距离被拉近，BD和AD靠近，报告基因表达，从而可以被检测到。 ③ Pulldown技术（in vitro） Pulldown，即蛋白沉降技术，它是建立在蛋白质亲和层析的基础上的一种检测蛋白质间相互作用的分析方法。亲和层析的原理如下图所示，不同蛋白对配体的亲和程度不同，因此可以先将非特异结合的蛋白用低浓度缓冲液给清洗出去，只剩目的蛋白与层析柱结合，然后再用洗脱液将目的蛋白洗脱下来，达到纯化目的蛋白的作用。
蛋白质相互作用研究方法
2.1酵母双杂交该系统由Fields 和Song[3]首先在研究真核基因转录调控时建立。利用真核生长转录因子的两个不同的结构域：DNA结合结构域(DNAbinding domain)和转录激活结构域(transcription-activating domain)，分别与目标蛋白X 及可能与目标蛋白相互作用的蛋白Y 相连，并共同转入酵母细胞。如果蛋白X与Y能够发生相互作用就能使转录因子原来分开的两部分结合，形成完整的活性形式从而激活下游报告基因。通过检测报告基因的表达产物就可判断两种蛋白是否发生相互作用[4~5]。 这一经典的蛋白相互作用研究方法接近于体内环境，那些瞬时、不稳定的两两相互作用也可以被检测到，并且与内源蛋白的表达无关[6]。鉴于这些优点并结合简便高效的Gateway表达载体构建方法[7]，在大规模的蛋白质－蛋白质相互作用研究中酵母双杂交系统得到了最为广泛的应用。Rain 等[8]用该法绘制了人类胃肠道病原菌Helicobacter pylori 的大规模蛋白质相互作用图谱。在261 种蛋白中，确立了1200 种相互作用关系，涵盖了整个蛋白质组得46. 6%。随后，Giot 等[9]和Li 等[10]在果蝇和线虫中也成功地研究了大规模的蛋白质相互作用。除了对模式生物的研究外，Stelzl 等[11]和Raul 等[12]则先后分析了人脑组织、人已知ORF中大规模的蛋白质相互作用网络。但酵母双杂交方法本身也有一定的局限性：(1)不能研究具有自激活特性的蛋白质；(2)只能检测两个蛋白间的相互作用；(3)检测的相互作用需发生在细胞核内，对于不能定位到细胞核中的蛋白质无法研究；(4)大部分实验中有将近50%的假阳性率，且推测的相互作用仅有3% 在两种以上的实验中得到验证。为了弥补方法本身的缺点及局限性，研究者也不断地对其进行完善和改进。Stelzl 等[11]在研究中就采用了以下的策略：(1)选择不同功能、不同大小的蛋白作为诱饵，以确保所选靶蛋白在整个蛋白质组中的代表性；(2)筛选过程中采用两轮杂交的方法：第一轮以混合诱饵(8 个)对文库进行筛选，结果呈阳性的克隆再进行一对一的第二轮杂交，这样既降低了工作量又提高了结果的准确性；(3)pull-down，免疫共沉淀对酵母双杂交的结果进行体内的相互作用验证；(4)利用生物信息学的方法对结果进行系统分析，包括基因的染色体定位、蛋白质作用网络的拓扑结构分析等，从多方面分析结果的可信度。据此，他们最终确认了911 对高可信度的相互作用涉及到401 种蛋白，数据分析中设立了6 个标准来判定得到的结果，大大提高了酵母双杂交实验结果的可信度。生物秀-专心做生物2.2串联亲和纯化Rigaut 等[13]首次采用串联亲和纯化技术(tandem affinity purification，TAP)研究了蛋白间的相互作用，与其他融合标签方法的最大不同是该方法选用了两个连续的标签而不是通常意义上的一个。标签共分三部分：蛋白A 、C B P (calmodulin binding peptide，钙调素结合多肽)和中间连接的TEV 酶识别的酶切位点。带有TAP 标签的融合蛋白在细胞中表达与内源相互作用蛋白形成复合物，细胞裂解后经IgG 偶联的层析柱纯化，蛋白A 与IgG 特异结合，从而使含有标签的复合物得到第一次纯化。为了除去与柱填料非特异结合的蛋白，用TEV 酶切割分离蛋白A 标签，使含有靶蛋白的复合物与层析柱分离并经过钙调素偶联的亲和层析柱进行第二次纯化，靶蛋白上的CBP标签可与钙调素结合；在加入过量螯合剂EGTA后CBP 与亲和层析柱分离使含有靶蛋白的复合体得到分离纯化，经SDS-PAGE，复合物中的各个蛋白被分开，切胶、胰酶消化后，即可通过质谱鉴定复合物中各个蛋白的氨基酸序列(图1)。该方法的优点：(1)不需要过多的背景知识就可以得到大量含靶蛋白的复合体；(2)蛋白表达及与复合物的结合都接近生理水平，是一种检测体内蛋白相互作用的方法；(3)TAP 采用两步亲和纯化，提高了纯化产物的特异性。一般在2L 的酵母培养基中(细胞湿重约10g)可以分离纯化得到足够一维电泳及质谱分析的蛋白复合物[ 1 5 ] 。 Gavin 等[16]采用TAP 结合质谱鉴定，对啤酒酵母的多蛋白复合物进行了大规模的研究。共分析了1 739 个基因其中与人类基因相关的有1 143 个，纯化了589 种蛋白，经生物信息学分析，它们分属于232 个不同的多蛋白复合体；在细胞中具有新功能的为344 个，231 个蛋白的功能以前未见报道。由于TAP/MS方法的高灵敏性使得仅有15个拷贝的蛋白