Western Blot 实验步骤(自己总结)

Western Blot步骤

北京协和医学院 阜外心血管病医院 心外科 心血管病国家重点实验室

吴益和

一．心肌总蛋白提取（一）

——TRIzol? Reagent蛋白质的提取

1. 准备试剂：异丙醇；含0.3M盐酸胍的95%乙醇；无水乙醇； 1%SDS。

1. 含0.3M盐酸胍的95%乙醇：

盐酸胍（分子量95.53）：95%乙醇=14.3295g：500ml

2．1%SDS：

SDS：H2O=0.5g：50ml

2. 操作步骤：

1. 取沉淀DNA后剩余的上清，用异丙醇沉淀蛋白质。每使用1ml TRIzol加

1.5ml异丙醇，室温放置10分钟，2～8℃12000×g离心10分钟弃上清；

2. 准备0.3M盐酸胍（guanidine hydrochloride）的95%乙醇洗涤液；

3. 用含0.3M盐酸胍（guanidine hydrochloride）的95%乙醇洗涤蛋白质沉淀。

每使用1ml TRIzol加2ml洗涤液，室温放置20分钟（Note: .蛋白质沉淀可保存在含0.3M盐酸胍的95%乙醇中2～8℃一个月以上或-20℃一年以

上）；

4. 2～8℃7500×g离心5分钟，弃上清；

5. 重复3-4两次以上；

6. 在三次洗涤后加2ml无水乙醇到蛋白质沉淀中，涡旋混匀15秒（Note: .蛋

白质沉淀可保存在无水乙醇中2～8℃一个月以上或-20℃一年以上）；；

7. 室温下孵化20分钟；

8. 2～8℃7500×g离心5分钟，弃上清；

9. 风干蛋白质沉淀5-10分钟(可以延长时间直到满意为止)，不要干燥过度；

10.蛋白质重悬浮：

1）用1% SDS（十二烷基硫酸钠）溶解蛋白质(200 μL)，反复吸打，50℃温浴使其完全溶解；

2）2～8℃10000×g离心10分钟除去不溶物；

3）将包含蛋白质的上清转移到新的EP管中（此时分离得到的蛋白质样品可直接用于Western Blot（之前先测浓度）或-20℃保存备用）；

4）因为不同溶剂中某些蛋白质的溶解性不同，SDS溶液中蛋白质的可溶性差，如果蛋白质沉淀在SDS溶液中不可溶，那么可以选择下面的溶剂(Hummon et. al., 2007)来溶解蛋白质沉淀：

1% SDS and 62.5 mM sarkosyl（肌氨酰:裂解病毒颗粒或感染细胞的一种去污剂）at pH 8.0–8.8；

　9.5 M urea and 2% CHAPS, pH 9.1；

250mM glycerol（甘油）, 10mM TEA, and 4% CHAPS；

2% diethylamine（二乙胺）；

10M Urea（尿素）。

3. 常见问题分析：

1. 得率低：A.样品裂解或匀浆处理不彻底；B.最后得到的蛋白质沉淀未完全

溶解。

2. 蛋白质降解：组织取出后没有马上处理或冷冻。

3. 电泳时条带变形：蛋白质沉淀洗涤不充分。

要不直接用裂解液或SDS缓冲液来代替1% SDS溶解蛋白质

采用上述方法提取的蛋白，可以用lowry法或BCA法进行蛋白定量

一．心肌总蛋白提取（二）

——裂解液法提取总蛋白

1．材料

心肌：手术室活检标本

试剂：蛋白裂解液,碧云天，产品编号P0013

仪器：组织匀浆机，Tekmar

2．方法和过程：

(1)将心肌组织块（2×2×2mm）放入含有裂解液的1.5ml EP管中（裂解液含量视组织量而

定），用微量匀浆器进行冰上迅速低温匀浆，直到看不见颗粒为止。

（如果需要测磷酸化蛋白，则在裂解液中加入磷酸酶抑制剂（普利来公司），具体方法见说明书）

(2)将匀浆液移至EP管中，冰上放置10分钟，14000rpm/min，4℃，离心15分钟，取上

清，-80℃保存备用，待测浓度。

二．蛋白浓度测定

1．材料准备：

试剂：碧云天BCA蛋白浓度测定试剂盒（增强型）产品编号P0010

仪器：酶标仪（BIO-RAD 680）

2．方法步骤（见试剂盒说明书）：

(1)取1.2ml蛋白标准配制液加入到一管蛋白标准（30mg BSA）中，充分溶解后配制成

25mg/ml的蛋白标准溶液。配制后可立即使用，也可-20℃长期保存；

(2)稀释标准品：取适量25mg/ml蛋白标准，稀释至0.5mg/ml(蛋白样品在什么溶液中，标

准品也宜用什么溶液稀释。但为了简便起见，也可以用0.9%NaCl或PBS稀释标准品)。

稀释后的0.5mg/ml蛋白标准也可-20℃长期保存；

(3)配制BCA工作液：按50体积试剂A加1体积试剂B配制适量工作液，充分混匀（配

制的量视样本量而定，200μl/孔）。工作液室温24小时内稳定。

(4)加标准品：将标准品按0、1、2、4、8、12、16、20μl加入96孔板的标准品孔中（做

副孔），加标准品稀释液补足到20μl。

(5)加样品：加2μl样品到96孔板的样品孔中，加18μl PBS(最好用1%SDS或裂解液，保

持与原样本中的一致)，使总体积达到20μl。

(6)加工作液：每孔加入200μl步骤2所配制工作液。

(7)37℃静置20-30分钟。可室温放置2小时。

(8)酶标仪测定A562，540-595nm之间的波长也可接受。

(9)EXCEL绘制标准曲线，根据标准曲线计算样品的蛋白浓度。

附：倍比稀释方法

1.取8个EP tubes；

2.第1管加入25μl 0.5mg/ml蛋白标准品，其余各管加入25μl ddH2O(最好用1%SDS或裂解

液，保持与样本中的一致)；

3.向第2个tube中加25μl BSA蛋白标准品，混合均匀后从第2个tube中取25μl稀释后的

BSA到第3个有25μl ddH2O的tube中，混合均匀；再从第3个tube中取25μl第二次稀释后的BSA到第4个有25μl ddH2O的tube中；……直到第7个tube；

4.第8个管为空白孔，单加ddH2O(最好用1%SDS或裂解液，保持与样本中的一致)；

5.如此配制出稀释了1倍，2倍，4倍，8倍，16倍，32倍,64倍，空白……的蛋白标准品

溶液。

三．Western Blot用蛋白样品制备

1．材料：

5×loading buffer（普利莱公司）或4×loading buffer（Takara公司）

2．方法：

样品 40μg蛋白量 10-40μg,

我的20μg足已

4μl（20μl体系）/6μl（30μl体系）5×SDS loading buffer

或4×loading buffer 5μl（20μl体系）/7.5μl（30μl体系）上样缓冲液中含有DTT，不需要再加DTT

加ddH2O 至总体积20μl（30μl）

100℃，加热5min使蛋白变性，立即放冰中速冷，-20℃放置备用。（上样总体积一般不超过20μl，加样孔的最大限度可加30μl样品。）

四．聚丙稀酰胺凝胶电泳

1. SDS聚丙稀酰胺凝胶的配制（自制胶）

准备：玻璃板用水冲干净，直立晾干，餐巾纸擦干净。

装上玻璃板，前后推动，最后往前拉些距离，扣上开关。

槽下面的海绵条带些水，可以部分抵抗漏水。

放装有玻璃板的架子于槽上，先放下部，再靠上部，加紧。

加入水，液面稍高些，等15分钟，看是否漏水。然后拿整个槽将水倒掉，再用吸水

纸吸干玻璃板内的残余水份。

1）安装玻璃板

z玻璃板洗干净即可

z小玻璃板向前，两玻璃板间夹上spacer，拧紧螺栓固定（安装一定要平，防漏水）

z加满蒸馏水，看是否漏水，静置 15min（记录漏液体积，以胶补充）

z用窄滤纸条吸干两玻璃板间的水滴

2）按分子量配制一定浓度的分离胶（12%，体积10ml）

ddH2O 3.3ml 30%丙烯酰胺溶液 4.0ml

1.5 mol/L Tris（PH8.8）

2.5ml

10%SDS溶液 100μl

10%过硫酸铵（AP） 100μl

TEMED 4μl

z加TEMED之前，充分混匀内容物，一旦加入TEMED，快速旋动混合物。

z在两玻璃板的间隙中灌胶，每板约3.5ml，加至旁边绿色柱子的上缘（如开始有漏液

现象，则要补上漏的那部分体积）

z在胶溶液上加满ddH2O（或加无水乙醇可以消泡），室温30min（可防止氧气扩散进入

凝胶而抑制聚合反应）

附：

标准的：SDS-聚丙烯酰胺凝胶的有效分离范围

丙烯酰胺浓度（%）线性分离范围（kDa）

15 10-43

12 12-60

10 20-80

7.5 36-94

5.0 57-212

网上的：分子量范围与凝胶浓度的关系

分子量范围适用的凝胶浓度/(%)

蛋白质

<10420-30

1-4×10415-20

1-5×104-1×10510-15

1×1055-10

>5×1052-5

核酸(RNA)

<10415–20

104–1055-10

105-2×1062-2.6

3）分离胶聚合完全后倾去上层水，用窄滤纸尽可能排去凝胶上的水，再用纸巾的边缘吸

净残留液体（倾斜胶，吸水纸放于一侧洗净水分），用记号笔做一个分离胶上沿记号，以

备电泳换压。

4）按试剂配制部分给出的数值在小瓶中配置5ml/2块板的积层胶

ddH2O 3.4ml 30%丙烯酰胺溶液 830μl

1.0 mol/L Tris（PH6.8） 630μl

10%SDS溶液 50μl

10%过硫酸铵（AP） 50μl

TEMED 5μl

z加TEMED之前，充分混匀内容物，一旦加入TEMED，快速旋动混合物

z在两玻璃板的间隙中灌胶，每板约2ml

z灌好胶后立即在积层胶溶液中插入Teflon梳子，小心避免混入气泡

z再加入积层胶以充满梳子之间的空隙，室温下垂直放置30min。

等待期间拿出蛋白marker及样本放在冰中，并配制1×电泳液：400ml 5×电泳液+1600ml

ddH2O。每个电泳槽内加大约800ml电泳液，先加外槽，再加内槽。内槽必须用新的电泳液，

外槽可以用旧的电泳液（只能用2次）。

附：制备胶

1. 不同分子量需要的缓冲液：

15 kDa to 260 kDa (MOPS Buffer),

3.5 kDa to 160 kDa (MES Buffer)

2. 拿出蛋白marker及样本放在冰中，并配制1×电泳液：每次需500ml， ddH2O稀释。

3. 每个电泳槽内加大约500ml电泳液，先加内槽观察有无漏水，再加外槽。内槽必须用新

的电泳液，外槽可以用旧的电泳液（只能用2次）。

2. 上样电泳

注：上样体积＜30ul,蛋白50-100ug（我的10-40ug）

1）拔去梳子，用洗瓶加蒸馏水洗涤加样槽去除未聚合的丙烯酰胺(制备胶不用)。

2）把凝胶固定在电泳装置上，内外槽均加入1×Tris-Gly电泳缓冲液（固定凝胶时，短面玻璃朝里，制备胶则是有字方向朝外）

z每个电泳槽内加大约500ml电泳液，先加内槽观察有无漏水，再加外槽。内槽必须用新的电泳液，外槽可以用旧的电泳液（只能用2次）。

z将蛋白、marker取出放在冰上，配1× loading buffer，将20 /30 ul loading buffer加在最边上的两排孔中，起到平衡作用（10孔用全则不必这一步）。

3）用微量进样器上样，每加完一个样品换一次枪头

z Marker上样量20ul(见说明书，我的用5ul)

z蛋白上样量为20ul/30ul（我的用20ul）

4）电泳装置与电源相接，电压120V跑到底，不时观察marker位置适时停止电泳附：

自制胶先电压40V跑，当染料前沿进入分离胶后（40分钟以上），可提高电压至80V （15V/cm）。继续电泳至溴酚兰进入分离胶的底部，电泳结束，关闭电源（大约2.5~3 h 可完毕）。

五．转膜（一）

——电转膜

1. 取两个平皿，倒上ddH2O;

2. 将胶从板上取下，用ddH2O洗一次；

3. 先铺阳极板（iBlot? Anode Stack）；

4. 把胶铺在转膜板上（两块胶的话头对头摆放）；

5. 把滤纸（iBlot? Filter Paper）放在ddH2O上浸湿后，盖在胶上；

6. 再铺阴极板（iBlot? Cathode Stack）；

7. 把海绵（iBlot? Disposable Sponge）嵌在盖上；

8. 盖紧盒盖，开始转。

（预实验证明P2,6:30转膜效果是合适的）

9. 电转结束后关闭装置；

z取下硝酸纤维素膜，去离子水漂洗膜（注意：PVDF膜电转完后需立即放于去离子水中以免干燥。如果PVDF膜干燥了，在使用前，需用甲醇重新浸湿并用去离子水漂洗膜几次。将膜转入封闭液前必须确保膜是完全湿的）；

z丽春红染色5~10min，轻摇。

z蛋白带出现后，TBST洗膜，圆珠笔标出marker位置。

（硝酸纤维素膜的保存：空气干燥膜后保存膜在一个密闭的塑料袋中，室温或4度保存，不要保存在-20度，低温会导致硝酸纤维素膜变脆；

对于PVDF膜，空气干燥膜后保存膜在一个密闭的塑料袋中，室温、4度或–80度保存均可，但在使用前需用甲醇重新浸湿几秒，然后用去离子水漂洗膜几次以去处甲醇。将膜转入封闭液前必须确保膜是完全湿的）

附：

1.The PVDF membrane has higher binding capacity than nitrocellulose.The PVDF

membrane is preactivated and ready for use without any pretreatment with alcohols.

2.Programs

3. Use the following parameters for blotting based on the gel type that you use.

1）The P3 Program is suitable for the transfer of proteins with molecular weights ranging from 30–150 kDa, but changes in the Run Time may be necessary for transfer of larger or smaller proteins.

2）Proteins >150 kDa migrate more slowly, and require more time to transfer. If your protein of interest is in this size range, it may be necessary to use a Run Time of 8–10 minutes for your transfer.

3）Small proteins <30 kDa migrate more rapidly during electrophoretic separation, and consequently require less time to transfer from the gel matrix to the membrane. If your protein of interest is in this size range, you may need to reduce the Run Time to 5–6 minutes for your transfer.

4）You may need to optimize the blotting parameters (volts or time) based on your initial results.

注意事项：

Performing an equilibration step prior to transfer.

To improve the transfer of high-molecular weight proteins from mini- or midi- NuPAGE? or Tris-Glycine gels, equilibrate the gel in 100 mL of Equilibration Buffer (2X NuPAGE? Transfer Buffer containing 10% methanol and 1:1000 NuPAGE? Antioxidant) for 10 minutes at room temperature on a shaker prior to transfer. After equilibration, use the gel for transfer using the iBlot? Device as described in this manual. Note: The equilibration step may increase the blow through of low molecular weight proteins.

五．转膜（二）

——半干转膜

1. 取两个平皿，分别放滤纸和纤维素膜。

2. 剪4张×2与凝胶大小相同的滤纸（约与名片大小相等），浸入电转缓冲液；剪2张硝酸

纤维素膜，浸入电转缓冲液5min以上（剪滤纸，纤维素膜都要戴手套）。

3. 按如下方法安装转移装置

1）电泳槽上取下放置SDS-聚丙稀酰胺凝胶的玻璃，撤去玻璃。

2）切去上层积层胶，在凝胶的右上角切一个标志。

3）取一个大玻璃板，依次放置4张电转缓冲液浸泡过的滤纸，对齐排除气泡。

4）把凝胶放置在硝酸纤维素膜上，放于滤纸上按凝胶的大小剪齐硝酸纤维素膜和滤纸。5）在凝胶上放置4张滤纸，剪齐。

6）在电转仪依次放置：胶在上，膜在下。自上而下的顺序，依次是滤纸、胶、膜、滤纸（注：边缘一定要对齐，防止短路）。

4．将转移装置安装在电转移设备上，盖好盖子，接通电源，15V，15min电转（若蛋白分子量大，可适当提高电压和延长时间，一般分子量的蛋白电压16V转膜16min，而高分子量比如>80的，建议18V，16分钟）（他们的：25V，30分钟，具体需根据预实验调整）

5. 电转15min 后关闭装置；

z取下硝酸纤维素膜，去离子水漂洗膜；

z丽春红染色5~10min，轻摇。

z蛋白带出现后，TBST洗膜，圆珠笔标出marker位置。若不继续做，则冰箱保存。

六．Western blotting

试剂准备：

1. 10×TBS缓冲液1L

Tris碱24.2g

NaCl 80g

定容1L

浓HCl调节PH到7.6

2. 1×TBST缓冲液

1×TBS (pH 7.6) 1L

Tween20 1000μl 快速搅拌3~4h。

3. 封闭液

脱脂奶粉5g

TBST 100ml 混匀，4℃保存4. 抗体洗脱缓冲液1L（不好使）

Tris 1.2g

Nacl 8.77g

ddH2O 800ml

HCl调PH至2.3，定容1000ml（浓HCI达到1ml左右）5. 丽春红

丽春红S 1g

三氯乙酸15g

磺基水杨酸15g

定容到50ml（10×储液）

用时5 ml 稀释成50 ml

具体步骤：

1．封闭硝酸纤维素膜的免疫球蛋白结合位点

将硝酸纤维素膜放入大平皿中，加入适量的5%牛奶封闭液（100ml TBST+ 5g 牛奶），室温平缓摇动1h~2h。

2．一抗和靶蛋白的结合（santa 抗体：1:500安全些）

剪一大小合适的杂交袋，取出滤膜，在滤纸上沾几下（PVDF膜需保持湿的状态），放入杂交袋中，加入2ml封闭液稀释2ul一抗（稀释倍数约1：1000）（如果配置一抗的液体是脱脂奶则封闭完后直接接一抗），而后用封口机封闭在袋内，赶尽气泡，4℃冰箱摇晃过夜（指12小时）。

3. 取出滤膜用TBST漂洗3次，每次10min（室温，平缓摇动）。

4. 将膜放入杂交袋内，加适量封闭液（脱脂奶粉）稀释的辣根过氧化物酶标记二抗（预实

验结果1：10000）

5. 尽可能排除气泡，室温2hr，平缓摇动。

6. TBST漂洗3次，每次10 min，平缓摇动。

7. 将0.3ml/张膜的A液和0.3ml/张膜的B液加入铝箔纸包裹Eppendorf管（起避光作用），

室温放置10min使其与室温一致

8. 提前准备压片板，里面沾两层保鲜膜，将硝酸纤维素膜放中间，A液和B液混匀用200ul

枪均匀加在硝酸纤维素膜上，室温下孵化5min，吸除过度的液体，而后将膜盖上，将夹关闭，拿机器曝光

9. 核对marker，如正确则将膜用抗体洗脱液洗 10min×3次。

10.如果不再接抗体则放于冰箱保存（具体温度见前面），如果继续接其他抗体则再用TBST

洗10min×3次，再封闭后，接一抗4℃冰箱摇晃过夜。

注：电转后的膜可放冰箱保存（具体温度见前面）。

一抗处理后的膜也可以放冰箱保存（具体温度见前面）。

（硝酸纤维素膜的保存：空气干燥膜后保存膜在一个密闭的塑料袋中，室温或4度保存，不要保存在-20度，低温会导致硝酸纤维素膜变脆；

对于PVDF膜，空气干燥膜后保存膜在一个密闭的塑料袋中，室温、4度或–80度保存均可，但在使用前需用甲醇重新浸湿几秒，然后用去离子水漂洗膜几次以去处甲醇。将膜转入封闭液前必须确保膜是完全湿的）

七．洗脱抗体

1. 冰箱取出膜，抗体洗脱液洗3×10min。

2. TBST洗3×10min

3. 丽春红染色

4. 蛋白带出现后，TBST洗膜，圆珠笔标出marker位置。若不继续做，则冰箱保存

5. 封闭硝酸纤维素膜的免疫球蛋白结合位点，后面同前了

注：每次显影完毕后，即刻洗脱抗体，冰箱保存或者直接结合其它一抗，一张膜可以结合3个一抗抗体。

常见问题及分析

1. 配胶缓冲液系统对电泳的影响？

在SDS－PAGE不连续电泳中，制胶缓冲液使用的是Tris－HCL缓冲系统，浓缩胶是pH6.7，分离胶pH8.9；而电泳缓冲液使用的Tris－甘氨酸缓冲系统。在浓缩胶中，其pH环境呈弱酸性，因此甘氨酸解离很少，其在电场的作用下，泳动效率低；而CL离子却很高，两者之间形成导电性较低的区带，蛋白分子就介于二者之间泳动。由于导电性与电场强度成反比，这一区带便形成了较高的电压梯度，压着蛋白质分子聚集到一起，浓缩为一狭窄的区带。当样品进入分离胶后，由于胶中pH的增加，呈碱性，甘氨酸大量解离，泳动速率增加，直接紧随氯离子之后，同时由于分离胶孔径的缩小，在电场的作用下，蛋白分子根据其固有的带电性和分子大小进行分离。

所以，pH对整个反应体系的影响是至关重要的，实验中在排除其他因素之后仍不能很好解决问题的情况，应首要考虑该因素。

2. 样品如何处理？

根据样品分离目的不同，主要有三种处理方法：还原SDS处理、非还原SDS处理、带有烷基化作用的还原SDS处理。

1）还原SDS处理：在上样buffer中加入SDS和DTT（或Beta巯基乙醇）后，蛋白质构象被解离，电荷被中和，形成SDS与蛋白相结合的分子，在电泳中，只根据分子量来分离。一般电泳均按这种方式处理，样品稀释适当浓度，加入上样Buffer，离心，沸水煮5min，再离心加样。

2）带有烷基化作用的还原SDS处理：碘乙酸胺的烷基化作用可以很好的并经久牢固的保护SH基团，得到较窄的谱带；另碘乙酸胺可捕集过量的DTT，而防止银染时的纹理现象。100ul样品缓冲液中10ul 20％的碘乙酸胺，并在室温保温30min。

3）非还原SDS处理：生理体液、血清、尿素等样品，一般只用1％SDS沸水中煮3min，未加还原剂，因而蛋白折叠未被破坏，不可作为测定分子量来使用。

3. SDS-PAGE电泳凝胶中各主要成分的作用？

聚丙烯酰胺的作用：丙烯酰胺与为蛋白质电泳提供载体，其凝固的好坏直接关系到电泳成功与否，与促凝剂及环境密切相关；

制胶缓冲液：浓缩胶选择pH6.7，分离胶选择pH8.9，选择tris－HCL系统，TEMED 与AP：AP提供自由基，TEMED是催化剂，催化自由基引起的聚合反应进行；十二烷基硫酸钠（SDS）：阳离子去污剂，作用有四：去蛋白质电荷、解离蛋白质之间的氢键、取消蛋白分子内的疏水作用、去多肽折叠。

4. 提高SDS-PAGE电泳分辨率的途径？

聚丙烯酰胺的充分聚合，可提高凝胶的分辨率。建议做法：待凝胶在室温凝固后，可在室温下放置一段时间使用。忌即配即用或4度冰箱放置，前者易导致凝固不充分，后者可导致SDS结晶。一般凝胶可在室温下保存4天，SDS可水解聚丙烯酰胺。

一般常用的有氨基黑、考马斯亮蓝、银染色三种染料，不同染料又各自不同的染色方法，具体可参照郭尧君编著的《蛋白质电泳技术手册》P82-103。

5.“ 微笑”（两边翘起中间凹下）形带原因？

主要是由于凝胶的中间部分凝固不均匀所致，多出现于较厚的凝胶中。

处理办法：待其充分凝固再作后续实验。

6. “皱眉”（两边向下中间鼓起）形带原因？

主要出现在蛋白质垂直电泳槽中，一般是两板之间的底部间隙气泡未排除干净。

处理办法：可在两板间加入适量缓冲液，以排除气泡。

7. 为什么带出现拖尾现象？

主要是样品融解效果不佳或分离胶浓度过大引起的。

处理办法：加样前离心；选择适当的样品缓冲液，加适量样品促溶剂；电泳缓冲液时间过长，重新配制；降低凝胶浓度。

8. 为什么带出现纹理现象？

主要是样品不溶性颗粒引起的。

处理办法：加样前离心；加适量样品促溶剂。

9. 什么是“鬼带”，如何处理？

“鬼带”就是在跑大分子构象复杂的蛋白质分子时，常会出现在泳道顶端（有时在浓缩胶中）的一些大分子未知条带或加样孔底部有沉淀，主要由于还原剂在加热的过程中被氧化而失去活性，致使原来被解离的蛋白质分子重新折叠结合和亚基重新缔合，聚合成大分子，其分子量要比目标条带大，有时不能进入分离胶。但它却于目标条带有相同的免疫学活性，在WB反应中可见其能与目标条带对应的抗体作用。

处理办法：在加热煮沸后，再添加适量的DTT或Beta巯基乙醇，以补充不足的还原剂；或可加适量EDTA来阻止还原剂的氧化。

10. 为什么溴酚蓝不能起到指示作用？

我们在实验中常会遇到溴酚蓝已跑出板底，但蛋白质却还未跑下来的现象。主要与缓冲液和分离胶的浓度有关。

处理办法：更换正确pH值的Buffer；降低分离胶的浓度。

11. 为什么电泳的条带很粗？

电泳中条带很粗是常见的事，主要是未浓缩好的原因。

处理办法：适当增加浓缩胶的长度；保证浓缩胶贮液的pH正确（6.7）；适当降低电压；

12. 为什么电泳电压很高而电流却很低呢？

这种现象一般初学者易出现。比如电压50v以上，可电流却在5mA以下。主要是由于电泳槽没有正确装配，电流未形成通路。包括：a.内外槽装反；b.外槽液过少；c.电泳槽底部的绝缘体未去掉（比如倒胶用的橡胶皮）。

处理办法：电泳槽正确装配即可。

13. 浓缩胶与分离胶断裂、板间有气泡对电泳有影响吗？

这主要出现在初学者中，一般对电泳不会有太大的影响。前者主要原因是拔梳子用力不均匀或过猛所致；后者是由于在解除制胶的夹子后，板未压紧而致空气进入引起的。

14. 凝胶时间不对，或慢或快，怎么回事？

通常胶在30MIN-1H内凝。如果凝的太慢，可能是TEMED，APS剂量不够或者失效。APS应该现配现用，TEMED不稳定，易被氧化成黄色。 如果凝的太快，可能是APS和TEMED用量过多，此时胶太硬易裂，电泳时易烧胶。

15. 电泳时间比正常要长？

可能由于凝胶缓冲系统和电级缓冲系统地PH选择错误，即缓冲系统地PH和被分离物质的等电点差别太小，或缓冲系统的离子强度太高。

westernblot详细图解

Western免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测的方法。对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。 与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。 经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以

检测电泳分离的特异性目的基因表 达的蛋白成分。该技术也广泛应用 于检测蛋白水平的表达。 实验材料蛋白质样品 试剂、试剂盒丙烯酰胺SDS Tris-HCl β-巯基乙醇 ddH2O 甘氨酸Tris 甲醇PBS NaCl KCl Na2HPO4 KH2PO4 ddH2O 考马斯亮兰乙酸脱脂奶粉硫酸镍胺H2O2 DAB试剂盒 仪器、耗材 电泳仪电泳槽离心机离心管硝酸纤维素 膜匀浆器剪刀移液枪刮棒 实验步骤一、试剂准备 1. SDS-PAGE试剂：见聚丙烯酰胺凝胶电泳实验。 2. 匀浆缓冲液：1.0 M Tris-HCl(pH 6.8) 1.0 ml；10%SDS 6.0 ml；β-巯基乙醇0.2 ml；ddH2O 2.8 ml。 3. 转膜缓冲液：甘氨酸2.9 g；Tris 5.8 g；SDS 0.37 g；甲醇200 ml；加ddH2O定容至1000 ml。

(完整word版)WB原理、步骤及总结,推荐文档

实验原理 蛋白质印迹是把电泳分离的蛋白质转移到固定基质上，然后利用抗原抗体反应来检测特异性的蛋白分子的技术，包括三个部分：SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳，蛋白质的电泳转移，免疫印迹分析。 SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳主要用于测定蛋白质相对分子质量，SDS是阴离子去污剂，能断裂蛋白质分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏其高级结构。SDS与大多数蛋白质的结合比为1.4:1，由于SDS带有大量的负电荷，与蛋白质结合时掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差别，使各种蛋白质带有相同密度的负电荷，形似长椭圆棒，蛋白迁移率与蛋白质相对分子质量的对数呈线性关系。因此，利用相对分子质量标准蛋白所作的标准曲线，可以求得未知蛋白的相对分子质量。 电泳后蛋白质分子嵌在凝胶介质中，探针分子很难通过凝胶孔，将蛋白质从凝胶转移到固定基质上可以对蛋白质进行免疫检测分析。方法有两种：①水平半干式转移即将凝胶和固定基质似三明治样夹在缓冲液浸湿的滤纸中间，通电10~30min可完成②垂直湿式转移即将凝胶和固定基质夹在滤纸中间，浸在转移装置的缓冲液中，通电2~4h或过夜可完成。固定基质通常有硝酸纤维素膜、聚偏二氟乙烯膜和尼龙膜。 蛋白质转移到固定化膜上之后，通过蛋白质染料如丽春红S检测膜上的总蛋白，或用考马斯亮蓝检测凝胶上的蛋白剩余量，以验证转移是否成功。用抗体作为探针进行特异性的免疫反应检测抗原蛋白，分为4步：①用非特异性、非反应活性分子封阻固定化膜上未吸附蛋白的自由结合区，以防止作为探针的抗体结合到膜上，出现检测时的高背景②固定化膜用专一性的一抗温育，使一抗与膜上的抗原蛋白分子特异性结合③酶标二抗与一抗特异结合④加入酶底物，适当保温，膜上便可见到颜色反应，检测出抗原蛋白区带。 主要溶液 10%分离胶 水 3.3mL、30% 丙烯酰胺混合液 4.0mL、1.0mol/L Tris（pH8.8）2.5mL、10% SDS 0.1mL、10%过硫酸铵0.1mL、TEMED 0.004mL 5%浓缩胶 水 2.7mL、30%丙烯酰胺混合液0.67mL、1.0mol/L Tris0.5mL、10%SDS0.04Ml/10%过硫酸铵0.04mL、TEMED0.004mL 1×Tris –甘氨酸电泳缓冲液 Tris碱3.03g、甘氨酸18.77g、SDS 1g，用去离子水定容至1L 2×SDS凝胶加样缓冲液 Tris-HCl（pH6.8） 100mmol/L，β-巯基乙醇10%，10%甘油，0.01%溴酚蓝，10%SDS 转移缓冲液 Tris 2.45g，甘氨酸11.25g，甲醇100mL，加去离子水至1L TBST Tris 1.21g NaCl 8.77g，Tween-20 1 mL，加去离子水至1L Stripping 1.3mL Tris （pH 6.8），4mL10%SDS，140μlβ-巯基乙醇，用水定容到20mL 实验步骤 1 SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳

Western超详细实验步骤

Western实验步骤 1. 电泳(Electrophoresis) （1）SDS-PAGE凝胶配制 SDS-PAGE凝胶进行配制，配方试剂去离子水，Arc-HCL(29:1)，10%APS，SDS,TEMED。 一般按分子大小配胶，现实验分离胶配12%-15%的胶，浓缩胶10%的胶。 配胶步骤： 1.清洗玻璃板，装好（注意不要漏即玻璃板要对齐）。 2.按比例配分离胶（8ml-10ml） 3.加水压胶，待分离胶凝固后（可见有分离胶与水有分隔线，一般凝固时间30分钟-1小时左右），吸走上层水面 4.按比例配浓缩胶（3ml-4ml），加入分离胶上层，插入梳子，（注意别有气泡），待凝。（如果今日不上样可以放入4°C冰箱） 注意：玻璃板要洗得干净；玻璃板要装好，不要漏；制胶过程中，一定要充分混匀，而且避免有气泡；（2）样品处理 1.准备无菌EP管，向EP管内加入样品蛋白质体积的1/4体积的SDS缓冲液（5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液，现样品加 3.5ul），之后加入相应蛋白样品（要制冰，蛋白质样品要放置在冰上），充分吹打混匀 2.100℃水浴加热5分钟，以充分变性蛋白。 3.12000r离心5分钟。 （3）上样与电泳 1.将玻璃板装入电泳槽中，加电泳缓冲液至泳槽的的2/3左右 2.蛋白质样品冷却到室温后，直接上样到SDS-PAGE胶加样孔内即可，样品两边加蛋白质Maker(6ul)（注意上样蛋白质顺序，一定不要弄错）。 3.通常把电压设置在100V，然后设定定时时间为100分钟（一般为90-120分钟）。设置定时可以避免经常发生的电泳过头。 通常电泳时溴酚蓝到达胶的底端处附近即可停止电泳，或者可以根据预染蛋白质分子量标准的电泳情况，预计目的蛋白已经被适当分离后即可停止电泳。（为了避免电泳过头，最好是在电泳设定时间的提前30分钟观察电泳） 注意：上样时尽量避免样本被上漏出孔外；注意电泳时间的把握；最重要的是一定要记录上样顺序，必要时记录在本子上。 3.转膜(Transfer) 1.物品准备，甲醇，转膜缓冲液，滤纸，转膜槽，玻璃皿3个，制冰。 2.取下胶板，用专门的板将玻璃板分离（务必不要将胶弄破，动作轻些，从下面和上面分离玻璃板），切适合大小的胶（不要切掉MAKER）。 3.用专门的板将胶转入事先放有转膜缓冲液的皿中，记录胶的顺序，剪与胶同等大小的滤纸和转膜纸PVDF膜，PVDF膜要放入甲醇中浸15秒（一般1-2分钟），胶要切角做标记（不要切到maker）,一般一个切三个角，一个切一个角，记录顺序 4.铺膜，PVDF膜铺在胶上，在PVDF膜上铺三层滤纸，然后胶的对侧面铺三层滤纸即可（滤纸要大于等PVDF膜，PVDF膜要大于等胶），赶尽气饱。 5.再将铺好的膜胶滤纸，转入转膜夹中，有PVDF膜这面放在正极侧（即无色透明夹这面），再将夹子放入转膜槽里（电极不要放错，蛋白质带负电的）

WB实验步骤

Western blotting实验步骤 1．蛋白质的样品制备： 取心肌组织50mg，待组织块自行溶解，用滤纸吸去其表面水分，将组织块放入玻璃匀浆器球状部位，用组织剪尽量将其剪碎，将剪碎的心肌组织放入玻璃匀浆器的杆状部，按1mlRIPA+10ulPMSF/100mg心肌组织的比例加入RIPA和PMSF（先加RIPA再加PMSF），将玻璃匀浆器插入冰中，匀浆约30分钟。 将心肌组织匀浆转移到离心管中，4℃12000g离心5分钟，收集上清（如有粘稠物进一步用超声处理），样品分装冻存于-20℃备用。 2 .测定蛋白浓度： 2.1 按50：1配置BCA工作液。 2.2 10ulC液（蛋白标准）+90ulPBS液稀释成0.5mg/ml的蛋白标准液。 2.3 分别以0、1、2、4、8、12、16、20ul将蛋白标准液加入96孔板的第1~8标准孔中，在其他样品孔中加入10ul待测样品。 2.4 分别加PBS定容至20ul。 2.5 各孔中加入200ulBCA工作液，室温放置2小时。 2.6 用酶标仪测定蛋白浓度：测定A562，依标准曲线算出蛋白浓度。 3 SDS-PAGE电泳： 3.1 制胶: 按比例配制分离胶，缓缓地摇动溶液，使激活剂混合均匀，将凝胶溶液平缓地注入两层玻璃极中，再在液面上小心注入一层水，以阻止氧气进入凝胶溶液中，静置40min。同前按比例配制浓缩胶，但混匀溶液时不要过于剧烈以免引入过多地氧气。吸去不连续系统中下层分离胶上的水分，连续

平稳的注入凝胶溶液，然后小心插入梳子并注意不得在齿尖留有气泡，静制60min以上以保证完全聚合。 3.2 预电泳：将聚合好的凝胶安置于电泳槽中，小心拔去梳子，加入电泳缓冲液后低电压10-20V的预电泳20-30min。（目的是清除凝胶内的杂质，疏通凝胶孔径以保证电泳过程中电泳的畅通）。 3.3 样品准备：首先计算上样体积，然后按样品：上样buffer=4：1的比例加入上样bufer混匀，沸水煮10分钟，冰上5分钟。 3.4 加样：预电泳后依次加入标准品（Marker）和待分析样品。（加样时间要尽量短，以免样品扩散，可在未加样的孔中加入等量的样品缓冲液避免边缘效应。每个泳道加5ul。 3.5 电泳：加样完毕，选择80V恒压进行电泳，电泳直至溴酚蓝染料前沿到达两胶交界处（一般约20分钟），更换至100V恒压电泳，电泳直至溴酚蓝染料前沿下至凝胶末端处，即停止电泳（一般约为1小时20分钟）。 4．转膜： 4.1 切胶：将电泳完毕的胶完整的放在盛有电转液的玻璃皿中，将目的蛋白所在区域切下来，测量其长宽，并记录。 4.2 剪膜和滤纸：按胶的尺寸剪膜和滤纸（滤纸长宽较凝胶小0.5~1mm，PVDF 膜长宽较凝胶大0.5~1mm），滤纸浸入盛有电转液的玻璃皿中10秒钟，膜放入盛有10%甲醇的玻璃皿中10秒钟，然后将两者都放入盛有去离子水的玻璃皿中3分钟，进一步放入盛有电转液的玻璃皿中3分钟。 4.3 向电转槽中倒入部分电转液，将海绵浸入。按如下顺序制作“三明治”（注意避免两边滤纸相互接触，以免发生短路）。从正极到负极按如下顺序排列：

WesternBlot原理和操作方法(全)讲解

Western Blot 原理和操作方法（全） Western Blot 工作原理 蛋白质的电泳分离是重要的生物化学分离纯化技术之一,电泳是指带电粒子在电场作用下,向着与其电荷相反的电极移动的现象.根据所采用的支持物不同,有琼脂糖凝胶电泳,淀粉凝胶电泳,聚丙烯酰胺凝胶电泳等.其中,聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)由于无电渗作用,样品用量少(1-100μg),分辨率高,可检出10-9-10-12mol 的样品,凝胶机械强度大,重复性好以及可以通过调节单体浓度或单体与交联剂的比例而得到孔径不同的凝胶等优点而受到广旱挠τ? SDS-PAGE是最常用的定性分析蛋白质的电泳方式,特别是用于蛋白质纯度检测和测定蛋白质分子量. PAGE能有效的分离蛋白质,主要依据其分子量和电荷的差异,而SDS-PAGE(SDS 变性不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳)的分离原理则仅根据蛋白质的分子量的差异,因为SDS-PAGE的样品处理液是在要跑电泳的样品中假如含有SDS和巯基乙醇(2-ME)或二巯基赤藓醇(DTT),其可以断开半胱氨酸残基之间的二硫键,破坏蛋白质的四级结构,SDS是一种阴离子表面活性剂即去污剂,它可以断开分子内和分子间的氢键,破坏蛋白质分子的二级及三级结构,并与蛋白质的疏水部分相结合,破坏其折叠结构,电泳样品假如样品缓冲液后,要在沸水中煮3-5分钟使SDS与蛋白质充分结合形成SDS-蛋白质复合物,SDS-蛋白质复合物在强还原剂巯基乙醇存在时,蛋白质分子内的二硫键被打开而不被氧化,蛋白质也完全变性和解聚,并形成榛状结构,稳定的存在于均一的溶液中,SDS与蛋白质结合后使SDS-蛋白质复合物上带有大量的负电荷,平均每两个氨基酸残基结合一个SDS分子,这时各种蛋白质分子本身的电荷完全被SDS掩盖,远远超过其原来所带的电荷,从而使蛋白质原来所带的电荷可以忽略不计,消除了不同分子之间原有的电荷差别,其电泳迁移率主要取决于亚基分子质量的大小,这样分离出的谱带也为蛋白质的亚基. 样品处理液中通常加入溴酚蓝染料, 溴酚蓝指示剂是一个较小的分子,可以自由通过凝胶孔径,所以它显示着电泳的前沿位置,当指示剂到达凝胶底部时,即可停止电泳. 另外样品处理液中也可加入适量的甘油或蔗糖以增大溶液密度,使加样时样品溶液可以沉入样品加样槽底部. 重要参数 ①聚丙烯酰胺凝胶(PAG)制备原则:由于孔径的大小取决于单体和双体丙烯酰胺在凝胶中的总浓度(T)以及双体占总浓度的百分含量即交联度(C)决定的,因而制胶之前必须首先知道这两个参数.一般可以由下述公式计算: T%=(a+b)/m*100%; 和C%=a/(a+b)*100% 其中: a=双体(bis)的重量;b=单体(arc)的重量;m=溶液的体积(ml) ②当分析一个未知样品时,常常先用7.5%的标准凝胶制成4-10的梯度凝胶进行试验,以便选择理想的胶浓度.如果蛋白质的分子量已知,可参考下表选择所需凝胶浓度: 蛋白质分子量范围(Da) 适宜的凝胶浓度(%) <104 20-30

Western操作步骤

Western-Blot 操作流程 （一）组织中总蛋白的提取 用干净的剪刀剪取绿豆大小的组织块于1.5ml的EP管中，加入200uLRIPA裂解液(含PMSF，比例为97：1：1：1)，用杵子研磨3-4min, 段事先在酒精里浸泡至少30min，用之前用滤纸吸干酒精，） 20-30s,每隔5min 后在 4℃下12000rpm 离心 5min，取上清分装于 1.5mlEP管中并置于-80℃冰箱保存。 （二）BCA法蛋白含量的测定 (1) 从-20℃取出 1mg/ml BSA，室温融化后，备用。 (3)以上步骤完成后，在所有加样的孔里各加上200uLBCA蛋白浓度测定试剂（按试剂A：试剂B=50：1的比例配置），然后置于37℃水浴锅30min后取出。 (4)酶标仪测定OD值。 (5)EXCEL表格制作标准曲线，按照标准曲线计算各样本的蛋白浓度。 （三）稀释蛋白及蛋白变性 如果计算出的样本的蛋白浓度偏高，需要用RIPA裂解液将蛋白稀释（一般将蛋白浓度稀释至5-10ug/uL）;稀释完后取10-30uL的样本蛋白置于新的1.5mLEP管中，加入新EP管中总体积1/4体积的上样缓冲液，置于99-100℃的干式恒温器中加热5-10min,使蛋白变性。（注意：将EP管的盖子盖紧，插入加热器的大圆孔中）煮过的蛋白置于-20℃冰箱保存。 （四）制作SDS电泳胶 ⑴清洗玻璃板，双蒸水冲洗晾干后，根据厂家说明安装玻璃板。 ⑵配置10%的分离胶 配方：H2O2 4.0ml 30%丙烯酰胺液 3.3ml 1.5mol/l Tris （ PH8.8） 2.5ml 10%SDS 100ul 10%过硫酸胺 100ul TEMED 4ul ⑶分离胶溶液中加入 TEMED 以及 10%过硫酸胺后需立即混匀（防止未灌胶就发生凝固），将混合液立即加入玻璃板内，距梳子下缘约 lcm 处即可，蒸馏水封顶，待凝胶完全聚合（约30min）后，倒去双蒸水。 ⑷制备5%的浓缩胶 配方；H2O2 3.4ml 30%丙烯酰胺液 0.83ml 1.5mol/l Tris （ PH6.8） 0.63ml 10%SDS 50ul

(完整版)WesternBlot(免疫印迹法)实验方法步骤

Western Blot(免疫印迹法)实验方法步骤 发布日期:2008-8-25 热门指数:4360 Western Blot(免疫印迹法) 主要包括以下4个基本步骤： n 样品制备 n 电泳分离 n 蛋白的膜转移 n 免疫杂交与显色――蛋白检测 溶液和试剂 n 1X 磷酸盐缓冲液(PBS) n Modified RIPA buffer Tris-HCl: 50 mM, pH 7.4 ; NP-40: 1% ;Na-deoxycholate: 0.25% ;NaCl: 150 mM ;EDTA: 1 mM ;P MSF: 1 mM ;Aprotinin, leupeptin, pepstatin: 1 microgram/ml each ;Na3VO4: 1 mM ;NaF: 1 mM n 1X SDS 样品缓冲液 62.5 mM Tris-HCl (pH 6.8 于25°C), 2% w/v SDS, 10%甘油,50 mM DTT, 0.01% w/v溴酚蓝 n 转移缓冲液 25 mM Tris base, 0.2 M 甘氨酸, 20%甲醇(pH 8.3) n 10X Tris缓冲盐(TBS) 准备1L 10X TBS: 24.2 g Tris base, 80 g NaCl;用1N HCl调pH为7.6 n 脱脂奶粉或BSA n 甲醇 n TBS/T缓冲液 1X TBS, 0.1% Tween-20 n 封闭缓冲液（TBS/T）

1X TBS, 0.1% Tween-20加5% w/v脱脂奶粉或BSA n 一抗的稀释 1X TBS, 0.1% Tween-20 加5% BSA (多抗)或5%脱脂奶粉(单抗) Note:一般来说, BSA被推荐用于多克隆抗体，脱脂奶粉用于单克隆抗体，这样可得到较高的信噪比。抗体的稀释度参考抗体说明书或根据实验确定。 n 预染的蛋白质Marker，可用于监测转膜的效率 样品制备 原始样品可为细胞、组织、培养上清、免疫沉淀或亲和纯化的蛋白，以下为定性检测目的蛋白时细胞样品的处理方法，其余的样品制备方法参阅相关文献。 1．培养细胞或药物处理。 2．弃培养基，用1X PBS漂洗细胞2次，去尽残留培养基。 3．加入1X SDS样品缓冲液(6-well plate, 100 μl /w或75 cm2plate, 500-1000 μl/瓶)，刮落细胞，转移到Ep管。注意：冰上操作。 4．超声10~15秒剪切DNA以减低样品粘性。 5．煮沸样品5 minutes。 6．离心12000g, 5 min，取上清。 7．电泳分离：上样15μl~20 μl 至SDS-PAGE 胶(10 cm x 10 cm)电泳。 如要定量检测某蛋白的表达水平，应用RIPA裂解液(1 ml per 107cells/100 mm dish/150 cm2flask)裂解细胞，收集裂解液至离心管中，在振荡器上混匀4～15min，14000g离心15min（4℃），弃沉淀，用B radford法或其它蛋白质测定方法测定上清中蛋白浓度以调整上样体积和上样量，进行Western杂交时还需设置内或外参照，通常用beta-actin。 注意：一般上样20~30 μg已足够，如待检蛋白为低丰度蛋白，可加大上样量至100μg，但电泳条带易拖尾，可制备亚细胞组份或采用更敏感的检测方法。 电泳分离（参照SDS-PAGE电泳方法） 转膜 杂交膜的选择是决定Western blot成败的重要环节。应根据杂交方案、被转移蛋白的特性以及分子大小等因素，选择合适材质、孔径和规格的杂交膜。用于Western blot的膜主要有两种：硝酸纤维素膜(NC) 和PVDF膜。NC膜是蛋白印迹实验的标准固相支持物，在低离子转移缓冲液的环境下，大多数带负电荷的蛋白质会与膜发生疏水作用而高亲和力的结合在一起，但在非离子型的去污剂作用下，结合的蛋白还可以被

westernblot实验详细步骤(1)

Western Blot实验技术一、制胶 SDS-PAGE分离胶配方表 1、检查制胶器是否漏水，吸干玻璃中水分

2、配置分离胶，加入玻璃板中（注意：不能有气泡和杂物），距离玻璃上口1.5mL停止加胶。 3、再加ddH2O或异丁醇水封除去气泡，凝胶后倒掉水，吸干水到浓缩胶插梳。 二、上样 1、先在内槽加满电泳液才可以拔梳子。 2、拔梳子时垂直向上拔出，不可左右摇晃梳子。 3、拔完梳子后观察梳子孔，是否有缺口和歪，用针头拨正。 4、上样时从左到右依次上样。 5、若上样组不多时，左右第一孔不加样。 6、要预留Marker的上样孔。 三、电泳 四、转膜

PVDF膜即聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride）是蛋白质印迹法中常用的一种固相支持物。PVDF膜是疏水性的，膜孔径有大有小，随着膜孔径的不断减小，膜对低分子量的蛋白结合就越牢固。 （转膜缓冲液：需4度预冷，现配现用，不能放太久。） 1、转印滤纸：全胶长8.5cm，宽5.5cm，需剪裁成7层滤纸，压平后约3mm。需在转膜缓冲液中平衡浸泡备用。 2、海绵垫：在转膜液中平衡浸泡备用。 3、PVDF膜：剪裁8.5cm*5.5cm ，需在甲醇中浸润2min（活化膜上正电基团），然后在转膜缓冲液中平衡浸泡备用。 4、凝胶：凝胶也需要在预冷的转膜转膜缓冲液中平衡浸泡3－5分钟。否则在转膜过程中会出现皱缩，导致出现转移的条带变形。 三明治夹心法：负极（黑）-海绵垫-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-海绵垫-正极（白） 转膜时间：通电恒流，60V，一个槽100mA左右，1h

（注意：在操作过程中用玻棒赶走气泡。 装置转膜仪时注意黑对黑（负对负），白对红（正对正）。 装置运行时需冰浴。） 五、封闭 在进行抗体杂交之前，需要先对转印膜进行封闭，以防止抗体对非转印蛋白区域的非特异性吸附。 封闭一般采用异源性蛋白质或去污剂，本实验室常用的有5%BSA，10%脱脂奶等，至于选择哪一类封闭液，首先应考虑与检测目的相适应（做l酪氨酸磷酸化时不推荐non-fat milk 封闭）。 1、将脱脂奶粉封闭液（1xTBST:脱脂奶粉=20mL：2g一块膜用量。牛血清蛋白、5%BSA 效果更好）倒好。 2、将PVDF膜取出放入封闭液中，盖子改好。 3、封膜一般常温1-2小时即可，也可4℃封闭过夜。 六、一抗 抗体反应主要采用间接法: 即先加入未标记特异性一抗与膜上抗原结合后，再加入标记的二抗进行杂交检测，标记二

western blot实验步骤

Western bolt 一、实验目的 通过实验了解western blot技术的原理和操作。 二、实验原理 SDS-PAGE是最常用的定性分析蛋白质的电泳方式,特别是用于蛋白质纯度检测和测定蛋白质分子量。 PAGE能有效的分离蛋白质,主要依据其分子量和电荷的差异,而SDS-PAGE的分离原理则仅根据蛋白质的分子量的差异。 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS（十二烷基硫酸钠），SDS会与变性的多肽，并使蛋白带负电荷，由于多肽结合SDS的量几乎总是与多肽的分子量成正比而与其序列无关，因此SDS多肽复合物在丙稀酰胺凝胶电泳中的迁移率只与多肽的大小有关，在达到饱和的状态下，每克多肽可与1.4g去污剂结合。当分子量在15KD到200KD之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：logMW=K-bX，式中：MW为分子量，X为迁移率，k、b均为常数，若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。 硝酸纤维素膜(nitrocellulose filter membrane，简称NC膜)，在胶体金试纸中用做C/T线的承载体，同时也是免疫反应的发生处。NC膜是生物学试验中最重要的耗材之一。 第一抗体就是能和特异性抗原特异性结合的蛋白。第二抗体是能和抗体结合，即抗体的抗体，其主要作用是检测抗体的存在，放大一抗的信号。 化学发光HRP底物（辣根过氧化物酶底物，也常被称为ECL试剂）是目前Western blot检测中最为灵敏的试剂。显影液的A液主要成分为鲁米诺（Luminol）及发光增强剂，B液主要成分为过氧化物溶液。二抗上含有HRP（辣根过氧化物酶），可以催化A液和B液反应发光。 三、实验器材 1.电泳槽，胶板架子 2.转膜仪 3.NC膜 4.电泳电源 5.滤纸 6.摇床 7.X射线摄影暗匣 8.X射线胶片 9.塑料薄膜 四、实验试剂 1.runningbuffer 5xrunningbuffer(1L) Tris 15.1g

蛋白印迹——western-blot-实验流程及注意事项

蛋白印迹——Western blot 实验流程及注意事项 各种凝胶电泳方法可以直接了解蛋白的某些性质如迁移率、电荷、大小、丰度以至蛋白的亲疏水性等。此外，特异染色方法可用于识别不同种类的蛋白质。Western blot技术大大扩展了凝胶电泳后识别和鉴定蛋白的可能性。这一技术首先将电泳分离后的蛋白质条带或斑点从凝胶介质转移到固相支持膜上，然后用特异性配体进行检测。特异性抗体和凝集素等已被广泛应用检测印迹膜上的蛋白。印迹技术还常常作为电泳分离后用化学方法（如蛋白氨基端序列分析等）鉴定蛋白的一个重要步骤。 一、聚丙烯酰胺凝胶电泳（Polyacrylamide gel electrophoresis, PAGE或SDS-PAGE） 聚丙烯酰胺凝胶电泳简称为PAGE（Polyacrylamide gel electrophoresis），是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的一种常用电泳技术。聚丙烯酰胺凝胶由单体丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺聚合而成，聚合过程由自由基催化完成。催化聚合的常用方法有两种：化学聚合法和光聚合法。化学聚合以过硫酸铵（AP）为催化剂，以四甲基乙二胺（TEMED）为加速剂。在聚合过程中，TEMED催化过硫酸铵产生自由基，后者引发丙烯酰胺单体聚合，同时甲叉双丙烯酰胺与丙烯酰胺链间产生甲叉键交联，从而形成三维网状结构。

PAGE根据其有无浓缩效应，分为连续系统和不连续系统两大类，连续系统电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷和分子筛效应。不连续系统中由于缓冲液离子成分，pH，凝胶浓度及电位梯度的不连续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应，分子筛效应，还具有浓缩效应，因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者佳。不连续体系由电极缓冲液、浓缩胶及分离胶所组成。浓缩胶是由AP催化聚合而成的大孔胶，凝胶缓冲液为pH6.7的Tris-HCL。分离胶是由AP催化聚合而成的小孔胶，凝胶缓冲液为pH8.9 Tris-HCL。电极缓冲液是pH8.3 Tris-甘氨酸缓冲液。2种孔径的凝胶、2种缓冲体系、3种pH值使不连续体系形成了凝胶孔径、pH值、缓冲液离子成分的不连续性，这是样品浓缩的主要因素。 实验步骤 1.配制分离胶5ml（配方见图1）； 2.将液体用1ml移液器加入玻璃板（从玻璃板的边缘加入，速度适中，尽量不 要产生气泡）； 3.用去离子水压胶（利用重力作用把胶压平，否则如果有气泡，胶就不平了， 影响电泳效果。注意上面盖一保鲜膜，防止液体挥发）； 4.大约1第二天一早配制堆积胶）， 5.倒掉玻璃板上面的水并用滤纸吸干，加入堆积胶，并插入梳子； 6.约1小时后堆积胶凝固，把玻璃板转移到电泳装置并加紧（防止漏液）； 7.将电泳装置内加入电泳缓冲液并观察是否漏液； 8.拔掉梳子，用微量注射器冲洗上样孔，加入和上样缓冲buffer混合变性的蛋 白；①蛋白上样量：20-50μg；②上样缓冲液：加入5×SDS 上样缓冲液至终浓度为1×；③上样最大体积：根据梳子孔径和玻璃板的距离而定，一般我们用的上样最大体积在30ul左右；④蛋白变性：上样前要将样品于沸水中煮5-10min 使蛋白变性。可以使用PCR仪进行变性，99℃5分钟，加快速度，这样就不用将水煮沸了，同时在水中煮蛋白样品有下面弊端：a. EP 管容易炸开，样品丢失；b. 容易进水，使样品体积增加，超过电泳最大上样量； 9.在电泳槽中加入电泳缓冲液； 10.恒压80V 30分钟，100V 2小时左右，溴酚蓝跑到底即可（电泳时间可以根 据自己目的蛋白的具体条件设置，一般4～5 h，电压为40V 较好，也可用60V。）；

Westernblot基本操作步骤

W e s t e r n b l o t基本操作步骤 一、细胞蛋白的提取 弃去培养基，加入预冷的PBS洗一遍，加入的RIPA裂解液（含1mM PMSF(100×)，每10ml加蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂各一片，六孔板每孔150-250μl，60mm×15mm 培养皿300-400μl，），于冰上裂解约5分钟，裂解总液12000rpm离心10 min。取上清，用BCA法测定蛋白浓度。用于western blot的蛋白样品取一定量加4×loading buffer，10×reducing，再用裂解液补齐到所需上样体积。离心，使蛋白沉底。将EP管于沸水中煮5min，变性，之后再离心后准备上样。 二、BCA法测蛋白浓度操作步骤 将蛋白标准配制溶液溶解蛋白标准（BSA），配制成5mg/ml的蛋白标准溶液，10μl 分装，-20℃冷冻保存。 完全溶解蛋白标准品，取10μl用PBS稀释至100μl，使终浓度为0.5mg/ml。 据样品数量，按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B(50:1)配制适量BCA工作液，充分混匀。BCA工作液室温24小时内稳定。 将标准品按0, 1, 2, 4, 8, 12, 16, 20μl加到96孔板的标准品孔中，加稀释标准品的溶液补足到20μl。 加适当体积样品到96孔板的样品孔中（可以通过预实验摸索稀释倍数），加PBS 到20μl。 各孔加入100μl BCA工作液，37℃放置30分钟。 测定580nm条件下吸光度。根据标准曲线计算出蛋白浓度。 三、Western blot基本操作步骤 1、溶液配制： ①Runnig Buffer(1×)：SDS Runnig Buffer（20×）50mL，加MiliQ水至1L； ②Transfer Buffer(1×): Transfer Buffer(10×)100mL,甲醇200mL（20%，v/v），加MiliQ水至1L； ③TBST缓冲液 1M Tris·HCl（pH7.6）：60.5g Tris-base，加入约30ml浓盐酸，调PH至7.6，加MiliQ 水至500ml。 TBS缓冲液（10×）：1M Tris·HCl 100ml+80g NaCl加MiliQ水1L TBST缓冲液（1×）：TBS缓冲液（10×）100ml+0.5ml Tween-20（0.05%，v/v），加MiliQ水至1L。 ④封闭液：5% BSA（5g/100ml，称取1g BSA至20ml TBST，充分混匀溶解） 2、样品准备与加样 ①用4×SDS loading buffer, 10×reducing与蛋白质样品混合，并将此EP 管放在水浴锅中沸水煮5min，使蛋白质变性。 ②将预制胶固定到电泳装置中，并在装置中加满Runnig Buffer(1×)，内槽加入0.5mL 抗氧化剂，小心拔下梳子； ③向上样孔中加入一定体积的蛋白样品（总蛋白量20μg以上）。向marker孔中加入2.5μl marker（按照实验要求设定marker量），向空白孔中加入一定体积的加样缓冲液(loading buffer)。注意采用相同（或相近）的上样体积，以保证蛋白的各带宽度相同。防止体积较大的上样孔中的蛋白质将向相邻的泳道扩散。 3、电泳

western-blot-全过程-详细步骤复习课程

w e s t e r n-b l o t-全过程-详细步骤

一：提蛋白： 1.PBS洗2遍，加RIPA 80-100ul（含10xcooktail）。 2.在冰上刮到离心管中，在冰上裂解20-30min。 3.4度离心，13000rpm、10-15min（准备新的离心管、配BCA 200ul/每孔(A:B=50：1)、96孔板加 PBS(2个对照组20ul，实验组18ul)）。 4.取上清转移到新离心管中，记住转移的体积。 5.96孔板中每孔加2ul蛋白液。 6.每孔加200ulA/B混合液。 7.37度半小时。 8.测浓度以及标化用一起在libo文件夹找模板，最后得到每组需要加的RIPA以及loding buffer，还 有标化后的浓度。562波长0.046斜率（实验组值-对照组值）/斜率=浓度浓度最好在4-8ug/ul最好，跑胶时就可以只加10ul蛋白液（蛋白含量40-80ug） 9.加好对应的RIPA以及loding buffer后，煮蛋白5-15min，-20度保存。 二：跑胶 1. 1.0玻板，洗干净 2.配制10%或者12%分离胶一块胶需要5ml 3.灌分离胶，在分离胶上层灌无水乙醇 4.配制5%浓缩胶 2块胶需要4ml 5.待分离胶干后，灌浓缩胶，插梳子 6.待胶干后，将胶及玻板一起放入电泳槽，拔梳子，倒入1*running buffer（上腔灌满，下腔过电线 丝） 7.预电泳，100v，10-15min 8.加样（蛋白样品及marker）10ul，marker 5ul 9.60v 10-20min，之后100-110v 三：转膜

1.配transfer buffer ，用10*transfer buffer 稀释10倍，并加20%甲醇 2.transfer buffer浸泡海绵、滤纸 3.pvdf膜，甲醇泡1分钟，清水洗2次，泡在transfer buffer里20min 4.胶取出，在transfer buffer里泡10min 5.黑胶白膜（一层海绵，2层滤纸） 6.转膜100v，1—1.5h（黑对黑，冰板，在冰里跑） 四：封闭、一抗、二抗 1．5%脱脂奶粉（pbst溶）1h 37度 2.一抗4度12h 3.pbst洗膜，3次，每次10min 4.二抗（1:5000）1h 37度 5. pbst洗膜，3次，每次10min 6.显影剂A和B各300ul PBST：1000ml’PBS+1mltween 5%脱脂奶粉：100mlPBST+5g脱脂奶粉 10*running buffer：tris 30.3g 甘氨酸 144.1g sds 10g 加水至1000ml 10*transfer buffer：tris 30.3g 甘氨酸 144.1g 加水至1000ml 1* transfer buffer：100ml10*transfer buffer 200ml甲醇加水至1000ml

Western blot实验操作步骤

Western blot实验步骤 一、制备蛋白样品（单层贴壁细胞总蛋白提取） 1.倒掉细胞培养液,加3ml预冷的PBS洗涤细胞，重复两次，弃掉PBS 后将细胞培养瓶置于冰上。 2.裂解液RIPA(强)1ml +PMSF10ul(100:1),两者混匀后加入培养瓶中裂解细胞，冰上裂解30min,为使细胞充分裂解,培养瓶要经常来回摇动。 3.裂解完后，用细胞刮将细胞刮于一侧（动作要快），转移至ep管中. 4.4度，12000rpm,离心5min.离心后取上清至新的ep管中，用于后续实验（-80保存） 常用蛋白收样：倒掉细胞培养基后，预冷PBS洗涤细胞2次，弃去，再加入1ml PBS，用细胞刮轻轻刮取细胞，转移至1.5ml ep管中，12000rpm，离心5min，尽量吸净上清，沉淀于-80保存，用于后续实验。融化蛋白样品，加入RIPA+PMSF细胞裂解液（200ul/ep管），充分混匀，冰上裂解20min，4度离心，5min ，12000rpm，小心吸取上清至新的ep管中。 二、蛋白浓度测定(BCA法) BCA(碧云天)蛋白浓度测定试剂盒灵敏度高，检测浓度下限达到25ug/ml，最小检测蛋白量达到0.5ug，待测样品体积为1-20ul。在50-2000ug/ml浓度范围内有较好的线性关系。 标准蛋白BSA浓度：5mg/ml (-20保存),完全溶解蛋白标准品，取10ul 稀释至100ul，使终浓度为0.5mg/ml(ug/ul)。蛋白样品在什么溶液中，

标准品也宜用什么溶液稀释。但为了简便起见，也可以用0.9%NaCl 或PBS稀释标准品。 1.配置BCA工作液 A液： B液= 50 :1 ，混匀 A液+B液=200ul (每个样本) 样本数量： 7个标准品 + N 个待测蛋白样本 2.先将每孔加入200ul BCA工作液，再加入蛋白样本。（96孔板）, 总体积为10ul.待测蛋白样本先10倍稀释。 3.37度，温箱中孵育30min。562nm波长，测OD值。待测蛋白样品浓度在50-2000ug/ml浓度范围内有较好的线性关系。 4.根据所测样品的OD值，绘制标准曲线。根据标准曲线即可计算样本相应的蛋白含量，除以样本稀释液总体积（10ul）,再乘以样本稀释倍数，即为样本的实际浓度（ug/ul） 5.蛋白定量后，以最小蛋白浓度为标准，将各组蛋白样本调至相同浓度（ddH2O补齐） 绘制标准曲线：X轴为蛋白质量，Y为OD值 插入—XY散点图,选中图上一点，右键，添加趋势线—选项（显

最详细的WesternBlot过程步骤详解

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Western Blot详解(原理、分类、试剂、步骤及问题解答) Western免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。 本文主要通过以下几个方面来详细地介绍一下Western Blot技术: 一、原理 二、分类 i.放射自显影 ii.底物化学发光ECL ECF iv.底物DAB呈色 三、主要试剂 四、主要步骤 五、实验常见的问题指南 1.参考书推荐 2.针对样品的常见问题 3.抗体 4.滤纸、胶和膜的问题 的相关疑问 6.染色的选择 7.参照的疑问

8.缓冲液配方的常见问题 9.条件的摸索 10.方法的介绍 11.结果分析 一、原理 与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。 二、分类 现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色，体同水平和实验条件的是用第一种方法，目前发表文章通常是用底物化学发光ECL。只要买现成的试剂盒就行，操作也比较简单，原理如下（二抗用HRP标记）：反应底物为过氧化物+鲁米诺，如遇到HRP，即发光，可使胶片曝光，就可洗出条带。

WB的原理、操作及注意事项

WB的原理、操作及注意事项 原理： 通过电泳区分不同的组分，并转移至固相支持物，通过特异性试剂（抗体）作为探针，对靶物质进行检测，蛋白质的Western 印迹技术结合了凝胶电泳的高分辨率和固相免疫测定的特异敏感等多种特点，可检测到低至1?5ng （最低可到10- 100pg）中等大小的靶蛋白。 一、抗原的选择和制备 A：样品的制备 1 组织： 组织的处理方法：组织洗涤后加入3倍体积预冷的PBS0C研磨，加入5X STOFbuffer , 180W6mins , 0C 超声波破碎，5000rpm,5mins 离心，取上清。加入B -ME（9.5ml 加入0.5ml）, 溴酚蓝（9.5ml加入0.5ml ）煮沸10min，分装后于-20 C保存，用时取出，直接溶解上样。 2 细胞： 细胞的处理方法：离心收集细胞或者直接往细胞培养瓶内加入 5 x STOPbuffer，收集， 180W6mins , 0C超声波破碎，5000rpm,5mins 离心，取上清。加入B -ME（9.5ml 加入0.5ml）, 溴酚蓝（9.5ml加入0.5ml ）煮沸10min，分装后于-20 C保存，用时取出，直接溶解上样。3 分泌蛋白的提取（特例）： 直接收集分泌液，加入B -ME、溴酚蓝制样。 B:蛋白的定量方法及影响蛋白定量原因 1. 双缩脲法： 双缩脲法是第一个用比色法测定蛋白质浓度的方法。在需要快速，但不很准确的测定中，常用此法。硫铵不干扰显色，这对蛋白质提纯的早期阶段是非常有利的。双缩脲法的原理是Cu2+与蛋白质的肽键，以及酪氨酸残基络合，形成紫蓝色络合物，此物在540nm波长处有最大吸收。双缩脲法常用于0.5g/L ?10g/L 含量的蛋白质溶液测定。干扰物有硫醇，以及具有肽性质缓冲液，如Tris、Good缓冲液等。可用沉淀法除去干扰物，即用等体积10%^的三 氯醋酸沉淀蛋白质，然后弃去上清液，再用已知体积的1mNaOH溶解沉淀的蛋白质进行定量 测定。 2. Lowry 法： 此法是双缩脲法的进一步发展。他的第一步就是双缩脲反应，即Cu++与蛋白质在碱性 溶液中形成络合物，然后这个络合物还原磷钼磷-磷钨酸试剂（福林-酚试剂），结果得到深 蓝色物。此法比双缩脲法灵敏得多，适合于测定20mg/L?400mg/L 含量的蛋白质溶液。其干扰物质与双缩脲法相同，而且受他们的影响更大，硫醇和许多其他物质的存在会使结果严重偏差。另外要注意的是，加入福林试剂时要特别小心，试剂只在酸性pH环境中才稳定，上 述提到的还原反应只有在pH10时才发生，因此，福林试剂加入到碱性的Cu2+-蛋白质溶液 中时，必须立刻搅拌，以使磷钼酸-磷钨酸试剂在未被破坏之前能有效地被Cu2+-蛋白质络 合物所还原。 3. 紫外吸收法： 大多数蛋白质在280nm波长处有特征的最大吸收，这是由于蛋白质中有酪氨酸，色氨酸和苯丙氨酸存在的缘故，因此，利用这个特异性吸收，可以计算蛋白质的含量。如果没有干扰物质的存在，在280nm处的吸收可用于测定0.1?0.5mg/ml含量的蛋白质溶液。部分纯化的蛋白质常含有核酸，核酸在260nm波长处有最大吸收。有核酸时，所测得的蛋白质浓度必须作适当校正，一般按下述公式粗略计算： M 白虜浓皮（m”/mi）—1 ” 55A”? - 0.76 \ m 280 260

western步骤

1、组织蛋白的提取 取上述用于Mn含量测定中另外4只大鼠剩余的纹状体组织置于2ml EP管中，用干净的剪刀将组织块尽量剪碎，加400μl单去污剂裂解液（含PMSF）于超声器中进行裂解，然后置于冰上。几分钟后再超声数秒再置于冰上，要重复几次使组织尽量碾碎。裂解30min后，即可用移液器将裂解液移至1.5ml离心管中，然后在4℃下12000rpm离心5min，去上清分装于新的离心管中并置于-20℃保存。 2、蛋白含量的测定 （1）制作标准曲线 从-20℃取出1mg/ml BSA，室温融化后，备用。取96孔板，按下表加入各种试剂。混匀后，室温放置2min。在酶标仪上比色分析，测量OD值。 表2，标准曲线的制备 0μg 2.5μg 5.0μg10.0μg20.0μg40.0μg 1mg/mlBSA - 2.5μl 5.0μl10.0μl20.0μl40.0μl 0.15mol/L NaCl 100μl97.5μl95.0μl90.0μl80.0μl60.0μl G250考马斯亮蓝溶液1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml （2）检测样品蛋白含量 ①取96孔板，实验用各孔加入4℃存储的考马斯亮蓝溶液1ml。室温放置30min，后即可用于测蛋白。 ②其中一孔加0.15molNaCl溶液100μl做空白对照，其余个孔加95μl 0.15molNaCl溶液和5μl 0.15molNaCl待测蛋白样品，混匀后静置2min，在酶标仪上比色分析，在595nm处测量OD值。 ③绘制标准曲线，测得的结果是5μl样品含的蛋白量。 3、SDS-PAGE电泳 （1）干净玻璃板对齐后放入夹中卡紧。然后垂直置于架上准备灌胶。 （2）制备分离胶并灌胶：配置8ml 10%分离胶，3.2ml ddH2O，2.0ml 1.5mol/L Tris·HCl分离胶缓冲液（pH8.8），2.72ml 30%丙烯酰胺溶液，80μl 10%SDS，80μl 10%APS（过硫酸铵），16μl TEMED。