噬菌体裂解液的制备和菌种的保藏、噬菌体效价的测定、细菌转导测定、凝聚反应、沉淀反应

P1噬菌体转导敲除基因的实验步骤

P1噬菌体转导基因敲除操作步骤 实验室常用大肠杆菌基因敲除方法为P1噬菌体转导敲除。 大肠杆菌利用噬菌体为媒介，将供体细胞DNA转移给受体细胞，从而使受体细胞的基因型 和表现型发生改变，这一过程称为转导。P1噬菌体的DNA分子量为5.8×107Da，在复制过程中， 头部包装时容易发生错误包装，可将其宿主菌（供体菌）的基因组DNA误包入蛋白质衣壳内。 当用这一噬菌体裂解液侵染新的宿主菌（受体菌）时，供体菌的DNA片段可随P1噬菌体进入受 体菌内，并可以与受体菌基因进行同源重组，从而永久性的存在于受体菌基因组上。P1转导的频 率一般很低，需要选择性标记进行转导子筛选，本实验中为卡那霉素抗性基因（KmR）。 准备材料 LB液体试管，LB半固体培养基，LB固体培养基，20%（w/v）葡萄糖溶液，1M CaCl2溶液，1M MgSO4溶液，氯仿，1M柠檬酸三钠溶液； 效价109-1010（pfu/mL） P1噬菌体储液，大肠杆菌溶源性供体菌，大肠杆菌受体菌； TM buffer：10mM Tris-HCl（pH7.4）buffer加入10mM MgSO4； P1盐溶液：10mM CaCl2与5mM MgSO4的混合溶液； 实验步骤 平板培养法 准备野生菌种子液 自保存甘油管或划线培养平板上，转接到3mL LB液体试管中，37℃，250rpm，培养过夜 （12hr）。 制备野生型P1噬菌体 1.将野生型菌株的过夜种子液，按1%（v/v）转接5mL LB液体试管，摇床培养至对数中期 （~2*108细胞/mL，OD600=0.2~0.3）。 2.加入5mM CaCl2，继续培养至菌体细胞OD600=1。 3.取出野生菌培养液，低温聚菌，加入2倍体积的TM buffer重悬菌体。 4.倒下层平板，LB固体培养基中加入5mM CaCl2。 5.取2.5mL半固体LB培养基，加入0.25mL重悬菌液，混合均匀后倒在下层平板上，轻柔 地倾斜平板使其均匀地覆盖在下层培养基表面。（注意培养基的温度不可过高，以手触摸时感觉温度舒适，建议先分别分装到15mM无菌离心管内，待凉到温度适宜后加入菌液，迅速混匀倒平 板。） 6.待琼脂凝固后，点10ul P1噬菌体储液在上层细胞琼脂表面。待噬菌体储液被上层琼脂吸 收后，将平板正置放置37℃培养过夜。对照板只有细胞，同样正置培养。（spot方法获得 的噬菌体效价虽然高，但量太少，可能无法满足后续实验需求，可在步骤5中与上层细胞琼脂同时 混合后倒平板，亦可获得高效价噬菌体） 7.计算效价，刮取噬菌体。 转导大肠杆菌供体菌（keio collection） 1.准备供体菌种子液，同野生型菌体。 2.接种100uL至5mL LB液体试管中，接种前在LB液体中加入0.1%（w/v）葡萄糖。需接 种两支试管，一支做对照用。振荡培养约1.5hr，至菌体达到对数生长期 （OD600=0.2~0.3）。

(精编)2020年高考生物一轮复习专题噬菌体侵染细菌的实验每日一题

专题噬菌体侵染细菌的实验 T2噬菌体侵染细菌的部分实验如下图所示。下列叙述正确的是 A．①中噬菌体为子代DNA复制提供了模板和逆转录酶 B．适当时间保温后进行②操作，使细菌外的噬菌体外壳与细菌分离C．由该图分析可知，实验结果可说明DNA是主要的遗传物质 D．该实验得到的子代噬菌体中，大多数含有放射性32P 【参考答案】B “二看法”判断子代噬菌体标记情况 1．下列关于T2噬菌体侵染细菌实验的叙述，正确的是

A．T2噬菌体的蛋白质外壳中只含有S元素 B．T2噬菌体侵染细菌时利用细菌的DNA作为模板进行DNA复制 C．35S标记的T2噬菌体侵染细菌后，沉淀物中含有少量放射性可能是因为35S进入了宿主细胞 D．32P标记的T2噬菌体侵染细菌后，释放的大量子代T2噬菌体中含32P的个体所占的比例很小 2．1952年，赫尔希和蔡斯用35S和32P分别标记T2噬菌体时，做法是 A．分别用含35S和32P的人工培养基培养T2噬菌体 B．分别用含35S和32P的培养基培养细菌，再分别用上述细菌培养T2噬菌体 C．分别将35S和32P注入鸡胚，再用T2噬菌体感染鸡胚 D．分别用含35S和32P的动物血清培养T2噬菌体 3．有a、b两类噬菌体，它们均己被32P或35S中的一种标记过。将a、b噬菌体分别侵染甲、乙两管大肠杆菌，经保温、搅拌和离心后，检测离心管内放射性物质的位置，结果如下图。下列叙述正确的是 A．实验结果表明a的蛋白质外壳和b的DNA均有放射性 B．可以确定甲管的放射性来自32P，乙管的放射性来自35S C．检测结果表明噬菌体的DNA和蛋白质可侵入大肠杆菌内 D．伴随着噬菌体DNA的复制，乙管内沉淀物的放射性将逐渐增强 4．在噬菌体侵染细菌的实验中，随着培养时间的延长，培养基内噬菌体与细菌的数量变化如图所示，下列相关叙述不正确的是 A．噬菌体增殖所需的原料、酶、能量均来自细菌 B．在t0~t1时间内，噬菌体还未侵入到细菌体内 C．在t1~t2时间内，噬菌体侵入细菌体内导致细菌大量死亡 D．在t2~t3时间内，噬菌体因失去寄生场所而停止增殖

噬菌体效价及转导实验

噬菌体效价测定及转导 姓名 学号： 系别：生命科学学院生物科学专业 班号： 实验日期：4月26日、5月3日 同组同学： 实验目的 1.学习噬菌体效价测定的方法 2.了解转导原理、学习转导实验方法

实验材料 菌种：E. coli K12 F、E. coli K12S、噬菌体裂解液 培养基：牛肉膏蛋白胨液体培养基、 EMB培养基、牛肉膏蛋白胨固体培养基 实验原理 1.噬菌体的效价就是一毫升培养液中所含活噬菌体的数量。效价测定的方法，一般应用双层琼脂平板法。由于含有特异宿主细菌的琼脂平板上，一个噬菌体产生一个噬菌斑 2.噬菌体的悬浮液是由双重溶源菌（内含一个λ及一个λdg两种噬菌体）裂解而来的，因此λ及λdg两种噬菌体是等量的。 3. λ噬菌体能够侵染大肠杆菌并能使其裂解，因此能够形成噬菌斑；λdg噬菌体能够侵染大肠杆菌但不能使其裂解，因此不能够形成噬菌斑 4.噬菌体效价/噬菌体数/ml=每皿平均噬菌斑数*稀释倍数/0.5ml*2 （λdg不能够形成噬菌斑且其数量与λ相等，因此计算时乘以2） 5. λdg是缺陷型噬菌体，其基因组上带有宿主菌的发酵半乳糖的基因。当λdg侵染S菌的时候，就能够使得S菌具有发酵半乳糖的能力，因此菌落也会显现出发酵半乳糖的特征（菌落有金属光泽）。 6.转导子数/ml=每皿平均转导子数*稀释倍数/0.1ml*2 （因为裂解液为0.5ml，所以要乘以2）；转导频率=转导子/ml./噬菌体效价*100% 实验步骤 一、噬菌体效价的测定 1）熔化100mlEMB固体培养基、100ml牛肉膏蛋白胨固体培养基 2将熔化的EMB培养基中加入6.5ml的0.1%的美蓝和2ml的2%的伊红 3）用100ml熔化的EMB培养基倒六个平板。编号EMB1-EMB6 4）用100ml熔化的牛肉膏蛋白胨固体培养基倒4个平板。编号牛固1-牛固 5）水浴加热5管素琼脂，溶解后置于50摄氏度下保温。 6）稀释裂解液：取0.5ml裂解液，加入到4.5ml牛肉膏蛋白胨液体培养基，稀释成了10^-1的稀释液，以此方法，再稀释到10^-2、10^-3、10^-4.并做好标记。

噬菌体治疗细菌感染的研究进展

第42 卷第 6 期 2013 年 浙江大学学报（医学版） JOUＲNAL OF ZHEJIANG UNIVEＲSITY （MEDICAL SCIENCES） Vol 42 No 6 2013 http：∥www．journals．zju．edu．cn / med DOI：10．3785 / j．issn．1008-9292．2013．06．019 噬菌体治疗细菌感染的研究进展 裴景亮1，付玉荣2综述 （1．潍坊医学院医学检验学系、附属医院检验科、 山东省临床检验诊断学高校重点实验室，山东潍坊261031； 2．潍坊医学院基础医学院病原生物学教研室，山东潍坊261053） ［摘要］噬菌体是一种细菌依赖性病毒，在治疗细菌特别是耐药性细菌感染方面，与传统的抗 生素比较具有独特的优势，其代谢动力学及给药途径是目前的研究热点。噬菌体裂解酶作为一种 新的治疗手段，具有比活性噬菌体制剂更多的优点。文中就噬菌体在细菌感染治疗方面的作用机 理、给药途径和基因工程的应用，及噬菌体裂解素的研究进展进行综述，对噬菌体治疗细菌感染提 出展望。 ［关键词］细菌噬菌体；裂解酶；给药途径；细菌感染/治疗 ［中图分类号］Ｒ378 ［文献标志码］ A ［文章编号］1008-9292（2013）06-0700-05 Ｒesearch advance on bacteriophage therapy in bacterial infection PEI Jingliang1，FU Yurong2（1．Affiliated Hospital of Weifang Medical University，Key Laboratory of Clinical Diagnosis in Universities of Shandong，Weifang 261031；2．Department of Microbiology，Weifang Medical University，Weifang 261053） ［Abstract］Bacteriophage is a bacterium dependent virus．It has unique advantages in the treatment of bacterial infection，especially infection caused by drug-resistant bacteria．Its metabolic kinetics and route of administration are the current research focus．Bacteriophage lytic enzyme，as a new therapeutic method， has more advantages than active bacteriophage．This review is focused on the recent progress in bacteriophage research，including the mechanism of bacteria lysis，the route of administration，the application of genetic engineering，etc． ［Key words］Bacteriophages；Lytic enzymes；Ｒoute of administration；B acterial infection / therapy ［J Zhejiang Univ （Medical Sci），2013，42 （6）：700-704．］ 耐药菌特别是多重耐药菌的出现对人类健 收稿日期：2012-09-03 修回日期：2013-01-30 康构成了极大威胁，这类细菌感染的疾病面临无药可用的境地。寻找新的有效的抗菌制剂已 经成为刻不容缓的问题。噬菌体制剂作为新型 的治疗方法，受到越来越广泛的关注。 噬菌体（ bacteriophage，phage）是一类特异性感染细菌、真菌、放线菌等微生物的病毒，广基金项目：国家自然科学基金资助项目（81100006 ）； 山东省自然科学基金资助项目（ZＲ2010HM073）． 作者简介：裴景亮（1979 －），男，硕士，主管技师，从事临床微生物学研究工作． 通讯作者：付玉荣（1973 －），女，博士，副教授，硕导，从事病原微生物学研究；E-mail：yifuyurong@ 163．com

噬菌体效价实验

中国典型培养物保存中心 China Center for Type Culture Collection (CCTCC) 噬菌体效价实验 实验材料： 菌株：CCTCC AB 2013329（λ噬菌体溶原株）Escherichia coli K12 WK 6 λCCTCC AB 2013330（λ噬菌体敏感株）Escherichia coli C600 CR34 培养基：肉汤培养基；软琼脂：肉汤培养基中加入0.5%琼脂10ml/管 培养条件：NA培养基或LB培养基，37℃ 实验步骤： 7.5ml 新鲜E.coliλ菌液（CCTCC AB 2013329）离心 菌沉淀用1ml无菌水悬浮 菌悬液加在无菌平皿中央，开皿盖，在安全柜的紫外灯下照射15秒 （0.15mJ/cm2） 加入NA培养液5ml 37℃暗培养3小时 吸取以上菌液-培养液混合物，加1 - 0.5ml氯仿震荡后离心12000rpm2分钟 上清十倍稀释至10-7 选择10-5、10-6、10-7上清稀释液100ul 与100ul受体菌（CCTCC AB 2013330） 混合 37℃温浴20分钟 混合菌液加入到NA软琼脂（不烫手）中震荡混匀倒NA平板 实验结果： 稀释度为10-4的平板：布满噬斑不可数 稀释度为10-5的平板：噬斑346个 稀释度为10-6的平板：噬斑37个 稀释度为10-7的平板：噬斑4个

图1. 上一排为平板背面照片，下一排为平板正面照片。 教学建议： 噬菌体液体放置在室温下两周会导致数量下降一个数量级。 宿主菌必须是噬菌体敏感菌株CCTCC AB 2013330，教学用普通大肠菌和噬 菌体溶原菌株不能产生噬菌斑。 琼脂的浓度（1.5%-2.0%），过高或过低的琼脂含量均不能达到好的效果。 噬菌体与细胞的比例，测定噬菌体效价应采用低感染复数。 指示菌密度是在平板上获得清晰噬菌斑效果的重要因素之一，其细胞密度不 宜过高。一般控制在1ⅹ107个细胞/ml为宜。 实验教材： 沈萍，陈向东《微生物学实验》4版. 高等教育出版社.2007, 35-39. 王建波，方呈祥《遗传学实验教程》武汉大学出版社. 2004, 111-114.

噬菌体治疗细菌性疾病的研究进展

《专业外语》课程论文

噬菌体治疗细菌性疾病的研究进展 摘要噬菌体在被发现之初已经被尝试用于治疗细菌性疾病，后来由于抗生素的出现使之渐渐淡化出人们的眼球，但是对于现今很多细菌都对抗生素有很强的耐药性甚至出现了具有多重耐药性的超级细菌，使得重新重视起噬菌体治疗细菌性疾病的作用。本文主要综述了噬菌体对于治疗细菌性疾病的早期研究和最新进展。 关键词噬菌体裂解酶细菌性疾病 细菌性感染是感染性疾病中比较常见的类型，如果缺乏及时有效的治疗，严重的话可以导致很高死亡率[1]。例如每年由弯曲杆菌、沙门氏菌、O157大肠杆菌和单核细胞增多利斯特菌引起的食源性疾病就给人类带来巨大的经济损失和生命威胁。 在19世纪初Herelle发现噬菌体（bacteriophage，phage）[2,3]后，人们就曾经尝试采用噬菌体治疗细菌感染。但自抗生素的出现后人们就渐渐的淡化噬菌体的研究而大量的进行有关抗生素的研究，进而大量使用抗生素作为治疗细菌感染的有效途径，在前期抗生素的确有非常好的治疗效果，然而随着抗生素使用的泛滥，细菌的耐药性问题日益加剧，新抗生素研发的速度远远低于耐药菌产生的速度。由于新型抗生素的发现越来越困难，噬菌体治疗重新得到人们的重视，并且取得了一些不错的研究成果。 1 噬菌体及裂解酶的概况 噬菌体( Bacteriophage，简称phage)又叫细菌病毒，是一种可以侵入细菌细胞内，通过酶的用破坏细胞壁，使细菌裂解从而将其杀灭的病毒。噬菌体分为烈性噬菌体和温和性噬菌体，前者可在敏感宿主菌内增殖并使之裂解，亦称为毒性噬菌体（virulent phage）。 噬菌体裂解酶( Lysin或Endolysin)是双链DNA噬菌体所特有的、在病毒复制晚期合成的一类胞壁质水解酶。多数噬菌体具有编码3种细胞壁水解酶的基因，分别为裂解酶、酰胺酶和内肽酶，其中酰胺酶是国内外研究比较多的一种裂解酶。裂解酶的高亲和性与种属特异性的细胞壁糖基有关，而后者常常是细菌存活的必要成分。因此，细菌很难产生对裂解酶的抗性。 2 噬菌体的研究历史回顾 人们曾尝试用噬菌体治疗痢疾、手术伤口的皮肤感染,采用口服、局部外用、滴眼耳鼻等多种给药途径，治疗效果较好[4]。Bruynoghe和Maisin于1921年率先用噬菌体制剂治疗皮肤葡萄球菌感染[5]。1934年美国科学家就报道了噬菌体疗法抗肠球菌感染的成功率可达80%。近期各国研究者进行的动物试验及临床应用结果表明, 噬菌体治疗的效果是值得肯定的并且其效果受使用剂量和用药时间的限制较小。Smith等[6]用噬菌体治疗感染了大肠埃希氏菌的小鼠模型,结果发现给予1次后，小鼠体内的大肠埃希氏菌数量即下降，小鼠全部存活下来。在随后的研究，Smith发现利用专一性噬菌体可治疗由大肠埃希氏菌引起的猪、牛和羊的腹泻，所有经噬菌体治疗的动物都存活下来。所以噬菌体不失为一种安全性和治疗性都较好的药物。2002年, Bisw as采用耐万古霉素的肠道球菌对老鼠进行感染, 45m in后腹腔内注射一定剂量的噬菌体。保护力达到100%。即使在老鼠处于濒死状态的时候才注射噬菌体, 其保护力仍有50%。而没有进行噬菌体治疗的老鼠48h后几乎全部死亡。Bull等[7] 也证明, 即使是在小鼠感染后8h才使用噬菌体对其治疗仍不影响治愈率, 但使用抗生素治疗的小鼠成活率却大大降低。同时，大量的人体试验也证明了噬菌体治疗的安全性。2005年，

第四章 细菌和噬菌体的遗传分析

第四章细菌和噬菌体的遗传分析 例题1：酵母菌的中性小菌落的线粒体DNA有缺陷，但决定线粒体的核基因是正常的。分离性型小菌落的线粒体DNA是正常的，但带有一个决定线粒体有缺陷的隐性核基因。将这样的中性小菌落和分离型小菌落杂交。问：二倍体F1表型是什么？由二倍体细胞产生的子囊孢子发育成的单倍体世代的表型如何？（浙江大学2000年考研试题10分） 知识要点： 1．酵母菌是单细胞子囊菌，它的生活周期中具有形态上相同的 单倍体和二倍体世代交替。成熟的二倍体营养细胞可以进行出芽生 殖。但在某些环境条件下，二倍体细胞会进行减数分裂，形成单倍性 的四个子囊孢子，子囊孢子释放出来后长大形成单倍体成体细胞。 2．酵母菌二倍体细胞的形成是由两个单倍性的子囊孢子相互结 合形成，双方提供等量的核物质和细胞质。正常的核基因、正常的细胞质基因是显性3．酵母菌的小菌落类型分为分离性小菌落、中性小菌落、抑制 性小菌落。分离性小菌落是由于核基因发生了突变，表现为经典的孟德尔式遗传，与野生型大菌落杂交形成的二倍体细胞为正常的，二倍体细胞减数分裂形成的4个子囊孢子1/2发育成大菌落，1/2发育成小菌落；中性小菌落是由于细胞质中的线粒体上的基因发生了突变，大多数中性小菌落都是没有mtDNA，与野生型大菌落杂交形成的二倍体细胞为正常的，但此二倍体细胞减数分裂形成的4个子囊孢子全部发育成为大菌落；抑制性小菌落是许多突变型的表现，是由于核基因的突变或者是由于mtDNA的突变，或者两方面因素都存在。抑制性小菌落可以在二倍体中表现出来，完全抑制性的可以把二倍体细胞全部转变成小菌落的，也可以把由此产生的四个子囊孢子都转变成小菌落的。 解题思路： 1．根据知识要点1知道此二倍体F1是生活周期中的一个时期根据知识要点2知道此杂交产生的二倍体F1细胞质中有正常线粒体也有不正常线粒体，细胞核中有突变基因也有正常基因，因此，此二倍体F1的表现型为正常大菌落。 2．根据知识要点3知道此二倍体F1 减数分裂形成的四个子囊孢子的细胞质中有正常细胞质也有不正常细胞质，但是，有2个子囊孢子的核基因是突变的，有2个子囊孢子的核基因是正常的，因此，产生的4个子囊孢子的表现型为2正常大菌落，2小菌落。 标准答案： 二倍体F1表型是正常大菌落。

噬菌体侵染细菌的实验

噬菌体侵染细菌的实验教学设计 王莹 一、教材内容分析 《噬菌体侵染细菌的实验》是苏教版普通高中生物必修2《遗传与进化》中第4章第1节的内容。本部分内容之前已经介绍了格里菲斯和艾弗里的“肺炎双球菌的转化实验”。“噬菌体侵染细菌”的实验是更具有说服力的实验，其设计思路科学而缜密，值得学生借鉴和学习。本内容是从分子层面上认识遗传物质的本质，为学习DNA的复制，基因的表达和基因突变打下了基础 二、学习对象分析 高中必修一也在介绍原核生物与真核生物时，也了解了病毒是一种寄生的没有细胞结构的生物。可以简要跟学生介绍大肠杆菌和噬菌体，引发回忆。高中学校没有成熟的实验条件供学生亲自做噬菌体侵染细菌的实验，因此教师应该形象直观地展示科学探索的过程，引导学生的思路再现一遍科学家的实验探究过程，达到发展学生科学思维能力的目的。根据新课程理念，高中生物学教学重在培养学生的科学思维、科学探究，因此，本节课以“自主探究科学发现的过程”为设计理念，切实落实主体性教学，提高学生的探究能力，训练学生科学的思维方法。 三、教学策略 由“格里菲斯和艾弗里肺炎双球菌转化实验”的不足之处引入新内容，让学生思考如何对这一问题进行研究，提高说服力，培养他们分析问题和解决问题的能力，激发他们了解科学家当年的研究过程和方法的兴趣。通过重温科学家的探究历程，领会实验选材的巧妙、思维的严谨和实验方法的科学；通过实验结果的分析理解DNA是主要的遗传物质根据主体性教学目标，以“自主性、探究性、合作性”为学生学习的三个基本维度，以培养学生的科学素质为指导，以侧重科学方法教育为归宿，本节课采用“引导探究”教学模式，融合讨论法、比较法、归纳法等多种教学方法，并配以多媒体辅助教学，引导学生模拟科学发现过程，进行分析、讨论、归纳和总结。 采用“设疑导入→问题引导呈现探究过程→讨论实验结果→归纳总结→反馈运用”的教学程序。 四、教学目标 1、知识与技能： （1）进行“噬菌体侵染细菌”的实验设计； （2）描述“噬菌体侵染细菌”的实验步骤 2、情感态度和价值观： (1) 探讨实验技术在证明DNA是主要遗传物质中的作用。体验科学探索的艰辛过程； (2) )领悟科学研究的过程和方法，培养学生的实验探究能力。 五、教学重点和难点 1、重点：

实验十二 噬菌体效价的测定

实验十二噬菌体效价的测定 一、实验目的 1、学习并掌握噬菌体效价的测定原理。 2、学习并掌握双层琼脂平板法测定噬菌体效价。 二、实验原理 噬菌体属于细菌病毒，它不具备完整的细胞结构，只能通过寄主细胞完成自我复制。因此人类只有通过电子显微镜才可观察到它们的形态结构。但由于噬菌体侵染细菌细胞后，可导致寄主细胞裂解死亡，并在琼脂培养基表面形成是菌斑，所以人们可以此来判断噬菌体的存在。 当烈性噬菌体侵染敏感细菌后,会迅速引起敏感细菌裂解，释放出大量子代噬菌体，然后它们再扩散和侵染周围细胞，结果就会在菌苔上形成一个具有一定形状、大小、边缘和透明度的肉眼可见噬菌斑(plague)。 噬菌体的效价：１mL样品中所含侵染性噬菌体的粒子数。其测定常用双层琼脂平板法。由此得到的噬菌斑形态、大小较一致且清晰度高，计算准确。根据不同稀释度平板上出现的噬菌斑数目，即可算出原液噬菌体的效价。 双层琼脂平板的配制：底层平板（1.5~2％琼脂的LB培养基10ml)，将适当稀释的噬菌体与培养至对数期的受体菌混合，保温吸附，加入45°左右的半固体琼脂糖，迅速混匀铺平板作为上层。 计算公式：噬菌体效价(pfu/ml)=噬菌斑数×稀释倍数×10；（这里的10为换算单位，即实验中用到100μl噬菌体原液，换算成1000μl，即1ml时，要乘以10） 三、操作步骤 流程图 流程步骤目的 1、制备9套LB 固体培养基底层平板将融化并冷却至45℃左右的LB培养基倒入 无菌培养皿，每皿约10~12ml.水平放置，凝 固后做好稀释度标记。 1、提供细菌生长营养物质 2、提供更加平整的平面 2、制备噬菌体稀释液取0.5mL噬菌体原液于4.5mL无菌水中得到 10-1稀释液。再取0.5ml10-1稀释液于4.5ml 缓冲液中得到10-2稀释液。同理再制备10-3 稀释液，并在试管上标记备用。（稀释过程应 充分混匀） 通过连续稀释使单个噬菌 体吸附一个大肠杆菌细 胞。 3、制备受体菌细胞将感受态大肠杆菌接种于50ml LB培养液，经 过夜培养，离心收集菌体细胞，悬浮于20ml 10mM MgSO4中备用。 由实验员制备。 4、吸附用取样器分别取100μl 10-1、10-2、10-3噬菌 体稀释液和100μl受体菌细胞液，充分混合 后置于37℃恒温箱保温25min.并在离心管上 做好标记。 —— 5、制备上层平板用枪分别取350μL受体菌菌悬液和噬菌体稀 释液，加入到冷却至45℃左右的0.7%琼脂糖 中，迅速混匀，倒在有相应标记的底层平板， 边倒边摇匀。 防止琼脂糖凝固结块儿。 6、培养37℃倒置培养15~18h，检查结果。——

2012浙江工商大学研究生入试微生物学真题

浙江工商大学2011年硕士研究生入学考试试 卷（B）卷 招生专业：食品科学与工程、生物化工、环境工程、工程硕士 考试科目：827微生物学总分： 150分考试时间：3小时1、 判断题（每小题1分，共15分，答案写在答题纸 上。） 1. 真菌在进行准性生殖时，通过有丝分裂进行基因。 2. 一切好氧微生物都含有超氧化物歧化酶（SOD）。 3. 低剂量照射紫外线，对微生物几乎没有影响，但以超过某一阈 值剂量的紫外线照射，则会导致微生物的基因突变。 4. 溶源性细菌在一定条件诱发下,可变为烈性噬菌体裂解寄主细胞。 5. 吸器和假根都是营专性寄生吸收营养的菌丝的特殊形态。 6. 链霉菌是霉菌，其有性繁殖形成接合孢子。 7. 共生固N菌的防氧保护靠根瘤细胞中的豆血红蛋白，而自生固N 菌的防氧保护靠菌体的呼吸保护，蓝细菌固N靠异型胞两端的特殊构造控制氧气的进入。 8. 微生物分解蛋白质,核酸和其它含氮有机物为NH3的过程称为氨化作用。 9. 地衣是藻类和真菌的共生体是微生物之间典型的互惠共生关系。 10. 大多数嗜热菌的G-C含量高于中温菌。 11. 酒精的浓度越高，杀菌能力越强。 12. 在10 分钟内杀死某微生物的最低温度称为该微生物的致死温度。 13. 一分子葡萄糖经正型乳酸发酵可产2个ATP, 经异型乳酸发酵可产1个ATP。 14. 一种细菌只能被一种噬菌体感染。 15. 与单独处理相比，诱变剂的复合处理虽然不能使微生物的总突

A. 孢囊 B. 芽孢 C. 伴孢晶体 D. 子实体 5.苏云金芽孢杆菌伴孢晶体的化学成分是：（ ） A. 脂多糖 B. 磷脂 C. 蛋白质 D．核糖 6. Staphylococcus aureus是下列那种微生物的学名：（ ） A. 金黄色葡萄球菌 B. 黑曲霉 C. D. 酿酒酵母 7. ） A.青霉 B.曲霉 C.根霉 D.毛霉 8. 新陈代谢研究中的核心问题是（ ）。 A.分解代谢 B.合成代谢 C.能量代谢 D.物质代谢 9. 艾姆氏试验的原理是利用鼠伤寒沙门氏菌的（ ）缺陷型的回复突变。 D.his 10. 现发现一种只含不具侵染性RNA成分的分子病原体，它属于（ ）。 A.病毒 B.类病毒 C.拟病毒 D.朊病毒 11. 参与沼气发酵的微生物有：（ ） A. 产酸细菌 B. 产甲烷细菌 C. 好氧菌 D. A. B 二者皆是 12. 人类最先发现的抗生素产生菌是：（ ） A. 点青霉 B. 产黄青霉 C. 灰色链霉菌 D.降红小单孢菌 13. 细菌对抗生素的抗性决定于细菌细胞中的（ ） A. F质粒 B. R质粒 C. col 因子 D. 染色体 14. 硝酸盐在反硝化细菌的作用下能被还原为：（ ） A. NO2- B. NH3 C. N2 D. A，B，C 15 1克种植多年的菜园土中的微生物数量可以达到：（ ） 3 B. 10 4 C. 10 5 D. 106 A. 10 16. 空气并不是微生物良好的栖息繁殖场所因为：（ ） A. 缺乏营养 B. 高pH C. 夏季高温 D. 无固

噬菌体效价

噬菌体的分离纯化及效价的测定 1 目的 1.1 了解噬菌体效价的含义及其测定原理。 1.2 学会检查噬菌体的方法。 1.3 掌握用双层琼脂平板法测定噬菌体效价的操作技能。 2 原理 噬菌体是一类专性寄生于细菌和放线菌等微生物的病毒，其个体形态极其微小，用常规 微生物计数法无法测得其数量。 当烈性噬菌体侵染细菌后会迅速引起敏感细菌裂解， 释放出 大量子代噬菌体，然后它们再扩散和侵染周围细胞， 最终使含有敏感菌的悬液由混浊逐渐变 清，或在含有敏感细菌的平板上出现肉眼可见的空斑──噬菌斑。了解噬菌体的特性，快速 检查、分离，并进行效价测定，对在生产和科研工作中防止噬菌体的污染具有重要作用。 检样可以是发酵液、空气、污水、土壤等（至于无法采样而需检查的对象，可以用无菌 水浸湿的棉花涂拭表面作为检查样品）。为了易于分离可先经增殖培养，使样品中的噬菌体 数量增加。 因而不能及时判断是否有噬菌体污染。 采用生物测定法进行噬菌体检查， 约需 12h左右， 通过快速检查可大致确定是否有噬菌体污染， 以采取必要的防治措施。 根据正常发酵 （培养） 液离心后菌体沉淀，上清液蛋白含量很少，加热后仍然清亮； 而侵染有噬菌体的发酵 （培养） 液经离心后其上清液中因含有自裂解菌中逸出的活性蛋白，加热后发生蛋白质变性，因而在 光线照射下出现丁达尔效应而不清亮。此法简单、快速，对发酵液污染噬菌体的判断亦较准 确。但不适于溶源性细菌及温合噬菌体的诊断，对侵染噬菌体较少的一级种子培养液也往往 不适用。 噬菌体的效价即１mL样品中所含侵染性噬菌体的粒子数。效价的测定一般采用双层琼 脂平板法。由于在含有特异宿主细菌的琼脂平板上，一般一个噬菌体产生一个噬菌斑，故可 根据一定体积的噬菌体培养液所出现的噬菌斑数， 计算出噬菌体的效价。此法所形成的噬菌 斑的形态、大小较一致，且清晰度高，故计数比较准确，因而被广泛应用。 3 材料 3.1 菌种 敏感指示菌（大肠杆菌）、大肠杆菌噬菌体(从阴沟或粪池污水中分离)。 3.2 培养基 二倍肉膏蛋白胨培养液，上层肉膏蛋白胨半固体琼脂培养基（含琼脂0.7%，试管分装， 每管５mL），下层肉膏蛋白胨固体琼脂培养基（含琼脂 2%），1%蛋白胨水培养基。 3.3 仪器和器具 无菌的试管、培养皿、三角瓶、移液管（1、5mL），恒温水浴锅，离心机等。 4 流程 4.1 噬菌体的分离纯化鉴定 4.2 噬菌体效价的测定 5 方法 5.1 噬菌体的检查 5.1.1 样品采集 将 2～3g 土样或 5mL 水样（如阴沟污水）放入灭菌三角瓶中，加入对数生长期的敏感 指示菌（大肠杆菌）菌液 3～5mL，再加 20mL二倍肉汤蛋白胨培养液。 5.1.2 增殖培养 30℃振荡培养 12～18h, 使噬菌体增殖。

细菌噬菌体应该如何检测

细菌噬菌体应该如何检测 噬菌体是一类专性寄生于细菌和放线菌等微生物的病毒，其个体形态极其微小，用常规微生物计数法无法测得其数量。当烈性噬菌体侵染细菌后会迅速引起敏感细菌裂解，释放出大量子代噬菌体，然后它们再扩散和侵染周围细胞，最终使含有敏感菌的悬液由混浊逐渐变清，或在含有敏感细菌的平板上出现肉眼可见的空斑──噬菌斑。了解噬菌体的特性，快速检查、分离，并进行效价测定，对在生产和科研工作中防止噬菌体的污染具有重要作用。 检样可以是发酵液、空气、污水、土壤等(至于无法采样而需检查的对象，可以用无菌水浸湿的棉花涂拭表面作为检查样品)。为了易于分离可先经增殖培养，使样品中的噬菌体数量增加。 采用微生物测定法进行噬菌体检测，约需12h左右，因而不能及时判断是否有噬菌体污染。通过快速检测可大致确定是否有噬菌体污染，以采取必要的防治措施。根据正常发酵(培养)液离心后菌体沉淀，上清液蛋白含量很少，加热后仍然清亮;而侵染有噬菌体的发酵(培养)液经离心后其上清液中因含有自裂解菌中逸出的活性蛋白，加热后发生蛋白质变性，因而在光线照射下出现丁达尔效应而不清亮。此法简单、快速，对发酵液污染噬菌体的判断亦较准确。但不适于溶源性细菌及温合噬菌体的诊断，对侵染噬菌体较少的一级种子培养液也往往不适用。 噬菌体的效价即1mL样品中所含侵染性噬菌体的粒子数。效价的测定一般采用双层琼脂平板法。由于在含有特异宿主细菌的琼脂平板上，一般一个噬菌体产生一个噬菌斑，故可根据一定体积的噬菌体培养液所出现的噬菌斑数，计算出噬菌体的效价。此法所形成的噬菌斑的形态、大小较一致，且清晰度高，故计数比较准确，因而被广泛应用。 检测材料 1.菌种 敏感指示菌(大肠杆菌)、大肠杆菌噬菌体(从阴沟或粪池污水中分离) 2.培养基 两倍肉膏蛋白胨培养液，上层肉膏蛋白胨半固体琼脂培养基(含琼脂0.7%，试管分装，每管mL)，下层肉膏蛋白胨固体琼脂培养基(含琼脂2%)，1%蛋白胨水培养基。 3.仪器耗材

实验七 噬菌体效价的测定

实验七噬菌体效价的测定 杨明轩生物111 1102040128 一、实验目的 1、学习并掌握噬菌体效价的含义及其测定原理。 2、学习并掌握双层琼脂平板法测定噬菌体效价。 二、实验原理 噬菌体属于细菌病毒，侵染细菌细胞后，可导致寄主细胞溶解死亡，并在琼脂培养基表面形成空斑，即为噬菌斑。人们可以根据噬菌斑来判断噬菌体的存在。 噬菌体的效价指的是每毫升培养液中含有的具感染性的噬菌体的数量。其测定常用双层琼脂平板法。由此法得到的噬菌斑形态、大小较为一致，且清晰度高，计算准确。该方法首先在无菌培养皿内倒入营养琼脂作为底层，然后将适当稀释的噬菌体与培养至对数期的受体菌混合，保温吸附后，加入冷却至45℃左右的半固体琼脂糖，迅速混匀后铺平板，作为上层，最后倒置培养。只要噬菌体具有感染力就可形成噬菌斑。根据不同稀释度平板上出现的噬菌斑数目，即可算出原液噬菌体的效价。 公式为：噬菌斑形成单位（pfu/ml）＝噬菌斑数×稀释倍数×10 （注：需要说明的是，“×10”表示换算单位，根据本实验步骤，因为加入的是100ul 噬菌体原液，换算成1000ul，即1ml，因此“×10”，如有变动更改则需另行计算）本实验选择的是λ噬菌体EA94，它是一种被改造过的烈性噬菌体。 三、实验材料 1、菌种：大肠杆菌（Escherichia coli）LE392； 2、噬菌体：λ噬菌体EA94； 3、培养基：300ml三角瓶中分装100ml LB培养基，15×150mm试管分装4ml 0.7%琼脂糖； 4、灭菌物品：20%麦芽糖，1mol/L MgSO4，10mmol/L MgSO4，18×180mm试管分装4.5ml 和20ml噬菌体缓冲液，100ml离心管，500μl枪头，200μl枪头，微离心管，培养皿； 5、仪器：取样器，恒温水浴锅，恒温培养箱，台式离心机。 四、实验方法 1、感受态的大肠杆菌菌悬液的制备：将活化的大肠杆菌接种于50ml牛肉膏蛋白冻培养液（内含0.5ml20% 8磅灭菌麦芽糖和500ul1mol/L灭菌MgSO4·7H20）中，经37℃过夜培养后，4000转/分，15min离心收集菌体细胞，然后悬于20ml10mmol/L MgSO4中，备用。使用前分装至灭菌离心管中，1.2ml菌液/组，保存条件为4℃冰箱保存。 2、噬菌体悬浮液的制备：4℃冰箱保存在缓冲液中的噬菌体0.6ml与活化的处于感受态的E. coli菌体0.6ml混匀，在37 ℃条件下保温25min，使噬菌体吸附到E. coli上。取10块LB平板，每板加入0.1ml混合液并涂抹均匀。在37℃下培养10h。每个平板加入10ml噬菌体缓冲液，将菌及噬菌体洗下。离心后取上清液。进行效价测定预实验。达到所需要求后加1-2滴氯仿，分装为550ul/每组，并置于4℃保藏。 3、制备底层平板：将在50℃左右的LB固体培养基倒入无菌培养皿，每皿约10~12ml，共9皿（每个稀释度做3个重复）。水平放置，凝固后，做好稀释度标记备用。（作用：1、

6第六章细菌和噬菌体的遗传

第六章细菌和噬菌体的遗传 一、名词解释 1、菌落：单个微生物生长繁殖到一定程度可以形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞生长群体. 2、噬菌体:指侵染细菌、放线菌以及真菌的病毒。包括温和、烈性两种，单一核酸分子（DNA 或RNA）称为基因带或染色体。 3、中断杂交技术：根据供体基因进入受体细胞的顺序和时间绘制连锁图的技术。 4、重组作图：指根据基因之间重组率进行基因定位的作图方法。 5、性导：F-细菌通过获得F′因子而改变遗传性状的过程。 6、F′因子（F′质粒）：当F因子从主染色体切除出来时，如果不是以原来的位置切除，而是将供体菌（Hfr）的主染色体上的个别基因切除，成为F因子的一部分，这种质粒称F′因子。 7、F′菌株：含有F′因子的菌株。 8、双重感染（混合感染、复感染）：是指用两种噬菌体同时感染某一菌株。 9、溶源性细菌：细菌体内已含有噬菌体，但噬菌体并不裂解细菌的菌株，又称溶源菌。这种现象称为溶源性。 10、原噬菌体：溶源性细菌所携带的无感染能力的噬菌体。有2种存在方式：一种是游离状态，一种是整合状态。 11、合子诱导：带有原噬菌体的Hfr菌株与敏感性的F-菌株杂交后，由于噬菌体在受体菌中随即复制，诱导受体菌裂解，这种现象称合子诱导。 12、转导：以噬菌体作为媒介，把一个细菌（供体）的遗传物质转移到另一细菌（受体），中进行基因重组的过程叫转导。 13、共转导（并发转导）：两个紧密连锁的基因往往可以一起被转导，这种结合转导现象叫共转导。 14、流产转导：转导DNA进入受体细胞后，不与受体基因组交换，也不进行DNA复制，稳定独立存在与细胞中。使后代细胞中只有一个细胞具有转导DNA，其他细胞不含转导DNA ，后代细胞发生分离。 15、附加体: 质粒可以独立存在与细胞质中,也可以整合到主染色体上,,成为染色体的一部分,这样的质粒特成为附加体 16、转导噬菌体：携带了供体DNA（遗传物质）、并且能把它转移到受体中的噬菌体。 二、填空 1、一个噬菌斑通常含有（107——108）个噬菌体。一个噬菌斑是由（1）个噬菌体引起的， 所以，一个噬菌斑中的噬菌体在遗传上是均一的，相当于一个（克隆）。 2、（温和性噬菌体）侵染细菌后，并不使细菌很快裂解，而是存活或潜伏较长的时期。而是在（特定）的条件下才使细菌裂解。如有（紫外线照射或温度）刺激，就可使原来（温和性噬菌体）改变成（烈性噬菌体），使细菌裂解。 3、F因子的结构是由（原点）（可育基因（性伞毛基因群））（复制区DNA复制酶基因）（重组区（插入序列；插入区））组成。 4、Hfr细菌又称（高频重组菌株），其细菌含有（F）因子，并且（F）因子通过交换整合到（主染色体）上，在细菌杂交中相当于（雄）性。 三、选择填空 1、下列（A）因子属于附加体。A F因子B col因子C R因子 D 分解因子 2、F+与F-杂交，F因子通过（B）进入F-。 A 接触 B 接合管 C 性伞毛 D 复制 3、F+与F-杂交，F因子通过（C）复制方式进行复制。

厦门大学 微生物 考研真题(02-07)

厦门大学微生物历年考研真题02-07 厦门大学2002年微生物考研试题 一、填空题：（第8题 3分，其余1分/题） 1.用____和____糖等成分可以制成培养真菌的半组合培养基。 2.细菌产生抗药性的3种途径分别为：染色体组上发生基因突变、____的转移和____的适应性。 3.病毒的核酸类型是及其多样的，总的来说，动物病毒以____和____居多，植物病毒以____居多，而噬菌体以____居多。 4.在实验中培养化能异养型细菌时，通常以____为碳源，____为氮源，____为生长因子，以____提供矿质元素。 5.F因子是大肠杆菌等细菌中决定____的质粒，其大小为____kb，约等于____％染色体DNA，其中1/3基因（tra区）与____有关。 6.病毒大小的单位是____，多数病毒粒子的直径在____上下。 7.电子显微镜观察表明：放线菌无性孢子的形成，只有____方式，而无____方式。 8.放线菌的形态特征，以链霉菌最典型：细胞形态呈____，营养生长期菌丝内____隔，一般呈____细胞，细胞内具有为数众多的____体：根据菌丝的结构和功能把菌丝分为____、____和____3类。其中____能分化产生成串的分生孢子。 二、名次解释：（2分/题） 1．光能自养型（photoautotroph） 2．微体（microbody） 3．连续培养（continuous cultivation） 4．感受态因子（competence factor） 5．共同抗原（common antigen） 6．单细胞蛋白（single cell protein） 7．紫膜（purple menbrane） 8．活性污泥(activated sludge) 9．类毒素（toxoid） 10．Park 核苷酸（ park nucleotide ） 11．膜边体（ lomasome） 12．细菌沥滤（bacterial leaching） 三、问答题（没标注的3分/题，） 1．龋齿的形成与某些产荚膜细菌有关吗？解释你的答案。 2．为什么说病毒是一类非细胞结构的大分子生物？

5细菌和噬菌体的遗传分析

细菌和噬菌体的遗传分析 [习题]1 一、填空题 1、F’因子是从_________细胞中不准确地切除_________时产生的。 2、F因子和温和噬菌体因为都可以__________________________________________，称为_________。 3． Hfr×F—时，为使Hfr不被选择，要使它带有__________基因，而且这个基因应位于染色体的______。 4． Hfr（λ）×F—，可使F—发生______，而Hfr×F—（λ）能产生_____，这种现象叫________。 5、原噬菌体是由温和噬菌体经______________________整合到细菌染色体形成的，这与Hfr 菌株形成过程相同。 6、F’因子是从_________细胞中不准确地切除_________时产生的。所以F’因子除了含F因子的基因外，还有部分_______的基因。 7、在Benzer的顺反测验中，当T4rIIA×T4rIIB侵染E．coli K12时，可产生______反应，再涂布到E．coli B上时，出现_________。 8、单向的同源重组常在原核生物中发生。如____________和___________。 9、大肠杆菌F+菌株与F-菌株结合，最后F+菌株变成了________,F-菌株变成了________。 二、解释下列名词： F-菌株、F+菌株、Hfr菌株、F因子、F'因子、烈性噬菌体、温和性噬菌体、溶原性细菌、部分二倍体。 三、选择题 1、某些细菌能通过其细胞膜摄取周围供体的染色体片段，并将此外源DNA片段通过重组参入到自己染色体组的过程，称为( )。 a.接合 b.性导 c.转导 d.转化 2、让Hfr arg-leu+azi s str r与F-arg+leu-azi r str s混合培养，使其发生接合。想增多F-重组型arg+leu+azi r的出现，下面哪—种培养基将完成这个选择( )。

第七章 细菌和噬菌体的遗传学分析

第七章细菌和噬菌体的遗传学分析 1、一个基因型为a+b+c+d+e+并对链霉素敏感的E.coliHfr菌株与基因型为a-b-c-d-e-并对链霉素耐性的F-菌株接合，30分钟后，用链霉素处理，然后从成活的受体中选出e+型的原养型，发现它们的其它野生型（+）基因频率如下：a+70％，b+-，c+85％，d+10％。问a，b，c，d四个基因与供体染色体起点（最先进入F-受体之点）相对位置如何？ 解：根据中断杂交原理，就一对接合个体而言，某基因自供体进入受体的时间，决定于该基因同原点的距离。因此，就整个接合群体而论，在特定时间内，重组个体的频率反映着相应基因与原点的距离。 报据题目给定的数据，a、b、c、d与供体染色体的距离应该是： 是： 2、为了能在接合后检出重组子，必须要有一个可供选择用的供体标记基因，这样可以认出重组子。另一方面，在选择重组子的时候，为了不选择供体细胞本身，必须防止供体菌株的继续存在，换句话说，供体菌株也应带有一个特殊的标记，能使它自己不被选择。例如供体菌株是链霉素敏感的，这样当结合体（conjugants）在含有链霉素的培养基上生长时，供体菌株就被杀死了。现在要问：如果一个Hfr菌株是链霉素敏感的，你认为这个基因应位于染色体的那一端为好，是在起始端还是在末端？ 解：在起始端 3、有一个环境条件能使T偶数噬菌体（T-even phages）吸附到寄主细胞上，这个环境条件就是色氨酸的存在。这种噬菌体称为色氨酸需要型（C）。然而某些噬菌体突变成色氨酸非依赖型（C+）。有趣的是，当用C和C+噬菌体感染细菌时，将近一半的色氨酸非依赖型子代在进一步的实验中表现为基因型C。你如何解释这个发现？ 解： 首先，这不可能是回复突变，因为这里的频率是1／2。 应该注意的是，这里进行的是C和C+对寄主的混合感染。当两种类型噬菌体同时感染同一寄主细胞时，两者在同一寄主细胞中增殖，同时，各自按照本身的遗传组成指导合成其外壳蛋白质，以便组装成成熟的噬菌体颗粒。也就是说，在寄主细胞中，同时存在两种类型的噬菌体染色体和可以包装其染色体的两类型噬菌体的所需蛋白质。