PCR技术简述

PCR技术简述

北京大学医学部基础医学院 07级临床一班陈依然 90701114

一、摘要

早在高中时期，生物课教程中就已经出现了“PCR技术”的字样。但是由于当时知识深度与教学要求、目的所限，教师并未对“PCR技术”即行明确的讲解。这个疑问一直延伸到今天。

结合查阅的资料，本文对PCR技术进行了简要而比较全面地介绍，内容主要涉及PCR技术的发展历程、原理、主要步骤、反应特点、反应的关键因素——引物与DNA聚合酶、荧光实时定量技术以及PCR在医学与法医学领域的应用，并且将该项技术与用于DNA扩增的常规基因工程技术进行了比较。

基于以上内容，本文呈现了有关PCR技术的基本知识。

二、关键词

PCR技术基本知识原理应用与常规方法的比较

三、正文

3.1 PCR技术简介

多聚酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）是近十年来发展最快、应用最广的分子生物学技术。PCR是在细胞外（体外）快速扩增特定DNA序列的技术，故又称体外基因扩增技术或无细胞分子克隆技术（Cell-free molecular cloning）。

该项技术采用定向酶促扩增法，选择性地富集某一特异性DNA序列，将被认为不可能监测到的极微量靶DNA分子扩增到足以方便地进行监测和分析的数量级。PCR不但有高的监测能力，还简化了操作程序，省去了诸多繁琐的操作，被人们称为分子克隆技术中的一次重大革命，对基础研究、实际应用，推动现代分子生物学技术的发展，具有难以估量的作用。而且由于PCR技术在理论和应用上的跨时代意义，该项技术的发明者Mullis也于1993年获得了诺贝尔化学奖。

3.2 PCR技术发展历程

PCR技术的最初设想是由美国Cetus公司的Kary Mullis博士于1983年提出的。

自1993年至今，该项技术一共经历了手动/机械手式水浴基因扩增、自动化控制型定性基因扩增、终点定量/半定量PCR、实时定量PCR四代产品。随着产品的发展，操作大幅简化，成本迅速降低，而这些都有赖于DNA聚合酶的改良和荧光定时定量PCR等技术的发明与应用。

目前的第四代产品，对PCR可以进行精确的定时定量控制，并采用了微电脑控制全部反应过程，大大简化了操作过程，节省了实验时间，降低了成本，极大促进了PCR 技术的实际应用与发展。迄今PCR技术在生物科研和临床应用中得到广泛应用，成为分子生物学研究的最重要技术之一。

3.3 PCR技术原理

DNA的半保留复制是生物遗传物质向后代传递的重要途径。双链DNA在多种酶的作用下可以变性解链成单链，在DNA聚合酶与启动子的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两个DNA分子。在实验中发现，DNA分子在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，并设计引物做启动子，加入DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。

PCR是根据以上原理，以特定顺序DNA的两条链为模板，在一对引物的介导下，在

体外运用DNA聚合酶合成特定DNA序列的反应。

PCR包括以下三个主要的连续步骤：

1、热变性：加热破坏DNA两条链之间的结合力，使目的DNA于高温解链成为

单链模板。

2、退火：退火是属于分子杂交复性的过程，在一定温度条件下，两个人工合

成的寡聚核苷酸引物分别与目的片段两侧的两条链互补结合而起到启动子

的作用。

3、延伸：在最适温度条件下，DNA聚合酶将核苷酸从引物3’端开始掺入，沿

模板由5’至3’方向延伸，合成DNA。

经过几年的探索与实践，在发现耐高温的DNA聚合酶之后，以上三个步骤的温度与循环已有规律可循。一般情况下，94℃加热1分钟，56℃退火2分钟，72℃延伸5分钟，如此循环25至35次，即可得到所需目的DNA的数量，理论值为2n，n为循环次数。

3.4 PCR的引物设计和DNA聚合酶

正确地设计引物和合理地使用DNA聚合酶是PCR实验工作能否成功的关键所在。

3.4.1引物设计

PCR反应中所使用的引物都是人工合成的一段寡聚核苷酸。设计引物所须考虑的原则有以下几点：

1、引物须与目的DNA两条链的5’端相匹配；

2、引物的G+C含量应设计为50%左右，尽量避免数个嘌呤或嘧啶的连续排列；

3、引物需要避免内部形成二级结构；

4、两个引物之间不应发生互补，避免形成引物二聚体；

5、人工合成的引物最好通过PAGE或离子交换HPLC进行纯化。

3.4.2 DNA聚合酶（DNA polymerase）

在PCR技术中，DNA聚合酶是关键的因素之一。DNA聚合酶最早于1955年发现，而较具有实验价值及实用性的Klenow fragment of E. Coli则是于20世纪70年

代的初期由Dr. H. Klenow所发现，但由于此酶不耐高温，高温能使之变性, 因

此也制约了PCR技术的应用和发展。经过改进后目前使用的DNA聚合酶是Saiki

等人于1988年从温泉中得到的一种水生嗜热杆菌（Thermus aquaficus）分离出

来的，称为TaqDNA聚合酶。该聚合酶具有极佳的热稳定性，并且提高了扩增目的

产物的特异性，使PCR技术进入实用化阶段。

3.5 荧光实时定量PCR技术(real-time quantitative PCR, qPCR)

荧光实时定量PCR技术是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。借助于荧光信号来检测PCR产物，一方面提高了灵敏度，另一方面可以在每次PCR循环收集数据，建立实时扩增曲线，准确地确定域值循环数，计算起始DNA复制数，做到了真正意义上的DNA定量。

荧光实时定量PCR技术最早是在1992年由一位日本人Higuchi提出的。经过不断发展完善，到1996年当时的PE公司（后来的ABI）推出了世界第一台商品化的荧光定量PCR仪，标记方法也由最初的染料法，逐渐发展到了特异性更高的Taqman探针法，以及Molecular Beacon、Fret等不同方法的标记探针。

实时定量PCR技术真正实现了PCR从定性到定量的飞跃，通过对PCR过程的实时监

控，专一、灵敏快速、可重复地精确定量起始模版浓度，已经在科研和临床诊断领域得到了越来越广泛的应用。

3.6 PCR技术与常规基因工程技术的比较

PCR技术为测序的分子克隆和模板制备的大部分重复工作提供了替代者。过去，为了获得特定的DNA序列和有意义的靶基因的分析研究数量，采用基因工程的方法把带有靶基因的载体导入细菌细胞，经过细菌繁殖后，扩增的靶基因再用同位素探针筛选。此种方法需要将靶基因在细胞与细胞之间来回搬运，然后经过培养、提取、纯化等程序获得靶基因，操作繁琐，还得使用同位素，效率不高，从而限制了许多重大课题的研究。

直接测序比PCR片段常规的克隆到质粒和病毒的基因组的方法具有以下两大优点：

1、由于它是不依赖于生物体的体外系统，PCR技术更易标准化、自动化；

2、操作简便，更加快速可靠而准确；

PCR反应具有特异性强、灵敏度高、简便、快速、对标本的纯度要求低发等优于常规方法的特点，促进了该项技术的实用化与产业化。

3.7 PCR技术的应用

自PCR技术发明以来，因其操作简便、省时、灵敏度高、特异性强，故应用范围极其广泛，新的方法层出不穷。以下简述其在医学和法医学的重要应用。

3.7.1 医学应用

特异性核苷酸杂交探针的采用已使传染病病原体的检测和对与疾病关联的遗传变异的鉴定发生了变革。PCR借助于产生足够量的靶顺序使以DNA为根据的临床诊断成为可能，从而得以采取简易、快捷和有活力的方法来诊断。PCR技术最先应用于镰刀型细胞贫血症的产前诊断，进而应用于许多遗传疾病的诊断，从而表明，即使疾病位点和突变尚未被确定，PCR扩增也可能有助于基因诊断。

已经证明，PCR不仅在遗传性疾病和癌症的分析中起到重要作用，对诊断多种传染病病原体也有积极贡献。可以想见，PCR除了应用于对已知病原体以及已知基因疾病的诊断之外，将同样有助于对一些新病原体的识别并有可能增加对某些慢性疾患的病毒病因学的理解。因此，PCR有望在医学中重要顺序的识别上以及在成为对其检测的重要诊断方法上起到关键性的研究作用。

3.7.2 法医学应用

PCR技术检测生物学证据样本DNA多态性的能力使法医学得以革新。采用PCR技术扩增特异的多态性DNA顺序可以克服传统方法的限制，耐热的TaqDNA聚合酶的应用明显的改善了PCR的特异性和收获率，并使该过程得以自动化。其结果是从一根头发、单个二倍体细胞，针织单个精子鉴别其DNA类型成为可能。为法医学的发展以及生物证据样本的提供做出了巨大贡献。

四、参考文献

[美]HA艾利希主编，田丁、张基增等译《PCR技术——DNA扩增的原理与应用》北京医科大学（现北京大学医学部）中国协和医科大学联合出版社 1991年8月张丰德、吕宪禹主编《现代生物学技术（第三版）》南开大学出版社 2005年2月百度百科https://www.wendangku.net/doc/5717607633.html,/view/2764.htm

医生圈社区网https://www.wendangku.net/doc/5717607633.html,/bbs/viewthread.php?tid=2919

网易博客

https://www.wendangku.net/doc/5717607633.html,/yf_yuanmeng@126/blog/static/159332872007102684043439/

PCR技术的种类及应用

PCR技术的发展及应用 平骏 14112822276摘要：聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction, PCR）是1985年由美国PE- Cetus 公司的科学家Kary Banks Mullis发明的一种可在体外快速扩增特定基因或DNA序列的技术。经历了近30年的技术发展，现如今PCR技术在生命科学研究以及相关的很多领域都得到广泛的应用。本文主要对PCR的基本原理、反应组份作简要的介绍；同时也对在PCR基础上发展起来的相关技术作简要综述。 关键词：PCR技术；PCR原理；PCR新技术 对核酸的研究己有100多年的历史，20世纪70年代初人们就致力于研究基因的体外分离技术，Korana于1971年最早提出核酸体外扩增的设想，该设想在1985年被Mullis等人实现，他们发明了具有划时代意义的聚合酶链反应[6]。这项新技术是根据生物体内DNA序列能进行快速复制的特点，实现在体外对特定DNA序列进行快速扩增，可在短时间内从试管中获得数百万个特异DNA序列拷贝。PCR技术操作简便、结果可靠，被世界各国广泛应用于医学、农业、考古学等各个领域的基因研究和分析，对分子生物学的发展产生了深远的影响[18]。发明人Kary Banks Mulis也因此荣获了1994年的诺贝尔化学奖。 1、PCR 技术的原理[1,2] PCR技术是模拟细胞内DNA的天然复制过程，DNA 聚合酶以单链DNA为模板，借助一小段双链DNA 来启动合成，通过一个或两个人工合成的寡核苷酸引物与单链DNA 模板中的一段互补序列结合，形成部分双链。在适宜的温度和环境下，DNA 聚合酶将脱氧单核苷酸加到引物3，- OH 末端，并以此为起始点，沿模板5，→3，方向延伸，合成一条新的DNA互补链。简言之，其基本原理包括3个基本反应过程：变性→退火→延伸。PCR 反应的基本成分包括：模板DNA( 待扩增DNA )、引物、4种脱氧核苷酸( dNTPs)、DNA 聚合酶和适宜的缓冲液。每一循环中所合成的新链，又都可作为下一循环中的模板。PCR 合成的特定的DNA序列产量随着循环次数呈指数增加，每完成一次循环需2-4min，2-3h就能将目的基因扩增，从而达到迅速大量扩增的目的。 2、PCR技术的反应组份 2.1 模板DNA PCR反应的模板可以是单链DNA也可以是双链DNA，可以是基因组DNA 或cDNA，

PCR 技术的种类及其应用

PCR 技术的种类及其应用 1PCR 技术的基本原理 PCR技术是在模板DNA、引物和四种dNTP等存在的条件下, 依赖于DNA聚合酶(T aq酶)的酶促合成反应。其具体反应分三步：变性、退火、聚合。以上三步为一个循环，每一循环的产物DNA又可以作为下一个循环模板，数小时后，介于两个引物之间的目的DNA得到了大量的复制，经25～30次循环DNA数量可达2×106～7拷贝数。2PCR技术的种类 2.1反向PCR( Inverse PCR, IPCR)技术 原理：反向PCR是克隆已知序列旁侧序列的一种方法．主要原理是用一种在已知序列中无切点的限制性内切酶消化基因组I)NA．后酶切片段自身环化．以环化的DNA 作为模板，用一对与已知序列两端特异性结合的引物，扩增夹在中间的未知序列。该扩增产物是线性的DNA片段，大小取决于上述限制性内切酶在已知基闲侧翼DNA 序列内部的酶切位点分布情况。用不同的限制性内切酶消化，可以得到大小不同的模板DNA，再通过反向PCR获得未知片段。 该方法的不足是：①需要从许多酶中选择限制酶，或者说必须选择一种合适的酶进行酶切才能得到合理大小的DNA片段。这种选择不能在非酶切位点切断靶DNA。②大多数有核基因组含有大量中度和高度重复序列，而在YAC或Cosmid 中的未知功能序列中有时也会有这些序列，这样，通过反向PCR得到的探针就有可能与多个基因序列杂交。 2.2锚定PCR(Anchored PCR, APCR)技术 用酶法在一通用引物反转录cDNA3’-末端加上一段已知序列, 然后以此序列为引物结合位点对该cDNA进行扩增, 称为APCR。 应用：它可用于扩增未知或全知序列, 如未知cDNA的制备及低丰度cDNA文库的构建。 2.3不对称PCR(asymmetric PCR)技术 两种引物浓度比例相差较大的PCR技术称不对称PCR。在扩增循环中引入不同的引物浓度, 常用50～100÷1比例。在最初的10～15个循环中主要产物还是双链DNA, 但