细菌脂多糖的制备与纯化
细菌脂多糖的提取与制备
生技052 张创峰
指导教师宫强
摘要
目的：提取制备出鸡白痢细菌的脂多糖（Lipopolysaccharides LPS），并检测出其纯度，免疫动物后检测其诱导机体产生抗体的效价。
方法：对刚接种的细菌进行37℃培养过夜，此时菌体大致处于对数期。利用热酚水法提取LPS，通过离心、反复冻融对菌体进行破碎，再透析、浓缩进行LPS粗提取，进而通过酶解、加丙酮沉淀等一系列步骤纯化LPS；然后利用紫外光谱法、标准曲线法和硫酸蒽酮法分别对制备的LPS溶液中核酸、蛋白、糖的含量进行分析测定，配制成适合注射的LPS浓度；最后通过皮下注射免疫鸡，对鸡血进行离心得到血清，保存血清。免疫三次，采血三次，利用间接Elisa法测定抗体的效价。
结果：成功提取了细菌的LPS，免疫注射浓度为121.5μg/mL。未经酶解的粗制LPS于260nm处有强吸收，经酶解处理分离纯化的LPS，于260nm处吸收值较小。经分光光度计测定，结果为0.324，从标准曲线找出其蛋白含量为0.59mg/mL。然而所提取的LPS并未使动物产生抗体，免疫动物不成功。
关键词：鸡白痢细菌，脂多糖（LPS），提取，糖含量，免疫，ELISA
Extraction and Preparation of Salmonella
Lipopolysaccharide
Grade 2005, Class2, Major of Biotechnology Chuagfeng Zhang
Tutor Qiang Gong
ABSTRACT
Objective This study was to extract and prepare Salmo nella pullorum’s Lipopolysaccharides(LPS), and test its purity, after immune the animals, we will detect its antibody titer induced by the production.
Methods Put the vaccinated Salmonella at just 37℃ overnight train, to ensure the biomass is at logarithmic phase, and then extraction of LPS from biomass with mixture of hot phenol-water, through centrifugation and repeated freezing and thawing the biomass to carry out broken the biomass, and then dialysis, dialysis the solution for the crude LPS extraction, through the zymohydrolysis, adding acetone to precipitate LPS, using the ultraviolet spectroscopy, the BSA standard curve method and anthrone-sulfuric acid method for testing the content of nucleic acids, protein, sugar of the prepared LPS solution. Finally, through the subcutaneous injection to immune chicken, to obtain serum from centrifuged blood, preservation serum, immunization three times, blood three times, select chicken serum antibodies, using an indirect ELISA method to detect the titer of antibody.
Results We successfully extracted LPS from the Salmonella, the concentration for immunization is 121.5μg/mL. Without the enzyme in the crude LPS there is strong absorption of 260nm by the enzyme to deal with separation and purification of LPS, in a relatively there is small absorption of 260nm Department. Measured by the spectrophotometer, the results is 0.324, we can find out the protein content is 0.59mg/mL from the standard curve. Nevertheless, the extraction of LPS did not make animals generate antibodies, the immune on animals is unsuccessful.
KEY WORDS: Salmonella Pullorum, Lipopolysaccharides(LPS), extracts, sugar content, immunization, ELISA
目录
前言............................................................................... 错误！未定义书签。第1章文献综述........................................................... 错误！未定义书签。
1.1 鸡白痢简介 .............................................................................. 错误！未定义书签。
1.1.1 病原................................................................................... 错误！未定义书签。
1.1.2 传播流行特点................................................................... 错误！未定义书签。
1.1.3 病理变化........................................................................... 错误！未定义书签。
1.1.4 检测手段........................................................................... 错误！未定义书签。
1.1.5 研究趋势........................................................................... 错误！未定义书签。
1.2 LPS研究进展 ........................................................................... 错误！未定义书签。
1.2.1 LPS的来源........................................................................ 错误！未定义书签。
1.2.2 LPS的结构........................................................................ 错误！未定义书签。
1.2.3 LPS提取方法的研究........................................................ 错误！未定义书签。第2章实验材料与方法............................................... 错误！未定义书签。
2.1实验材料 ................................................................................... 错误！未定义书签。
2.1.1菌株与实验动物................................................................ 错误！未定义书签。
2.1.2 试剂................................................................................... 错误！未定义书签。
2.1.3 主要溶液的配制............................................................... 错误！未定义书签。
2.1.4 主要仪器........................................................................... 错误！未定义书签。
2.2 实验方法 .................................................................................. 错误！未定义书签。
2.2.1培养基的配制.................................................................... 错误！未定义书签。
2.2.2菌体的获得........................................................................ 错误！未定义书签。
2.2.3 LPS粗品的制备................................................................ 错误！未定义书签。
2.2.4 LPS的纯化........................................................................ 错误！未定义书签。
2.2.5 LPS某些物质含量的测定................................................ 错误！未定义书签。
2.2.6 O-SP制备 .......................................................................... 错误！未定义书签。
2.2.7 免疫与采血....................................................................... 错误！未定义书签。
2.2.8 血清分离........................................................................... 错误！未定义书签。
2.2.9抗体效价的测定................................................................ 错误！未定义书签。第3章结果与讨论....................................................... 错误！未定义书签。
3.1 结果 .......................................................................................... 错误！未定义书签。
3.1.1 LPS核酸的检测................................................................ 错误！未定义书签。
3.1.2 LPS蛋白含量测定............................................................ 错误！未定义书签。
3.1.3 LPS糖含量测定................................................................ 错误！未定义书签。
3.1.4提取的LPS免疫原性检测............................................... 错误！未定义书签。
3.2 讨论 .......................................................................................... 错误！未定义书签。第4章结论................................................................... 错误！未定义书签。参考文献......................................................................... 错误！未定义书签。致谢............................................................................... 错误！未定义书签。外文资料译文
前言
禽细菌病(Salmonellosisavium)，即鸡白痢，是一个概括性术语，指由细菌属中的任何一个或多个成员所引起禽类的一大群急性或慢性疾病。细菌属是庞大的肠杆菌科的一个成员，细菌属包括了2100多个血清型。在自然界中，家禽构成了细菌最大的单独贮存宿主。
鸡白痢是由鸡白痢细菌引起的鸡的传染病。本病特征为幼雏感染后常呈急性败血症，发病率和死亡率都高，成年鸡感染后，多呈慢性或隐性带菌，可随粪便排出，因卵巢带菌，严重影响孵化率和雏鸡成活率。本病可经蛋垂直传播，也可水平传播。
目前，预防鸡白痢普遍采用庆大霉素、痢特灵、氯霉素以及新型喹诺酮类药物，但是，用药物预防需要防止长时间使用一种药物，更不更一味加大药物剂量达到防治目的。而且需要有效药物在一定时间内交替、轮换使用，药物剂量要合理。做到这些对于一般的养殖来说是比较困难的。而生物制剂在防治鸡白痢疾病方面有较好效果，具有安全、无毒、不产生副作用，细菌不产生抗药性，价廉等特点。经大批量的实验认为，生物制剂防治鸡白痢病的效果多数情况下相当或优于药物预防的水平。
因此，研发预防鸡白痢的新型疫苗势在必行。而LPS是鸡白痢细菌菌体主要的保护性抗原之一，与外膜蛋白在免疫中共同起着重要的作用。各项研究的进行以及方法的研究都需要对鸡白痢细菌LPS结构特性及其特异性免疫保护进行研究，因而提取细菌LPS是各项相关工作的第一步，细菌LPS本身目前已成为医学和免疫学的研究热点之一。因此提取与制备细菌LPS更加必要的。本文直接通过提取鸡白痢细菌LPS制备抗原，对鸡进行免疫，对于研究预防鸡白痢疾病的疫苗也是有其现实意义的。
本文研究了热酚水法提取脂多糖，通过离心、反复冻融，透析、浓缩、酶解一系列步骤进行纯化，然后利用紫外光谱法、标准曲线法和硫酸蒽酮法分别对LPS中核酸、蛋白、糖的含量进行分析测定，最后通过皮下注射免疫兔子，从兔子血清中获得抗体，利用间接Elisa法测定抗体的效价。
第1章文献综述
1.1 鸡白痢简介
鸡白痢(Salmonellosisavium)是由鸡白痢细菌引起的鸡的传染病。是一种古老而且危害严重的禽类传染病，在世界范围内均有发生，是世界性疾病。细菌属是庞大的肠杆菌科的一个成员，细菌属包括了2100多个血清型。在自然界中，家禽构成了细菌最大的单独贮存宿主。在所有动物中，最常报道的细菌来源于家禽和禽产品。因此鸡白痢已成为严重影响家禽养殖业的问题之一。
1.1.1 病原
鸡白痢是由鸡白痢细菌所引起鸡的一大群急性或慢性疾病。鸡白痢细菌具有高度宿主适应性。本菌为两端稍圆的细长杆菌（0.3～0.5um×1～2.5um），对一般碱性苯胺染料着色良好，革兰氏阴性。细菌常单个存在，很少见到两菌以上的长链。在涂片中偶尔可见到丝状和大型细菌。本菌不能运动，不液化明胶，不产生色素，无芽胞，无荚膜，兼性厌氧。分离培养时应尽量避免使用选择性培养基，因为某些菌株特别敏感。细菌在下列培养基中生长良好，如营养肉汤或琼脂平板。在普通琼脂、麦康凯培养基上生长，形成圆形、光滑、无色呈半透明、露珠样的小菌落[1]。在外界环境中有一定的抵抗力，常用消毒药可将其杀死。
1.1.2 传播流行特点
各种品种的鸡对本病均有易感性，以2～3周龄以内雏鸡的发病率与病死率为最高，呈流行性。随着日龄的增加，鸡的抵抗力也增强。成年鸡感染常呈慢性或隐性经过。火鸡对本病有易感性，但次于鸡。鸭、雏鹅、珠鸡、野鸡、鹌鹑、麻雀、欧洲莺和鸽也有自然发病的报告。芙蓉鸟、红鸠、金丝雀和乌鸦则无易感性。一向存在本病的鸡场，雏鸡的发病率在20％～40％左右，但新传入发病的鸡场，其发病率显著增高，甚至有时高达100％，病死率也比老疫场高。本病可经蛋垂直传播，也可水平传播[2]。
1.1.3 病理变化
雏鸡：在日龄短、发病后很快死亡的雏鸡，病变不明显。肝肿大，充血或有条纹状出血。其他脏器充血。卵黄囊变化不大。病期延长者卵黄吸收不良，其内
容物色黄如油脂状或干酪样；有心肌、肺、肝、盲肠、大肠及肌胃肌肉中有坏死灶或结节。有些病例有心外膜炎，肝或有点状出血及坏死点，胆囊肿大，脾有时肿大，肾充血或贫血，输尿管充满尿酸盐而扩张，盲肠中有干酪样物堵塞肠腔，有时还混有血液，肠壁增厚，常有腹膜炎。在上述器官病变中，以肝的病变最为常见，其次为肺、心、肌胃及盲肠的病变。死于几日龄的病雏，见出血性肺炎，稍大的病雏，肺可见有灰黄色结节和灰色肝变[3]。
成年鸡：慢性带菌的母鸡，最常见的病变为卵子变形、变色、质地改变以及卵子呈囊状，有腹膜炎，伴以急性或慢性心包炎。受害的卵子常呈油脂或干酪样，卵黄膜增厚，变性的卵子或仍附在卵巢上，常有长短粗细不一的卵蒂（柄状物）与卵巢相连，脱落的卵子深藏在腹腔的脂肪性组织内[4]。有些卵则自输卵管逆行而坠入腹腔，有些则阻塞在输卵管内，引起广泛的腹膜炎及腹腔脏器粘连。可以发现腹水，特别见于大鸡。心脏变化稍轻，但常有心包炎，其严重程度和病程长短有关。轻者只见心包膜透明度较差，含有微混的心包液。重者心包膜变厚而不透明，逐渐粘连，心包液显著增多，在腹腔脂肪中或肌胃及肠壁上有时发现琥珀色干酪样小囊包。
成年公鸡的病变，常局限于睾丸及输精管。睾丸极度萎缩，同时出现小脓肿。输精管管腔增大，充满稠密的均质渗出物。
1.1.4 检测手段
自19世纪后期，细菌首次被鉴定为人类的一种病原以来，检测方法学都是建立在采取感染病人的粪便或血液作为临床病料的基础上。此后的60年间，用于分离细菌的方法实质上与那些用于临床病料的方法是相同的。随着DNA和抗体技术的发展，近10～15年间发展了无数改进的方法，其中许多可以在48h内检出细菌，这些方法通称为快速检测。
最初的是传统的培养方法，是选择性增菌步骤，它使细菌生长而使肉汤中同时存在的微生物数量减少。由于没有任何一种培养基可以全面地保持各种细菌血清型，所以，较适当的做法就是使用两种培养基平行地进行试验。然后选择性培养物在含一种或多种抑制非细菌生长制剂的琼脂平板上划线培养，对平板上肉眼可见的特征性菌落进行确认，并对该菌落分离物进行一系列生化和血清学检测，以作出鉴定。传统细菌检测法全过程需时至少4～7天，才能得出明确的诊断结果[5]。
然后发展了以抗体为基础的检测方法，利用抗原-抗体反应的显著特异性，来进行细菌的鉴别和血清学定型，已有半个多世纪的历史。已经建立的细菌免疫
学检测方法有许多种，大致可分为以酶标抗体(ELISA)，荧光抗体染色(免疫荧光法)，同位素标记抗体(放射免疫试验)为基础的方法及其它多种以抗体为基础，利用乳胶凝集、免疫传感器、免疫扩散及免疫色谱技术的方法。但常规中最广泛采用的是以双位点ELISA技术即夹心ELISA为基础的方法[6]。此法改进后用有放射活性的同位素替代标记抗体，然后用分光光度法即很容易检测到目标抗原。采用微量滴定板作为固态基质使反应形式标准化，并促成其自动化。
黎兆滚等人首次在国内口岸系统应用微量板ELISA法(Salmonelletest1)对进出口动物产品(鱼粉、肉骨粉等)进行细菌检测。总的来说，标准的ELISA法样品的制备，约需要经过40～48h的孵育才能完成。黎兆滚等人的微量板ELISA法(Salmonellatest1)样品制备过程分三步，共耗时24h比上述标准的ELISA法样品制备过程缩短了一半的时间。ELISA方法身，则仅需要大约2h而已（其中30min是操作时间，90min是孵育时间[7]）。相比之下，黎兆滚等人的方法可在27h内完成，比上述方法缩短了一半的时间，颇值得推广应用。
近几年则发展了以核酸为基础的方法，细胞核酸DNA和RNA是唯一一类可以携带信息的大分子。由于所有的细胞都含有这种分子，可以利用它作为检测的标靶。标靶通常是一个特异性核酸序列，它可通过以补体核酸分子作为探针来检出。与免疫学方法相似，探针也需要加附适当的标记，如放射性同位素的标识物。Fitts等人检测极限可达108个细菌/mL，但由于要使用放射性同位素，只能在专门的实验室应用，此方法的优点都被抵消了。为此，以核酸杂交为基础的第二代技术—比色计目前已发展起来。这种方法依赖于细菌核糖体RNA(rRNA)—核糖体发育过程中储存的核酸成分的检测。由于rRNA为单链(而DNA为双链)，杂交前需要进行预增菌和选择性增菌。rRNA探针法比细菌ELISA法更耗时，但二者成本相近。聚合酶链反应(PCR)，用该体系可对制备好的样品进行细菌DNA扩增，以便更易于用诸如凝胶电泳法或比色型ELISA法检测。一个完整的以PCR为基础的方法，需要2天才能完成，很大程度上抵销了其高敏感性的优点[8]。
1.1.5 研究趋势
鸡白痢作为重要的人畜共患病，它的传染和流行不仅严重影响了畜牧业的健康持续发展，而且还威胁着人类的身心健康。
早在20世纪就用青霉素、链霉素、土霉素对其防治，鸡白痢细菌对抗生素药物的敏感性在不断变化，在不同地区，不同场群的药敏情况可有很大不同，所以应经常分离致病菌株，做药敏试验并研究用药途径，以免盲目用药贻误时机，
药物防治可有效地控制商品鸡群鸡白痢病的发生。即往常用于鸡白痢的的土霉素，四环素，磺胺类，青霉素，链霉素等药物在生产实践中的防治作用已很低，甚至完全无效，但庆大霉素，卡那霉素，氯霉素，新霉素肌肉注射，并注意穿梭用药，防治效果非常显著[9]。
但是后来经过大量的试验表明药物防治的区域性太大，所以使人们又希望寻求一种更加高效而又受区域限制小的防治方法。随着分子生物学技术的不断进步，目前研制的特异性主要有减毒活菌苗免疫预防、灭活菌苗免疫预防、脂多糖抗原免疫预防和高免卵黄液被动免疫，这些疫苗应用免疫保护效果比较显著。为了更好地防治鸡白痢和有效地实施根除计划，需要进一步对鸡白痢的遗传学和分子流行病学、传播该病的生物种类、病原与宿主复杂的相互作用等进行详细研究。
碳水化合物（如乳糖、甘露糖）可减少鸡白痢细菌在肠道内定居，促进其他肠道菌丛的生长，后者可创造对白痢细菌不利的生长环境，有人用 2.5%的5中糖于出壳时饮水，3日于后攻击白痢细菌，10天时扑杀检测白痢细菌的定居数量，结果预防组白痢沙门氏的定居数量明显减少，对照组为100%[10]。乳糖的作用也可能提高肠道的酸性。把鸡细菌弱毒苗按不用剂量分别往口服和颈部皮下接种1日龄商品带鸡具有良好的安全性和免疫力。陈金顶研究，口服抗生素后对集白痢伤寒细菌的定植量明显增多，PH值也显著增高，他认为，抗生素可以破坏生态平衡，是病菌定植的几率增高。
芬兰科学家Nurmi（1973）和Rantala根据他们的研究，首先提出了利用竞争排除方法控制鸡白痢细菌感染的理论及方法，即生物竞争排斥的理论[11]。一句此理论，近几年为防止鸡白痢，推出了调菌生，调痢生，促菌生，乳康生等各种微生态制剂（活菌生物制剂），对雏鸡口腔滴服的促生长和预防效果显著。他们无药物残留，不污染环境，符合生态规律，应用前景较为广阔，但仅在环境控制，卫生状况良好的情况下表现较好的防治作用。给1日龄的雏鸡喂服获喷雾成年健康鸡肠道内容物悬浮液或者厌氧培养物，有效地提高了雏鸡对白痢沙门氏的抵抗力，这被称为Nurmi概念[11]。
1.2 LPS研究进展
一般细菌毒素可分为两类，一类为外毒素(Exotoxin)；它是一种毒性蛋白质，是细菌在生长过程中分泌到菌体外的毒性物质。产生外毒素的细菌主要是革兰氏阳性菌，如白喉杆菌、破伤风杆菌、肉毒杆菌、金黄色葡萄球菌以及少数革兰氏阴性菌。另一类为内毒素(Endotoxin)，是革兰氏阴性菌的细胞壁外壁层上的
特有结构[12]。细菌在生活状态时不释放出来，只有当细菌死亡自溶或粘附在其它细胞时才表现其毒性，内毒素的主要化学成分是脂多糖（LPS）中的类脂A成分。
LPS作为革兰氏阴性菌细胞壁外膜的重要组分之一，是菌株血清分型的主要依据，同时协同产Vero毒素的大肠杆菌感染寄主，在发病机制中起着重要作用。它是鸡白痢细菌菌体主要的保护性抗原之一，与外膜蛋白在免疫中共同起着重要的作用。
1.2.1 LPS的来源
细菌菌体裂解后可释放内毒素, 日本和我国学者普遍认为内毒素包含脂多糖和蛋白质两部分, 而英美学者认为内毒素就是脂多糖。脂多糖又称细菌内毒素，对其研究已有60多年的历史，作为革兰氏阴性菌细胞壁外膜的重要组分之一，是菌株血清分型的主要依据，同时协同产Vero毒素的大肠杆菌感染寄主，在发病机制中起着重要作用[13]。1909 年Coley报道革兰阴性菌具有抗肿瘤效果后，后续研究证明革兰阴性菌细胞壁的结构成分细菌脂多糖，具有抗肿瘤及增强免疫功能等作用[14]。
1.2.2 LPS的结构
革兰氏阴性细菌细胞壁较薄，厚约10－15nm,结构也较复杂。肽聚糖含量低，仅占细胞干生10％左右，层薄又较疏松，因肽聚糖之间仅四肽侧链直接联结，缺乏五肽桥；肽聚糖居于细胞最内层，外面由内向外还有脂蛋白，外膜和脂多糖的三层聚合物。
脂多糖(lipopolysaccharide, LPS) 由多糖O抗原、核心多糖和类脂A(lipid A)组成，位于最外层。多糖O抗原向外，由若干个低聚糖的重复单位组成的多糖链，即革兰氏阴性菌的菌体抗原(O抗原)，有特异性[15]。核心多糖由庚糖、半乳糖、2-酮基-3-脱氧辛酸(2-keto-3-deoxyoctonic acid，KDO)等组成，所有革兰氏阴性细菌都有此结构。类脂A是以脂化的葡萄胺二糖为单位，通过焦磷酸酯键组成的一种独特的糖脂化合物，具有致热作用，是革兰氏阴性细菌内毒素的毒性成分[16]。
1.2.3 LPS提取方法的研究
研究LPS生物活性时，LPS的提取是通过利用有机溶剂分离的经典方法。经典方法提取LPS包括利用热酚水法(PW)，或使用由苯酚、氯仿、石油醚(PCP)
组成的混合溶剂从大量生物体中获得[17]。这两种方法都是基于破坏细菌细胞膜及利用苯酚析出蛋白质，但他们具有不同的选择性。热酚水法提取光滑型(S)和粗糙型(R)的LPS，而为PCP法主要分离粗糙型LPS。
Darveau 和Hancock采用了更少见的方法，用机械方法破坏细菌的细胞，然后利用酶处理，加入SDS或/和EDTA,对提取LPS两种类型(R和S)同样有效[18]。其他几个可供选择的方法是采用多种有机溶剂，如盐，酸或碱，配合剂或酶，这些都被介绍过[14]。
所介绍的这些方法对于实验室规模是非常有用的，但是扩大提取是很困难的。这么多的步骤十分费劲，它还会残存有机溶剂、制造毒废物，以至最终产品可能被溶剂残留物所污染。目前，LPS制剂有越来越多的市场需求，它们需要不含有毒杂质，例如用作免疫学研究或作为疫苗佐剂一种有价值的源泉。温和的和单步程序制备纯化内部核心抗原决定簇具有特定的免疫决定子粗糙型LPS菌类将是非常重要的，例如脑膜炎球菌。
Jacek Rybka和Pawel Grycko则采用超临界流体二氧化碳（scCO2）进行LPS的提取，scCO2是有害易燃的有机溶剂的安全替代物[19]。通过压力和温度以及添加少量极性的选择性共溶剂来改变scCO2溶剂属性如密度或疏水性是相对简单的。该方法能适应特定的需求，如提取高疏水性或高极性物质。
国内外不论是从不同的取材还是用不同的方法来提取脂多糖，都涉及到热酚水法，因而，热酚水法依然广泛使用于脂多糖的提取，秦敏对热酚水法进行了优化处理，改进后用乙醇分级沉淀冷冻离心法所提取的脂多糖较纯，利于后续研究。周丽蓉用DNase I酶和RNase 酶作用除去DNA和RNA ,得到初步纯化的脂多糖，方法简单快速。冷静用westphal 热酚水法对脂多糖进行粗提, 阴离子交换层析法进行纯化[20]。适用于纯化出低相对分子质量高纯度水溶性的成团泛菌脂多糖LPS，为不同分子质量的脂多糖的提纯提供已较好的思路和研究方法。
第2章实验材料与方法
2.1实验材料
2.1.1菌株与实验动物
细菌43063号菌株购自中国兽药检查所；
成年家养鸡两只购自菜市场。
2.1.2 试剂
兔抗鸡IgG-HRP购于北京希凯生物科技有限公司；
RNaseA购于上海生物工程技术服务有限公司；
DNase I购于北京希凯生物科技有限公司；
考马斯亮蓝R-250购于中国医药（基团）上海化学试剂公司；
聚乙二醇6000购于天津市科密欧试剂公司；
牛血清白蛋白购于上海天呈医流有限公司；
蛋白胨、牛肉膏、琼脂粉等生化试剂购于北京奥博星生物技术有限责任公司；
苯酚、蒽酮、葡萄糖、氯化钠（NaCl）、冰乙酸、氢氧化钠（NaOH）、乙醇、磷酸等试剂均为国产分析纯。
2.1.3 主要溶液的配制
（1）热酚水法提取脂多糖所需试剂
45%酚水溶液：加55mL去离子水于45mL融化的苯酚溶液中，混匀后室温保存备用。
95%酚水溶液：加5mL去离子水于95mL融化的苯酚溶液中，混匀后室温保存备用。
（2）O-SP制备所需试剂
1.5%醋酸溶液：加1.5mL冰乙酸于98.5mL去离子水中，混匀后室温保存备用。
（3）测脂多糖中某些物质含量所需试剂
标准蛋白质溶液：精确称取100mg牛血清白蛋白，溶于100mL蒸馏水中，即为1000mg/mL的原液，混匀后室温保存备用。
考马斯亮蓝G—250试剂：称取25mg考马斯亮蓝G—250，溶于12.5mL95%乙醇中，加入85%（W/V）的磷酸100mL，最后用蒸馏水定容到250mL，混匀后室温保存备用。
标准葡萄糖溶液：精确称取50mg葡萄糖，溶于500mL蒸馏水中，即为100mg/L的原液，混匀后室温保存备用。
蒽酮试剂：称取蒽酮0.2g，溶于100mL浓硫酸（AR 95%～98%）, 使其终浓度为2g/L，混匀后室温保存备用。
（4）ELISA检测测抗体效价所用主要试剂
包被缓冲液：0.05mol/L，pH9.6碳酸盐缓冲液（CBS）
Na2CO3 l.59g
NaHCO3 2.93g
加去离子水水至1000mL，调pH值到9.6。15磅高压灭菌20min后，室温贮藏。
磷酸盐缓冲溶液（1×PBS）：0.01 mol/L、pH7.4
NaCl 8.0g
KH2PO4 0.2g
KCl 0.2g
Na2HPO4·12H2O 2.9g
溶于900mL去离子水后，调节pH至7.4，定容到1L。15磅高压灭菌20min后，室温贮藏。
10×PBS：0.2 mol/L、pH7.4
NaCl 80g
KH2PO4 2.4g
KCl 2.0g
Na2HPO4·12H2O 36.05g 或Na2HPO4 14.4g 溶于900mL去离子水后，调节pH至7.4，定容到1L。15磅高压灭菌20min后，室温贮藏。
洗液：含0.05% Tween20的0.01 mol/L、pH7.4的磷酸盐缓冲液(PBST)。
封闭液：0.5% 聚乙烯醇或5%BSA或脱脂乳或1%的明胶
酶标二抗溶液：用PBST适当稀释辣根过氧化物酶标记二抗。
底物溶液：OPD-H2O2-磷酸盐缓冲液
A液(0.1mol/L柠檬酸)：柠檬酸19.2g加去离子水至1L。15磅高压灭菌20min后，室温贮藏。
B液(0.2mol/L Na2HPO4溶液)：Na2HPO4·12H2O 71.6g加去离子水至1L。15磅高压灭菌20min后，室温贮藏。
10ml底物液：取A液2.43m1, B液2.57mL，去离子水5mL，加OPD 4mg 充分混匀溶解。加入15μL 30%H2O2后，配好后即刻使用。
终止液(2mol/L H2SO4)：把109mL浓硫酸缓慢加入891mL去离子水中，边加边不断搅拌，以利于散热。
2.1.4 主要仪器
酶标仪Stat Fax-2100 Awareness Technology,Inc.
微量高速台式离心机TG16-W 长沙湘仪离心机仪器有限公司
多管架自动平衡离心机TDES-WS 长沙湘仪离心机仪器有限公司
高速冷冻离心机H2050R 长沙湘仪离心机仪器有限公司
单人双面净化工作台SW-CJ-1F 苏州净化设备有限公司
电热恒温培养箱HPP-9272 北京东联哈尔仪器制造有限公司
台式恒温振荡器THZ-320 上海精宏实验设备有限公司
电热恒温干燥箱202型北京市永光明医疗仪器厂
紫外可见分光光度计UV2800 上海尤尼科仪器有限公司
分光光度计722S 上海精密科学仪器有限公司
电子天平JA1003 上海上天精密仪器有限公司
万用电炉DL-1型北京中兴伟业仪器有限公司
手提式压力蒸汽消毒器GMSX-280 北京市永光明医疗仪器厂
恒温水浴锅HH-S 江苏金坛市亿通电子有限公司
艾科普超纯水制备系统AWL-1002-U 艾科普仪器有限公司
数控超声波清洗器KQ-500DE 昆山市超声仪器有限公司
雪花制冰机FM50 北京长流科学仪器公司
海尔冰箱BCD-239SK DE 青岛海尔股份有限公司
2.2 实验方法
2.2.1培养基的配制
（1）牛肉膏蛋白胨液体培养基：
牛肉膏5g
蛋白胨10g
Nacl 5g
以上试剂加入950mL去离子水，定容到1000mL，121℃高压灭菌20 min，室温保存备用。
（2）牛肉膏蛋白胨固体培养基：加琼脂15g于1000mL牛肉高蛋白胨液体培养基中，121℃高压灭菌20 min，冷却至50℃左右，倒平板，37℃无菌检验后，4℃贮存备用。
2.2.2菌体的获得
（1）菌体的活化
在37℃下对保藏菌株活化半小时，然后采用牛肉膏蛋白胨固体培养基划线培养18 h；
（2）增菌
用2倍体积无菌水于无菌区小心洗下生长良好的菌苔，然后转接入牛肉膏蛋白胨液体培养基中摇床培养（200r/min）18小时。
（3）收获菌体
将所得含菌培养基分装离心(3500r/min，15min)，离心所得沉淀称湿重，收集后置 4 ℃保存。
2.2.3 LPS粗品的制备
（1）菌体破碎
细菌收集物按每1g 细菌加 3 mL蒸馏水进行充分悬浮。之后将细菌悬浮液放入水浴锅中70℃水浴3min，然后取出菌悬液放入提前制备好的碎冰中冰浴3min。如此反复冻融4 次。
（2）LPS制备
采用热酚水法制备[20]。按每250mL 菌液加等量的45%酚水作用5min。再加等量的95%的酚水混合液，在水浴68℃中不断搅拌，作用20～30min，取出。在冷水浴中冷却到10℃左右，然后以5000 r/min离心45min，离心后溶液分三层，从上到下依次为水层、酚层、不溶层。上层水相含LPS，中层为变性蛋白，下层为沉淀；小心吸取上层水相，下层沉淀重复上述步骤反复提取2 次。
将几次所得水层溶液混在一起装入透析袋，放入烧杯中，自来水流水透析48h，透析袋中浑浊溶液变透明，然后用蒸馏水静置透析2d，每天换水4次。最
后，按每100mL溶液加入聚乙二醇6000 固体4g，浓缩LPS溶液为原来体积的1/4，即得粗品LPS。
2.2.4 LPS的纯化
按每1ml溶液精确称取DNase I和RNase A各50μg计算，将称好的DNase I和RNase A加入浓缩后的粗品LPS中，37℃下酶解4h。然后在水浴锅中100℃水浴加热10min，使酶变性，取出冷却至室温后离心(1500r/min，30min)，弃沉淀，保留上清液，于上清中加2倍体积丙酮，过夜沉淀[21]。第二天可见絮状沉淀，小心离心（200 r/min，2min），弃去上清，即可获得纯化LPS。
2.2.5 LPS某些物质含量的测定
（1）核酸含量检测
紫外光谱(260nm)吸收检测。分别于DNase I和RNase A酶解前和酶解后测出其中的核酸含量，以便对比即可。
（2）蛋白含量检测
可见光谱（595nm）吸收检测[22]。
①取100mg/L 标准蛋白溶液，分别吸取0，0.2，0. 4，0. 8，1.0 mL等，然后用蒸馏水补足到1mL ，再从所配制各管中吸取0.1mL，分别放入10mL带塞试管中，分别加入5.0ml考马斯亮蓝G-250试剂，盖塞，将试管中溶液纵向倒转混匀，放置2min后，在595nm波长下比色测定，记录吸光度，以牛血清蛋白为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。
②测定蛋白含量吸取0.1mL LPS 加入带塞试管中，加入5.0mL考马斯亮蓝G-250试剂，充分混匀，放置2min后，以标准曲线1号管伟空白，在595nm 波长下比色，记录吸光度。
（3）多糖含量测定
可见光谱（620nm）吸收检测[23]。
①取100mg/L 葡萄糖溶液，分别吸取0. 05，0.1，0.2，0.4 和0.8 mL等，然后用蒸馏水补足到1mL，再加入3mL 蒽酮试剂，迅速浸入冰水中冷却，待每只试管均加完后，一起浸入沸水浴中维持10 min，取出，用自来水冲冷，在室温中平衡10min左右，再用722S 型分光光度计620nm 测定，然后用蒸馏水为空白进行比色，记录吸光度，绘制标准曲线.；
②测定糖含量吸取1mL LPS加入3mL蒽酮试剂，迅速浸入冰水中冷却，然后浸入沸水浴中维持10min，取出用自来水冲冷，在室温中平衡10min 左
右，再用722S 型分光光度计620nm测定，用蒸馏水为空白进行比色，记录吸光度。
2.2.6 O-SP制备
将LPS沉淀溶于5mL 1.5%的醋酸溶液中，于水浴锅中100℃水浴30min，离心(1500r/min，10min)，弃沉淀(类脂)，上清置于透析袋中，于4℃下透析24h去酸，最后加入聚乙二醇6000浓缩得O-SP抗原[24]，分装于离心管中备用。
由于免疫鸡所用抗体免疫剂量需要在100μg/mL以上[25]，因此制备O-SP时要注意浓度的配制。本实验将所得溶液浓缩一倍之后所得免疫剂量可用。
2.2.7 免疫与采血
免疫采取颈部四点免疫法。准备好酒精棉球，干棉球及注射器等后可进行免疫。吸取1mL LPS，于鸡颈部分四点进行皮下免疫。一周后进行第二次免疫，免疫方法同上，但免疫之前需要先从鸡翅膀静脉处采血，采集1mL即可。共免疫三次，采血三次。
试验分对照组与试验组，对照组按同样饲养条件饲喂即可，试验组进行LPS 免疫。
2.2.8 血清分离
每次采血之后，首先在37℃静置1h，然后置于4℃冰箱中放置2h，再取出血样离心（6000r/min）8min，反复三次，直至出现淡黄色血清。收集保存于-20℃冰箱中备用。
2.2.9抗体效价的测定[26]
用包被液CBS稀释包被抗原至20μg/mL，酶标板中每孔加入50μL，留下三孔分别设阳性、阴性、空白对照。湿盒内室温过夜包被。弃包被液（用力拍干），用洗涤液1×PBST洗板3次（每孔均要加满），每次3min~5min。再在每孔加封闭液（1% BSA）250μL，置于37℃恒温培养箱中封闭2h。用洗涤液1×PBST洗板3次，每次3min~5min。
结合一抗：用1×PBST缓冲液1∶100稀释被检血清，每孔加50μL，要设立阴性对照，置于37℃恒温培养箱中孵育 1.5h。洗涤方法同上。结合二抗：每孔加入用1×PBST 500倍稀释的酶标二抗羊抗鸡IgG-HRP 50μL，置于37℃恒温培养箱中孵育1.5h。洗涤方法同上。
显色：每孔加底物溶液（OPD）50μL ，置室温暗盒内显色10min。待显色后，每孔加入50μL终止液（2mol/L H2SO4）终止反应。
最后使用酶标仪读取492nm的OD值，以确定血清抗体水平[27]。
第3章 结果与讨论
3.1 结果
3.1.1 LPS 核酸的检测
经分光光度计测定，未经酶解的粗制LPS 于260nm 处有强吸收，经酶解处理分离纯化的LPS ，于260nm 处吸收值较小。
3.1.2 LPS 蛋白含量测定
经分光光度计测得BSA 标准曲线（见图3-1），从标准曲线得出其蛋白含量与吸光度关系式为：
y = 1.8832x - 0.0198
而测得LPS 的OD 值为0.324，因此，LPS 蛋白含量为0.59 μg/mL 。
图3-1 BSA 标准曲线
Fig 3-1 standard curve of BSA 3.1.3 LPS 糖含量测定
经分光光度计测得葡萄糖标准曲线（见图3-2），从标准曲线得出其糖含量与吸光度关系式为： y = 85.439x - 1.7919
y = 1.8832x - 0.0198R 2 = 0.984100.20.40.60.811.200.10.20.30.40.50.6
吸光度A 蛋白质含量（μg /m L ）
而测得LPS糖含量吸光度为0.732，因此，LPS糖含量为60.75 μg/mL。
图3-2 葡萄糖标准曲线
Fig 3-2 Standard curve of glucose
3.1.4提取的LPS免疫原性检测
经过酶标仪检测，得出抗体效价数据（表3-1和图3-3）。
表3-1 酶标仪所测OD值
Table 3-1 The OD value detected by ELISA reader 组别对照鸡试验鸡
492nm OD值
一免二免三免一免二免三免0.367 0.371 0.375 0.365 0.372 0.378
y = 85.439x - 1.7919
R2 = 0.9955
10
20
30
40
50
60
70
80
90
00.20.40.60.81
吸光度（A）
葡
萄
糖
浓
度
（
μ
g
/
m
L
）
0.35
0.355
0.36
0.365
0.37
0.375
0.38
一免二免三免
O
D
4
9
2对照鸡
实验鸡
微生物菌种的分离和纯化方法
从混杂微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物分离与纯化。在分子生物学的研究及应用中，不仅需要通过分离纯化技术从混杂的天然微生物群中分离出特定的微生物，而且还必须随时注意保持微生物纯培养物的“纯洁”，防止其他微生物的混入。 1、用固体培养基分离和纯化 单个微生物在适宜的固体培养基表面或内部生长、繁殖到一定程度可以形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞生长群体，称为菌落。当固体培养基表面众多菌落连成一片时，便成为菌苔。不同微生物在特定培养基上生长形成的菌落或菌苔一般都具有稳定的特征，可以成为对该微生物进行分类、鉴定的重要依据。大多数细菌、酵母菌、以及许多真菌和单细胞藻类能在固体培养基上形成孤立的菌落，采用适宜的平板分离法很容易得到纯培养。所谓平板，即培养平板的简称，它是指固体培养基倒入无菌平皿，冷却凝固后，盛固体培养基的平皿。这方法包括将单个微生物分离和固定在固体培养基表面或里面。固体培养基用琼脂或其它凝胶物质固化的培养基，每个孤立的活微生物体生长、繁殖形成菌落，形成的菌落便于移植。最常用的分离、培养微生物的固体培养基是琼脂固体培养基平板。这种由Kock建立的采用平板分离微生物纯培养的技术简便易行，100多年来一直是各种菌种分离的最常用手段。1.1 稀释倒平板法 首先把微生物悬液作一系列的稀释（如1:10、1:100、1:1000、1:10000），然后分别取不同稀释液少许，与已熔化并冷却至50℃左右的琼脂培养基混合，摇匀后，倾入灭过菌的培养皿中，待琼脂凝固后，制成可能含菌的琼脂平板，保温培养一定时间即可出现菌落。如果稀释得当，在平板表面或琼脂培养基中就可出现分散的单个菌落，这个菌落可能就是由一个细菌细胞繁殖形成的。随后挑取该单个菌落，或重复以上操作数次，便可得到纯培养。 1.2 涂布平板法 因为将微生物悬液先加到较烫的培养基中再倒平板易造成某些热敏感菌的死亡，且采用稀释倒平板法也会使一些严格好氧菌因被固定在琼脂中间缺乏氧气而影响其生长，因此在微生物学研究中常用的纯种分离方法是涂布平板法。其做法是先将已熔化的培养基倒入无菌平皿，
实验2 细菌的芽孢染色和荚膜染色
实验二细菌的芽孢染色和荚膜染色 生物111班杨明轩1102040128 一、实验目的 1、学习并掌握细菌芽胞染色的原理和方法。 2、学习并掌握细菌荚膜染色的原理和方法。 二、实验原理 （一）细菌的芽孢染色 芽孢通常指某些细菌在生长后期于细胞内形成的一种圆形、椭圆形或圆柱形的、厚壁、折光性高、含水量极低而抗逆性极强的内生休眠体。 芽孢染色法是利用细菌的芽孢和菌体对染色剂亲合力不同的原理，用不同的染料进行着色，使芽孢和菌体呈现出不同的颜色而加以区别。芽孢通常具有厚而致密的壁，透性低，不易着色和脱色，当用着色力强的弱碱性染色剂孔雀绿在加热条件下染色师，芽孢和菌体同时着色，进入菌体的染色剂可经水洗脱色，而进入芽孢的染料则难以透出。经对比度大的复染液番红染色后，芽孢仍保留初染剂的颜色，呈绿色；而菌体被复染剂染成红色，易于区别。 （二）细菌的荚膜染色 荚膜是包围细菌细胞的一层粘液性物质，具有明确的外缘，牢固地附着在菌体细胞壁外；荚膜的主要成分是多糖，不易着色，其含水量高达90%以上，易变形。荚膜染色通常采用衬托染色法或称负染法，即将菌体和背景分别着色，从而把不着色且透明的荚膜给衬托出来。 三、实验材料 1、菌种：枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），26~28℃培养2~3天； 钾细菌（Bacillus mucilaginosus），点接于阿须贝平板上，26~28℃培养3天。 2、染色剂：孔雀绿染液、番红染液，石炭酸复红、墨汁（已过滤） 3、其他：载玻片、无菌水、洗瓶、擦镜纸、吸水纸、二甲苯、香柏油、接种用具 四、实验方法 （一）细菌的芽孢染色 1、制片：将枯草芽孢杆菌涂片、干燥固定。 2、染色：用吸水纸块盖住涂片处，然后在吸水纸张滴加孔雀绿染液至饱和。加热使染液微冒蒸汽后，保持5min。加热时应不断添加染液，不要使吸水纸干燥。 3、水洗：待玻片冷却后，用镊子除去吸水纸，再用水平轻轻冲洗至孔雀绿不再褪色为止。 4、复染：用番红染液染色2~3min。 5、镜检：涂片干燥后，置油镜下观察。 6、清理：整理桌面，将显微镜恢复原样，将废片放入废片缸内。 （二）细菌的荚膜染色 1、制片：在洁净的载玻片的中央滴加1滴无菌水，取少许钾细菌制成涂片，在空气中风干。 2、染色：用石炭酸复红在涂片处染色4~5min，水洗，稍风干。 3、滴加一滴墨汁在载玻片的一侧，左手持此玻片，右手拿一干净玻片作推片用。将推片边缘凭证的一端与混合菌液成30°胶接触，顺势将菌液推开（不要太用力），使其涂成一薄层，并在空气中充分自然干燥。 4、镜检：玻片自然干燥后，置油镜下观察。
微生物菌种的分离和纯化方法
在从混杂微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物分离与纯化。 不仅需要通过分离纯化技术从混杂的天然微生物群中分离出特分子生物学的研究及应用中，防止其他微生物的混入。定的微生物，而且还必须随时注意保持微生物纯培养物的“纯洁”， 、用固体培养基分离和纯化1 有繁殖到一定程度可以形成肉眼可见的、单个微生物在适宜的固体培养基表面或内部生长、便成称为菌落。一定形态结构的子细胞生长群体，当固体培养基表面众多菌落连成一片时，可以成为菌苔。不同微生物在特定培养基上生长形成的菌落或菌苔一般都具有稳定的特征，以及许多真菌和单细胞藻鉴定的重要依据。大多数细菌、酵母菌、为对该微生物进行分类、所谓平板，类能在固体培养基上形成孤立的菌落，采用适宜的平板分离法很容易得到纯培养。即培养平板的简称，它是指固体培养基倒入无菌平皿，冷却凝固后，盛固体培养基的平皿。固体培养基用琼脂或其它凝这方法包括将单个微生物分离和固定在固体培养基表面或里面。胶物质固化的培养基，每个孤立的活微生物体生长、繁殖形成菌落，形成的菌落便于移植。建立的采用Kock最常用的分离、培养微生物的固体培养基是琼脂固体培养基平板。这种由多年来一直是各种菌种分离的最常用手段。平板分离微生物纯培养的技术简便易行，100 稀释倒平板法1.1 ），然后分别取不、1:100001:1000首先把微生物悬液作一系列的稀释（如1:10、1:100、50℃左右的琼脂培养基混合，摇匀后，倾入灭过菌的培同稀释液少许，与已熔化并冷却至如果养皿中，待琼脂凝固后，制成可能含菌的琼脂平板，保温培养一定时间即可出现菌落。这个菌落可能就是由一个在平板表面或琼脂培养基中就可出现分散的单个菌落，稀释得当，细菌细胞繁殖形成的。随后挑取该单个菌落，或重复以上操作数次，便可得到纯培养。涂布平板法1.2 且采用稀释因为将微生物悬液先加到较烫的培养基中再倒平板易造成某些热敏感菌的死亡，因此在微生物倒平板法也会使一些严格好氧菌因被固定在琼脂中间缺乏氧气而影响其生长，学研究中常用的纯种分离方法是涂布平板法。其做法是先将已熔化的培养基倒入无菌平皿，再用无菌玻璃涂棒将将一定量的微生物悬液滴加在平板表面，制成无菌平板，冷却凝固后，）。菌液均匀分散至整个平板表面，经培养后挑取单个菌落（图1供参 考． 涂布平板法1 图平板划线法1.3 最简单的分离微生物的方法是平板划线法，即用接种环以无菌操作沾取少许待分离的材料，），微
细菌脂多糖免疫对结肠炎小鼠TNF-α 表达的影响 (2)汇总
细菌脂多糖免疫对结肠炎小鼠TNF-α表达的影响 [摘要]目的：为了研究细菌脂多糖免疫对结肠炎小鼠TNF-α表达的影响并探讨炎症性肠炎的发生机制。方法：设计动物模型实验，将30只BALB/C小鼠随机分为三组：观察组10只（注射细菌脂多糖免疫后诱导小鼠溃疡性结肠炎模型）、模型组10只（注射生理盐水后诱导小鼠溃疡性结肠炎模型）和对照组10只（不做任何处理并注射生理盐水），4周后处死并取结肠组织标本检测，统计炎症介质TNF-α的表达情况并进行比较。结果：观察组血清TNF-αmRNA含量均值为（16.36±1.28）%，结肠TNF-α含量均值为（23.25±2.15）%，数据结果与其他两组差异具有统计学意义（P<0.05）。病理切片观察结果：观察组小鼠的溃疡点、靡烂点个数均较模型组明显减少，同时炎症细胞浸润和杯状细胞减少程度也明显较轻。结论：细菌脂多糖可降低小鼠结肠粘膜TNF-α及血清TNF-α的含量，在病理切片结果中可明显观察到经过LPS免疫小鼠的病理状态明显减轻，这可能为其对溃疡性结肠炎的治疗提供理论依据。 [关键词]细菌脂多糖；溃疡性结肠炎；肿瘤坏死因子 Effect of LSP on the expression of TNF- α immunity in mice with colitis [Abstract] Objective: To study the influence of LSP on the expression of TNF- α immunological colitis in mice and to explore the mechanisms of IBD. Methods: the experiment animal model design, 30 male BALB/C mice were randomly divided into three groups: the observation group 10 (IBD models were induced by injection of LSP after immunization), 10 rats in model group (IBD mice models were induced by injection of saline) and 10 in control group (without any treatment and injection of physiological saline), 4 weeks after the colon tissue samples were taken for detection, and compared the expression of inflammatory mediators in TNF- α statistics. Results: in the observation group, serum TNF- α mRNA content was (16.36 ±1.28)%, the mean content of TNF- α colon was (23.25 ± 2.15)%, with statistical significance of data and other differences between the two groups (P<0.05). Pathological observation: the number of the observation group mice ulcer, corrupt are compared with model group were significantly reduced, and the infiltration of inflammatory cells and goblet
细菌胞外多糖生物活性的研究进展_赵霞
网络出版时间：2016-03-22 16:00:27 网络出版地址：https://www.wendangku.net/doc/5b11488335.html,/kcms/detail/62.1120.R.20160322.1600.002.html 细菌胞外多糖生物活性的研究进展 赵霞综述，王若愚审校 中国科学院寒区旱区环境与工程研究所生态与农业研究室，甘肃兰州 730000 摘要：细菌胞外多糖（Exopolysaccharides，EPS）是细菌产生的一类重要的生物大分子，在许多重要生命过程中 起着非常关键的作用，由于其具有多种生物活性成为近年来研究的热点。目前，细菌EPS作为天然产物，可大量 发酵提取，且可降低成本，特别是一些乳酸杆菌和海洋细菌的新型EPS被证实具有多样化结构多糖的、潜在的有 益生物活性，如抗肿瘤、免疫调节和抗氧化等，其在食品、医学等领域被广泛应用。本文就细菌EPS在生物材料 和药品方面的应用、免疫调节功能、抗肿瘤活性及抗氧化活性作一综述。 关键字：细菌；胞外多糖；抗肿瘤；抗氧化；免疫调节 中图分类号：Q936文献标识码：A 文章编号： DOI： Progress of bioactivities for bacterial exopolysaccharides ZHAO Xia, WANG Ruo-yu KeyLaboratory of Ecological and Agricultural Research, Cold and Arid Regions Environmental and Engineering Research Institute, Chinese Academy of Sciences, Lanzhou730000，Gansu Province, China Corresponding author: WANG Ruo-yu, E-mail: wangruoyu@https://www.wendangku.net/doc/5b11488335.html, Abstract：Bacrerial exopolysaccharides (EPS）were produced from bacteria, which is a type of large biological molecule and takes a cruicial effect in many process of life, and becomes a hot focus in recent years because it has a variety of biological activities. At present the bacterial EPS as a natural product may be extracted in large quanties by the fermentation process with a reduced cost, particularly some new types EPS from Lactobacillaceae and ocean bacteria have been identified to having polysaccharides with multiple-structure and potential biological benefitactivities,such as anti-tumor, anti-oxidationand immuno-modulatory effects. The bacterial EPS hasbeen found an outstanding prospect in food industry and medicine.. In this paper,applications of bacteria EPSare reviewed, including in biomedicine materials,pharmaceiticals and health preparation, .andanti-tumor, anti-oxidationand immuno-modulatory effects. Key word：Bacteria; Exopolysaccharide(EPS); Anti-tumor; Anti-oxidation; Immuno-modulation 多糖是一类由醛糖或酮糖通过糖苷键连接而成的天然高分子聚合物，广泛存在于植物、真菌、藻类和 细菌中。根据其来源不同可分为植物多糖、动物多糖、真菌多糖、藻类多糖和细菌多糖。真菌多糖的研究是目前最成熟和深入的，如香菇多糖、灵芝多糖、茯苓多糖等均已开发为临床用药，具有抗肿瘤和增强免疫力的疗效[1-3]。随着对多糖药用价值的研究，药用植物多糖的研究也很受青睐，常见的有黄芪多糖、当归多糖、灰树花多糖等，在抗肿瘤、提高免疫、抗病毒、消炎等方面具有很好的疗效[4-6]。另外，一些藻类多糖和地衣多糖也受到关注，且其也被证明具有抑制肿瘤细胞增长、免疫调节、抗氧化等作用[7-9]。 细菌胞外多糖（Exopolysaccharides，EPS）是细菌产生的一类重要的生物大分子，在许多重要生命过程中起着非常关键的作用。根据多糖存在的位置，可以将细菌多糖分为3种类型：①在细胞质内，提供碳源和能量来源的多糖；②细胞壁多糖包括磷聚酸和肽聚糖；③分泌到细胞外的多糖，有EPS和荚膜多糖（Capsular polysaccharides，CPS）[10-11]。由于细菌多糖生产成本相对较低，且安全无毒，工业上其已被广泛用于溶液凝固剂和乳化剂。如肠膜明珠串珠菌产生的葡聚糖（Dextran）、野油菜黄单胞菌产生的黄原胶（Xanthan），鞘氧醇单胞菌分泌的结冷胶（Gellan）等[12-15]。在医药领域，细菌产生的EPS被证实具有抗菌、抗肿瘤和免疫调节，甚至抗HIV等广泛的生物活性[16-18]。由于细菌多糖通过发酵能够进行批量工业化生产，因此已成为新药物的重要来源，得到了广泛的关注。本文就细菌EPS在生物材料和药品方面的应用、免疫调节功能、抗肿瘤活性及抗氧化活性作一综述。 1 在生物材料和药品方面的应用 一些高分子量多糖的分子性质决定了它在一些医学应用方面的作用，包括流变学（Rheology）性质、保 ____________________________________________________ 基金项目：国家自然科学基金（No.31370447） 作者简介：赵霞(1986-),女,博士研究生,主要从事解淀粉芽孢杆菌类胶原蛋基因功能和胞外多糖研究。 通讯作者：王若愚,研究员,博士生导师, E-mail: wangruoyu@https://www.wendangku.net/doc/5b11488335.html,
实验五 细菌的荚膜染色
实验五细菌的荚膜染色 生物112 周泓兆1102040226 一、目的 学习并掌握荚膜染色的原理及方法。 二、原理 荚膜的主要成分为多糖类，不宜着色，而且含水量高达90%以上，易变形，因此荚膜染色通常采用负染法，将菌体和背景分别着色，从而把不透明的荚膜衬托出来。 三、材料 1.菌种：钾细菌（Bacillus mucilaginous），点接于阿须贝平板上，26℃-28℃培养三天。 2.染色剂：石炭酸复红，墨汁（使用前必须用滤纸过滤，除去墨汁中的杂质） 3.其它：载玻片，无菌水，洗瓶，香柏油，二甲苯，擦镜纸，吸水纸，酒精棉球，接种环，酒精灯，镊子。 四、实验步骤 1.制片：在洁净载玻片上左右两侧各滴加一滴无菌水，取少许培养72小时的钾细菌制成涂片，空气中风干； 2.染色：用石炭酸复红与孔雀绿，分别在两涂片处染色1-2分钟，水洗，稍风干； 3.在载玻片的一侧滴加半滴到一滴墨汁，左手持此玻片，右手另拿一干净玻片做推片用，将推片边缘平整的一端与墨汁成30°角接触，顺势将墨汁推开，使其涂成一薄层，并在空气中充分自然干燥； 4.镜检：玻片自然干燥后，滴加香柏油，置于油镜下观察，菌体为红色（石炭酸复红染色）或绿色（孔雀绿染色），荚膜无色，背景黑色； 5.清理：用二甲苯与干净擦镜纸擦净镜头，将涂片和直接固体垃圾置入垃圾桶，液体垃圾倒入废液缸，无腐蚀性毒性液体可倒入下水道，用酒精棉球擦洗器材将溅出的染料擦除。 五、结果与讨论： 这个实验成功率较低，主要问题出现在以下几个方面：①如果取菌过少在镜检时会很难找到菌体，而如果取菌过多则涂片很难涂匀，会看到菌体形成菌胶团，无法观察到荚膜形状。 ②染色时间不能太短，否则无法看清菌体。而染色如果过长则会导致荚膜也被染上颜色。③尽可能挑取边缘的菌种，而且涂抹的时间不宜过长，否则会发现许多菌体破裂，影响观察。 ④涂抹墨汁的时候要求墨汁量少，而且要尽可能涂的均匀，才能明显看到荚膜形状。 六、思考题 1.简单染色能否观察细菌荚膜？请解释原因。 答：不能。荚膜主要成分为多糖，很难着色，通过简单染色无法染出荚膜，导致荚膜和背景均为透明的，因此无法观察到荚膜。 2.细菌的荚膜有何特点？在对其染色观察结果时应注意什么？ 答：细菌的荚膜含水量高达90%，在风干和染色过程中不应使其遇热。涂墨后风干时间也不宜过长，否则荚膜也会失水变形。
最新土壤中放线菌的分离与纯化
土壤中放线菌的分离与纯化 实验目的 1掌握放线菌的生长特性，微生物的培养方法。 2掌握微生物实验的基本生物技术，主要包括无菌操作技术，纯种分离技术，纯种培养技术，以及抗生素检测等。 3掌握合成培养基，选择培养基的制备方法。 4学习对微生物实验的中出现问题的分析，解决方法 实验材料 药品：可溶性淀粉、KNO3、NaCl、K2HPO4?3H2O、MgSO4?7H2O、FeSO4?7H2O、琼脂、重铬酸钾 其他：高压蒸汽灭菌锅、扭力天平、药匙、烧杯、量筒、玻璃棒、三角瓶、试管、牛皮纸、硫酸纸、线绳、无菌培养皿、铁锹、小铲、酒精棉球、镊子、玻璃铅笔。 实验原理 放线菌是重要的抗生素产生菌，主要分布在土壤中（主要是链霉菌），其数量仅次于细菌。一般在中性偏碱性、有机质丰富、通气性好的土壤中含量较多。由于土壤中的微生物是各种不同种类微生物的混合体，为了研究某种微生物，就必须把它们从这些混杂的微生物群体中分离出来，从而获得某一菌株的纯培养。分离放线菌常用稀释倒
平板法。根据放线菌的营养、酸碱度等条件要求，常选用合成培养基或有机氮培养基。如果培养基成分改变，或土壤预先处理（120℃热处理1h），或加入某种抑制剂（如加数滴10%酚等），都可以使细菌，霉菌出现的数量大大减少，从而淘汰了其它杂菌。再通过稀释法，使放线菌在固体培养基上形成单独菌落，并可得到纯菌株。 放线菌可以产生抗生素，抑制其他菌种的生长，故可用金黄色葡萄球菌（G+）和大肠杆菌（G-）作指示菌鉴别放线菌。 高氏一号合成培养基是培养放线菌的培养基。这种培养基是采用化学成分完全了解的纯试剂配制而成的培养基，高氏一号培养基：碳源为可溶性淀粉、氮源为KNO3 、NaCl 、K2HPO4?3H2O 、MgSO4?7H2O 作为无机盐，FeSO4?7H2O作为微生物的微量元素，提供铁离子等组成 1.高氏一号合成培养基的制备 K2HPO4 ?3H2O 0.125g，可溶性淀粉5g，硝酸钾0.25, MgSO4? 7H2O0.125g， FeSO4?7H2O 0.025g，氯化钠0.125g，琼脂5g，水250ml。 配制时，先依次加入上述药品（除琼脂外）顺序溶解，加入无菌水至250ml，调节pH＝7.4，再加入琼脂不断搅拌震荡至溶化后，121℃灭菌20分钟。 将6套平皿、12只试管灭菌。
细菌脂多糖诱导人外周血单核细胞肿瘤坏死因子α 的合成及核因子κB 的活化
?实验研究? [文章编号] 100723949(2002)1020420320204 细菌脂多糖诱导人外周血单核细胞肿瘤坏死因子α 的合成及核因子2κB 的活化 李凝旭,李建军,李庚山,王 晶,徐红新,李 夏,彭 俊 (武汉大学人民医院心内科,湖北省武汉市430060) [主题词] 炎症; 肿瘤坏死因子; 单核细胞; 核因子2κB ; 免疫细胞化学 [摘 要] 为研究细菌脂多糖对人外周血单核细胞肿瘤坏死因子α合成和核因子2κB 活化的影响,采用密度梯度 离心法分离人外周血单核细胞,经细菌脂多糖刺激后,应用酶联免疫吸附法检测肿瘤坏死因子α水平随刺激剂量 和时间的变化,应用免疫细胞化学方法观察核因子2κB 在单核细胞的激活随刺激时间的变化。发现核因子2κB 在接 受刺激15min ～1h 之间,随刺激时间的延长逐渐从胞质向胞核转移,1h 达高峰。细菌脂多糖呈浓度依赖性(1～1 000μg ΠL )诱导肿瘤坏死因子α合成,肿瘤坏死因子α在刺激后1h 出现,6h 达到高峰,其合成出现在核因子2κB 的 活化后。以上提示细菌脂多糖通过激活单核细胞内核因子2κB 来诱导炎性细胞因子肿瘤坏死因子α的合成。 [中图分类号] R541.4[文献标识码] A Lipopolysaccharide I nduced Tumor N ecrosis F actor 2αSynthesis and Nuclear F actor K ap 2pa B Activation in H uman Monocytes LI Ning 2Xu ,LI Jian 2Jun ,LI Y u 2Shan ,W ANGJing ,X U H ong 2X in ,LI X ia ,and PE NGJun (Department o f Cardiology ,People Hospital o f Wuhan University ,Wuhan 430060,China ) [MeSH ] In flammation ; Tum or Necrosis Factor ; M onocytes ; Nuclear Factor 2kappa B ; Immunohistochemistry [ABSTRACT ] Aim T o evaluate the effect of lipopolysaccharide on human m onocytes tum or necrosis factor αproduction and nuclear factor kappa B activation. Methods M onocytes were is olated by Ficoll density gradient from blood of healthy v olun 2teers. The am ount of tum or necrosis factor αprotein in culture medium was quantified by using tum or necrosis factor αE LIS A systems. Nuclear factor kappa B translocation in m onocytes was observed by immunohistochemistry assay. R esults We find that nuclear factor kappa B was activated after being stimulated for 15minutes and reached peak at 1hour. Lipopolysaccharide (1μg ΠL ～1mg ΠL )induced m onocytes tum or necrosis factor αproduction in a dose 2dependent manner. Tum or necrosis factor αprotein in medium could be detected at 1hours ,and achieve peak at 6hour. Nuclear factor kappa B activation before tum or ne 2crosis factor αproduction in m onocytes. Conclusions Lipopolysaccharide induced pro 2in flammation cytokine production at least in part through nuclear factor kappa B activation in m onocytes. [收稿日期] 2001211229 [修回日期] 2002206216 [作者简介] 李凝旭,女,1977年出生,心血管内科硕士研究生,主要研究方向为冠心病。李建军,男,1957年出生,博士后,主任医师,教授,博士生导师,主要研究方向为冠心病。李庚山,男,1932年出生,主任医师,教授,博士生导师,主要研究方向为冠心病。 单核Π巨噬细胞是人体最主要的免疫Π炎性细胞,同时也是动脉粥样硬化斑块的重要组成成分。 核因子κB (nuclear factor kappa B ,NF 2κB )是一种重要 的炎症转录因子,许多炎症基因的表达是通过NF 2κB 的活化来实现的。本文以细菌脂多糖诱导人外 周血单核细胞的炎症反应,并观察NF 2κB 在单核细胞炎症反应中的作用,以确立NF 2κB 的活化与单核细胞炎症反应的关系。 1 试剂与方法 1.1 试剂 细菌脂多糖(lipopolysaccharide ,LPS )011B4(Sig 2 ma ),肿瘤坏死因子α(tum or necrosis factor α,T NF 2 α),E LIS A 试剂盒(G enzyme ),p65鼠抗人单克隆抗体(Santa Cruz ),RPMI1640(GI BC O ),淋巴细胞分离液(上海化学试剂二厂)。 1.2 外周血单核细胞的分离培养与鉴定 采健康志愿者外周血,生理盐水1∶1稀释,用吸管轻铺于比重1.077淋巴细胞分离液表面,稀释血与淋巴细胞分离液体积约2∶1,形成清晰界面。用水平或台式离心机1500r Πmin 离心25min ,离心后单个核细胞悬于分层液面,呈白膜状。用吸管轻轻将单个核细胞吸入另一管内。用生理盐水清洗2次(1500r Πmin ,7min )。使用台式离心机,常带有少量红细胞,可用红细胞裂解液(150mm ol ΠL NH 4Cl ,10mm ol ΠL NaHC O 3,1mm ol ΠL Na 4E DT A ) [1] 去除。将清 洗后的细胞重悬于RPMI1640(含25mm ol ΠL HEPES ,
微生物胞外多糖及其生物合成途径研究现状
Advances in Microbiology 微生物前沿, 2017, 6(2), 27-34 Published Online June 2017 in Hans. https://www.wendangku.net/doc/5b11488335.html,/journal/amb https://https://www.wendangku.net/doc/5b11488335.html,/10.12677/amb.2017.62004 Research Status of Microbial Exopolysaccharide and Its Metabolic Pathway Ning Pang1,2, Jiaqi Zhang1, Jin Qi3, Binhui Jiang1* 1School of Resources and Civil Engineering, Northeastern University, Shenyang Liaoning 2Beijing Yingherui Environmental Technology Co. Ltd., Beijing 3Fushun Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Fushun Liaoning Received: May 22rd, 2017; accepted: Jun. 9th, 2017; published: Jun. 12th, 2017 Abstract Due to their unique physical and chemical properties, rheological properties and biological safety, microbial polysaccharides have been widely used in many fields, such as industrial production and life. But due to high production costs and less production limit its wide application. The screening, isolating and culturing of microbial strains of extracellular polysaccharides were in-troduced in this paper, and the optimization of production of flocculant conditions and the sepa-ration and purification of extracellular polysaccharides were also discussed. Furthermore, the re-search status of the microbial exopolysaccharide metabolic pathway was focused. The method of improving the production of extracellular polysaccharides can be found by the study of metabolic pathways of microbial exopolysaccharides, which lays the foundation for the industrial applica-tion of microbial extracellular polysaccharide. Keywords Microbial Flocculant, Glycobacter, Biosynthetic Pathway 微生物胞外多糖及其生物合成途径研究现状 庞宁1,2，张佳琪1，齐进3，姜彬慧1* 1东北大学，资源与土木工程学院，辽宁沈阳 2北京盈和瑞环境科技股份有限公司，北京 3抚顺出入境检验检疫局，辽宁抚顺 *通讯作者。 文章引用: 庞宁, 张佳琪, 齐进, 姜彬慧. 微生物胞外多糖及其生物合成途径研究现状[J]. 微生物前沿,2017, 6(2):
细菌的荚膜
细菌的荚膜 荚膜：粘液状物质具有一定外形，相对稳定地附着在细胞壁外，厚度：＞0.2μm。 微荚膜（microcopsule)：粘液状物质较薄，厚度：＜0.2μm ，与细胞表面牢固结合。 粘液层(slime layer)：粘液物质没有明显的边缘，比荚膜松散,可向周围环境中扩散,增大黏性。菌胶团(zoogloea):包裹在细胞群体上的胶状物质。 ★ 幻灯片041.042） 有些细菌细胞外存在着一层厚度不定的胶状物质，称为荚膜。根据其厚度和边界情况的不同，常有不同的名称，例如微荚膜（microcapsule）、荚膜或粘液层（slime layer），有的细菌例如Zoogloea（动胶菌属）的菌种回产生有一定形状的大型粘胶物，称为菌胶团（zoogloea），它实质上是细菌群体的一个共同荚膜。荚膜可通过离心沉降（分层），而粘液层则是扩散到培养基中的胞外多糖，通过离心无法使它沉降，有时甚至将培养容器倒置时，培养液还是结成凝胶状。 观察方法：负染色 成分： 纯多糖葡聚糖：肠膜状明串珠菌等 多糖纤维素：木醋杆菌 杂多糖：几种链球菌（如肺炎链球菌） 多肽：炭疽芽孢杆菌 荚膜成分蛋白质：鼠疫巴氏杆菌 多肽和多糖：巨大芽孢杆菌 DNA：几种盐杆菌（生长在亚适量盐浓度下时形成） 主要功能： a) 抗干燥、抗吞噬； b) 贮存养料； c) 堆积代谢废物； d) 附着作用，如Streptococcus salivarius（唾液链球菌）和S.mutans（变异链球菌）。 应用：代血浆（Leucomostoc mesenteroides ）、葡聚糖凝胶制剂（Sephadex）、黄原胶（xanthan，Xanthomonas campestris）、污水处理等。 为害：食品变质发粘；增强致病力；造成严重龋齿。 荚膜的观察： 荧光显微镜 负染色 特殊染色 荧光显微镜下的荚膜 荚膜的成分：富含水（90%以上），有机组分依种而异： 纯多糖：葡聚糖：肠膜状明串珠菌等 纤维素：木醋杆菌 杂多糖：杂多糖：几种链球菌（如肺炎链球菌） 多肽：炭疽芽孢杆菌（聚D-谷氨酸)
食品中腐败菌的分离纯化及生物学性状观察
微生物学大实验 食品中腐败菌的分离纯化及生物学性状观察 （标题小四黑体，正文小四宋体，段前、段后0，行距20磅） 专业 班级 姓名 同组人 日期
0 前言 食品腐败变质是指食品受到各种内外因素（例如温度，气体等）的影响，造成其原有物理性质或化学性质发生变化，降低或失去其营养价值和商品价值的过程。食品腐败变质的过程实质上是食品中碳水化合物、蛋白质、脂肪在污染微生物的作用下分界变化、产生有害物质的过程。 本次实验以略微腐烂的苹果、栗子、香蕉，饮料为材料，运用三区划线、倾注、点植、涂布等方法从中分离出腐败菌，观察和分析其菌种及菌落形态。 1 试验材料和仪器设备 1．1试验材料 食材：土豆、苹果、栗子、香蕉、饮料。 试剂：营养琼脂粉、麦芽粉、琼脂粉、葡萄糖、牛肉膏、蛋白胨、氯化钠、磷酸氢二钠、溴麝香草酚兰溶液、草酸结晶紫、碘液、95%酒精、沙黄、生理盐水、%吕氏碱性美蓝染液、自来水等。 1．2仪器设备 试验仪器：显微镜、蒸汽灭菌锅、恒温培养箱、试管、酒精灯、接种针（环）、针、培养皿、盖玻片、载玻片、三角玻璃涂布棒等。 2 试验方法 培养基的制备 2.1.1营养琼脂培养基 称取4.5克营养琼脂粉，加入100ml水加热溶解，分装，在121℃下蒸汽灭菌。20min后取出导入无菌平皿中冷却凝固。 2.1.2土豆培养基 将去皮土豆200g切成2cm左右小块加入1000ml水煮沸10min，过滤补充水份，加入20g琼脂粉，20g葡萄糖，加热溶化，分装，121℃下蒸汽灭菌20min。 2.1.3麦芽汁培养基 称取5g麦芽粉加入100ml和2g琼脂，在115℃下蒸汽灭菌20min。 2.1.4糖发酵培养基的制备 2.1.4.1葡萄糖发酵管 取0.25g葡萄糖加入100ml的已配置好的糖溶液混合均匀即可. 2.1.4.2葡萄糖发酵管 取0.25g乳糖加入100ml已配置好的糖溶液混合均匀即可.
芽孢杆菌胞外多糖的结构初步分析_万红贵
芽孢杆菌胞外多糖的结构初步分析 万红贵,袁建锋,单咸旸,朱明新,宗素艳,石楠 (南京工业大学制药与生命科学学院,江苏南京,210009) 摘 要 从筛选自新疆罗布泊沙漠的1株芽孢杆菌的发酵滤液中分离得到胞外多糖EPS 和EP S ,其中EPS 为主要成分,占总糖的89 5%,EP S 为糖蛋白,其分子质量为96 292ku,多糖含量为93 79%,蛋白含量为5 62%,不含糖醛酸,是由D N 乙酰葡萄糖胺,D 木糖和D 甘露糖构成,它们的摩尔比例是2 36 0 98 1 75。EPS 为 型吡喃糖,经高碘酸氧化和Smit h 降解,EPS 中含有(1 ),(1 3)和(1 4)糖苷键,且(1 )和(1 4)糖苷键的比例为1 24 05,其中的糖肽是O 糖苷键。关键词 芽孢杆菌,糖蛋白,结构分析 第一作者:硕士,研究员。 收稿日期:2008-10-24,改回日期:2008-11-19 细菌多糖主要以3种形式存在:胞内多糖、胞壁 多糖和胞外多糖。广义上的胞外多糖指的是糖被(gly cocalyx ),包括微荚膜、荚膜、黏液层和菌胶团,对细菌本身来说它具有很多的功能。例如:保护细菌免受干旱损伤、免受宿主细胞的吞噬、储藏养料、堆积某些代谢和表面吸附作用等等;狭义上的胞外多糖指的是黏液层,是一种扩散到培养基中的多糖,也是人们通常所说的胞外多糖 [1] 。 细菌胞外多糖除了其对细菌自身的生物学意义之外,更重要的是由于它具有安全无毒、理化性质独特、用途广泛、易与菌体分离及可通过深层发酵实现工业化生产等优良性质而备受关注 [2] 。近些年来,一 些具有生物活性的细菌胞外多糖开始引起人们的重视,它们同一些真菌多糖和中草药多糖一样,对机体具有很强的免疫增强和抗肿瘤作用。因此,它们作为一种新型糖,成为科学工作者研究的一个新热点。本课题报道了细菌发酵粘液中分离得到多糖EPS 的理化性质和一级结构,为以后的进一步生物学功效的研究打下基础。 1 材料与方法 1 1 供试菌株 芽孢杆菌(Bacillus),筛选自新疆罗布泊沙漠。1 2 仪器和试剂 TGL 16G 高速离心机,上海安亭科学仪器厂;RE 52AA 旋转蒸发仪,上海亚荣生化仪器厂;All tech 高效液相色谱仪,426型H PLC 泵,ELSD 2000 检测器,Alltech 色谱工作站,美国奥泰科技有限公 司;SH B 循环水式多用真空泵,郑州长城科工贸有限公司;数显恒温水浴锅H H 4,国华电器有限公司;PH S 3C 精密pH 计,上海精密科学仪器有限公司;DZF 602型真空干燥箱,上海博讯实业有限公司;BS 100A 自动部分收集器,上海沪西分析仪器厂;N ico let380FT IR,美国热电公司T herm o;TU 1901双光束紫外可见分光光度计,北京普析通用仪器有限责任公司;柱层析系统;BS124S 电子天平,北京赛多利斯仪器系统有限公司。 活性炭;Sephadex G-100(Wolsen);标准葡聚糖(Dex tran)(A R,国药集团化学试剂有限公司);其余试剂除注明外都为分析纯试剂。1 3 培养基和培养条件 培养基使用葡萄糖牛肉膏蛋白胨培养基。16h 的种子以1%(体积比)的接种量转接至发酵培养基,500mL 发酵摇瓶的装液量为50mL,于30 ,200r/m in 的条件培养48h 。1 4 胞外多糖EPS 的制备 发酵液经离心除去菌体,得到的上清液使用Sevag 法除去杂蛋白,调节pH 值为7 0,以1 4的体积比加95%的乙醇,4 放置24h,10000r/m in,10m in 离心收集沉淀,真空干燥得粗多糖。 将粗多糖溶解后上活性炭柱(1 5cm 24cm ),先用蒸馏水60mL 洗脱,再用60%乙醇60mL 洗脱,最后使用95%乙醇60m L 洗脱,每150s 收集1管洗脱液,硫酸 苯酚法跟踪多糖分布,同时用考马斯亮蓝法跟踪蛋白质分布,收集主峰部分。经过真空浓缩,上SephadexG 100柱纯化,硫酸苯酚法监测,收集其主峰部分,使用95%乙醇沉淀,真空干燥得到多
细菌 、放线菌 、酵母菌及霉菌的分离与纯化
土壤中细菌、放线菌、酵母菌及霉菌的分离与纯化 一、实验目的 1. 学习、掌握从土壤稀释分离、划线分离各类微生物的技术。 2. 学习从样品中分离、纯化出所需菌株。 3. 学习并掌握平板倾注法和斜面接种技术，了解培养细菌、放线菌、酵母菌及霉菌四大类微生物的培养条件和培养时间。 4. 学习平板菌落计数法。 二、实验原理 将待分离的样品进行一定的稀释，使微生物的细胞（或孢子）尽量呈分散状态，选用有针对性的培养基，在不同温度、通风等条件下培养，让其长成一个纯种单个菌落。 要想获得某种微生物的纯培养，还需提供有利于该微生物生长繁殖的最适培养基及培养条件。微生物四大类菌的分离培养基、培养温度、培养时间见表2-1所示。 表2-1 微生物四大类菌的分离和培养要求 样品来源分离对象分离方法稀释度培养基名称培养温度 /℃培养时间/d 土样细菌稀释分离10-5，10-6， 10-7 牛肉膏蛋白胨30～37 1～2 土样放线菌稀释分离10-3，10-4， 10-5 高氏1号28 5～7 土样霉菌稀释分离10-2，10-3， 10-4 马丁氏琼脂28～30 3～5 面肥或土样酵母菌稀释分离10-4，10-5， 10-6 马铃薯葡萄糖28～30 2～3 细菌分离平 板 细菌单菌落划线分离10-2 牛肉膏蛋白胨30～37 1～2 三、实验材料 1. 菌源土样 2. 培养基牛肉膏蛋白胨培养基，马丁氏培养基，高氏合成1号培养基，马铃薯葡萄糖培养基(制平板和斜面)，见附录Ⅲ。 3. 无菌水 250 mL锥形瓶，每瓶装99 mL无菌水(或95mL为分离霉菌用)，内装10粒玻璃珠。 4.5 mL无菌水试管(每人5～7支)。 4. 其他物品无菌培养皿，无菌移液管，无菌玻璃涂棒(刮刀)，称量纸，药勺，橡皮头，10%酚溶液。 （一）系列稀释平板法 1. 取土样 选定取样点，按对角交叉（五点法）取样。先除去表层约2cm的土壤，将铲子插入土中数次，然后取2～10cm处的土壤。盛土的容器应是无菌的。将5点样品约1kg充分混匀，除去碎石、植物残根等杂物，装入已灭过菌的牛皮纸袋内，封好袋口，并记录取样地点、环境及日期。同时取10～15g，称重后经105℃烘干8h，置干燥器中冷却后再次称重，计算含水量。土样采集后应及时分离，凡不能立即分离的样品，应保存在低温、干燥条件下，尽量减少其中菌种的变化。 2. 制备土壤稀释液 称土样1g于盛有99mL无菌水的三角瓶中，充分振荡，此即为10-2浓度的菌悬液。用无菌移液管吸取悬液0.5mL于4.5mL无菌水试管中，用移液管吹吸三次，摇匀，此即为10-3浓度。同样方法，依次稀释到10-7。稀释过程需在无菌室或无菌操作条件下进行。