食品酶学综合性实验
实验1 菠萝蛋白酶的提取、初步分离纯化及活性测定
【目的和要求】
1. 了解酶分离纯化的一般程序;
2. 掌握硫酸铵沉淀法、透析法分离提取菠萝蛋白酶的基本原理和方法;
3. 熟悉蛋白质含量测定、菠萝蛋白酶活力测定等实验原理和方法。
【实验原理】
1.建立有效的酶纯化程序应考虑的原则
(1)利用酶在分离纯化上最有利的特性;
(2)尽早使用一种选择性好的方法;
(3)选择交换能力高的层析技术作为第一步层析;
(4)不要连续使用相同的纯化方法;
(5)将各层析步骤连接起来,使前一步得到的样品适用于下一步层析;
(6)在造成酶被稀释的步骤后来要用浓缩酶的方法;
(7)要使每步过程的分辨能力呈递增趋势;
(8)每步纯化过程后,通过量体积,酶活力和蛋白质浓度测定,监测纯化的进程。
2.菠萝蛋白酶简介
菠萝蛋白酶(Bromelain,EC 3.4.22.3)简称菠萝酶,是从凤梨属植物菠萝中提取的一组复合的半胱氨酸巯基蛋白水解酶。在食品工业中菠萝蛋白酶作为一种食品添加剂,能分解蛋白质、肽、酯和酰胺等,可用于肉质嫩化、水解蛋白、啤酒澄清、干酪生产等。在医药上它可以治疗水肿及多种炎症。
1891年Mercaro于菠萝的汁中首先发现。菠萝蛋白酶属于糖蛋白,是由巯基蛋白酶和非蛋白酶组分构成的复杂复合物,因含有一个不稳定的游离巯基,所以菠萝蛋白酶极易被氧化而使其酶活下降。菠萝蛋白酶的相对分子质量大约为33 000DW,等电点9.55,最适pH在7.1左右,在偏酸环境下酶活下降较快,碱性环境能延缓失活。菠萝蛋白酶的
温度的最稳定范围是55℃~65℃。金属盐离子中NaCl、KCl对酶活的影响不是很大,维生素C、半胱氨酸、硫代硫酸钠、2-巯基乙醇是菠萝蛋白酶的稳定剂,,EDTA能通过螯合对酶活有影响的金属离子而保护菠萝蛋白酶,有机溶剂中甲醇、乙醇、乙二醇对酶活损失较大。
3.菠萝蛋白酶的粗分离
(1)盐析分离
盐析法是粗分离蛋白质的重要方法之一。在稀盐溶液中,蛋白质的溶解度随盐浓度的增加而升高,这种现象称为盐溶。但当盐浓度增加到一定量时,其溶解度又逐渐下降,直到某一浓度时便从溶液中沉淀出来,这种现象即为盐析。利用盐析作用可使不同蛋白质从溶液中析出从而实现分离。这是因为蛋白质是亲水胶体,在高浓度的中性盐影响下脱去水化层,同时,蛋白质分子所带的电荷被中和,结果蛋白质的胶体稳定性遭到破坏而沉淀析出。经透析或用水稀释时又可溶解,故蛋白质的盐析作用是可逆过程。盐析不同的蛋白质所需中性盐浓度与蛋白质种类及pH有关。分子量大的蛋白质(如球蛋白)比分子量小的(如白蛋白)易于析出。改变盐浓度,使得不同分子量的蛋白质分别析出。用于盐析的中性盐通常有硫酸铵、硫酸钠和硫酸镁等。由于硫酸铵的溶解度大而温度系数小(在25℃时,溶解度为767g/L;在0℃时,溶解度为697g/L),分离效果好,能保持蛋白质的天然构象,且价廉易得,以硫酸铵最为常用。不同蛋白质盐析时所需盐浓度不同,调节盐浓度可适当地将不同的蛋白质分开。如鸡蛋清中的球蛋白在50%饱和度硫酸铵溶液中沉淀,清蛋白100%饱和硫酸铵中沉淀。硫酸铵的饱和度可从附录的“硫酸铵饱和度计算表”中查找,计算所需添加的硫酸铵量。
(2)透析和超滤
透析和超滤是利用蛋白质分子不能透过半透膜,而小分子可以自由透过的性质,使蛋白质与小分子物质分开。透析是将待提纯的蛋白质溶液装在半透膜的透析袋里,扎紧袋口放在蒸馏水或缓冲溶液中进行。透析时,需不断更换透析外液,直到透析袋内小分子物质降低至内外平衡为止。超滤是利用压力或离心力,借助超滤膜将不同分子质量物质分离的技术。超滤膜是由丙烯晴、醋酸纤维、硝酸纤维、尼龙等高分子聚合物制
成的多空薄膜,截留的颗粒直径为2~20nm,相当于相对分子质量1 000~5×105.超滤技术不仅使蛋白质得以分离纯化,还可以达到浓缩的目的。
4.菠萝蛋白酶活性测定
酪蛋白是一种蛋白质,它被菠萝蛋白酶降解生成的酪氨酸在紫外光区280nm处有最大吸收,且光吸收值与含量成正比,符合Beer定律。根据测定的280nm处的吸收值,可判定菠萝蛋白酶的酶活性。
【实验仪器和用品】
1.实验仪器
电子天平、恒温水浴锅、电磁搅拌器、酸度计、可见紫外分光光度计(配石英比色杯和玻璃比色杯)、冰箱、高速离心机、台式天平(离心平衡用)。
2.实验用品
(1)以组为单位的用品
大试管18mm×200 mm(10支)、试管架(2个)、烧杯(50mL×1,100mL×2,200mL×1)、滴管(2支)、玻璃棒(2支)、移液管(5mL×1,1mL×2,0.1mL×1,0.2 mL×1)、漏斗(3个)、量筒(100mL×1)、研钵、白瓷板、纱布、滤纸、蒸馏水瓶、洗耳球、标签纸、橡皮筋。
(2)全班共用的用品
试剂瓶(1000mL×7,250mL×3,60mL×20)、烧杯(1000mL×4)、塑料烧杯(2000mL×2)、量筒(500mL×2,1000mL×2)、广泛pH试纸、剪刀、电炉和锅、蒸馏水容器、透析袋(截留相对分子质量8 000~14 000)。
【实验材料及试剂】
1. 实验材料
新鲜菠萝(3个)。
2.试剂配制
(1)盐析粗提液
℃ 0.1mo1/L pH 7.8磷酸缓冲液配制(PBS)(配4 000mL):称取65.166g Na2HPO4·2H2O (或131.108g Na2HPO4·12 H2O)5.305g NaH2PO4·2H2O,加蒸馏水溶解,定容至4000mL。℃ 0.01mo1/L pH 7.8磷酸缓冲液配制(PBS)(配4 000mL):称取6.517g Na2HPO4·2H2O (或13.111g Na2HPO4·12 H2O)0.531g NaH2PO4·2H2O,加蒸馏水溶解,定容至4000mL。
(2)酶活力测定试剂
℃1%酪蛋白(进口分装)(配100mL):称1g酪蛋白,溶于100ml0.1mol/L PBS(PH7.8),于40-50o C水浴溶解,不停搅拌,约需1-2 h才能完全溶解。
℃激活剂[含20mmo1/L半胱氨酸-盐酸盐、1mmo1/L EDTA-Na2 (乙二胺四乙酸二钠)]:用0.1mo1/L pH 7.8磷酸缓冲液配制,配制100mL,现配现用。
℃10%三氯乙酸(TCA):称20g三氯乙酸,用蒸馏水溶解并定容至200mL。
(3)透析袋的处理
新买的透析袋,裁剪成所需大小,在蒸馏水中煮沸30min,取出用蒸馏水漂洗干净,即可使用。
【实验步骤】
1. 菠萝蛋白酶的粗酶提取
称取菠萝皮材料30g,将菠萝皮在清水中洗净,沥干,切成小段后置于超高速搅拌机中,加入约60mL预冷的0.1mo1/L pH 7.8 PBS,持续搅拌10~15min至粉碎,搅拌完成后用4层纱布过滤,得到滤液后,用冷冻离心机于4°C 3000rpm离心6min,弃沉淀,即得到菠萝蛋白酶粗提液,测定粗提液的体积、蛋白质含量和酶活性。
2. 盐析
根据附录的“硫酸铵饱和度计算表”,按30%硫酸铵饱和度计算在上述酶提取液中需添加的固体硫酸铵量,称取固体硫酸铵于研钵中,研磨呈粉末,慢慢小量分次向酶提取液中添加固体硫酸铵,边加边搅拌,使溶液最终硫酸铵饱和度为30%,放置于冰水混合物(4℃)30min 后,酶蛋白沉淀析出,4°C 4000rpm离心10min,收集沉淀,加入0.1mo1/L pH 7.8 PBS约15mL至完全溶解,测定其体积、蛋白质含量和酶活性。
3.透析
将溶解液装入2.5 cm×8cm透析袋(预先将透析袋在蒸馏水中煮沸30min)中,于500mL 烧杯中,在磁力搅拌器搅拌下用蒸馏水透析,15min换水一次,换水3~4次后,检查SO42-是否已被除净(检查的方法是:取2mLBaCl2溶液放入一支试管,滴加2~3滴透析外液至试管中,若出现白色沉淀,表示SO42- 未除净,若无沉淀出现,表示透析完全)。若透析液有沉淀,将透析液用滤纸过滤,测定过滤液的体积、蛋白质含量和酶活性。
4.酶活力测定方法
取2支试管,设置一支为实验对照,三支为平行样品。取0.1mL酶液,加入0.9mL 激活剂,加入37℃预热的1%酪蛋白溶液1mL,准确反应10min,加入10%三氯乙酸3mL反应终止酶反应。对照管先加入10%三氯乙酸溶液,后加酪蛋白溶液,其它与测定管相同。离心(3000r/min,5min)或过滤,清液于280nm波长下测定光吸收值。酶活单位定义:在上述条件下,每10min增加0.001个光吸收值为1个酶单位(U)。
实验步骤按照表格中完成。
5.蛋白质含量测定方法
将酶液稀释至一定程度,采用考马斯亮兰G-250法测定溶液中可溶性蛋白的含量(参照附录1)。
【结果计算】
1.蛋白质含量计算参照附录1。
2.酶活力计算
最后酶活结果取3次重复实验的平均值。
酶液活力(U/mL)=×稀释倍数
3.酶比活的计算
酶比活(U/mg· 蛋白)=酶活力/酶蛋白质含量
4.酶纯化过程中回收率计算
回收率(%)=(纯化酶总活力/粗酶液总活力)×100
= 〔(纯化酶活力×纯化酶液体积)/(粗酶活力×粗酶体积)〕×100
5.酶纯化倍数的计算
纯化倍数=纯化酶比活力/粗酶比活力
6.分析及讨论
将测定的数据整理计算分别填入下表,并菠萝蛋白酶的分离纯化效果进行分析和讨论。
菠萝蛋白酶分离纯化表
步骤总体积
(mL)总蛋白质含
量(mg)
总活力
(U)
比活力
(U/mg· 蛋
白)
回收率
(%)
纯化倍数
粗提取
盐析
透析
【注意事项】
1.酶活性测定时的反应时间一定要准确,并严格控制好反应时的温度。
A280nm
2.高速离心前一定要平衡好离心管。
3.注意透析袋是否破裂,透析时间长时要置于4℃下进行。
【思考题】
1.如何防止酶在分离纯化过程中发生变性失活。
2.常见的酶活性表示方法有那些(如:U/mL酶液;U/mg蛋白质; U/g干重或鲜重;
U/g 酶粉等)?它们各有什么含义,适用哪些场合?
3.蛋白质的沉淀作用还有哪些方法?哪些变性了?哪些没有变性?
4.实验中硫酸铵盐析为什么要选择0%~30%饱和度?
【参考书目】
1.李建武,萧能,余瑞元等,生物化学实验原理和方法,北京,北京大学出版社,1994
2.余冰宾.生物化学实验指导.北京:清华大学出版社,2003
3.赵亚华,高向阳.生物化学与分子生物学实验技术教程.北京:高等教育出版社,2005附录1
实验考马斯亮蓝G250染色法测定蛋白质含量
【目的和要求】
掌握考马斯亮蓝G250法测定蛋白质含量的原理和方法。
【实验原理】
考马斯亮蓝G250测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。考马斯亮蓝G250在游离状态下呈红色,当它与蛋白质结合后变为青色,前者最大光吸收在465nm,后者在595nm。在一定蛋白质浓度范围内(0~1000μg/mL),蛋白质-色素结合物在波长595nm处的光吸收与蛋白质含量成正比,故可用于蛋白质的定量测定。蛋白质和考马斯亮蓝G250结合在2min左右的时间内达到平衡,完成反应十分迅速,其结合物在室温下1h内保持稳定。该反应非常灵敏,可测微克级蛋白质含量。大量的去污剂对测定有严重的干扰,少量可通过对照消除。由于此法简便迅速、干扰物质少,灵敏度高,现已广泛用于蛋白质含量的测定。
【实验器材】
分光光度计、离心机、分析天平(万分之一)、药物天平、研钵、烧杯、量筒(10mL ×1)、容量瓶(100mL×1)、刻度吸管(lmL×1,0.lmL×1)、具塞刻度试管(10mL ×1)、漏斗、漏斗架、剪刀。
【实验材料及试剂】
(1)样品溶液。
(2)标准溶液:准确称取100mg牛血清白蛋白,溶于100mL蒸馏水中,即为1000μg/mL的原液。
(3)染液:称取0.1g考马斯亮蓝G250溶于50mL90%乙醇溶液中,再加入100mL 85%的磷酸,最后用蒸馏水定容至1000mL。此溶液在室温下可放置一个月。
【实验步骤】
1.标准曲线的绘制
(1) 0~1000μg/mL标准曲线的绘制:另取6支试管编号,按下表加入试剂。
1000μg/mL牛血清白蛋白(mL)蒸馏水(mL)
蛋白质浓度(μg/mL)
1.0
0. 2
0. 8
200
0. 4
0. 6
400
0. 6 0. 8 1.0
0. 4 0. 2 0
600 800 1000
得到从1到6号管的牛血清白蛋白溶液浓度分别为0、200、400、600、800、1000μg/mL,准确吸取各管溶液0.lmL,加入5ml考马斯亮蓝溶液,摇匀,静置2min,测定595nm 吸光值,绘制0-1000μg/mL标准曲线。
2.样品的测定
准确吸取样品溶液0.1mL放入具塞刻度试管中,与步骤(1)操作相同,测得样品的光吸收值A595nm。
【结果计算】
由标准曲线可查出相应的蛋白浓度(μg/mL),可按如下公式计算出样品中蛋白含量。
查出的蛋白提取液浓度(μg/mL)×定容体积(mL)
样品蛋白含量(μg /g鲜重)=─────────────────—————
样品重量(g)
【注意事项】
1. 比色应在出现蓝色2min~1h内完成。
2. 测定中,蛋白染料复合物会有少部分吸附于比色杯壁上,测定完后可用乙醇浸泡将比
色杯上的蓝色清洗干净。
【思考题】
1.考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量的原理是什么?
2.比较双缩脲法、Folin-酚法、紫外吸收法、考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量的优缺点。【参考书目】
1.Bradford,M.M.,Anal. biochem:1976,248-254
2.李建武,萧能,余瑞元等. 生物化学实验原理和方法. 北京:北京大学出版社,1994
附录2 硫酸铵饱和度计算表
(1)调整硫酸铵溶液饱和度计算表(25?C)
* 在25?C下,硫酸氨溶液由粗浓度调到终浓度时,每L溶液所加固体硫酸铵的g数(2)调整硫酸铵溶液饱和度计算表(0?C)
* 在0℃下,硫酸铵溶液由初浓度到终浓度时,每100mL溶液所加固体硫酸铵的g数。