鸡源大肠杆菌的分离与鉴定
菏泽学院
Heze University
本科生毕业设计（论文）
题目鸡源大肠杆菌的分离与鉴定
姓名学号
系别制药工程系
专业动物医学
指导教师职称
菏泽学院教务处制
目录
摘要 (1)
关键字 (1)
Abstract (1)
Key words (1)
引言 (2)
1 材料与方法 (3)
1.1材料 (3)
1.1.1培养基及配制 (3)
1.1.2试验仪器 (3)
1.1.3药敏纸片 (3)
1.1.4生化发酵管 (3)
1.1.5大肠杆菌O因子诊断血清 (4)
1.1.6 试验动物 (4)
1.2方法 (4)
1.2.1病料采集 (4)
1.2.2病原体分离 (4)
1.2.3病原体的纯培养 (4)
1.2.4革兰氏染色镜检 (4)
1.2.5生化试验 (4)
1.2.6 动物试验 (4)
1.2.7 血清学鉴定 (5)
1.2.8 药敏试验 (5)
2 结果与分析 (5)
2.1病菌的培养及镜检结果 (5)
2.2 生化试验鉴定结果 (5)
2.3 抗原测定结果 (5)
2.4 动物试验结果 (5)
2.5 药敏试验结果 (5)
3 讨论 (6)
参考文献 (7)
致谢 (8)
鸡源大肠杆菌的分离与鉴定
动物医学专业学生
指导教师
摘要：山东青岛即墨某鸡场所养雏鸡发生一种以败血症、高死亡率为特征的急性传染病，病鸡的临床症状多表现为精神萎靡，食欲减退或废绝，排白绿色稀粪等，剖检发现肝脏纤维素性炎症，呈铜绿色，脾充血、肿胀，心外膜水肿等。从病鸡中分离到一株致病菌，经细菌学检查和动物试验，确定该致病菌为大肠杆菌，抗原鉴定该菌的优势血清型为O78。环丙沙星、丁胺卡那、卡那霉素、新霉素、链霉素对该菌高敏；庆大霉素、罗红霉素对该菌中敏；对强力霉素、恩诺沙星对该菌低敏；对林可霉素、四环素、阿莫西林对该菌耐药。
关键词：鸡；大肠杆菌；分离与鉴定；药敏试验
Isolation and Identification of E.coli from Chicken
Student Majoring in Veterinary Medicine
Tutor
Abstract:An acute infectious diseases characterized by high mortality rate and sepsis was occurrenced in Chicken farms of Jimi in Shandong province, most of the chickens showed clinical symptoms of listlessness,loss of appetite,evacuated white-green liquid manure,and pathological change was showed that liver was copper green with fibrinous inflammation,spleen was congestion and swelling,epicardium edema and so on.A strain was isolated from diseased chickens and was examined with bacteriology inspection and animal test,and the result shows that the strain is Escherichia coli,and the serotype of the bacterium is O78 by antigenic identification.The bacterium is high-sensitivity with Ciprofloxacin,kanamycin,neomycin and streptomycin,middle-sensitivity with Gentamicin and net-mycin,low-sensitivity with doxycycline and enrofloxacin,and drug resistance with lincomycin,tetracycline and amoxicillin.
Key words:chicken;Escherichia coli;Isolation and Identification;susceptibility test
引言
鸡大肠杆菌病是由致病性大肠杆菌引起的鸡的不同类型疾病的总称[1]，是一种急性或慢性的细菌性传染病。本病广泛发生与雏鸡、肉鸡、蛋鸡，临床症状复杂多变，较难防治，给养殖业带来严重危害，是影响养殖业的重要疾病之一。
大肠杆菌是革兰阴性无芽孢的直杆菌，大小为0.4-0.7μm×2-3μm ，两端钝圆，散在或成对[2]，有鞭毛，有的菌株可形成荚膜，易于在普通培养基上增殖，适应性强。本菌对一般消毒剂敏感，但粘液和粪便的存在会降低这些消毒剂的效果。本菌对抗生素等药物极易产生耐药性。在畜禽舍内，大肠杆菌在水、粪便和尘埃中可以存活数周或数月之久。
根据抗原结构不同，已知大肠杆菌有菌体（O）抗原170种，表面（K）抗原近103种，鞭毛（H）抗原60种，因而构成了许多血清型。在引起人畜肠道疾病的血清型中，有肠致病性大肠杆菌（简称EPEC）、肠产毒素性大肠杆菌（简称ETEC）、肠侵袭性大肠杆菌（简称EIEC）和肠出血性大肠杆菌（简称EHEC）等之分。在170种“o”型抗原
血清型中约1/2左右对鸡有致病性，但最多的是O1、O2、O4、O11、O18、O26、O78、O88等血清型[3]。
本病一年四季均可发生，且不同地区的优势血清型往往有差别。在一些大型和个体养鸡场中，由于环境卫生条件较差，时常暴发鸡大肠杆菌病。由于鸡大肠杆菌血清型较多，且各地流行菌株不同，往往给本病的免疫预防带来许多困难。此外，由于临床上缺乏化验条件，生产上盲目滥用药物，造成大肠杆菌耐药菌株不断产生，致使该病治疗效果下降，给养鸡业造成了严重的经济损失[4-8]。雏鸡发病率可达30%-60%，病死率几乎达到100%。大型集约化养鸡场鸡群密度过大，通风换气不良，饲养用具及环境消毒不彻底可加速本病流行[9]。大肠杆菌随粪便排出，并可污染蛋壳，或大肠杆菌从感染的卵巢、输卵管等处侵入卵内，感染种蛋，是该病传播过程中的重要途径。健康鸡通过消化道采食被大肠杆菌污染的饲料和饮水或通过呼吸道吸入粘有大肠杆菌的尘埃可以造成水平传播。因此，预防本病十分重要，为使雏鸡获得被动免疫，可用本场流行的大肠杆菌血清型制备的多价活苗或灭活苗接种种禽。
本病的发病类型较多，常见的有败血症、心包心肌炎、全眼球炎、关节滑膜炎、腹膜炎、输卵管炎、脐炎、气囊炎和大肠杆菌性肉芽肿等。
败血症大肠杆菌主要发生于6-8周龄的肉用仔鸡，但不满一周龄的雏鸡也可大批发病死亡。若在鸡群中有经蛋感染的幼雏，则其发病后排出毒力强的致病菌。通过消化道和呼吸道而发生水平传播，在短期内可造成大批幼雏发生败血性大肠杆菌病引起死亡。症状为极度萎靡，排白绿色稀粪。尸体剖检，在4月龄以上的仔鸡，除具一般败血症变化外，突出的病变是浆液性纤维素性心包炎、纤维素性肝周炎、纤维素性腹膜炎、纤维素性气囊炎、肠炎，脾充血、肿胀，肝呈铜绿色，实质内有白色坏死点。
心包心肌炎型：浆液性纤维素性心包炎伴发心肌炎，通常是鸡败血症型大肠杆菌病的主要病变之一。但在中雏尤其是肉用仔鸡，有时以心包炎心肌炎为表现形式，病鸡呈亚急性经过，病鸡消瘦，贫血，逐渐衰竭死亡。尸体剖检，病变是心包炎和间质性心肌炎。心外膜水肿，并被覆淡黄色的纤维素性渗出物，心包呈不均匀的增厚，心包内充满淡黄色浆液和纤维素性渗出液。有些病例还有小化脓灶和肉芽肿样小结节。
全球眼炎型：常发生于败血型流行后期，一般仅一个眼发炎，眼结膜充血、出血，眼前房和角膜混浊，随后失明。镜检可见，全眼都有异嗜性粒细胞和单核细胞浸润，脉络膜充血，视网膜完全破坏。
关节滑膜炎型：多见于肩、膝关节。关节明显肿大，滑膜囊内有大量的灰白色或淡红色渗出物，关节周围组织充血水肿。
卵黄性腹膜炎及输卵管炎型：本病发生于成年鸡，一般是散发性，俗称“蛋子瘟”。
本病可经泄殖腔上行感染，病禽腹泻，腹部肿胀，蹲伏，脱水，逐渐衰竭死亡。腹腔内充满腥臭的卵黄和凝固的卵黄块，腹腔内各脏器和肠系膜表面充血，有纤维素性渗出物附着，病程长者出现肠袢、内脏之间纤维素粘连。卵巢中的卵泡变性、瘪缩，呈灰色、酱色、褐色等。破裂的卵黄凝结成大小不一的团块。输卵管粘膜充血、出血，管腔内有蛋白和纤维素凝块，严重时，塞满凝固的蛋白和卵黄。
脐炎型：主要发生于出壳不久的雏鸡，多见有脐环闭合不全，脐孔周围红肿，并常有皮肤破损、发硬，呈黄色，时间长者脐孔周围发红或呈紫黑色，后腹部肿大皮薄而发红或呈紫青色，拉黄白色或黄绿色稀粪，极为腥臭。病鸡全身衰竭，闭眼，垂翅，不愿走动，减食或废绝，出壳后最初几天死亡率较高。
气囊炎型：气囊增厚，表面有纤维素渗出物被覆，呈灰白色，由此继发心包炎和肝周炎，心包膜和肝被膜上附有纤维素性伪膜，心包膜增厚，心包液增量、混浊，肝肿大，被膜增厚，被摸下散在大小不等的出血点和坏死灶。
大肠杆菌性肉芽肿型：本病特征是肝、盲肠、十二指肠、肠系膜出现肉芽肿，一般为粟粒大至玉米粒大，切面灰黄色略呈放射状或轮层状，中央有脓点。
该养鸡场发现多只病鸡，剖检观察，疑似大肠杆菌病。为准确诊断、治疗和预防，对该致病病原体进行分离鉴定。从病鸡体内分离该致病病原体后，通过一系列细菌学检查、动物接种试验及药敏试验，确定该病原体和敏感药物，为临床用药治疗大肠杆菌病和制备该血清型的多价灭活苗预防大肠杆菌病提供准确依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1培养基及配制
营养琼脂培养基：
牛肉膏3g、蛋白胨10g、琼脂20g、NaCl 5g，将上述成分溶于1000ml蒸馏水中，调节PH至7.4，分装试管，121℃高压蒸汽灭菌20min。
麦康凯琼脂培养基：
蛋白胨20g、猪胆盐5g、NaCl5g、琼脂17g、乳糖10g、0.1%结晶紫水溶液1ml、0.5%中性红水溶液5ml，将蛋白胨、猪胆盐和NaCl溶于400ml蒸馏水中，调节PH至7.2，将琼脂加热溶于600ml蒸馏水中，将两液合并，分装试管，121℃高压蒸汽灭菌15min。临用时，加热融化，趁热加入乳糖，冷却至50-55℃时，加入结晶紫和中性红水溶热，摇匀后倾注平板。
三塘铁琼脂培养基：
牛肉膏5g、蛋白胨20g、乳糖10g、蔗糖10g、葡萄糖1g、NaCl5g、硫酸亚铁铵0.2g、硫代硫酸钠0.2g、琼脂12g、0.2%酚红水溶液12.5ml，将上述成分除琼脂和酚红外溶于1000ml蒸馏水中，调节PH至7.4，加入琼脂，加热，溶化琼脂，加入0.2%酚红溶液，摇匀，分装试管，121℃高压蒸汽灭菌15min[10]。
1.1.2 试验仪器
高压灭菌锅、恒温培养箱、超净工作台、显微镜、冰箱、常用玻璃仪器等。
1.1.3药敏纸片
12种药敏纸片:阿莫西林、链霉素、庆大霉素、强力霉素、卡那霉素、丁胺卡那、新霉素、四环素、罗红霉素、林可霉素、环丙沙星、恩诺沙星，均由杭州天和微生物试剂有限公司生产。
1.1.4生化发酵管
葡萄糖、麦芽糖、甘露醇、乳糖、蔗糖、枸橼酸盐、M-R试剂、V-P试剂等购自上海劲马科技有限公司。
1.1.5 大肠杆菌O因子诊断血清
O1、O2、O36、O78，4种O因子血清购自（北京）农业部中国兽药检查所细菌实验室。
1.1.6 试验动物
30只该场的6日龄健康雏鸡。
1.2 方法
1.2.1 病料采集
病料来源于山东青岛某鸡场疑似大肠杆菌病发病雏鸡，无菌采集病鸡的肝脏、心内血作为病料。
1.2.2病原体分离
用接种环将病料直接划线接种于麦康凯琼脂平板上，37℃需氧培养24h。全过程无菌操作。
1.2.3病原体的纯培养
从麦康凯琼脂平板上挑取红色菌落的可疑病菌接种到营养琼脂培养基上，37℃需氧培养24h，再从营养琼脂培养基挑取单个菌落的病菌接种到营养琼脂培养基上，37℃培养24h，连续纯培养3代，得到病菌的纯培养物。全过程无菌操作。
1.2.4革兰氏染色镜检
取纯培养的病菌，革兰氏染色，在显微镜下观察病菌的形态特征。
1.2.5生化试验
三糖铁琼脂试验：
取纯培养的病菌接种于三糖铁琼脂斜面培养管内，37℃培养24h，观察结果。
糖类发酵试验：
取纯培养的病菌接种于糖类（葡萄糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖）微量发酵管中，37℃培养24h，观察结果。
吲哚试验：
取纯培养的病菌接种于蛋白胨水培养液中，37℃培养3d。先加入少量乙醚，摇动试管以萃取和浓缩吲哚，待其浮于培养液表面后，再沿试管壁徐徐加入欧-波二氏试剂数滴，观察结果。
甲基红（M-R）试验：
取纯培养的病菌接种于葡萄糖蛋白胨水培养液中，37℃培养3d，加入甲基红试剂两滴，立即观察结果。
V-P试验：
取纯培养的病菌接种于葡萄糖蛋白胨水培养液中，37℃培养3d，加入等量的V-P 试剂（先加入V-P甲液，再加入V-P乙液），混匀后，观察结果。
枸橼酸盐利用试验：
取纯培养的病菌接种于枸橼酸盐斜面培养基上，37℃培养24h，观察结果。
尿素分解试验：
取纯培养的病菌接种于尿素培养基中，37℃培养24h，观察结果。
H2S产生试验：
取纯培养的病菌穿刺接种于H2S培养管中，37℃培养24h，观察结果。
1.2.6动物试验
取纯培养的病菌接种于肉汤培养液中，37℃培24h 。将30只健康雏鸡随机平均分成
A 、
B 两组，，A 组雏鸡腹腔注射0.2ml 肉汤培养菌物，B 组腹腔注射等量生理盐水作为对照试验，将两组分开，以免交叉感染，在适宜的环境中观察结果。
1.2.7血清学鉴定
用生理盐水将牛肉膏蛋白胨培养基上的病菌洗下，转移到 1.5ml 离心管中，10000r/min ，离心5min 。祛上清液，将沉淀用0.5ml 生理盐水振荡混匀，10000r/min ，离心5min ，重复上述操作3次。再祛上清液，将沉淀用0.5ml 生理盐水制成悬浊液，121℃高压蒸汽灭菌1h 。
取常见的O 1、O 2、O 36、O 78四种血清，分别滴于4片玻片上，再分取供试菌液50μl 与血清混匀，上下摇动玻片数次，3min 内观察并判结果。同时，用生理盐水设立对照试验。
1.2.8药敏试验
挑取纯培养的单个菌落接种到营养肉汤中，37℃振摇培养24h 。用灭菌的棉球蘸取致病菌的肉汤培养物，均匀涂布到牛肉膏蛋白胨琼脂平板的表面。再将庆大霉素、四环素、链霉素等10种常用的抗生素的药敏纸片贴到两个琼脂平板的表面，37℃培养24h 后，测量抑菌圈的大小。
2结果与分析
2.1病菌的培养及镜检结果
在麦康凯培养基的表面可见有表面光滑、边缘整齐、圆形隆起的红色菌落并分离到3株疑似大肠杆菌菌株。革兰氏染色镜检，视野中可见大量散在排列，形态均一，两端钝圆的革兰氏阴性红色短杆菌。
2.2生化试验结果
表1生化鉴定结果
实验项目
结 果 实验项目 结果 吲哚
甲基红
VP
枸橼酸利用
葡萄糖产气
乳糖 ＋ ＋ － － ＋ ＋ 麦芽糖 蔗糖 H 2S 尿素酶 TSI 反应模式a ＋ V － － K ／A ＋;－
a ．TSI （三糖铁培养基）上反应情况： A=产酸（黄色） K= 产碱（红色）；＋为阳性 －为阴性
生化试验结果均符合大肠杆菌生化特性。
2.3抗原测定结果
玻片上的仅O 78血清与试菌液发生了凝集，所以该大肠杆菌的O 抗原为O 78。
2.4动物试验结果
A 组雏鸡6 h 后开始出现症状，表现精神沉郁，食欲下降甚至废绝，不愿走动，多数出现腹泻，有的出现神经症状，头向后仰，两翅下垂。接种12h 后开始出现死亡。对照鸡正常，无一例死亡。剖检死亡鸡，有心包液混浊，脑出血，肺充血、出血呈红色，脾肿大出血，肝周炎，气囊混浊及肠炎等典型大肠杆菌病病变，并从肝脏中回收到致病菌株。
2.5药敏试验结果 表2 药敏试验结果（mm ）
药物 结果 药物 结果
2/H S
斜面底层产气；
庆大霉素环丙沙星丁胺卡那卡那霉素四环素强力霉素13
22
25
20
9
恩诺沙星
新霉素
罗红霉素
林可霉素
阿莫西林
链霉素
9
20
12
19
注：抑菌圈直径大于15mm为高敏，直径在10-15mm为中敏，直径小于10mm为低敏、不敏感。
药敏试验结果表明：该大肠杆菌对环丙沙星、丁胺卡那、卡那霉素、新霉素、链霉素高敏，抑菌圈直径达到了20mm左右；对庆大霉素、罗红霉素中敏；对强力霉素、恩诺沙星低敏；对林可霉素、四环素、阿莫西林耐药。
3讨论
致病性大肠杆菌是危害养殖业的重要病原菌，凡能引起机体抵抗力降低的各种因素，如饲养环境差、鸡舍阴暗潮湿、光照不足、通风不良、饲养密度大、鸡舍没有定期消毒及气候突变等因素均是引发本次疾病的原因，特别是各种病毒的感染，都可以诱发大肠杆菌病。因此良好的饲养管理条件和清洁的环境，避免和减轻应激反应对本病的预防会起到很大的作用。
由于大肠杆菌在鸡舍、鸡体消化道广泛存在，且不同发病鸡场的大肠杆菌血清型可能不同及同一血清型的不同菌株在不同鸡场所表现的致病性也有差异，因此从发病鸡场的病死鸡体内分离到的大肠杆菌并不一定都具有致病性，必须进行致病性试验，确定分离菌株致病性的强弱，然后选择具有致病性的分离株研制针对不同发病鸡场的疫苗，进行免疫接种，才有可能有效预防不同发病鸡场的大肠杆菌病。抗菌药物在临床上广泛应用，大肠杆菌的耐药性不断增加。为避免细菌耐药性的产生，应先做细菌药敏试验，再合理选择用药，可缩短治疗时间，又避免滥用抗生素，同时减少养殖户的经济损失。
针对雏鸡大肠杆菌病，可采取以下几方面的防治措施[11]：一是加强饲养管理：(1)保持适宜的温度：由于雏鸡对温度的要求很高，在育雏前3d，保证育雏室的温度达到33～35℃，以后每周均匀地下降3℃，直到30d育雏期结束，使室温维持在18～2l℃左右。
(2)保持适宜的湿度：育雏期间在供暖炉上适时蒸发点食醋或定期带鸡喷雾消毒(注意防疫期间决不可以带鸡消毒)。这样既可以保持空气湿润，又可保持地面干燥，效果很好。二是加强通风：保证温度的同时合理透风可以减少慢性呼吸道疾病的发生，同时也是防治大肠杆菌病的一个有力措施。三是加强消毒：必须重视消毒和消毒效果，因此饲养时务必做到：(1)全进全出(2)空合期间的打扫卫生和2～5遍消毒；(3)上鸡之后对饲养管理人员尤其外来人员消毒，对水槽、料盆的消毒；(4)定期不定期的带鸡喷雾消毒(防疫期间除外)。
参考文献
[1] 林曦.家畜病理学[M].3版.北京:中国农业出版社,1995: 241-243.
[2] 陆承平.兽医微生物学[M].4版.北京:中国农业出版社,2007:101-103.
[3] 陈溥言.兽医传染病学[M].5版.北京:中国农业出版社,2006:113-115.
[4] 潘玉善,苑丽,胡功政等.肉鸡大肠杆菌产超广谱β-内酰胺酶的检测与药敏分析[J].江苏农业科
学,2010(2):38-43.
[5] 左玉柱,范京惠,赵国先等.保定市鸡源致病性大肠杆菌的流行病学及药敏试验[J].畜牧与兽
医,2010(6):58-60.
[6] 李萍,黄翠峰.鸡源大肠杆菌的分离鉴定及药敏试验研究[J].山东畜牧兽医,2010(9):63-68.
[7] 卢晓辉,李祥瑞,孙清莲等.河南省部分地区鸡源大肠杆菌分离及其生物学特性[J].畜牧与兽
医,2009(2):69-71.
[8] 汪力一,贾海军,韩旭东等.影响鸡大肠杆菌病的病原分析与对策研究[J].畜牧与饲料科
学,2009(11):110-112.
[9] 蔡宝祥.家畜传染病学[M].4版.北京:中国农业出版社,2001:47-49.
[10] 薛会明,杨慧菠,张超等.肉雏鸡致病性大肠杆菌的分离及敏感药物筛选[J].吉林农业科技学院
学报,2009(3):136-138.
[11] 马文兹,黄诚.鸡大肠杆菌病的流行特点与防治措施[J].畜牧市场,2010(1)89-92.
致谢
在此毕业设计完成之际，衷心感谢指导我完成论文的尊敬的。学习、工作方面都给我热情而细心的帮助，在她的悉心指导下，论文才得以顺利完成，同时还要大力感谢青岛正大农业发展有限公司即墨鸡场的大力协助，在毕业设计中他们都给以热情的帮助和指导。短暂的几个月时间我不仅在理论知识上，而且在实际操作能力上，都有一个飞跃性的进步。温老师和养殖场的各位技术员严谨的学习和工作态度，一丝不苟的敬业精神，已在我的脑海里深深的扎下了根，将激励我在以后的人生旅途中不畏艰难，勇往直前。再一次衷心感谢温老师的悉心指导和帮助，感谢支持我的同学和同事。衷心感谢青岛正大农业发展有限公司的刘成业、党广辉、李涛、郭小鹏技术员的帮助。
实验1 大肠杆菌的培养与分离
实验1：大肠杆菌的培养和分离 一、教学要求 二、基本内容 培养 无菌技配制培养基的原 的培养基的配制计算→称量→溶化→调pH 实配制培养基的方法→分装→加棉塞→灭菌→倒验平板 室平板划线法培分离、纯化大肠杆菌 养稀释涂布法系列稀释平板涂布 1．培养基的种类和化学成份 培养基的种类有很多划分标准，按物理性质分：固体培养基和液体培养基（加入琼脂多少）。液体培养基用于扩大培养和工业生产，固体培养基用于菌种分离，鉴定，计数（菌落数量）。 培养基的化学成分包括水、无机盐、碳源、氮源、生长因子等。按照微生物的同化作用类型是自养还是异养，碳源不同，自养微生物为无机碳源，如硝化细菌是二氧化碳或碳酸盐，异养微生物为有机碳源，如大肠杆菌是葡萄糖等有机物。 2．常见微生物类群 原核生物（如细菌大肠杆菌――二分裂、革兰氏阴性、异养兼性厌氧性肠道杆菌、蓝藻、支原体、衣原体、放线菌等）、原生生物（草履虫、变形虫等）、真菌（酵母菌――出芽生殖.异养兼性厌氧性微生物、霉菌、食用菌）、病毒等。 细菌是单细胞的原核生物，有细胞壁（肽聚糖）、细胞膜、细胞质，无成型的细胞核，只有一环状DNA分子（拟核）。以分裂（二分裂）的方式繁殖，分裂速度很快。用革兰氏染色法将细菌分为革兰氏阳性菌（革兰氏染液染色后，再脱色处理，细菌仍保留染色液的颜色）和革兰氏阴性菌两大类，区别在细胞壁的成分不同。大肠杆菌是革兰氏阴性（细胞壁薄，有荚膜）、兼性厌氧的肠道杆菌。 3．无菌技术 对实验操作空间、操作者的衣着和手进行清洁和消毒；将培养器皿、接种用具和培养基等器具进行灭菌；为避免周围微生物污染，实验操作应在酒精灯火焰附近旁进行；避免已灭菌处理的材料用具与周围物品相接触。 灭菌方法： 。灼烧灭菌法①接种环、接种针、试管口等使用
乳酸菌菌种的分离筛选方法解读
乳酸菌菌种的分离筛选方法乳酸细菌是一类能利用发酵糖产生大量乳酸的细菌通称。为兼性厌氧菌，杆状或球状，革兰氏阳性菌，无芽孢，不运动。营养要求高，需要提供丰富的肽类氨基酸维生素。在琼脂表面或内层形成较小的白色或淡黄色的菌落。 通常用作为有益微生物的菌种有乳酸乳杆菌、干酪乳杆菌、植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、粪肠球菌、乳酸片球菌、双歧杆菌、屎肠球菌、戊糖片球菌等。 乳杆菌常用MRS琼脂作半选择培养基。当乳杆菌仅是复杂区系中的部分菌类 时，SL培养基常用作为选择性培养基。对于芽孢乳杆菌常用GYP培养基，链球菌有TYC培养基、MS培养基。M17培养基被用作乳球菌的分离培养基。 嗜酸乳杆菌属于乳杆菌属的一个种。其特性为：杆菌，两端圆，不运动，无 鞭毛。粪肠球菌为革兰氏阳性，圆形或椭圆形。 乳酸片球菌细胞呈球状，直径0.6~1.0μm，在直角两个平面交替形成四联状，一般细胞成对生，单生者罕见，不成链状排列。革兰氏阳性，不运动，兼性厌氧。在MRS培养基上菌落小，呈白色。沿洋菜穿刺线的生长物呈丝状。 乳酸菌在一般琼脂培养基上形成微小菌落，不易观察，所以分离时先富集培养并选择合适的培养基。分离培养基一般添加西红柿、酵母膏、吐温-80等物质，也常常加入醋酸盐，因醋酸盐能抑制部分细菌生长，对乳酸菌无害。 培养基中添加碳酸钙，乳酸溶解培养基中的碳酸钙形成透明圈，作为分离鉴别的依据，通过对生成的乳酸量进行性能鉴定。 乳酸菌生长繁殖时需要多种氨基酸，维生素及微氧，一般菌落比较小。分离培养基一般可添加西红柿酵母膏油酸吐温等物质，均具有促进生长作用。也常常添加醋酸盐抑制有些细菌的生长，对乳酸菌无害。 一.筛选方法： 1.溶钙圈法： 利用一些产酸类细菌在含CaCO3的培养基上产生CaCO3溶解圈，从而筛选出这些产酸类细菌，可用于乳酸菌的筛选。 其中培养基中加入CaCO3的作用是：①鉴别能产生酸的细菌；②中和产生的酸，以维持培养基的PH。 筛选过程：样品预处理→梯度稀释至10-6→选择合适的稀释度涂布→37℃培养
大肠杆菌分离鉴定及药敏实验方案
鸡致病性大肠杆菌的分离培养及药敏实验 实验基本步骤：样品→肝、脾触片革兰氏染色镜检→普通琼脂平板、麦康凯琼脂平板分离培养→革兰氏染色镜检、生化实验鉴定→普通肉汤培养基增殖培养→药敏实验。 1 病料采集 1.1 准备材料：试管、载玻片、手术刀、手术剪、结扎绳、记号笔、冰块、泡沫箱、口罩、手套（该灭菌的都进行高压蒸汽灭菌）、冰箱。 1.2 取材部位：血液、肝脏、脾脏、肠内容物，若有鸡胚感染则去鸡胚及卵黄物。 1.3 操作方法：将病死鸡浸泡在消毒剂溶液中，打开腹腔，无菌采集肝脏、脾脏放于事先准备好的灭菌试管内，将带有肠内容物的肠管两端结扎放于灭菌是试管内。将有明显病变的脏器入肝、脾进行触片，做好标记。都贴上标签，标示采集样品，来源地，采集时间，采集人。将装有病料的试管放在放有冰袋的泡沫箱中，及时返回实验室，置于4℃冰箱待检。 2 菌的分离培养及鉴定 2.1 准备材料：光学显微镜、革兰氏染色液、载玻片、手术刀、接种环、平皿、恒温箱、高压锅、摇床、酒精灯、葡萄糖、甘露醇、乳糖、蔗糖等微量生化发酵管，蛋白胨水（蛋白胨(或胰蛋白胨)20g、氯化钠5g、蒸馏水1000mL pH7.4），葡萄糖蛋白胨水溶液（每100 mL蛋白胨水中加入葡萄糖1g）、甲基红试剂、吲哚试剂、乙醚、VP指示剂、超净台。 培养基： A. 普通琼脂培养基（牛肉粉 3g、蛋白胨 10g、氯化钠 5g、琼脂 20g、蒸馏水1000ml，ph7.3±0.1）， B. 麦康凯琼脂培养基（蛋白胨20g、牛胆盐5g、氯化钠5g、琼脂15g，乳糖10g、结晶紫0.001g、中性红0.025g，ph7.2±0.2。）， C. 营养肉汤培养基（牛肉粉 3g、蛋白胨 10g、氯化钠 5g、蒸馏水1000ml，ph7.2±0.2）。 2．2 样品触片镜检 涂片镜检：取触片,进行革兰氏染色镜检。 2.2.1在玻片上滴加草酸铵结晶紫染色液，作用1min，水洗。 2.2.2 加革兰氏碘液于玻片上媒染，作用1min，水洗。
乳杆菌噬菌体的分离鉴定及生物学特性分析
乳杆菌噬菌体的分离鉴定及生物学特性分析乳杆菌作为公认的安全级微生物,具有促消化、抗菌、增强免疫力等多种益生功能,广泛应用于食品工业、医药工程和畜牧业,其中植物乳杆菌、干酪乳杆菌和戊糖乳杆菌较为常用。在发酵工程中,噬菌体的污染可造成不可忽视的后果,严重影响产品品质,甚至导致发酵失败。 本研究通过噬菌体富集法从酸菜中分离出两株烈性乳杆菌噬菌体,分别命名为LpeD和Lpa804,并对这两株噬菌体进行了生物学特性的鉴定。通过电镜观察,噬菌体LpeD和Lpa804均具有典型的二十面体头部和非收缩性尾部,均属于尾噬菌体目、长尾噬菌体科。 根据宿主范围测定结果,噬菌体Lpa804可感染植物乳杆菌(L.plantarum PA106和L.plantarum SC),而噬菌体LpeD可感染戊糖乳杆菌(L.pentosus KLDS1.0413)和植物乳杆菌(L.plantarumKLDSl.0344)。一步生长曲线的测定结果显示,噬菌体LpeD的潜伏期为15min,裂解期为90min,裂解量为194PFU/cell;噬菌体Lpa804的潜伏期为30min,裂解期为105 min,裂解量为221 PFU/cell。 理化因素对噬菌体的影响结果表明,噬菌体LpeD和Lpa804均对热敏感,LpeD 在56℃作用2 min全部失活,Lpa804在63℃作用2 min全部失活。噬菌体LpeD 和Lpa804在pH 4-12的环境中较为稳定,显示了较强的酸碱耐受性。 紫外线照射并不能使噬菌体LpeD和Lpa804完全灭活,二者在紫外线照射20 min后均仍有部分噬菌体颗粒存活。噬菌体LpeD和Lpa804对乙醇和异丙醇较敏感,35%乙醇作用10 min可使LpeD全部失活,25%乙醇作用10 min可使Lpa804 全部失活。 35%异丙醇作用10 min可使LpeD全部失活,25%异丙醇作用10 min可使
高中生物大肠杆菌的培养和分离(学案)
大肠杆菌的培养和分离 ——基础知识和操作过程梳理 一、大肠杆菌 细菌是单细胞的原核生物。细菌细胞的结构有细胞壁、细胞膜、细胞质等。细菌无成型的细胞核，细胞壁由肽聚糖组成。由于细菌细胞壁结构不同，细菌可分为革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌两类。革兰氏阳性菌细胞壁厚，无荚膜，多产生外毒素；革兰氏阴性菌细胞壁薄，有荚膜，多产生内毒素。革兰氏阳性菌对青霉素更为敏感。 大肠杆菌是革兰氏阴性、异养兼性厌氧型肠道杆菌。在肠道中一般对人无害，但任何大肠杆菌进入人的泌尿系统，都会对人体产生危害。大肠杆菌在基因工程技术中被广泛的应用，它的质粒是最常用的运载体，它也是基因工程中常用的受体细胞。 二、培养基配置 微生物生命活动过程中需要的化合物有碳源、氮源、生长因子、无机盐和水。有的化合物既是碳源又是氮源、能源。生长因子是微生物生长不可缺少的微量有机物，但不一定需要外界补充，有的微生物可以自身合成。在提供上述几种主要营养物质的基础上，培养基还需要满足微生物生长对pH、特殊营养物质以及氧气的要求。 我们一般用LB液体培养基来扩大培养大肠杆菌，培养后可在LB固体培养基上划线分离。以下为本实验中培养基配置步骤： 1．称量：准确称取各成分。蛋白胨0.5g，酵母提取物0.25g，氯化钠0.5g，加水50ml。配置LB固体培养基时还需加1g琼脂。 2．溶化：加热熔化，用蒸馏水定容到50mL。配置LB固体培养基时还需加琼脂，整个过程不断用玻棒搅拌，目的是防止琼脂糊底而导致烧杯破裂。 3．调pH：用1mol/L NaOH溶液调节pH至偏碱性。 4．灭菌：在两个250ml的三角瓶中分别装入50ml LB液体培养基和50ml LB固体培养基，加上棉塞。将培养皿用牛皮纸包好，放入灭菌锅内，1kg压力灭菌15min。 5．倒平板：灭菌后，待固体培养基冷却至60℃左右时在酒精灯火焰附近操作进行。其过程是：①将灭过菌的培养皿放在火焰旁，右手拿装有培养基的三角瓶，左手拔出棉塞；②右手拿三角瓶，使三角瓶的瓶口迅速通过火焰；③用左手将培养皿打开一条稍大于三角瓶口的缝隙，右手将培养基倒入培养皿，立刻盖上皿盖；④待平板冷却凝固后，将平板倒过来放置。
大肠杆菌和沙门氏菌的分离鉴定方案
大肠杆菌和沙门氏菌的分离鉴定方案 实验原理： 1、大肠杆菌的性质： 大肠杆菌是G--无芽孢直杆菌，在大多数培养基上表现出不同的特性。在麦康凯琼脂平板上是凸起光滑湿润的粉红菌落，革兰氏染色镜检为红色短杆菌。三糖铁琼脂上的反应为斜面和底部都变黄，产气，不产生硫化氢。生化特性为发酵葡萄糖、乳糖、甘露醇、麦芽糖，不发酵蔗糖。MR试验，吲哚试验为阳性，VP试验为阴性，不产生H2S，不能利用枸椽酸盐。半固体中沿穿刺线向四周生长。 2、沙门氏杆菌的性质： 沙门氏杆菌是G-直杆菌。在麦康凯平板上为细小半透明、圆形、无色小菌落，三糖铁斜面下层变黄色，上层仍为红色，穿刺处为变黑产生H2S。能发酵葡萄糖产酸产气，能利用枸椽酸盐，不发酵乳糖不利用蔗糖肌醇，MR阳性，VP阴性，不产吲哚，不分解尿素。 实验材料： 含有大肠杆菌和沙门氏菌的猪肝脏、培养基（琼脂平板培养基、三糖铁琼脂斜面培养基、麦康凯琼脂、生化培养基、SC）、器械（剪刀、记号笔、接种环、酒精灯、显微镜、试管、玻片、培养皿）、药品（消毒酒精、结晶紫、碘液、酸酒精、品红、松柏油） 实验内容及操作程序： 一、培养基制备： 制备普通琼脂培养基、麦康凯平板、SC增菌培养基、生化培养基，制备方法见附1.二、标本制备： （1）取新鲜猪肝脏一小块，火焰表面消毒。 （2）用浸过消毒液的剪刀剪开一个小口于消过毒的猪肝脏。 （3）用接种环在剪开的肝脏小口沾取肝脏液，分别画线于麦康凯培养基和接种于SC中，37°C恒温培养24小时。 三、细菌分离培养： （1）取出培养了24小时的麦康凯平板。挑选麦康凯平板上的凸起光滑湿润的粉红菌落染色镜检，看是否为红色短杆菌，若是，即疑似为大肠杆菌，则取其接种于另一麦康凯平板，37°C 恒温培养24小时。 （2）取出培养了24小时的SC增菌培养基，染色镜检，看是否有疑似沙门氏菌，有则取其中细菌画线接种于麦康凯平板上，37°C恒温培养24小时。 四、细菌的鉴定纯化： （1）检查疑似大肠杆菌的培养基是否长满了粉红色菌落，染色镜检。并取其分别接种于生化培养基上（葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇、蔗糖、肌醇、枸椽酸盐、尿素、MR、VP、H2S），并做穿刺实验于三糖铁上。37°C恒温培养24小时后观察结果。若实验结果满足预期效果，则可判定为大肠杆菌，则将其接种于普通琼脂培养基上传代培养。 （2）检查疑似沙门氏菌的平板上是否长满细菌，染色镜检，看是否满足于沙门氏菌的染色特性。并取其接种于生化培养基上，并作穿刺实验于三糖铁上，37°C恒温培养24小时后观察结果，若结果满足于沙门氏菌的生化特性，则可判定为沙门氏菌，则将其接种于普通琼脂培养基上传代培养。
乳酸菌得分离、纯化与鉴定
乳酸菌得分离、纯化与鉴定 第一部分:乳酸菌得分离、纯化 一、实验器材: 1、实验药品新鲜乳酸饮料(市售)、脱脂奶粉、蔗糖、1、6%溴甲酚绿乙醇溶液(溴甲酚绿、无水乙醇)、酵母膏、琼脂、革兰氏染液(结晶紫染液、卢戈氏碘液、95%乙醇、沙黄)、75%乙醇、香柏油、1mol/L NaOH、1mol/L HCl、碳酸钙; 0、4gNaOH固体、4、2ml浓HCL(分析纯) 、20gCaCO3固体、酵母膏20g 、琼脂30g 香柏油、脱脂奶粉100g 、蔗糖10g; 2、仪器与设备高压蒸汽灭菌锅、光学显微镜、培养箱、pH试纸、酸乳瓶、培养皿(φ9或φ12)、试管、300ml三角瓶(带玻珠)、移液管、天平、500ml锥形瓶、250ml锥形瓶、250ml烧杯。 二、实验步骤: 1、培养基配制(BCG牛乳培养基): (A)溶液:取脱脂乳粉100g,水500ml,加入1、6%溴甲酚氯乙醇溶液1ml,混合均匀后分装入三角瓶于高压蒸汽灭菌锅80℃灭菌20 min;(1、6%溴甲苯酚绿(BCG)乙醇溶液用1、6g溴甲酚绿加入20ml无水乙醇中,再加水至100ml制成) (B)溶液:酵母膏10g,水500ml,CaCO3 10g,琼脂20g,加热溶解,用精密pH试纸调节pH到6、8,分装入三角瓶后在103kPa 121℃高压蒸汽灭菌20Min。 以无菌操作趁热将(A)(B)溶液均匀混合。 2、药品配制 2、1 结晶紫:结晶紫乙醇饱与液(结晶紫2g溶于20ml 95%乙醇中)20ml,1%草酸氨水溶液80ml。将两液混匀,放置24小时后过滤即可。 2、2 卢哥氏碘液:碘1g,碘化钾2g,蒸馏水300ml。先将碘化钾溶于少量蒸馏水中,然后加入碘使之完全溶解,再加入蒸馏水300ml即成。 2、3 蕃红溶液:番红2、5g,95%乙醇100ml,溶解后存于密闭得棕色瓶中。用时取20ml与80ml蒸馏水混匀即可。 2、4 0、1%得吕氏美蓝染液:A液:美蓝0、3g,95%乙醇300ml;B液:0、01% KOH 100ml。混合A与B液即成,按1:100稀释即可。 2、4 生理盐水:称取9g氯化钠,溶解在少量蒸馏水中,稀释到1000毫升。 3、菌悬液得配制
大肠杆菌和沙门氏菌的分离鉴定方案
实验原理： 1、大肠杆菌的性质: 大肠杆菌是G无芽抱直杆菌，在大多数培养基上表现出不同的特性。在麦康凯琼脂平板上是凸起光滑湿润的粉红菌落，革兰氏染色镜检为红色短杆菌。三糖铁琼脂上的反应为斜面和底部都变黄，产气，不产生硫化氢。生化特性为发酵葡萄糖、乳糖、甘露醇、麦芽糖，不发酵蔗糖。MR试验，口引噪试验为阳性，VP试验为阴性，不产生H 2S,不能利用xx酸盐。 半固体中沿穿刺线向四周生长。 2、沙门氏杆菌的性质： -沙门氏杆菌是G直杆菌。在麦康凯平板上为细小半透明、圆形、无色小菌落，三糖铁斜面下层变黄色，上层仍为红色，穿刺处为变黑产生H 2S。能发酵葡萄糖产酸产气，能利用枸椽酸盐，不发酵乳糖不利用蔗糖肌 醇，MR阳性，VP阴性，不产呵噪，不分解尿素。 实验材料： 含有大肠杆菌和沙门氏菌的猪肝脏、培养基（琼脂平板培养基、三糖铁琼脂斜面培养基、麦康凯琼脂、生化培养基、SQ、器械（剪刀、记号笔、接种环、酒精灯、显微镜、试管、玻片、培养皿）、药品（消毒酒精、结晶紫、碘液、酸酒精、品红、松柏油） 实验内容及操作程序： 一、培养基制备： 制备普通琼脂培养基、麦康凯平板、SC增菌培养基、生化培养基，制备方法
见附 1. 二、标本制备： (1) 取新鲜猪肝脏一小块，火焰表面消毒。 (2) 用浸过消毒液的剪刀剪开一个小口于消过毒的猪肝脏。 (3) 用接种环在剪开的肝脏小口沾取肝脏液，分别画线于麦康凯培养基和接种于SC中，37 C恒温培养24小时。 三、细菌分离培养： (1) 取出培养了24小时的麦康凯平板。挑选麦康凯平板上的凸起光滑湿润的粉红菌落染色镜检，看是否为红色短杆菌，若是，即疑似为大肠杆菌，则取其接种于另一麦康凯平板，37 C恒温培养24小时。 (2) 取出培养了24小时的SC增菌培养基，染色镜检，看是否有疑似沙门 氏菌，有则取其中细菌画线接种于麦康凯平板上，37 C恒温培养24小时。 四、细菌的鉴定纯化： (1) 检查疑似大肠杆菌的培养基是否长满了粉红色菌落，染色镜检。并取其分别接种于生化培养基上(葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇、蔗糖、肌醇、枸椽酸盐、尿素、MR、VP、H 2S),并做穿刺实验于三糖铁上。37 C恒温培养24小时后观察结果。若实验结果满足预期效果，则可判定为大肠杆菌，则将其接种于普通琼脂培养基上传代培养。 (2) 检查疑似沙门氏菌的平板上是否长满细菌，染色镜检，看是否满足于沙门氏菌的染色特性。并取其接种于生化培养基上，并作穿刺实验于三糖铁 上，37 C恒温培养24小时后观察结果，若结果满足于沙门氏菌的生化特性，则可判定为沙门氏菌，则将其接种于普通琼脂培养基上传代培养。
大肠杆菌的培养和分离
一、大肠杆菌的培养和分离 用__________扩大培养，再用__________分离，形成一个个单独的菌落。 __________培养基是细菌通用培养基；__________培养基是植物组织培养通用培养基2.细菌分离方法比较 __________分离法---方法简单； __________分离法—单菌落易分离，操作复杂 3.灭菌操作 ①灭菌操作的首要条件是各种器皿必须是无菌的 ②各种培养基必须是无菌 4.培养和分离步骤 __________→__________→__________培养__________分离→培养保存 5.灭菌与消毒 二、分离以尿素为唯一氮源的微生物 1.实验原理 （1）利用尿素的细菌含有__________，通过降解_______作为其生长的氮源，其反应式如下：（NH2）2C=O+H2O----脲酶→____________________2 （2）利用指示剂（______）颜色变化检验脲酶所催化的反应，若酚红由__________色变为__________色，证明尿素以被脲酶水解产生__________ 2实验步骤 制备__________培养基和以______为唯一氮源固体培养基→制备细菌__________，并稀释至10-3、10-4、10-5、10-6→__________分离→培养保存 注意：在恒温箱中培养时，培养皿要__________—防止凝结的蒸馏水滴到培养基上 3预测结果： ①LB全素固体培养基上__________； ②以尿素为唯一氮源固体培养基__________； ③一定时间内，菌落周围出现__________区域； ④用浓度为10-4和10-5土壤稀释液接种，__________土壤稀释液更容易形成单菌落。 高考及高考模拟题
大肠杆菌的分离鉴定与药敏试验
河南农业大学 本科生毕业论文(设计) 题目鸡大肠杆菌的分离鉴定与药敏试验学院牧医工程学院 专业班级2011届动物医学专升本3班学生姓名王张凡 指导教师许兰菊(教授) 撰写日期：2011年5月10 日
鸡大肠杆菌的分离鉴定与药敏试验 王张凡 （2011届动物医学专升本3班） 摘要：为了对巩义某鸡场疑似鸡大肠杆菌病的鸡群进行确诊，并为有效防治提供依据，本研究利用细菌学检验方法对采集的典型病料进行细菌分离鉴定和细菌药敏试验。通过细菌分离培养、形态学观察、生化试验、动物试验和血清学试验。结果表明：该鸡群中分离到的病原菌为鸡大肠杆菌。动物攻毒试验结果表明：分离的鸡大肠杆菌具有明显的致病作用，雏鸡发病率为100%(5/5)，死亡率达60%(3/5)。血清学鉴定结果显示，该分离菌血清型为O1。药敏试验结果表明：该细菌对头孢曲松、头孢唑林、阿米卡星、复方新诺明（磺胺甲恶唑）、环丙沙星、诺氟沙星、氧氟沙星、氨苄西林、米诺环素和庆大霉素均敏感，对阿莫西林和阿奇霉素为中度敏感;但对罗红霉素和四环素耐药。本研究结果对准确诊断和有效防治该病提供了依据和条件。 关键词：鸡；大肠杆菌；分离鉴定；药敏试验 Isolation, Identification and Antibiotic Sensitivity Test of Chicken Escherichia Coli wang zhangfan (Class 3 of Veterinary Medicine, Graduated in 2011) Abstract:In order to make a definite diagnosis for the suspend Chicken Escherichia Coli about chicken house from Gongyi and provide a reference for effective prevention and treatment. The bacteria was isolated and identified from typical samples and antibiotic sensitivity test was also adopted. By bacterial separate cultures, morphological observation, biochemical tests, animal experiment and serological tests, the pathogen of this chickens is pathogenic E.coli bacteria. The result of animal experiment showed: this Escherichia coli had obviously pathogenic; the morbidity of chicklings was 100%(5/5) and the mortality was 60%(3/5).Serological testing results indicated: the serotype of this strain was O1. The antibiotic sensitivity test results illuminated: the sensitivity of the strain to ceftriaxone、cefazolin and other 8 kinds of drug were sensitive; and the drug sensitivity to amoxicillin and azithromycin are intermediate;but the strain were drug resistant to roxithromycin and acheomycin. This research provided a scientific basis and qualification for exact diagnosis and effective prevention and treatment to Escherichia coli. Key word:Chicken,Escherichia Coli, Isolation and Identification, Antibiotic Sensitivity Test 鸡大肠杆菌病是由禽致病性大肠杆菌(avian pathgenicity E．coli，APEC)引起的急性或慢性细菌性传染病，各种日龄的鸡均可发病，但雏鸡和产蛋鸡更易发病，其常与其他疾病混合
乳酸菌的分离、纯化与鉴定
乳酸菌的分离、纯化与鉴定 第一部分：乳酸菌的分离、纯化 一、实验器材: 1.实验药品新鲜乳酸饮料（市售）、脱脂奶粉、蔗糖、1.6%溴甲酚绿乙醇溶液(溴甲酚绿、无水乙醇)、酵母膏、琼脂、革兰氏染液（结晶紫染液、卢戈氏碘液、95%乙醇、沙黄）、75%乙醇、香柏油、1mol/L NaOH、1mol/L HCl、碳酸钙； 0.4gNaOH固体、4.2ml浓HCL(分析纯) 、20gCaCO3固体、酵母膏20g 、琼脂30g 香柏油、脱脂奶粉100g 、蔗糖10g； 2.仪器与设备高压蒸汽灭菌锅、光学显微镜、培养箱、pH试纸、酸乳瓶、培养皿（φ9或φ12）、试管、300ml三角瓶（带玻珠）、移液管、天平、500ml 锥形瓶、250ml锥形瓶、250ml烧杯。 二、实验步骤： 1.培养基配制（BCG牛乳培养基）： （A）溶液：取脱脂乳粉100g，水500ml，加入1.6%溴甲酚氯乙醇溶液1ml，混合均匀后分装入三角瓶于高压蒸汽灭菌锅80℃灭菌20 min；（1.6%溴甲苯酚绿（BCG）乙醇溶液用1.6g溴甲酚绿加入20ml无水乙醇中，再加水至100ml制成） （B）溶液：酵母膏10g，水500ml，CaCO3 10g，琼脂20g，加热溶解，用精密pH试纸调节pH到6.8，分装入三角瓶后在103kPa 121℃高压蒸汽灭菌 20Min。 以无菌操作趁热将(A)(B)溶液均匀混合。 2.药品配制 2.1 结晶紫：结晶紫乙醇饱和液（结晶紫2g溶于20ml 95%乙醇中）20ml，1%草酸氨水溶液80ml。将两液混匀，放置24小时后过滤即可。 2.2 卢哥氏碘液：碘1g，碘化钾2g，蒸馏水300ml。先将碘化钾溶于少量蒸馏水中，然后加入碘使之完全溶解，再加入蒸馏水300ml即成。 2.3 蕃红溶液：番红2.5g，95%乙醇100ml，溶解后存于密闭的棕色瓶中。用时取20ml与80ml蒸馏水混匀即可。
乳酸菌的分离和初步鉴定
乳酸菌的分离和初步鉴定 刘海音张超 (长春师范学院生物系，长春，130032) 摘要：本文采用BCG牛乳培养基琼脂平板筛选乳酸菌，经过连续6次以上的传代，以达到分离提纯，镜检时观察到链球状和杆状两种形状。为了鉴定分离出的菌种，做了一系列的生理生化反应实验，如吲哚试验的反应结果为阴性，糖发酵试验的反应结果为阳性。此外还进一步做了小型发酵实验，检测出了乳酸的存在⑴。以上实验结果符合乳酸菌的特征，从而证实该分离出的菌种为乳酸菌，杆状的叫做短乳杆菌，链球状的叫做乳链球菌。 关键词：乳酸菌分离鉴定 乳酸菌为一群可发酵碳水化合物以获取能量，并生成大量乳酸的一类细菌的总称。利用发酵技术保藏食品，最典型的是通过乳酸菌的发酵。这在发酵乳工业中已经得到广泛的应用。利用天然的或经筛选的乳酸菌发酵，已经生产出多种不同类型的发酵乳。因而分离和鉴定乳酸菌对人类的生产和生活都具有非常重要的意义。本报告采用BCG牛乳培养基琼脂平板筛选和分离乳酸菌，利用镜检观察到了链球状和杆状两种形状。通过吲哚试验和糖发酵试验以及小型发酵实验证明该菌种为乳酸菌，杆状的叫做短乳杆菌，链球状的叫做乳链球菌 1.材料和方法 1.1材料 1.1.1选用沈阳乳业有限责任公司乳品一厂生产的辉山纯酸奶 1.1.2 培养基 BCG牛乳培养基 A(溶液)：脱脂奶粉100g, 水500 ml, 加入1.6%溴甲酚绿（B.C.G）乙醇溶液1 ml, 80 摄氏度灭菌20 min. B(溶液)：酵母膏10 g, 水500 ml, 琼脂20 g, PH : 6.8 121摄氏度灭菌20 min 以无菌操作趁热将A ,B 溶液混合均匀后倒平板。 乳酸菌培养基 牛肉膏5 g , 酵母膏5 g , 蛋白胨10 g ,葡萄糖10 g , 乳糖5 g , 氯化钠5 g , 水1000 ml , PH : 6.8 121摄氏度湿热灭菌20 min 蛋白胨水培养基
仔猪黄痢大肠杆菌的分离鉴定
仔猪黄痢大肠杆菌的分离鉴定 仔猪黄痢病是出生仔猪常发的急性、致死性肠道传染病，多在仔猪出生后几天内发病，发病率高、死亡率高。临床症状主要以腹泻、排黄色稀粪、急性死亡为主要特征，剖检有肠炎和败血症变化，是危害哺乳仔猪的重要传染病之一，严重影响仔猪的生长发育，对养猪业危害极大。2015年3月，北京顺义某猪场突发仔猪腹泻，排黄白色或黄色水样稀便，根据流行病学、临床症状和病理剖检，并结合细菌病原分离、生化鉴定，致病性试验，药敏试验，确诊为仔猪黄痢大肠杆菌病。对分离的菌株进行了药敏试验，筛选出了3种敏感药物，根据诊断及药敏试验结果采取了相应的控制措施，效果显著经治疗，病情得到了有效控制。现报告如下。 1 发病情况北京顺义某猪场于2015年3月，5日龄仔猪突然发病，仔猪腹泻不止，患猪粪便呈黄白色或黄色水样，仔猪迅速消瘦、全身衰弱，很快死亡。 2 临诊症状患猪腹泻黄色水样、顺肛门流下。精神沉郁，停止吃乳，脱水，迅速消瘦。 3 病理变化心包增厚，心包膜外面覆盖纤维素性渗出物，心外膜小点出血。肝表面覆盖一层灰黄色纤维素膜，肝肿大呈土黄色，表面有细小的灰白色坏死点。脾肿大出血。十二指肠出血。 4 实验室诊断 4.1 细菌分离培养将采集的2份肝脏组织分别接种马丁琼脂培养基和麦康凯琼脂培养基，37℃培养18～24h，观察菌落形态。挑取可疑菌落涂片、革兰氏染色、镜检、纯培养。 4.2 生化试验参照BioMerieux VITEK32全自动细菌鉴定及药敏仪鉴定操作说明进行。取纯化的单菌落接于0.45% NaCL基物安培管，用比浊仪制备混浊度相当于1个麦氏单位的菌悬液，接种于VITEK革兰氏阴性菌鉴定卡（GNI+），放入读数器中鉴定读取结果。 4.3致病性试验 将上述生化试验鉴定为大肠杆菌阳性的菌株，分别取纯化的单菌落接种普通营养肉汤，37℃培养24h，将每个菌株的营养肉汤培养物分别经腹腔接种小白鼠
高中生物《大肠杆菌的培养和分离》学案1 浙教版选修1
高中生物《大肠杆菌的培养和分离》学案1 浙 教版选修1 一、大肠杆菌细菌是单细胞的原核生物。细菌细胞的结构有细胞壁、细胞膜、细胞质等。细菌无成型的细胞核，细胞壁由肽聚糖组成。由于细菌细胞壁结构不同，细菌可分为革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌两类。革兰氏阳性菌细胞壁厚，无荚膜，多产生外毒素；革兰氏阴性菌细胞壁薄，有荚膜，多产生内毒素。革兰氏阳性菌对青霉素更为敏感。大肠杆菌是革兰氏阴性、异养兼性厌氧型肠道杆菌。在肠道中一般对人无害，但任何大肠杆菌进入人的泌尿系统，都会对人体产生危害。大肠杆菌在基因工程技术中被广泛的应用，它的质粒是最常用的运载体，它也是基因工程中常用的受体细胞。 二、培养基配置微生物生命活动过程中需要的化合物有碳源、氮源、生长因子、无机盐和水。有的化合物既是碳源又是氮源、能源。生长因子是微生物生长不可缺少的微量有机物，但不一定需要外界补充，有的微生物可以自身合成。在提供上述几种主要营养物质的基础上，培养基还需要满足微生物生长对pH、特殊营养物质以及氧气的要求。我们一般用LB液体培养基来扩大培养大肠杆菌，培养后可在LB固体培养基上划线分离。以下为本实验中培养基配置步骤：
1、称量：准确称取各成分。蛋白胨0、5g，酵母提取物0、25g，氯化钠0、5g，加水50ml。配置LB固体培养基时还需加1g 琼脂。 2、溶化：加热熔化，用蒸馏水定容到50mL。配置LB固体培养基时还需加琼脂，整个过程不断用玻棒搅拌，目的是防止琼脂糊底而导致烧杯破裂。 3、调pH：用1mol/L NaOH溶液调节pH至偏碱性。 4、灭菌：在两个250ml的三角瓶中分别装入50ml LB液体培养基和50ml LB固体培养基，加上棉塞。将培养皿用牛皮纸包好，放入灭菌锅内，1kg压力灭菌15min。 5、倒平板：灭菌后，待固体培养基冷却至60℃左右时在酒精灯火焰附近操作进行。其过程是：①将灭过菌的培养皿放在火焰旁，右手拿装有培养基的三角瓶，左手拔出棉塞；②右手拿三角瓶，使三角瓶的瓶口迅速通过火焰；③用左手将培养皿打开一条稍大于三角瓶口的缝隙，右手将培养基倒入培养皿，立刻盖上皿盖；④待平板冷却凝固后，将平板倒过来放置。倒过来放置的目的是防止培养基冷却过程中形成的水滴落到培养基表面。向培养皿中转移已灭菌的培养基时，也不要把培养基沾在皿壁上。否则，空气中杂菌会在这些粘附培养基上繁殖，并污染皿内培养基。 三、灭菌和消毒
大肠杆菌分离鉴定论文
河南科技学院2010届本科毕业论文（设计） 一起猪源性大肠杆菌病的诊治 学生姓名：汤鹏 所在院（系）：动物科学学院 所学专业：动植物检疫 导师姓名：王宪文 完成时间：2014年5月
一起猪源性大肠杆菌病的诊治 摘要 大肠杆菌病是由病原大肠埃希氏菌所引起的一种急性、多型性、肠道型传染病，严重影响仔猪的存活率。主要临床表现有仔猪黄痢、仔猪白痢、猪水肿病。为了弄清养猪场大肠杆菌病的主要血清型、抗药性等特点，以便采取合理的防治措施，采集病料60份，进行大肠杆菌病的分离培养鉴定、生化试验、耐药性试验等，大肠杆菌的分离鉴定包括病原菌的分离培养、生化试验、毒理试验，在伊红美蓝上挑出略带金属光泽、紫黑色的菌落接种在麦康凯上经过培养后，轻摇显云雾状的菌环，在营养琼脂上培养形成菌落，进行试验找出菌落的特性，以及致病力。耐药性实验结果表明（），治疗试验中------，试验结论--。（方法为培养基的制备、琼脂纸片扩散法，氟哌酸、磺胺、四环素对大肠杆菌不太有效，大肠杆菌对头孢类药物较为敏感，对卡那霉素、庆大霉素不敏感）（删除） 关键词：仔猪、大肠杆菌、分离鉴定、药敏试验、中草药制剂
Abstract Escherichia coli disease is an acute, polymorphism, intestinal infectious diseasescaused by pathogenic Escherichia coli, seriously affect the survival rate of piglets. The main clinical manifestations of yellow scour of newborn piglets, white scour of piglets, edema disease of swine. In order to understand the swinecolibacillosis serotype, drug resistance, in order to take reasonable measures of prevention and cure disease, collecting material is 60, separation of Escherichia coli culture identification, biochemical test, resistance test, isolation, isolation and identification of pathogenic bacteria Escherichia coli include biochemical test,toxicity test, in eosin methylene blue was inoculated with metallic luster, pick out the purple black at mark Kang Kai. After training, annulus rocked the explicitcloud like, culture form colonies on nutrient agar, find out the characteristics ofcolony, and pathogenicity. Methods drug sensitivity test for the preparation of culture medium, agar disk diffusion method, norfloxacin, tetracycline andsulfonamide, less effective against Escherichia coli, E. coli sensitive tocephalosporins, not sensitive to kanamycin, gentamicin, Key words: Piglet, Escherichia coli, isolation and identification, drug sensitive test, micro ecological preparation
实验1 大肠杆菌的培养和分离.doc
实验1 大肠杆菌的培养和分离 ——基础知识和操作过程梳理一、大肠杆菌细菌是单细胞的原核生物。细菌细胞的结构有细胞壁、细胞膜、细胞质等。细菌无成型的细胞核，细胞壁由肽聚糖组成。由于细菌细胞壁结构不同，细菌可分为革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌两类。革兰氏阳性菌细胞壁厚，无荚膜，多产生外毒素；革兰氏阴性菌细胞壁薄，有荚膜，多产生内毒素。革兰氏阳性菌对青霉素更为敏感。大肠杆菌是革兰氏阴性、异养兼性厌氧型肠道杆菌。在肠道中一般对人无害，但任何大肠杆菌进入人的泌尿系统，都会对人体产生危害。大肠杆菌在基因工程技术中被广泛的应用，它的质粒是最常用的运载体，它也是基因工程中常用的受体细胞。二、培养基配置微生物生命活动过程中需要的化合物有碳源、氮源、生长因子、无机盐和水。有的化合物既是碳源又是氮源、能源。生长因子是微生物生长不可缺少的微量有机物，但不一定需要外界补充，有的微生物可以自身合成。在提供上述几种主要营养物质的基础上，培养基还需要满足微生物生长对ph、特殊营养物质以及氧气的要求。我们一般用lb液体培养基来扩大培养大肠杆菌，培养后可在lb固体培养基上划线分离。以下为本实验中培养基配置步骤： 1．称量：准确称取各成分。蛋白胨0.5g，酵母提取物0.25g，氯化钠0.5g，加水50ml。配置lb固体培养基时还需加1g 琼脂。 2．溶化：加热熔化，用蒸馏水定容到50ml。配置lb固体培养基时还需加琼脂，整个过程不断用玻棒搅拌，目的是防止琼脂糊
底而导致烧杯破裂。 3．调ph：用1mol/l naoh溶液调节ph至偏碱性。 4．灭菌：在两个250ml的三角瓶中分别装入50ml lb液体培养基和50ml lb固体培养基，加上棉塞。将培养皿用牛皮纸包好，放入灭菌锅内，1kg压力灭菌15min。 5．倒平板：灭菌后，待固体培养基冷却至60℃左右时在酒精灯火焰附近操作进行。其过程是：①将灭过菌的培养皿放在火焰旁，右手拿装有培养基的三角瓶，左手拔出棉塞；②右手拿三角瓶，使三角瓶的瓶口迅速通过火焰；③用左手将培养皿打开一条稍大于三角瓶口的缝隙，右手将培养基倒入培养皿，立刻盖上皿盖；④待平板冷却凝固后，将平板倒过来放置。倒过来放置的目的是防止培养基冷却过程中形成的水滴落到培养基表面。向培养皿中转移已灭菌的培养基时，也不要把培养基沾在皿壁上。否则，空气中杂菌会在这些粘附培养基上繁殖，并污染皿内培养基。 三、灭菌和消毒 1．无菌技术：①对实验操作空间、操作者的衣着和手进行清洁和消毒；②将培养器皿、接种用具和培养基等器具进行灭菌；③为避免周围微生物污染，实验操作应在酒精灯火焰旁进行； ④避免已灭菌处理的材料用具与周围的物品相接触。 2．消毒方法：①日常生活经常用到的是煮沸消毒法；②对一些不耐高温的液体，则使用巴氏消毒法；③对接种室、接种箱或超净工作台首先喷洒石炭酸或煤酚皂等溶液以增强消毒效果，然后使用紫外线进行物理消毒；④实验操作者的双手使用酒精进行消毒。 3．灭菌方法：①接种环、接种针、试管口等使用灼烧灭菌法；②培养基、无菌水等使用高压蒸汽灭菌法，所用器械是高压蒸汽灭菌锅；③表面灭菌和空气灭菌等使
仔猪致病性大肠杆菌的分离鉴定及药敏试验
仔猪致病性大肠杆菌的分离鉴定及药敏试验 程子兵1 董春霞2石国界3沙里塔那4 马长丽1 （1. 塔城地区动物疾控与诊断中心新疆塔城834700；2. 重庆市武隆县畜牧兽医局重庆市武隆县408500；3. 塔城市畜牧兽医工作站新疆塔城834700；4. 额敏县兽医工作站新疆额敏县834600） 摘要:对塔城地区一农户饲养猪群中仔猪发生的临床症状以水肿病、白痢、黄痢为特征的病例进行了样品采集，后经麦康凯、伊红美蓝分离培养，糖发酵生化试验、动物试验等结果显示均为大肠杆菌，同时通过药敏试验筛选出敏感抗生素。 关键词：仔猪；大肠杆菌；分离鉴定；药敏试验 Abstract：Specimens with dropsy and dysentery clinical symptoms were isolated from one household raises pig group in Tacheng area. By bacteria culture, biochemical test and animal test, the results indicate the bacterium is pathogenic Escherichia Coli. Meanwhile, we ascertain sensitive antibiotics to this E coli by medicine test. Key words:pig; Escherichia Coli; isolate indentify; medicine test 仔猪大肠杆菌病是由大肠杆菌引起的肠道传染病，主要表现为仔猪白痢、黄痢和水肿病，其中黄痢多发生于1周内哺乳仔猪，病猪主要表现为排黄色糊状粪便；白痢多发于10～30日龄，病猪主要表现为排乳白色或灰白色腥臭糊状粪便；水肿病多发于断奶仔猪，主要有神经症状、胃壁、肠黏膜等组织水肿，四季均可发生，发病率和致死率
鸡大肠杆菌的分离与鉴定
鸡大肠杆菌的分离与鉴定 摘要：**市某鸡场5600只240日龄罗曼蛋鸡陆续发病，产蛋率迅速下降，病死率约为6%。病鸡多呈精神沉郁、食欲减退，腹部膨大，粪便呈灰绿色或黄色，多经2~3周死亡，初步诊断为大肠杆菌病。采集2只病鸡的肝和卵巢，通过细菌的分离培养，获得2株革兰氏阴性杆菌。糖发酵试验、三糖铁琼脂试验、尿素分解试验、硫化氢产生试验、药敏试验、IMVIC试验确定其为大肠杆菌。玻板凝集 ；选用10种临床常用的抗菌药进行药敏试验，结果表试验鉴定其O抗原型为O 2 明分离菌株对先锋V、多粘菌素、呋喃妥因敏感，而对四环素、林可霉素耐药。关键词：鸡，大肠杆菌病，分离，鉴定 论文试验 鸡大肠杆菌病是由某些血清型的致病性大肠埃希氏菌引起的鸡的非肠道传染性疾病的总称。尽管近几年养鸡业发展迅速，但随着规模养殖的不断增加和产品流通的日益频繁，鸡大肠杆菌病越来越普遍，已经成为影响养鸡业快速发展的主要疫病之一。通过对大肠杆菌的分离、鉴定，对该病有着非常重要的意义。通过药敏试验测定大肠杆菌对药物的敏感，可为合理用药提供指导。本论文通过微生物学方法，对**市某鸡场罗曼蛋鸡的疑似大肠杆菌病进行了确诊。 1 材料 1.1 病料来源 2008年3月17日，**市某鸡场5600只240日龄罗曼蛋鸡陆续发病，产蛋率迅速下降，病死率约为6%。病鸡多呈精神沉郁、食欲减退，腹部膨大，粪便呈灰绿色或黄色，多经2~3周死亡。采集2只病鸡的肝和卵巢作为病料。 1.2 培养基 1.2.1 麦康凯琼脂（Mackonkey agar，蛋白胨20g，乳糖10g，氯化钠5g，牛胆盐5g，中性红0.025g，琼脂粉20g，加蒸馏水1000mL，pH7.3）。 1.2.2 三糖铁琼脂（蛋白胨20g，牛肉浸膏5g，乳糖10g，蔗糖10g，葡萄糖1g，氯化钠5g，硫代硫酸钠0.2g，硫酸亚铁0.2g，琼脂粉20g，0.4%酚红水溶液6.3mL，蒸馏水1000mL，除酚红指示剂外，各成分加热溶解，调至pH7.4，然后加入酚红指示剂，分装于试管；115℃高压蒸气灭菌15min后，制成底层较深的斜面）。 1.2.3 胰蛋白胨水溶液（蛋白胨2.5g，氯化钠1.25g，蒸馏水250mL，溶解后调pH为7.6，分装于试管，每管4~5mL，121℃高压蒸气灭菌15min）。 1.2.4葡萄糖蛋白胨水溶液（每100 mL pH7.6的邓亨氏蛋白胨水中加入葡萄糖1g，溶解后分装于试管，每管1mL，121℃高压蒸气灭菌15min）。