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荧光技术

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cyq 发表于2010-02-20 14:48 | 来源：| 阅读

随着分子生物学、有机化学以及材料科学等学科的进展，最近我们又获得了好几种新型的荧光蛋白标签，这些标签可以用于细胞生物学成像研究。本文将对荧光标志物在蛋白质研究中的优势及劣势进行一番详细的介绍，文章中将重点介绍如何使用荧光标志物研究活体细胞（而不是固定细胞）中的靶蛋白。使用该方法可以对靶蛋白的表达情况、细胞中的定位情况、活性状态等指标进行研究，还将介绍将荧光显微镜与电子显微镜技术相结合的可行性问题。小分子荧光标志物染料、纳米晶体材料，即所谓的“量子点（quantum dots）”材料、自发荧光蛋白、小分子蛋白质标签等等这些材料都可以作为荧光标志物，而且将这几种材料“混合”起来是一种非常有前途的荧光标志物研究新思路。

我们使用荧光技术来研究细胞生物学已经好多年了，而且在从微小的分子层面到完整的有机体层面等各个层面都可以使用荧光技术进行研究。最开始使用的方法是将小分子有机染料与各种抗体相连接，来研究各种目的蛋白。不过这种使用抗体的方法如果需要对细胞内的蛋白质进行研究时，还需要对细胞进行固定和透化操作。因此后来又发展出可以直接在活体细胞内标记某种细胞器、核酸分子或某些离子的荧光标志物。在最近这10年里，荧光蛋白的出现使得进行非侵入性的活体细胞成像成为了可能。使用这种荧光蛋白标志物，我们可以研究目的基因的表达情况，蛋白质运输情况以及各种细胞内动态的生物化学信号通路。使用经过遗传修饰的小分子有机荧光标志物构建的混合系统，我们还可以对蛋白质的寿命进行研究，如果再结合电镜技术和快速光淬灭技术（rapid

photoinactivation）还可以对蛋白质的定位情况进行研究。与此同时，半导体纳米晶体材料技术也得到了高度的发展，现在，这种新型的材料在亮度和光稳定性方面都要比传统的荧光标志物好得多，只不过现在这种材料的靶向性还不是很好。本文中我们将对目前荧光标志物及其相关技术的发展进行介绍，同时还将介绍荧光标志物在蛋白质表达、蛋白质活性以及蛋白质功能研究工作中的作用进行介绍。

荧光标志物

小分子有机染料

小分子有机染料是指分子量小于1KD的小分子物质，这种小分子有机染料可以通过与生物大分子共价连接的方式对其进行标记，我们现在对这种染料的最佳检测波长范围、亮度，即吸光系数、光稳定性和自我淬灭特性都有了比较详尽的了解。利用荧光染料的分子策略包括扩展共轭双键、额外添加环状结构增强其刚性、用氟或磺酸盐这类吸电子性的或带电荷的物质进行修饰等。现在市面上已经有数百种这类荧光染料的商业化产品可供选择，而且还在不

断增加之中。不过由于这类染料对蛋白质缺乏特异性，因此多与抗体联用（图1A~C）。

荧光蛋白

第一批用于细胞生物学的荧光蛋白包括藻胆蛋白（phycobiliproteins）和从蓝藻（cyanobacteria）中提取的触角光合色素（photosynthetic antenna pigments）。这些生物大分子都含有多种胆汁三烯生色基团（bilin chromophores）。这些生色基团都包裹在一种基质结构中，这样就能将它们的淬灭作用降至最小，因此这些藻胆蛋白的荧光亮度要比小分子荧光染料的亮度高出两个数量级。不过这些藻胆蛋白的“个头（分子量高达200KD）”也限制了它们在细胞内的扩散，因此，它们也只能与抗体联用，在流式细胞术试验或ELISA试验中用来检测细胞表面的蛋白质分子。不过如果能将这些藻胆蛋白在细胞中原位表达，那么它们的用途就会大为扩展，但问题在于胆汁三烯生色基团必须依赖脱辅基蛋白（apoproteins）的作用。不过令人高兴的是，我们已经在这方面取得了一些成绩。

自从科学家从维多利亚发光水母（jellyfish Aequorea victoria）中发现了绿色荧光蛋白（GFP）之后，生物成像领域就发生了革命性的改变。单独表达绿色荧光蛋白或与其它蛋白融合表达就可以在细胞内发出绿色荧光了，使用这种方法除了需要氧气O2之外，不再需要任何其它的试剂参与，因为生色基团是通过自发环化作用形成的，需要对深埋在直径约2.4纳米至4纳米的β桶（beta barrel）核心里的三个氨基酸（丝氨酸-酪氨酸-氨基乙酸）进行氧化才能发出荧光。绿色荧光蛋白只是荧光蛋白大家族中的一员，这些荧光蛋白大部分都来自海洋腔肠动物，因为各自含有共价结构不同以及非共价环境不同的生色基团，所以可以发出不同颜色的荧光。在实验室中对这些荧光蛋白进行遗传修饰之后可以进一步的丰富它们的特性，比如增加亮度和折叠效率、减少寡聚体形成等。突变既可以增加荧光蛋白的光稳定性，还可以赋予荧光蛋白光操控性，比如控制荧光发射与否，或者发出哪种荧光。这种光操控性既可以是可逆的也可以是不可逆的，可以用于监测蛋白的弥散过程、运输过程和老化过程等。虽然荧光蛋白在生色基团形成的过程中会生成H2O2，但似乎没有产生太多的活性氧簇（ROS），这一点也并不奇怪，因为荧光蛋白在进化过程中都是暴露在阳光下的。不过我们也可以对荧光蛋白进行改造使其能够形成ROS。荧光蛋白发出的荧光一般对它们所处的生化环境都不太敏感，但是酸性环境或变性剂的存在可以淬灭荧光。不过现在我们已经有了经过改造的、能耐受酸性环境或者能对金属离子、卤化物离子和巯基二硫化物氧化还原剂起反应的荧光蛋白。

量子点（QD）

量子点是一种无机纳米结晶体，它可以根据其大小发出特定波长的荧光，它具有非常高的消光系数，其消光系数要比小分子荧光基团和荧光蛋白高出10倍至100倍，同时量子点的量子产率也非常好。典型的量子点都含有一个硒化镉（CdSe）或碲化镉（CdTe）核心，外面包裹一硫化锌（ZnS）外壳（图1C）。量子点的吸收波长范围覆盖从非常短的波长至略低于其发射波长的广阔范围，因此一束单波长激发光就可以让量子点达到多重发射。对于生物学研究领域来说最重大的一项突破是研究出了能让量子点溶于水的包被材料，该材料能避免量子点被水淬灭，同时也能让量子点可以与抗体、抗生物素蛋白链菌素（streptavidin）等分子相连接（图1B）。不过这种结合了生物大分子的量子点体积过大（直径约10纳米至30纳米），从而阻碍了它通过细胞膜结构，这种量子点也就只能用于经透化处理的细胞，或者只能对胞外蛋白和可以被细胞内吞的蛋白进行研究。量子点的光稳定性使其能够反复成像，而其大小

和电子密度特性又使得它适合用于电镜研究。

在亲水的树枝状高分子聚合物（hydrophilic dendrimers）中形成的金或银纳米点材料也能发出荧光，同时也具有波长可调性。这种新型材料在细胞生物学领域的应用前景也是不可估量的。

标记蛋白技术

免疫标记法

表1中列举了几种免疫标记法以及其它标记蛋白的技术。在用荧光技术检测内源性蛋白质时最常用的方法就是免疫学方法，即先用特异性抗体（一抗）识别靶蛋白，再用标记有小分子有机染料、藻胆蛋白或量子点的二抗显色（图1A至C）。或者，也可以直接将荧光标志物或者生物素连接在一抗上，然后再用抗生物素蛋白链菌素检测。当把抗体直接注入细胞时或者为了对多个蛋白进行检测而使用了多种颜色的荧光时采用这种直接将标志物连接在抗体上的方法非常有效。但是如果没有高质量的抗体时最好就是将荧光标志物与靶蛋白一起融合表达来检测，尽管这种融合蛋白不能算真正意义上的“内源性蛋白”。对靶蛋白检测的精确程度取决于一抗的特异性，因此还需要用其它的方法进行佐证。使用免疫荧光标记法的劣势在于前面所述的，该方法只能用于经透化处理的细胞、胞外蛋白和可以被细胞内吞的蛋白，而且这些抗体标志物的多价性（multivalency）还可能会导致靶蛋白形成寡聚体。在标准的免疫标记法中，荧光标记的复合体通常来说分子量都会超过200KD，这有可能会影响到蛋白间的相互识别过程。

表1 荧光基团在蛋白质检测中的应用

++、+/-、-分别表示“应用范围较广”，“在某些领域内有所应用”，“较少应用”

遗传标记法

将荧光蛋白与靶蛋白融合在一起的遗传标记法最大的优势就是可以对靶蛋白进行精确的标记（图1C和D）。用转染技术和转基因技术进行荧光标记要比用荧光染料方便得多。遗传标记法的缺点在于表达的蛋白不是“内源性”蛋白，荧光蛋白的分子大小会带来影响，融合蛋白可能会影响到目的蛋白的功能，以及荧光蛋白的限制性问题等。因此，又发展出了好几种“混合系统”，在活细胞内或细胞表面将小分子荧光标志物与目的蛋白进行共价连接，或者通过酶的作用进行连接，甚至于可以自动连接。不过这些技术中的大部分都太新了，还没有得到足够的实用检验。这些混合系统中最好的系统应该算四半胱氨酸序列（tetracysteine）-biarsenical染料系统。该系统用一段由12个氨基酸残基组成的肽段对目的蛋白进行修饰，这段短肽内包含有4个半胱氨酸，这些半胱氨酸能够与可以透过细胞膜的biarsenical染料分子相结合，形成FlAsH或ReAsH，发出绿色或红色荧光，这种结合过程是高亲和力的过程，只需要皮摩尔级的分子就足够了（图1C和E）。同时使用小分子二巯基化合物解毒剂（dithiol antidotes）可以降低靶蛋白与染料之间的亲和力，同时减少毒性反应。Tetracysteine基序已

经经过了好几轮改良以提高它与biarsenical染料之间的亲和力，这样只需使用很低浓度的biarsenical染料就可以达到目的，而且可以降低背景。这种小分子Tetracysteine基序对目的蛋白的影响要比荧光蛋白小得多，有人用酵母微管蛋白（tubulin）、G蛋白和细菌致病蛋白等已经证实了这一点。这种tetracysteine-biarsenical系统还具有其它荧光蛋白不具有的优势，比如可以用于亲和纯化（affinity purification）、荧光蛋白辅助的光灭活作用（fluorophore-assisted light inactivation）、检测蛋白质合成过程、进行脉冲追踪标记（pulse-chase labeling）以及电镜下定位等等。不过，biarsenical染料会造成背景荧光偏高，因此在这一点上（荧光高对比度）相比荧光蛋白并不具备优势，因此还没有用于转基因动物，而且还不能同时对不同的蛋白标记上不同的颜色。Tetracysteine序列有时也可以提供一个十六烷酰化位点（palmitoylation site），虽然这种修饰作用有时会被已经存在的原位标签（epitope tag）所阻碍。这种遗传标记法具有其独特的优势，但是还是需要用其它方法验证标记物蛋白或融合蛋白是否会影响到目的蛋白的功能及定位。

荧光标记技术在原代细胞和固定组织中研究蛋白质表达情况和蛋白质定位情况时的应用

用流式细胞术研究蛋白质表达情况和蛋白质活性

免疫荧光技术是最适合研究内源性蛋白质的一种方法。能够特异性结合磷酸化蛋白的被荧光标记的抗体可以帮助我们清楚地观察到内源性蛋白质的活化状态，这一点对于用荧光流式细胞仪（fluorescent flow cytometry）对单细胞内的多种胞质蛋白的活性进行研究非常重要。单细胞内研究资料可以用于构建细胞信号网络，并且有可能用于在体外对病人的血细胞进行临床药物试验。目前对于胞质蛋白来说，小分子染料要比量子点更实用，因为小分子染料对于细胞的穿透性更好（表1）。不过量子点的高亮度特性有助于提高检测的极限，而且量子点的多色特性也有助于进行多色标记。使用小分子染料、藻胆蛋白和量子点，我们可以在流式细胞仪中同时对17种荧光进行检测。

图1 蛋白检测中各类荧光基团的特点及应用。本组图片展示了采用不同标记方法及不同类型的荧光基团在蛋白检测中的具体应用：A、B图中展示的是成纤维细胞中的α-微管蛋白（α-tubulin，红色）。D、E图中展示的则为HeLa细胞中的间隙连接蛋白43（connexin43，绿色）。不同类型的目的蛋白及标记荧光基团（图C）的结构均按比例显示（比例尺为2nm）。内源性蛋白质先经一抗标记后，再用与小分子有机染料（A图）共轭相连的二抗或与QDs相连的Fab片段（B图）进行标记，此种标记法同样也适用于在电镜下进行观察；B图右侧所示为用QD565标记间隙连接蛋白43后显示的间隙连接蛋白接口处情况。D图和E图分别采用的是融合表达荧光蛋白标签和tetracysteine标签标记方法。E图中先后分别采用FlAsH (绿色) 及ReAsH (红色)进行标记，从而对新旧蛋白进行区分。经光氧化作用处理后，ReAsH也可在电镜下观察到，如图E右侧图所示。比例尺：图A、B及D：20 μm（光镜）；B图：50nm （电镜）；C图：2nm；E图：2μm。

在光学显微镜和电子显微镜下进行蛋白质定位研究

要想获得蛋白质在细胞器和其它亚细胞结构中最准确的定位信息，这莫过于使用电子显微镜了。大部分单独的荧光基团在光照下都会产生单线态氧（singlet oxygen），这些单线态氧不仅容易对荧光基团自身起到漂白作用，而且可以将局部的二氨基联苯胺（diaminobenzidine，DAB）氧化形成电镜下的嗜锇小体（osmiophilic polymer）。这种“光转化（photo-conversion）”过程最初是在荧光黄（Lucifer Yellow）里发现的，后来又在四溴荧光素免疫荧光染色（eosin immunostaining）中发现了。最近发现，用tetracysteine序列标记的蛋白经biarsenical染色后形成的ReAsH对DAB也具有光转化作用，这提示我们需要在试验操作中更加仔细进行固定操作，已达到对细胞超微结构最佳的保存效果（图1E和图2H）。而且用tetracysteine序列标记方法还可以进行脉冲追踪标记，以此在电镜下区别出“新的”蛋白质和“老的”蛋白质（图1E）。据报道绿色荧光蛋白对于DAB也有光转化作用，不过转化效率要比ReAsH低很多。

光转化作用对于聚集在亚细胞结构中的蛋白质的作用最大。量子点在发现更多的蛋白质和在细胞内分布范围更广的蛋白质这一方面非常具有优势，它可以同时用于光镜和电镜（图1B）。量子点的高电子密度核心和其大小特性使得它可以在电镜下被发现，而且还可以借助银染的手段对量子点进行染色，进一步方便我们观察。有人用切片后标记的方法（postsectioning labeling）用量子点对核内蛋白（nuclear protein）进行了标记，证明了量子点在电镜下和光镜下的应用价值。最近有报道称有人用免疫标记方法将量子点直接对细胞和组织内的多种内源性蛋白质进行了标记，标记后可在光镜和电镜下进行观察。量子点标记后可以现在光镜下进行预筛，以检测标记效率，并划定目标区域，以方便后续的电镜检查。因为量子点的大小有差异，所以我们可以轻易的分辨出3种不同的蛋白质。又因为每一个量子点都可以发出荧光，可以在电镜下被检测到，因此从原理上来说可以用电镜进行所有的荧光观察研究，比如可以不用抗体而用生物素标记细胞表面蛋白，然后用标记有抗生物素蛋白链菌素的量子点进行检测等。不过因为在免疫标记法中需要对细胞进行透化处理，而且不能对细胞进行直接的、比较严苛的固定操作，因此细胞的超微结构不能得到很好的保存，这一点不如使用tetracysteine序列标记技术。

荧光标记技术在研究活体细胞内的蛋白质动力学时的应用

研究蛋白质在细胞内的弥散过程和运输过程

当被标记的蛋白质在细胞内运动、重新分布时，我们可以通过直接成像技术观察到这一动态变化的过程。通过检测蛋白质在胞内的这种运动过程，我们可以对蛋白质的活化、信号传递通路，第二信使等过程进行研究。比如有人就曾经用荧光蛋白标记了血小板同源结构域（pleckstrin homology domains）观察了它们在细胞内的转运情况，用这种方法监测了多磷酸肌醇（polyphosphoinositides）在胞膜上的聚集过程。即使到了稳定阶段，蛋白质也仍然是处于不断运动、不断在各个细胞器间交换的过程中。目前有三种主要的方法可以对蛋白质这种看不见的“流动状态”进行观察，这三种方法分别是单粒子示踪技术（single-particle tracking）、相关光谱学技术（correlation spectroscopy）和光标记技术（photomarking methods）。单粒子示踪技术是对单个的分子（molecules）、聚合物（aggregates）或细胞器（organelles）等进行

观察的技术，这些被观测的粒子必须足够亮，并且彼此之间的间隔要足够大，这样才能很好地对它们进行“跟踪”。比如低浓度的（<0.5%）荧光标记肌动蛋白或微管蛋白会分别在纤维状肌动蛋白（filamentous actin）或微管（microtubules）中形成一块荧光斑点（fluorescent speckles）。生物大分子结构的形成、变化和解散过程都可以由这种荧光斑点的动态变化过程来反映。荧光相关光谱学技术可以对荧光标记蛋白进入或离开某一激光焦点区域导致的荧光强度的改变情况进行统计学分析，以此来分析蛋白质的运动情况。荧光相关光谱学技术可以衍生出其它一系列的方法，比如影像相关光谱学技术（image correlation spectroscopy），该技术可以对荧光图像进行测量，发现不同图像间的变化情况，可以对细胞内蛋白间相互作用和蛋白动力学的总体情况进行了解。不过在上述这些方法中存在一个问题，那就是荧光基团的光化学敏感问题（Photochemical sensitivity），但这恰好是光标记技术所需要的。光标记技术也是一种图像化研究蛋白质动力学的方法。各种荧光蛋白都可以被破坏（图2F）、被去淬灭（dequenched），或者被光活化作用改变颜色（图2E）。经过上述处理的这些荧光标记分子就可以直接用来进行成像研究了。对主动转运过程来说，荧光标志物的大小不会是问题，但是在被动转运过程中，小分子标志物的效果要好得多。

单个的量子点可以用来反复成像，因为它们的亮度和光稳定性都非常高，但是很难在活体细胞内对量子点标记的胞质蛋白质进行观测，这成了困扰量子点应用的瓶颈问题。不过在对细胞表面蛋白质进行研究时，量子点方法要比单分子活体细胞成像方法好得多。

我们可以用免疫靶向的抗生物素蛋白链菌素标记的量子点（immunotargeted streptavidin-QDs）来研究甘氨酸受体的运动情况。我们已经获得了一千多张高质量的神经元细胞内源性受体的荧光图像，这些图像向我们展示了甘氨酸受体在突触外（extrasynaptic）、突触旁（perisynaptic）和突触内（synaptic）以不同速度运动的情况。Lidke等人最近将好几种上述研究方法和荧光标记物联用，获得了有关表皮生长因子（epidermal growth factor, EGF）信号通路的新发现。他们发现用量子点标记的表皮生长因子能够特异性地与ErbB1-GFP受体复合体共定位，并且用特异性靶向活化的ErbB1蛋白的Cy5标记的抗体发现，表皮生长因子能够激活ErbB1-GFP受体复合体。Lidke等人还用阿糖胞苷（Alexa）标记的转铁蛋白（transferrin）发现，EGF-ErbB1-GFP受体复合体是通过依赖笼形蛋白（clathrin）的细胞内吞途径（internalized）进入细胞的。此外，他们还发现EGF-QD分子的逆向转运过程是依赖受体的寡聚化过程。对光漂白的GFP-actin分子进行荧光恢复之后发现受体逆向转运过程的速度是与actin分子转运速度相同的。用不可进入细胞内的biotin-Alexa特异性地淬灭胞外的EGF-QDs-streptavidin分子，结果发现受体不会进入丝状伪足，但是可以进入胞体，因此丝状伪足可能起到了触角的作用，能够调节活化的受体进入细胞。

荧光标记技术在蛋白质构象改变研究中的应用

在研究蛋白质随时间、空间改变而发生构象动力学改变的时候，最为常用的一个方法就是将某一蛋白质结构域与两个荧光基团结合，形成一三明治样结构，然后对该结构的萤光共振能量转移现象（FRET）进行检测。最为常用的荧光基团有蓝绿色荧光蛋白（cyan FPs, CFP）和黄色荧光蛋白（yellow FPs, YFP）（图2A至C）。图2B给出了一个最为典型的FRET试验。FRET的效率取决于供体与受体间的距离和方向。FRET可以反映出蛋白分子内部因为方向而不是距离改变所造成的构象改变，因为荧光蛋白分子中有一个发生交替排列或者接头长度发生微小的改变都会给FRET带来很大的影响，这要比两个荧光蛋白分子间的距离改变对FRET造成的影响大得多。连接两个荧光蛋白的蛋白质本身也可以在生化信号的影响下改变

构象。如果与定位信号序列融合，这种三明治结构可以用于对胞内特定的亚细胞结构进行研究。我们已经用这种方法研究出了可用于对某些离子、环核甙酸（cyclic nucleotides）、代谢产物和神经递质等物质进行检测的指示剂，还研究出了可用于检测蛋白激酶与磷酸酶活性、蛋白酶活性、小G蛋白（small G proteins）活性和组蛋白乙酰基转移酶（histone acetylases）活性的指示剂。

荧光标记技术在蛋白与蛋白间相互作用研究中的应用

FRET还可以用于在活体细胞内研究蛋白间的相互作用（图2C）。此处应用的荧光蛋白长度在6纳米至8纳米之间。最近更有报道称可以在上述CFP和YFP的基础上再加上一种红色荧光蛋白（RFP），即利用三种荧光蛋白来研究高度复杂的蛋白复合体。在这种CFP-YFP-RFP 复合体中，CFP是YFP的供体，而YFP又是RFP的供体（图2C）。这种三联体研究方法已经用于多蛋白复合体以及三聚体蛋白的研究当中。如果对FRET供体和受体波长或光谱重叠范围进行进一步的优化将可以进一步的改进这种三联体研究方法。

荧光蛋白在某些位点断裂之后，生成的两个片段可以重新结合再形成生色基团，这就是图2D所示的名为生物分子荧光互补技术（bimolecular fluorescence complementation，BiFC）的原理。有报道称绿色荧光蛋白的裂解片段就具有不需要借助其它蛋白间相互作用的自我重组功能，不过只有当两个片段同处于一个结构之内才能发出荧光。BiFC技术可以用于研究至少在两个启动子调控之下的蛋白质的表达情况，已经有人在秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）中进行了类似的试验。BiFC技术具有很高的信噪比，因为它可以形成新的荧光，而不是只对已有的荧光进行调控。可以同时用好几对不同荧光蛋白的裂解片段对多个蛋白间的相互作用进行研究。不过BiFC试验花费的时间比较长，长达数小时甚至数天，而且试验是不可逆的，同时我们现在也不清楚蛋白间相互作用试验中所需要的空间几何学参数和亲和力参数。

在某些情况下，只需要简单的共定位试验就足以说明蛋白间的相互作用情况。比如，如果蛋白激酶A的调节亚单位是特异性靶向细胞膜结构的，同时在细胞内共表达荧光标记的催化亚单位，那么该催化亚单位就应该共定位在细胞膜结构上，同时当胞内cAMP浓度升高时，它会与调节亚单位解离。使用两种荧光颜色的荧光相关光谱学方法也可以用来进行蛋白间的相互作用研究。

荧光标记技术在蛋白质合成和降解过程研究中的应用

要研究蛋白质的降解过程首先就需要能分辨“陈旧的”蛋白质和“新生的”蛋白质。常用的方法是用不可逆的标记方法对某一时刻合成的所有蛋白质进行标记。然后再用另一种颜色的荧光对迟些时候新生成的蛋白质进行标记。可以用高亲和力的配体或标记有荧光基团的抗体对内源性蛋白和胞外蛋白，例如受体或表位等进行标记。也可以先用一种biarsenical染料标记Tetracysteine序列，然后再用另一种biarsenical染料进行标记的方法来研究蛋白复合体的合成过程以及蛋白在胞内的亚细胞定位情况（图1E和图2G）。用各种光标记荧光蛋白进行标记的融合蛋白是可以被光活化或光漂白的，因此也可以用于研究蛋白质的合成情况（图2E和图2F）。有一些荧光蛋白突变体在某些温度之上就会发生不可逆的变性，因此也可以借助温度来进行光漂白试验。还有一些荧光蛋白在生色基团成熟的过程中会自发地改变颜色，比如从绿色变成红色，因此不需要外界的作用也可以用来指示蛋白的“新旧”程度。不

过在这种情况下时间分辨率并不是显得那么重要，因为通常来说，这种自发性的颜色改变过程会持续好几个小时。

利用依赖生色基团的光灭活作用来控制蛋白质的活性

正如前文所述，我们知道荧光基团受光照活化后会生成ROS，尤其是生成单线态氧，利用这种特性我们可以将目的蛋白灭活（图2I）。这种灭活蛋白的方法在时空分辨率的控制方面要比基因敲除方法或RNA干扰方法好得多。这种依赖生色基团的光灭活作用（chromophore-activated light inactivation, CALI）最开始使用的是孔雀绿（malachite green）染料，借助免疫染色方法对目的蛋白进行标记。为了避免孔雀绿标记的抗体难以进入细胞这一技术上的障碍，我们开发出了用于CALI技术的标签蛋白。GFP、FlAsH、ReAsH和特异性结合FKBP12蛋白的荧光素标记抗体都可以被用于“摧毁”胞内的靶蛋白。上面所述这几种荧光标志物的摧毁效率按从大到小排列顺序是ReAsH > FlAsH>荧光素>> 孔雀绿>GFP。如果用对细胞伤害更小的波长更长的多光子激活方法（multiphoton excitation），还可以进一步减少CALI方法对细胞产生的非特异性杀伤作用。最近在检测不同荧光蛋白光毒性作用时发现了一种名为“KillerRed”的荧光蛋白。该蛋白非常适合作为CALI试验和光转换试验（photoconversion）的标签蛋白，不过该蛋白是以二聚体的形式存在，就目前的试验数据来看，它在CALI试验中的效率远不如ReAsH。

荧光标记技术在酶活性检测方面的应用

抗体识别方法或者遗传融合方法实际上都是遵循化学配比原则的，即每一个目的分子都只可能与一个或几个荧光标志物结合。而细胞内源性酶的荧光底物则为我们提供了一个绝好的机会，可以据此检测这些酶是处于活化状态、潜伏状态还是受抑状态。这对于蛋白酶的研究工作来说尤其重要，因为在大量的蛋白酶中只有一小部分是处于活化状态的。蛋白酶在感染性疾病、细胞凋亡、炎症性疾病以及肿瘤等疾病中都起到了重要作用，现在已经有了好几种方法可以研究活体动物体内的蛋白酶活性，比如FRET中断法（disruption of FRET）、荧光标记底物淬灭法或者激活能将荧光基团带入细胞上（内）的阳离子细胞穿膜肽（cationic cell penetrating peptides）方法等。

图2 图中A至I展示的是荧光标签的各种应用方法以及技术原理。图中圆筒状结构代表蓝绿色、绿色、黄色和红色的荧光蛋白。X、Y、Z分别代表目的蛋白。光强度以波形的粗细程度表示，参见文中相应文字获取更多详细信息。

A：FRET报告系统（reporter）（直接作用方式）。受体蛋白（图中灰色曲线）与配体（图中三角形所示）结合之后（即步骤1）会导致受体蛋白构象发生改变（即步骤2），通过FRET 的作用将发蓝绿色荧光的CFP荧光蛋白变成了发绿色荧光的FIAsH荧光蛋白；B：FRET 传感器（sensor）（间接作用方式）。底物经过修饰（如图中橙色所示的磷酸化修饰作用）之后会导致构象改变，通过FRET作用使得发蓝绿色荧光的CFP荧光蛋白变成了发黄色荧光的YFP荧光蛋白；C：三分子FRET作用。蛋白X和蛋白Y结合之后会使得发蓝绿色荧光的CFP荧光蛋白变成了发黄色荧光的YFP荧光蛋白。如果再与蛋白Z结合则会发中红色荧光；

D：BiFC技术。蛋白X与蛋白Y结合的同时也导致绿色荧光蛋白的两个裂解片段结合在一起，这两个裂解片段结合之后又会形成生色基团，发出绿色荧光；E：光活化作用。强烈的光刺激会改变局部荧光蛋白的发射光谱，这样就可以发现蛋白质的运动情况；F：FRAP作用。强烈的光刺激可以让局部的荧光被漂白。但是新合成的蛋白或从别处运动过来的蛋白仍然会发出荧光；G：脉冲追踪技术（pulse-chase）。用Tetracysteine序列标记的蛋白质被绿色染料标记后形成能发出绿色荧光的FIAsH，如图中绿色小点所示。在去掉绿色染料之后再用红色染料标记新生的蛋白质，就会形成能发出绿色荧光的ReAsH，如图中红色小点所示；H：电镜下光氧化作用。对ReAsH（图中红色小点所示）进行强烈的光刺激之后可以形成ROS。ROS可以让DAB发生多聚化反应沉淀下来（如图中棕色所示）。这种DAB沉淀可以被黑色的锇染料（Osmium）着色，在电镜下被观察到；I：CALI作用。对ReAsH（图中红色小点所示）进行强烈的光刺激之后会生成ROS，这些ROS可以氧化并灭活目的蛋白。

增加荧光标记技术的空间分辨率和对于细胞的穿透力

因为有很多分子间相互作用和细胞生物学现象都是在“远隔”好几百纳米的距离范围内发生的，因此我们还需要努力提高荧光显微镜的空间分辨力。目前使用的传统衍射技术的荧光显微镜的分辨率只有200纳米。当荧光发射光源只是一个点时，如果我们能收集到它所发射出来的足够光子，就能在亚纳米级精度对它进行准确的定位。这种测量方法在体外检测运动蛋白和持续性酶的步长时特别有用。最近还有人用该方法对活体细胞进行了实验，结果发现用绿色荧光蛋白标记的过氧化物酶体沿细胞微管运动时的步长大约是8纳米。对于更加复杂的，不知道其大小与形状的复合体来说，我们也可以用诸如结构照明技术（structured illumination）、相互比对技术（coherent observation）以及受激发射减损技术（stimulated emission depletion）等经改良的光学实验方法进行研究。

在研究散射深度超过1毫米的组织时要获得高质量的图像就需要用到红外线脉冲多光子激发技术（multiphoton excitation with pulsed infrared），因为在使用红外线时发生的散射现象最弱，而且试验中所收集到的光子都必须来自同一发射源，哪怕这些光子已经发生了散射。对于固定组织使用新的连续重建技术（serial reconstruction）或者对于活体组织使用断层摄影术（tomography）都有望提高荧光成像的深度，只不过会牺牲部分分辨率。

图3 不同的标记方法和荧光基团的应用。将GFP标记的α微管蛋白和ReAsH β-actin蛋白转染HeLa细胞。细胞固定后用量子点对高尔基体基质蛋白giantin进行免疫标记，用Cy5对线粒体酶细胞色素C进行标记，用Hoechst 33342对DNA进行标记。按下表中激发波长和发射波长获得图中图像。上面的小图是伪色图（false-colored），下面的大图是合成图。图中比例尺为20微米。

总结与展望

荧光成像技术正在各个领域里大显身手，而且应用范围也在不断扩大。荧光探针、标记技术、实验设备以及数据分析方法等各个相关领域都取得了非常大的进步，现在荧光成像技术已经可以进行高通量筛选、单分子检测、多蛋白乃至活体细胞成像等领域了。我们在各种各样天然荧光蛋白的基础上又进一步的进行了各种人工改造，获得了一大批优良的人工荧光蛋白，不过还没有一种荧光蛋白能够满足我们的所有需要。我们还开发出了很多关键代谢产物、关键调节酶和生化反应的指示剂，这些指示剂基本还没有发现有任何不足之处。虽然荧光标签蛋白在活体细胞成像中还是一个无法替代的方法，但我们还是需要用其它方法来验证荧光标签蛋白是否影响了目的蛋白的功能（图1和图3）。这些验证方法包括用标记了荧光基团的针对蛋白翻译后修饰情况的抗体检测目的蛋白的修饰情况，用knock-in实验检测细胞内外源性目的蛋白的量是否超过了内源性目的蛋白等。反过来，也可以用荧光蛋白进行免疫荧光标记的目的蛋白来验证抗体的质量（即特异性）。使用明亮、稳定的量子点可以降级免疫检测方法的检测极限，增强对多种蛋白进行检测的能力，同时也可以用于相关的电镜研究和Western blots以及ELISA一类的体外实验（表1）。但是为了让量子点能达到最佳的应用效能，我们还需要进一步提高它的靶向性与对细胞的穿透力。

荧光检测技术也可以应用于临床，比如可以检测患者细胞或活检组织里蛋白的活性，研究药物对患者体内信号通路的影响等等。荧光检测技术还非常适合用于进行高通量药物筛选工作，既可以用于生化方面的筛选工作，比如蛋白质芯片筛选，也可以用于功能方面的筛选工作，比如对活体细胞和动物进行筛选。由于荧光检测技术将高时空分辨率、对活体细胞或组织无伤害性和分子特异性等优势集于一身，因此我们可以相信，荧光检测技术必将在蛋白质网络分析和系统生物学研究领域占有重要的一席之地。

原文检索：

Ben N. G. Giepmans,Stephen R. Adams,Mark H. Ellisman,Roger Y. Tsien.(2006) The Fluorescent Toolbox for Assessing Protein Location and Function. Science, 312：217-224.

筱玥/编译

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