人骨髓间充质干细胞体外培养及与Bio-gide胶原膜复合培养的实验研究

?１６?江西医学院学报２００９年第４９卷第５期

ＡｃｔａＡｃａｄｅｍｉａ—ｅＭｅｄｉｃｉｎａｅ

Ｊｉａｎｇｘ—ｉ

２００９，Ｖｏｌ４９，Ｎｏ５

牙周治疗的最终目的是重建因牙周病而丧失的支持组织，形成新的附着性愈合Ｅｌｉ，出现于２０世纪７０年代的引导性牙周组织再生术（ｇｕｉｄｅｄ

ｔｉｓｓｕｅ

ｒｅ－

ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ，ＧＴＲ），能使因牙周病而破坏的牙周组织，包括牙骨质、牙周膜、牙槽骨再生，形成较理想的新附着［２１］，但此方法缺乏主动的诱导分化和加速生长作用［５］，对促进牙周组织的再生是有限的。随着生物医学科学的发展，组织工程技术的出现，使得牙周疾病造成的牙周组织的缺损修复成为了可能。本研究尝试应用组织工程技术，采用体外采集分离培养人骨髓间实质干细胞（ｈＭＳＣｓ），并在研究ｈＭＳＣｓ生物学特性的基础上，将ｈＭＳＣｓ与Ｂｉｏ—ｇｉｄｅ胶原膜体外复合培养，构建细胞／生物载体支架材料复合物，为今后采用ｈＭＳＣｓ作为牙周组织工程的种子细胞应用于牙周缺损的再生修复的可能性提供依据，并探讨Ｂｉｏ－ｇｉｄｅ胶原膜作为牙周组织工程支架材料的可行性。

１材料和方法

１．１主要材料

碱性磷酸酶试剂盒（上海太阳生物技术有限公司，５０７Ｎ００３），免疫组化试剂盒（中杉金桥公司，ＳＰ－９００１），ａ—ＭＥＭ培养液（美国Ｇｉｂｃｏ公司），胰蛋白酶（美国Ｓｉｇｍａ公司），小牛血清ＦＢＳ（美国Ｈｙｃｌｏｎｅ公司），淋巴细胞分离液（中国医学科学院血液学研究所，２００４１００９），肝素（Ｇｉｂｅｏ公司），Ｂ一磷酸甘油钠（Ｓｉｇｍａ公司），维生素Ｃ（Ｓｉｇｍａ公司，Ｖ０００５），地塞米松（Ｓｉｇｍａ公司，Ｈ１０５４９），Ｂｉｏ－ｇｉｄｅ胶原膜（美国Ｏｓｔｅｏｈｅａｈｈ公司）。

１．２

ｈＭＳＣｓ的分离和培养

选取年龄为１８、２５岁的健康男性志愿者５名，

在无菌条件下于髂骨髂前上棘处用一次性注射器抽取５～１０ｍＬ骨髓，在实验室内用淋巴细胞分离液分离出有核细胞进行原代细胞培养，培养液为内含１０％小牛血清、ｉ００Ｕ／ｍＬ青霉素、１００Ｕ／ｍＬ链霉素抗生素的ａ—ＭＥＭ培养基，其中成熟的有核的白

细胞自然死亡，存留能增值生长的ｈＭＳＣｓ，当原代ｈＭＳＣｓ铺满培养板底９０％左右时，用０．２５％胰蛋白酶消化传代。选取生长状态良好的第三代细胞，进行ｈＭＳＣｓ免疫组化染色。

选取生长状态良好的第三代细胞，进行体外诱导培养，所使用的成骨诱导液成分为口一ＭＥＭ培养液加入地塞米松１００

ｎｍｏｌ／Ｌ。ｐ磷酸甘油钠１０

ｎｍｏｌ／Ｌ、维生素Ｃ

５０

ｍｇ／Ｌ，再分别ｈＭＳＣｓ碱

性磷酸酶（ＡＬＰ）活性检测和ｈＭＳＣｓ体外培养矿化能力检测。

１．３

ｈＭＳＣｓ与Ｂｉｏ－ｇｉｄｅ胶原膜的复合

选取生长状态良好的第三代的ｈＭＳＣｓ，用

０．２５％胰蛋白酶消化，重悬为单细胞悬液，调整细胞浓度为５×１０６／ｍＬ，接种到预置Ｂｉｏ－ｇｉｄｅ胶原膜的２４孔培养板中，每块为１００弘Ｌ，置于３７℃、５％Ｃ０２孵箱中，行倒置相差显微镜观察。于２８ｄ将ｈＭ—ＳＣｓ／Ｂｉｏ—ｇｉｄｅ胶原膜取出。３％戊二醛及质量分数为０．０２的四氧化锇双重固定，乙醇逐级脱水，醋酸异戊酯置换，临界点干燥，金溅射喷镀，扫描电镜观

察。

２

实验结果

１）

原代ｈＭＳＣｓ，置相差显微镜观察人骨髓单

核细胞刚接种时呈圆形、椭圆状悬浮于培养基中（图１）；传代细胞接种３～４ｈ后可见部分细胞贴壁，

２４

ｈ后基本完全贴壁，细胞变成长梭形，或多角形，

增殖迅速。细胞传代２～３次，细胞自然纯化，基本未观察到上皮样细胞；３～６代细胞大小形态均一，排列一致，生长良好（图２）。选取生长状态良好的第三代的ｈＭＳＣｓ，进行ｈＭＳＣ细胞免疫化学染色，结果显示：细胞质出现棕黄色染色ＣＤ２９阳性，表明分离的ｈＭＳＣｓ具有间充质干细胞的特征；ＣＤ３４阴性证实这些细胞是非造血干细胞（图３—５）。

２）

ｈＭＳＣ碱性磷酸酶（ＡＬＰ）活性检测：使用

成骨诱导液培养的ｈＭＳＣ，胞浆中可见蓝黑色细小颗粒，细胞连成片状，染色较强（图６）。

图１

原代培养人骨髓单核细胞的细胞形态图２第３代ｈＭＳＣｓ的细胞形态

图３第３代ｈＭＳＣｓ（生物索染色ＣＤ２９）

江西医学院学报２００９年第４９卷第５期ＡｃｔａＡｃａｄｅｍｉａｅＭｅｄｉｃｉｎａｅＪｉａｎｇｘｉ２００９，Ｖｏｌ４９，Ｎｏ５?１７?图４第３代ｈＭＳＣｓ（㈣ＣＤ２９）图５第３代ｈＭＳＣｇ（免疫组化染色ＣＤ３４）图６碱性磷酸酶活性检测ｈＭＳＣｓ

３）ｈＭＳＣｓ体外培养矿化能力检测使用成骨诱导液培养的ｈＭＳＣ，细胞呈集落生长并逐渐形成黑色钙结节，随着培养时间的延长，钙结节渐增多、增大，可融合成斑片状（图７—８）。对照组细胞未见黑色钙结节。

４）选取生长状态良好的第三代的ｈＭＳＣｓ，接种于Ｂｉｏ—ｇｉｄｅ胶原膜复合培养，细胞接种２４ｈ后部分伸展开来呈纤维状。随培养时间延长，细胞数目增多，移行于材料周边，形成膜状结构，并可观察到分泌的细胞外基质（图９）。ｈＭＳＣｓ在胶原膜表面复层生长，扫描电镜观察，Ｂｉｏ－ｇｉｄｅ胶原膜表面可见粗细不等的胶原纤维，其间有一定的孔隙（图１０）。培养早期，细胞呈多角形、梭形，散在分布（图１１）。培养２８ｄ后，ｈＭＳＣｓ在胶原膜支架上密度较高，生长状态好；细胞增殖连接成复层，相互紧密排列；胞体伸出突起相互连接，其间有明显基质分泌（图１２）。

图７体外培养矿化能力检测ｈＭＳＣｓ图８培养２周后体外矿化能力检测ｈＭＳＣ８图９接种后ｈＭＳＣｓ在Ｂｉｏ－－ｇｉｄｅ

胶原膜上的生长情况

图１０扫描电镜观察接种后ｈＭＳＣｓ在图１１培养早期ｈＭＳＣｓ形态分布图１２培养２８ｄ后ｈＭＳＣｓ形态分布Ｂｉｏ－ｇｉｄｅ胶原膜上的生长情况

３讨论

牙周病治疗的最终目的是重建因牙周病而丧失的支持组织，形成新的附着性愈合‘１｜，即有新的牙骨质和牙槽骨形成，其间有新的牙周膜纤维连接。目前治疗牙周病的常用方法对牙周缺损修复有一定疗效，但在恢复牙周组织的生理结构和功能上还远未达到所期望的目标［６＿８］。

随着现代组织工程学研究不断深入，其内涵不断扩大，目前组织工程技术在骨、皮肤、软骨等领域取得一定进展，在牙周组织结构与功能性再生方面

的研究国内外尚处于起步阶段。将组织工程技术引

人骨髓间充质干细胞体外培养及与Bio-gide胶原膜复合培养

的实验研究

作者：宋莉， 曲丰江， 汪泱， 王冰， 戴芳

作者单位：南昌大学第二附属医院口腔科,南昌,330006

刊名：

江西医学院学报

英文刊名：ACTA ACADEMIAE MEDICINAE JIANGXI

年，卷(期)：2009，49(5)

被引用次数：1次

参考文献(11条)

1.Cochran D L,Wozney J M.Biological Mediators for Periodontal

Regeneration[J].Periodontol,2000,1999,19(2):40-58.

2.张蕴惠,郭淑娟,萧卓然.胶原膜引导牙周组织再生的研究、动物模型的建立及组织形态学观察[J].华西口腔医学杂志,1993,11(4):273-276.

https://www.wendangku.net/doc/5616567839.html,nger R,Vacanti J P.Tissue Engineering[J].Science,1993,260(5110):920-928.

4.Owen M E.Lineage of Osteogenic Cells and Their Relationship to the Stromal System[M]//Peck W

A.Bone and Mineral Research.Amsterdam:Elsevier,1984:1-2.

5.Beresford J N.Osteogenic Stem Cells and the Stromal System of Bone and Marrow[J].Clin

Orthop,1989,240:270-280.

6.Sherman P R,Hutchen L H Jr,Jewson L G.The Effectiveness of Subgingival Scaling and Root Pla-nning Ⅱ Clinical Responses Related to Residual Calculus[J].Periodontol,1990,61(1):9-11.

https://www.wendangku.net/doc/5616567839.html,urell L,Gottlow J,Zybutz M,et al.Treatment of Intrabony Defects by Different Surgical Procedures.A Literature Review[J].Periodontol,1998,69(3):303-313.

8.Mellonig J T.Freeze-dried Bone Allografts in Periodontal Reconstructive Surgery[J].Dent Clin North Am,1991,35(3):505-520.

9.Vogel G.Harnessing the Power of Stem Cell[J].Science,1999,283(5407):1432-1434.

10.Sanchez Ramos J,Song S,Cardozo Pelaez F,et al.Adult Bone Marrow Stromal Cells Differentiate into Neural Cell in Vitro[J].Experiment Neurology,2000,164(2):247-256.

11.鲁红,吴织芬,陈书军.狗牙周膜细胞三维立体培养的体外实验研究[J].实用口腔医学杂志,2003,19(4):304-307.相似文献(4条)

1.期刊论文谭丽思.林晓萍.刘尧.魏巍组织工程骨促进犬牙槽骨再生的体内研究-口腔医学研究2010,26(2)

目的:探讨以犬骨髓间充质干细胞( bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)为种子细胞,Bio-Oss小牛无机骨粉为支架,构建组织工程化骨,结合Bio-Gide胶原膜促进犬牙槽骨再生的可行性.方法:在3只犬的口腔里人工制作12个三壁骨缺损,每只犬的左侧为实验组,右侧为对照组.实验组:植入组织工程化骨;对照组:单纯植入Bio-Oss骨粉.手术后即刻及术后4周,8周,通过影像学和组织学方法(HE, Masson染色)检测骨缺损的再生效果.结果:术后8周

,实验组X-ray 可见缺损区新生骨骨量明显增加,切片HE染色见新生牙槽骨已充满骨缺损处,骨小梁成团状,Masson染色为红色;对照组X-ray可见骨缺损区阴影变浅,HE染色骨小梁排列凌乱,Masson染色为蓝绿色.结论:组织工程化骨促进犬牙槽骨再生是可行的.

2.学位论文谭丽思组织工程骨用于促进犬牙槽骨再生的实验研究2007

目的：

选用骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymfl stem cells，BMSCs)作为种子细胞， Bio-Oss小牛无机骨粉作为支架材料，构建组织工程化骨

，探讨应用组织工程技术，结合Bio-Gide胶原膜促进犬牙槽骨再生的可行性。

方法:

1．体外分离培养，成骨诱导扩增犬BMSCs，将第三代细胞复合Bio-Oss小牛无机骨粉，构建组织工程化骨。

2．细胞培养过程中，倒置相差显微镜观察。

3．术前3个月拔除3只犬第二前磨牙。手术时在缺牙区人工制造三壁骨缺损，然后将12个人工制造的骨缺损区随机分为2组，实验组：植入组织工程化骨，结合Bio-Gide胶原膜，间断缝合牙龈组织；对照组：单纯植入Bio-Oss骨粉，结合Bio-Gide胶原膜，间断缝合牙龈组织；实验组和对照组缝合后均放置牙周塞制剂，术后3天常规抗炎治疗，术后14天拆除塞制剂。

4．分别在术前即刻，术后2周，4周和8周进行影像学检查，术后8周做组织学检查，通过HE和Masson两种染色方法来评价牙周骨缺损的再生效果。

1、所有实验动物无一例死亡，术后饮食正常。缺损处伤口愈合良好，无红肿及感染，无移植物排出。

2、倒置相差显微镜下观察原代培养第10天的BMSCs呈漩涡状排列，铺满整个培养瓶表面，融合达70％～80％。

3、术前，观察实验组和对照组的X-ray影像，可见两组拔牙创均已完全骨性愈合，骨质密度相同．

4、术后2周，实验组和对照组X-ray无明显区别。术后4周，实验组：X-ray可见骨缺损区有新骨形成，缺损区阴影变浅，可见正常骨小梁结构，Bio-Oss骨粉部分吸收；对照组骨缺损区有少量新骨形成，边缘模糊。术后8周，实验组缺损区新生骨骨量明显增加，Bio-Oss材料已经完全吸收，缺损区被正常骨小梁结构所覆盖，密度与缺损区周围骨相接近，骨缺损区密度增高，阴影消失；对照组骨缺损区阴影变浅，可见正常骨小梁结构。

5、术后8周组织切片检查，实验组建立了正常的钙化骨结构，胶原膜结构成分已消失，新生牙槽骨己充满骨缺损处，牙槽骨骨小梁细小、多空腔且呈团状，新生牙槽骨骨化效果明显优于对照组，胶原Masson染色为红色，其钙化程度近似于正常牙槽骨；对照组新生牙槽骨尚未充满骨缺损处，牙槽骨骨小梁细小、多空腔且凌乱，虽然建立了正常的骨结构，但钙化程度极低，基本为胶原性骨结构，Masson染色为蓝绿色。

结论:

选用BMSCs作为种子细胞， Bio-Oss小牛无机骨粉作为支架材料，构建组织工程化骨，应用组织工程技术，结合Bio-Gide胶原膜促进犬牙槽骨再生是可行性的，且实验组牙槽骨的生长速度明显快于对照组。

3.期刊论文詹暶.闫福华.肖毅.Zhan Xuan.Yan Fu-hua.Xiao Yi自体骨髓间充质干细胞移植密度与Beagle犬牙

Ⅱ度根分叉病变组织修复的关系-中国组织工程研究与临床康复2008,12(16)

背景:目前临床上II度根分叉病变区牙周组织的再生仍是一项难题.目的:比较不同密度自体骨髓间充质干细胞修复II度牙根分叉病变区牙周组织缺损的能力.设计:随机对照观察实验.单位:福建医科大学附属口腔医院实验室和福州总医院动物实验科.材料:实验于2005-07/2006-09在解放军南京军区福州总医院动物实验科和福建医科大学附属口腔医院实验室完成.6只1岁半雄性Beagle犬由解放军南京军区福州总医院动物实验科提供,实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准.实验中选用Bio-Gide胶原膜和BME-10X胶原膜.方法:在犬的下颌第2,3前磨牙和第1磨牙颊侧根分叉处制备慢性II度牙根分叉病变模型.从6只18月龄的Beagle犬抽取自体骨髓间充质干细胞.应用5×108 L-1,5×109 L-1,5×1010 L-1的骨髓间充质干细胞复合BME-10X胶原膜移植治疗牙根分叉病变,表面覆盖Bi0-Gide胶原膜,单纯Bi0-Gide胶原膜组为对照组.采用OLYPUS IX 71显微照相系统和OLYSIA BioAutoCell软件计算新生牙骨质长度的百分比和新生牙槽骨面积的百分比.主要观察指标:苏木精-伊红染色观察并测量牙周组织再生(新生牙骨质长度和新生牙槽骨面积的百分比)情况.结果:对照组的新生牙骨质长度和新生牙槽骨面积的百分比分别为:(51.5±5.6)%和(27.1±7.7)%;5×108 L-1骨髓间充质干细胞组为:(84.8±8.9)%和

(30.6±7.7)%; 5×109 L-1骨髓间充质干细胞组为:(91.8±5.2)%和(68.3±11.4)%;5×1010 L-1骨髓间充质干细胞组为:(88.8±7.2)%和

(78.5±12.7)%.细胞组的新生牙骨质量与对照组相比,差异有显著性意义(P < 0.01),但各细胞组间相互比较差异无显著性意义;5×109 L-1组和5×1010 L-1组的新生牙槽骨量与 5×108 L-1组和对照组相比差异有显著性 (P < 0.05),但前两组间和后两组间比较则差异无显著性意义.结论:骨髓间充质干细胞移植能促进牙根分叉病变区的牙周组织再生,其作用与细胞的接种密度有关.

4.学位论文曲丰江人骨髓间充质干细胞体外成骨分化及与Bio-gide胶原膜复合培养的实验研究2007

目的：本实验拟研究人骨髓间充质干细胞(human mesenchymal stem cells，hMSCs)分离、培养与鉴定的方法，观察其成骨细胞表型特征，探讨其作为牙周组织工程种子细胞的可行性；将Bio-gide胶原膜与hMSCs进行体外复合培养，行形态学观察。

方法：体外分离培养hMSCs，进行形态学观察，增殖测定，细胞表面抗原检测；取生长状态的良好的第三代hMSCs，分别于不同培养条件下(实验组

：成骨诱导液；对照组：普通培养液)进行培养，检测细胞碱性磷酸酶表达及矿化能力。将hMSCs与Bio-gide胶原膜进行体外复合培养，通过倒置相差显微镜，扫描电镜进行观察。

结果：梯度密度离心法结合贴壁筛选法能获得高纯度高活性的hMSCs。经成骨诱导后可表达高水平碱性磷酸酶活性(p＜0.05)，连续培养28天左右可形成矿化结节。hMSCs可在Bio-gide胶原膜上贴附增殖，并复层生长。

结论：hMSCs 取材方便、创伤小；具有成骨分化潜能，经诱导后具有成骨细胞表型特征。hMSCs可作为牙周组织工程种子细胞来源。Bio-gide胶原膜可作为细胞生长载体，有望成为hMSCs的支架材料应用于牙周组织工程研究。

本文链接：https://www.wendangku.net/doc/5616567839.html,/Periodical_jxyxyxb200905005.aspx

授权使用：青岛大学IP账户(sdqddx)，授权号：c6c931bc-bcb2-4090-ab2b-9ea000ca6aa1

下载时间：2011年3月8日