多酚氧化酶特性研究
多酚氧化酶特性研究
摘要: 采用分光光度法, 对板栗仁多酚氧化酶( PPO) 的催化特性、最适波长、最适反应时间、最适温度、最适pH 值、热稳定性等性质进行了研究, 同时研究了Vc、EDTA、NaCl、柠檬酸4种添加剂对板栗仁多酚氧化酶活性的影响。结果表明: 板栗仁多酚氧化酶催化氧化产物的最大吸收波长为410nm, 最佳反应时间为3min, 最适反应温度为30℃, 最适pH 值为6. 0, 米氏常数Km = 0.0694mo l/L, Vmax = 3.918OD/min。95℃水浴处理5min该酶已基本失活, 其中V c 和EDTA对板栗仁多酚氧化酶酶促褐变有很好的抑制效果。
关键词: 板栗; 多酚氧化酶; 褐变; 抑制
多酚氧化酶( Polyphenolox idase, PPO ) 是由核基因编码的铜金属酶, 其酶促褐变机制是: 内源性酚类物质在多酚氧化酶的催化下氧化生成醌, 醌再相互作用生成高分子聚合物, 从而导致褐色素的生成。它能催化两类不同的反应, 可以使一元酚羟基化, 生成相应的邻二羟基化合物;也可以氧化邻苯二酚生成醌[ 1]。而酚类物质是果疏组织褐变的物质基础, 不同植物、同一植物的不同组织, 同一植物的不同品种、生长环境以及不同的发育期, 其褐变的主要酚类物质均有所不同, 导致酶褐变活性也有所差异。云南富产板栗, 但对板栗仁PPO 的活性及影响活性因素的研究则未见报道。
1材料与方法
1.1材料
板栗市场购外观良好, 无病虫害, 无机械损伤新鲜的云南板栗。
1.2试剂与仪器
主要试剂: 聚乙烯吡咯烷酮( PVPP)、邻苯二酚、乙酸钠、冰乙酸、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、甲醇、乙醛、盐酸、维生素C ( V c)、EDTA、柠檬酸、氯化钠等, 均为国产分析纯。
主要试验仪器: TGL - 16G 高速台式冷冻离心机、722W 型分光光度计、HH - 4型数显恒温水浴锅、冰箱等。
1.3试验方法
1.3.1粗酶液的制备
酶液提取参照文献[ 2] 的方法, 有所改进。称150g 冷冻鲜样, 加入PH 值6.0 的0.05mol /L冷冻磷酸缓冲液150mL 和15gPVPP, 打浆, 过滤, 于3℃下12000r /min 离心15min, 取上清液置于0~ 4℃保存备用。
1.3.2褐变度( BD) 的检测
称5g 样品加入15mL 蒸馏水中研磨, 离心( 14000r/min、15min)。沉淀溶于15mL甲醇甲酸溶液(体积比1:1), 充分浸提15min 后离心。
将两次所得上清液混匀后用蒸水定容为25mL, 离心, 取上清液检测410nm 下的吸光值An ×10 表示。
1.3.3总酚( TP) 的提取和含量检测
称取5g 样品, 加入15mL 乙醛- 盐酸溶液( pH3.0) 研磨, 在恒温水浴中震荡1h, 取出离心15000r /min, 30min, 量取滤液体积, 吸取5mL, 用蒸水定容到50mL, 测定A 值, 用邻苯二酚做标准曲线。
1.3.4酶活性的测定
取2mL 0.2mol/L 邻苯二酚溶液和2mL一定pH值的磷酸缓冲溶液加入到试管中, 然后加入0.5ml的粗酶液, 水浴保温3min后立即倒人比色管中, 在410nm波长处测定反应混合液的吸光值变化(△A), 每30s读数1次, 共记录3min。空白用蒸馏水代替邻苯二酚。酶活性以1min△A 值为每增加0.001 为1 个活力单位( U )。检测410nm 下的吸光值表示为A = U ×100。
2结果与分析
2．1工作波长的选择
体系反应产物在可见光波350 ~ 470nm 下的吸光度见图1所示。
图1 PPO酶促反应体系每隔3m in的波长扫描图。
由图1可以看出在从350nm 后昅光值一直呈下降的趋势, 但当反应液在410nm处时吸光度值便出现上升, 并从最初3min 的约0.527 升到9min的约0.638, 随着时间的延长反应液在410nm 处的吸光度值逐渐增大。当反应15min后吸光度值已经增大到接近0.87, 并形成
一个大的波峰, 说明该酶促反应的产物最大吸收波长在410nm 处, 故以此波长处的吸光度来衡量PPO 酶促反应速度的大小。
2．2 PPO的活性测定
以1.3.4 中所述的方法进行PPO 活性的测定, 其结果见图2所示:
在5min内, 随着时间的延长吸光值也随之增大, 在反应达3min时吸光度的变化达到最大, 此后增长趋于平稳。因此试验的测定均采用反应3min时410nm处的OD值表示PPO的活力。
图2 ppo反应进程曲线
2.3总酚含量与褐变度的关系
按照1.3.3中总酚测定方法测定, 以邻苯二酚浓度为纵坐标, 吸光度为横坐标, 总酚标准工作曲线见图3。
图3总酚含量工作标准曲线
由于吸光值越大说明褐变越厉害 , 由图3可以看出, 总酚含量与褐变度的关系为直接相关, 而相关系数很大( R2 = 0.9692), 说明总酚含量与褐变度有很大的相关性, 说明褐变主要是酚类底物的氧化引起的。
2.4 PPO活性与褐变度的关系
通过线性方程法得到PPO活性与褐变度的关系, 结果见图4。
图4 ppo活性与褐变度的关系
由图4可以看出, 板栗仁中PPO 活性与褐变度相关系数很大( R2 = 0.9369) , 说明板栗仁中的PPO 活性直接影响到褐变度的大小, 结合2.3结果, 充分说明板栗仁的褐变主要为PPO 引起
的酶促褐变。
2.5底物浓度对PPO活性的影响
由图5可以看出, 底物(邻苯二酚) 浓度与PPO 活力的关系表现为: 当底物浓度低于0.03mo l/L时, 酶活性(酶促反应速度) 随底物浓度增加而直线上升; 当底物浓度大于0.07mol/L时, 反应速度的增加变慢; 当底物浓度远大于Km时, 反应速度则趋向于最大值Vmax 。
图5底物浓度对ppo活性的影响
根据上述描述可知, 板栗仁多酚氧催化反应过程中, 反应速度与底物浓度之间的关系可化酶催化反应过程符合米氏方程所描述的单底物酶促反应动力学, 其用L inew eaver— Burk方程:1 /V = Km ×1/ [ S] + 1 /Vmax, 求得此条件下的Km及Vmax值。然后以1 /V 对1 / [ s] 作图如图6所示。
图6 Lineweaver- Burk曲线
图6中直线在横轴及纵轴的截距可分别求得Km = 0.0694mol /L, Vm ax = 3.918OD /min米氏常数Km是酶的一个基本特征常数, 它反应了酶与底物结合和解离的性质, Km值越小说明底物与酶结合的亲和力越强。
2.6不同因素对PPO活性的影响
2.6.1 pH 值对PPO活性的影响
以1.3.4d的方法进行试验, 结果如下。
图7 pH值对ppo活性的影响
从图7可以看出, 以邻苯二酚为底物时, 反应体系的pH 值对板栗多酚氧化酶活力的影响比较明显。pH 值在4.5 和6.0时, 分别有两个顶
峰, 但比较而言以pH 值为6.0 的酶活性最高。当pH 为3.0 时, 酶活性仅为pH6.0 时的30% 。当pH 值小于3.0 或者大于8.0时, PPO 几乎丧失活力。据推测这一方面可能是由于PPO 的辅基是Cu+ 2, 在强酸性条件下, 酶中的铜离子被解离出来, 使酶失去活性。在强碱条件下, Cu+ 2转化为Cu ( OH ) 2沉淀, 脱离了酶蛋白, 也能使酶失去活性; 另一方面是由于反应体系的pH 值对底物的解离使之不能被催化反应。因此, 调节pH值能有效抑制PPO 的活力。
2．6.2温度对红枣PPO活性的影响
2．6．2．1不同温度下PPO 活性的比较
由图8可以看出, 温度在30℃时板栗仁中PPO 活性最
图8温度对ppo活性的影响
强, 在10℃ ~ 30℃范围内随温度的升高活性增加, 在温度高于30℃时, 随着温度的升高, 酶活性降低。所以说通过提高温度或者降低温度可以抑制酶的活力。温度对PPO 的影响是双重的, 一、方面温度升高能加快酶催化反应速度进程, 另一方面促使酶蛋白变性。
2.6.2.2 PPO的热稳定性
按照1.3.4的方法进行试验, 结果见图9。
图9不同温度处理对ppo活性的影响
由图9可以看出, PPO 的热失活速度随着温度的升高而加快, 在95℃条件下, 5m in左右酶活性几乎全部被抑制。在85℃条件下, 加热7min后仍然有10%的活性存在。在75℃条件下, 加热25min仍有10% 的酶活性存在。
2.7不同抗褐变剂对酶活性的影响
2.7.1 VC对酶活性的影响
选用不同浓度的VC 按照1.3.4所述方法进行试验, 结果见图10。
图10 VC 对ppo活性的影响
由图10可知, 随着VC 浓度的加大, 多酚氧化酶活性逐渐下降,
在VC浓度为0.1% 时, 残余酶活性只剩下2%。VC 不仅是多酚氧化酶辅基铜离子的螯合剂, 而且也是多酚氧化酶作用底物的竞争性抑制剂。此外, VC 还可以还原多酚氧化酶作用所形成的醌。
2.7.2柠檬酸对PPO 活性的影响
选用不同浓度的柠檬酸按照1.3.4所述方法进行试验, 结果见图11。
图11柠檬酸对ppo活性的影响
由图11可以看出, 随着柠檬酸浓度的增大、对PPO的抑制作用也随之增大, 柠檬酸的浓度为0.1%时, PPO 的活性是1% 的3 ~ 4倍。这充分说明高浓度的柠檬酸对酶促褐变有一定的抑制作用。低浓度的柠檬酸不能络合足够的铜辅基, 而高浓度的柠檬酸可使体系pH 降低, 使之远离PPO最适pH 值而降低活性, 同时柠檬酸的3 个羧基有较强的鳌合PPO铜辅基而达到抑制PPO 活性的作用。
2.7.3 EDTA 对PPO 活性的影响
选用不同浓度的EDTA 按照1.3.4所述方法进行试验, 结果见图12。
图12 EDTA对ppo活性的影响
EDTA 是一种金属离子鳌合剂, 可以与大多数金属离子, 如铜、铁离子等鳌合。所以可抑制金属离子对板栗仁PPO 活性的促进作用而引起的酶褐变, 而且还有降低体系pH 值的作用。图12表明, 随着EDAT 浓度的增大, 对PPO 活性的抑制作用一直在增强, 当浓度低于0.03% 时, 抑制率随着浓度的提高增长较快, 当浓度达到0.08%时, PPO相对活性为降到了原来的10% 。
2.7.4. NaCl对PPO 活性的影响
选用不同浓度的NaCl按照1.3.4所述方法进行试验, 结果见图13。
图13氯化钠对ppo活性的影响
由图13可以看出随着NaC l浓度的增大, PPO的相对活性呈下降趋势, 但是相对趋势比较平缓,在NaCl浓度为0.7% 时, PPO 的相对活性基本保持不变。可见, NaCl对PPO 的抑制作用不强。
3结论
1.充分说明板栗的褐变主要为PPO引起的酶促褐变, 板栗多酚氧化酶对底物邻苯二酚酶促反应的反应产物的最大吸收波长为410nm。
2.板栗多酚氧化酶最适温度为30℃ ; 其最适pH值为60; 最适反应时间为3m in。该酶有很强的耐热性, 95℃下处理5m in才能完全失活。
3.当底物浓度小于0.03mol /L 时, 酶活性(酶促反应速度) 随
底物浓度增加而直线上升;当底物浓度继续变大时, 酶活性的增长速度逐渐变小, 不再呈线性关系。
4.板栗多酚氧化酶催化反应过程符合米氏方程所描述的单底物酶促反应动力学, 反应速度与底物浓度之间的关系可用米氏方程来描述, 米氏常数Km = 0.0694mo l/L, 最大反应速度为Vm ax =3.918OD /m in。
5.不同抗褐变剂对板栗多酚氧化酶活性的影响不同, VC 和EDTA 具有明显的抑制作用, 而NaCl对PPO的抑制作用不强。
参考文献:
[ 1 ] 何国庆, 丁立孝. 食品酶学[M ] . 北京: 化学工业出版社, 2006. 130- 134.
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[ 4 ] 王清章, 刘怀超. 莲藕贮藏中褐变度及多酚氧化酶的初步研究[ J] . 冷藏技术, 1996, 4.
多酚氧化酶
多酚氧化酶 1 多酚氧化酶的概念 植物多酚氧化酶是一类多基因家族表达的产物，是含Cu元素的膜结合蛋白，具有基团专一性，主要与植物色素的生成及其产品的色变有关。多酚氧化酶最早发现于1895年，1937年KubOwitz在实验室中第1次分离出多酚氧化酶。1907年Bertrand等从小麦麸皮中发现多酚氧化酶(酪氨酸酶，TyrOsinase)的存在。多酚氧化酶是一种蛋白体，在茶树生命活动和茶叶加工过程中参与一系列由酶促活动而引起的化学变化，故又被称为生物催化剂。茶叶中的酶较为复杂，种类很多，包括氧化还原酶、水解酶、裂解酶、磷酸化酶、移换酶和同工异构酶等几大类。酶蛋白具有一般蛋白质的特性，在高温或低温条件下有易变性失活的特点。各类酶均有其活性的最适温度范围，一般在30C～50℃范围内酶活性最强。酶若失活、变性，则就丧失了催化能力。酶的催化作用具有专一性，如多酚氧化酶，只能使茶多酚物质氧化，聚合成茶多酚的氧化产物茶黄素、茶红素和茶褐素等;蛋白酶只能促使蛋白质分解为氨基酸。茶叶加工就是利用酶具有的这种特性，用技术手段钝化或激发酶的活性，使其沿着茶类所需的要求发生酶促反应而获得各类茶特有的色香味。如绿茶加工过程中的杀青就是利用高温钝化酶的活性，在短时间内制止由酶引起的一系列化学变化，形成绿叶绿汤的品质特点。红茶加工过程中的发酵就是激化酶的活性，促使茶多酚物质在多酚氧化酶的催化下发生氧化聚合反应，生成茶黄素、茶红素等氧化产物，形成红茶红叶红汤的品质特点。 2 多酚氧化酶的分布 多酚氧化酶是一种由核基因编码的质体酶，普遍存在于植物、真菌、昆虫的质体中，即主要存在于叶绿体、黄色体和白色体等的内膜上。植物多酚氧化酶广泛存在于植物体的各种器官和组织中。各种器官和组织中PPO分布是不均匀的，具有时间和空间特异性，幼嫩部位的PPO活性较高，成熟或衰老部位活性较低。另外，环境胁迫、化学药品也能诱导PPO的表达，植株组织受到机械损伤或病虫害的侵染，该部位的PPO活性也将上升。对于小麦，从植株幼苗到成熟籽粒都含有PPO，但是其活性和种类有差异，籽粒中的PPO主要存在于麸皮中。不同生物体、同一生物体的不同部位和不同发育时期PPO的含量和种类均有所不同。20世纪60年代以来，研究者们曾从不同的植物中分离出PPO，其中以茶叶、葡萄、荔枝及番茄等中的PPO含量较为丰富，而小麦等禾谷类作物中PPO不是太丰富。虽然几乎所有的质体中都包含PPO，但在某些组织中很难检测到PPO的活性，如C4植物的维管束鞘细胞和保卫细胞的质体。 3 多酚氧化酶的生理生化特性及功能 高等植物组织发生褐变主要是PPO活动的结果。PPO催化单酚羟基化为O﹣二酚，二羟酚氧化为O﹣醌，醌聚合并与细胞内蛋白质的氨基酸反应，产生黑色或褐色色素沉淀，最终导致水果、蔬菜等经济作物外观和风味变差，营养价值下降，造成经济损失。但关于PPO 的生理功能问题，至今尚未有一个比较明确的认识。目前研究比较多的都集中在它与植物抗病性的关系上。多酚氧化酶位于质体的类囊体膜上，作为氧化还原酶，被认为与呼吸链末端的电子传递有关，能消除氧自由基的伤害，从而达到抗病的目的。随着研究的深入，人们还逐步发现了多酚氧化酶的其他生理功能。PPO参与植物色素的生成；还与植物抗逆、生长发育有关，可能促进已烯代谢；在光合作用中，可能在叶绿体内起着能量转换作用，传递光还原产生的分子氧；与植物的抗病虫等方面相关，大多数研究表明，PPO与植物的免疫抗性有关，如烟草对炭疽病、黄瓜对黑星病、苹果对轮纹病、棉苗对枯萎病、水稻对白叶枯病以
植物多酚的抑菌特性—天然防腐剂
植物多酚的抑菌特性—天然防腐剂 植物多酚对微生物的抑制作用是多种因素共同作用的结果。植物多酚与蛋白质的高度结合能力，可以改变微生物酶的活性，减少微生物对外源性蛋白质的利用；植物多酚与金属离子的络合特性可以使某些金属酶失活；植物多酚对细胞膜的作用可以影响微生物的代谢。其中，植物多酚对酶的抑制作用是其抑菌的主要原因。 早在1947年，我国对紫苏叶的抗菌性能进行了研究。结果表明紫苏叶能有效地抑制一些葡萄球菌的生长。 通过对紫苏抗菌作用的研究，发现紫苏油中的挥发性成分紫苏醛和柠檬醛具有一定的协同抗真菌能力。 研究表明紫苏精油对金黄色葡萄球菌、化脓链球菌、大肠杆菌、假结核棒状杆菌等细菌有明显的抗菌活性，不仅可以治疗牙科感染，而且可以抑制链球菌的生长。张子扬研究表明，紫苏油和桂皮油对蜂蜜的保藏存储中自然污染的霉菌和酵母菌的抑制能力明显高于尼泊金乙酯和苯甲酸。 丁香油酚和乙酰基丁香油酚及紫苏醛可以抑制绿脓杆菌的传染，等采用蒸馏法以甲醇作为提取剂提取紫苏茎叶中的精油，并对其抗菌活性进行了研究。 结果表明，紫苏的水蒸气提取物具有广谱的抗菌活性，其中的主要成分紫苏醛具有中等广谱的抗菌活性，且与水寥中的寥二醛具有较明显的协同效应。 将紫苏醛应用在肉制品防腐试验中，发现紫苏醛可以有效降低微生物的生长能力，减少其生长量‘紫苏叶水浸液、水煎液和乙醇提取液对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌也具有一定的抑制能力。 在紫苏愈伤组织迷迭香酸的纯化及抗菌活性研究中发现，迷迭香酸水溶液对以大肠杆菌为代表的杆状菌和以金黄色葡萄球菌为代表的球状菌的生长均有一定程度的抑制作用。 紫苏抗菌防腐性能，紫苏不同溶剂提取物、紫苏不同提取条件提取物、紫苏不同部位提取物都对细菌、酵母菌和霉菌有一定的抑制效果，添加浓度1.25%。紫苏提取液到卤肉中的防腐效果与浓度0.5% 山梨酸钾溶液浸2min处理的效果相似，与不添加防腐剂的对照相比，均能明显延长保质期。 紫苏提取物对革兰氏阳性和阴性菌均具有不同程度的抑制能力，且酚羟基对多酚类物质的抑制作用起决定性作用。黄丹等研究了紫苏乙醇提取物对细菌、酵母菌和黑曲霉
多酚氧化酶特性研究
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多酚氧化酶活性测定
实验二十六植物体内多酚氧化酶活性的测定 一、目的 通过实验，掌握植物体内多酚氧化酶活性的测定方法。 二、原理 多酚氧化酶是一种含铜的氧化酶，在有氧的条件下，能使一元酚和二元酚氧化产生醌。用分光光度法在525nm波长下测其吸光度，即可计算出多酚氧化酶的活力和比活性。反应式如下： 多酚氧化酶 邻苯二酚（儿茶酚）＋1∕2 O 2 ——————→ 邻醌＋ H 2 O 三、材料、仪器及试剂 1. 材料：马铃薯块茎等 2. 仪器：UV－1206或UV－1240分光光度计；离心机；恒温水浴；研钵或匀浆机；试管；移液管；纱布袋等。 3. 试剂：聚乙烯吡咯烷酮（PVP）；0.01mol·L－1pH 6.5磷酸缓冲液；0.1m mol·L －1pH6.5磷酸缓冲液；0.05 mol·L－1pH5.5磷酸缓冲液；30%饱和度硫酸铵；0.1 mol·L－1儿茶酚； 20％三氯乙酸。 四、实验步骤 1. 粗酶液的制备 称取马铃薯块茎5g于研钵中，加入0.5g 不溶性聚乙烯吡咯烷酮（事先用蒸馏水浸洗，然后过滤以除去杂质）和100ml 0.1mol·L－1pH6.5磷酸缓冲液,磨成匀浆，用几层纱布袋过滤，滤液加入30%饱和度硫酸铵，离心除沉淀，上清液再加硫酸铵使达60％饱和度，离心收集沉淀。将所得沉淀溶于2～3ml 0.01mol·L－1 pH6.5磷酸缓冲液中，即为粗制酶液。 2. 活性酶的测定
在试管中加入3.9ml 0.05 mol·L－1 pH5.5磷酸缓冲液，1.0ml 0.1 mol·L－1儿茶酚在37℃恒温水浴中保温10min ，然后加入0.5ml酶液（可视酶活性增减用量），迅速摇匀，倒入比色杯内，于525nm波长处以时间扫描方式，在1～2min 内测定吸光度变化（A）值。 五、酶活性的计算 值变化0.01为1个酶活力单位，按下式计算多酚氧化酶的活力以每min内A 525 和比活性。 A 酶提取液总量（ml） 酶活力（0.01A·min－1）＝———————×——————————— 0.01×反应时间测定时酶液用量（ml） A 酶提取液总量（ml） 酶的比活性(0.01A·g－1Fw·min)=————————×—————————— 0.01×W×反应时间测定时酶液用量（ml） 公式中：A —为反应时间内吸光度的变化值；W为样品鲜重（g）。
多酚氧化酶活性测定及控制[文献综述]
毕业论文文献综述 生物工程 多酚氧化酶活性测定及控制 1 前言 多酚氧化酶（PPO）广泛存在于自然界，在果实和蔬菜收获后，PPO所引起的反应常常会使果肉发生褐变、产生异味和损失营养。本文总结了多酚氧化酶的活性测定方法以及对其活性的控制，主要研究了抑制剂对其活性的影响，为果蔬贮藏和加工中酶促褐变的防治提供思路。 多酚氧化酶（PPO）作为一种植物酶类，是引起果蔬褐变的主要因素。鲜切果蔬因组织被切分使PPO与酚类底物的接触机会增加，酚类物质被氧化成棕褐色的醌，导致产品褐变。抑制PPO活性取决于抑制剂的性质和浓度、底物的可利用性、pH值和温度。一些还原剂、酶类、螯合剂和蜂蜜等均已被用于防止果蔬酶褐变。本文主要总结了抑制剂对于控制果蔬PPO活性的研究。 2 主题部分 2.1 从果蔬中提取PPO（以莲藕为例） 2.1.1 丙酮法（丙酮法提取所得酶液比活力最高。适合需大量制样时使用） 将莲藕洗净，去皮，切碎，加4倍量预冷至．18。C的丙酮(w／v为1：4)捣碎，搅拌3min，抽滤，冷风吹干残渣后，混匀，得丙酮粉。称取丙酮粉O．5 g，加入0．2 mol／L，pH为5．4的预冷磷酸二氢钠．柠檬酸缓冲液20ml，搅拌3min，8 000r／min离心10min，所得上层清液即为粗酶液。【1】 2.1.2 匀浆法（匀浆法提取的酶液没有活性） 将莲藕洗净，去皮，切碎，加入0．05mol／L，pH5．4的预冷磷酸氢二钠．柠檬酸缓冲溶液(含5％的PVPP)，料液比为1：2．2，捣碎，搅拌，抽滤。向滤渣中加入0．05mol／L，pH5．4磷酸氢二钠一柠檬酸缓冲溶液(W／V为1：1)再次搅拌，抽滤，两次滤液合并，8 000r／min离心10rain，所得上清液即为粗酶液。【2】 2.2.3 匀浆浸提法（匀浆浸提法提取所得粗酶液活性最高，操作简便，提取所得粗酶液活性
大气气溶胶表面化学与光学特性研究进展
大气气溶胶表面化学与光学特性研究进展 陈建民* 复旦大学全球环境变化研究所，上海，200433 复旦大学环境科学与工程系，上海，200433 *Email：jmchen@https://www.wendangku.net/doc/686112678.html, 大气气溶胶有一次排放的矿尘、黑炭（soot）、海盐等，二次气溶胶富含硫酸盐、硝酸盐、铵盐、有机物等成分。大气气溶胶作为污染物的载体或反应床，其表面界面化学反应及消光（光吸收、光散射）特性，对空气质量、大气能见度产生影响，其消光特性对气候效应产生直接影响、作为云凝结核影响成云与降雨表现出对气候效应产生间接影响。本文对近年来矿尘、黑炭、海盐、混合气溶胶与SO2、NOx、有机物、O3等大气污染物表面化学反应机理研究前沿进行了分析，特别对大气气溶胶表面变化引起的光吸收、光散射特性的变化规律进行介绍，指出该领域发展前沿难点问题及重要的研究方向。 Progress on Aerosol Surface Chemistry and its Optical Property Jianmin Chen* Research Institute for the Global Environment Change, Fudan University, Shanghai , 200433 Department of Environmental Science & Engineering, Fudan University, Shanghai , 200433 Aerosol includes primary emission such as dust, black carbon(soot), sea-salt, and secondary evolutings like sulfate, nitrate, ammonium and organics et.al. Aerosol provides surfaces serving as a carrier or reaction bed for pollutants. The atmosperic chemistry of aerosol and its optical extinction (light adsorption and scattering) during heterogeneous reaction have significantly effects on air quality, visibility. Aerosol light extinction has both direct impact on climate change through absorption and scattering of solar radiation, and indirectly, through the modification of cloud properties and wet deposition. This paper concerns recent progress on surface chemistry of heterogeneous reaction mechanism between dust, soot, sea-salt and SO2、NOx、organics、O3 et al..The focus of significant research effort has been paid on light adsorption and scattering yet remaining highly uncertain and a significantvconstraint on the evaluation of climate sensitivity.
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多酚氧化酶（polyphenol oxidase,PPO）是自然界中分布极广的一种金属蛋白酶，普遍存在于植物、真菌、昆虫的质体中，甚至在土壤中腐烂的植物残渣上都可以检测到多酚氧化酶的活性。由于其检测方便，是被最早研究的几类酶之一。自1883年Yoghid发现日本漆树液汁变硬可能和某种活性物质相关，1938年Keilin D.和Mann G.研究了蘑菇多酚氧化酶的提取和纯化，得到多酚氧化酶并将这类酶称为polyphenol oxidase。多酚氧化酶又称儿茶酚氧化酶，酪氨酸酶，苯酚酶，甲酚酶，邻苯二酚氧化还原酶，是六大类酶中的第一大类氧化还原酶。 多酚氧化酶的共同特征是能够通过分子氧氧化酚或多酚形成对应的醌。在广义上，多酚氧化酶可分为三大类：单酚单氧化酶(酪氨酸酶tyrosinase,EC.1.14.18.1)、双酚氧化酶(儿茶酚氧化酶catechol oxidse,EC.1.10.3.2)和漆酶(laccase,EC.1.10.3.1)。在这三大类多酚氧化酶中，儿茶酚酶主要分布在植物中，微生物中的多酚氧化酶主要包括漆酶和酪氨酸酶。现在大部分文献所说的多酚氧化酶一般是儿茶酚氧化酶和漆酶的统称。 编辑本段 二、多酚氧化酶在自然界的分布 1植物中的多酚氧化酶及作用
在植物(如苹果、荔枝、菠菜、马铃薯、豆类、茶叶、桑叶、烟草等)组织中，PPO是与内囊体膜结合在一起的，天然状态无活性，但将组织匀浆或损伤后PPO被活化，从而表现出活性。在果蔬细胞组织中，PPO存在的位置因原料的种类、品种及成熟度的不同而有差异，绿叶中PPO活性大部分存在于叶绿体内[7]；马铃薯块茎中几乎所有的亚细胞部分都含有PPO，含量大约与蛋白质部分相同[8]；在茶叶中的PPO 分为游离态和束缚态，前者主要存在于细胞液中属可溶态PPO，而后者则主要存在于叶绿体、线粒体等细胞器中，与这些细胞器的膜系统或其他特异部位结合呈不溶态[9]，ThanarajS.N.(1990)研究了茶树新梢中PPO活性及多酚含量对红茶品质的影响，发现PPO活性强，多酚含量高，对红茶品质有利，相反则利于绿茶的生产[10]；新鲜的苹果中，多酚氧化酶几乎全部存在于叶绿体和线粒体中。从这两部分分别制备的PPO，其底物专一性稍有差异[11]。刘乾刚认为，PPO在细胞内除了存在于叶绿体及线粒体上外，细胞壁也可能存在PPO，且对发酵产生影响，细胞只要轻微破损便有PPO的作用。多酚氧化酶是一种质体酶，有些研究人员认为多酚氧化酶可能仅存在于质体中[12]，缺乏质体的组织就不存在多酚氧化酶，例如筛管和筛胞等，但是有质体的组织也可能没有多酚氧化酶，如C4植物叶。含有质体的植物组织不一定都存在多酚氧化酶，而多酚氧化酶一定在含有质体的植物组织中。 随分子生物学的发展，象西红柿、苹果等的多酚氧化酶的基因已被克隆。浙江大学赵东等[12]对茶树多酚氧化酶的克隆及其序列进行了比较。从已经克隆的多酚氧化酶的基因看，均属于基因家族，多则
多酚氧化酶
多酚氧化酶的酶学性质及其应用 摘要：本文论述了多酚氧化酶的酶学性质和它对果蔬类食品的影响，以及如何利用它的酶学性质加以控制。 关键词：多酚氧化酶性质抑制 0引言 多酚氧化酶（polyphenol oxidase,PPO）是自然界中分布极广的一种金属蛋白酶，普遍存在于植物、真菌、昆虫的质体中，甚至在土壤中腐烂的植物残渣上都可以检测到多酚氧化酶的活性。由于其检测方便，是被最早研究的几类酶之一。自1883年Yoghid发现日本漆树液汁变硬可能和某种活性物质相关，1938年Keilin D.和Mann G.研究了蘑菇多酚氧化酶的提取和纯化，得到多酚氧化酶并将这类酶称为polyphenol oxidase。多酚氧化酶又称儿茶酚氧化酶，酪氨酸酶，苯酚酶，甲酚酶，邻苯二酚氧化还原酶，是六大类酶中的第一大类氧化还原酶[1]。 1多酚氧化酶的结构特性 多酚氧化酶是一种含有Cu2+离子的结构蛋白，可以催化酚类上的羟基，使之转化为醌或催化多酚类变为氧合醌。因为醌类具有较强的电化学性质，会发生自动氧化、蛋白质的亲核聚合反应及一些二级反应，而这些反应都会导致酶促褐变反应的发生[2]。 多酚氧化酶的共同特征是能够通过分子氧氧化酚或多酚形成对应的醌。在广义上，多酚氧化酶可分为三大类：单酚单氧化酶(酪氨酸酶tyrosinase,EC.1.14.18.1)、双酚氧化酶(儿茶酚氧化酶catechol oxidse,EC.1.10.3.2)和漆酶(laccase,EC.1.10.3.1)。在这三大类多酚氧化酶中，儿茶酚酶主要分布在植物中，微生物中的多酚氧化酶主要包括漆酶和酪氨酸酶。 2 多酚氧化酶的来源和制备 2.1多酚氧化酶的来源 多酚氧化酶普遍存在于植物、真菌、昆虫的质体中。 2.2多酚氧化酶的制备 制备马铃薯丙酮粉：取50g去皮切丁的马铃薯与60mL丙酮（-20℃）混合粉碎抽滤，滤渣用-20 ℃的丙酮冲洗至白色室温下晾干。 PPO粗提液的制备：5g马铃薯干粉与40mL粗酶提取液混合搅拌1min 静止1hr，4℃离心（4℃，15000rpm，15min）过滤取上清，即得PPO粗提液，粗酶提取液为4.2g+1000mL0.2M PB。 PPO纯化之盐析：PPO的纯化常采用盐析法。盐析主要是利用酶蛋白在高浓度的盐溶液中溶解度减小而析出的原理。硫酸铵由于价廉、溶解度大，且能使蛋白质稳定，故是最常用的盐析剂。 粗酶制剂加入等体积饱和(NH4)2SO4静置1hr，4℃离心（4℃，17000rpm，10min）收集沉淀加15mL0.2MPB溶解再次离心（条件同前）收集上清，即得PPO粗酶制剂取4mL粗酶制剂于冷冻干燥机上冻干，得PPO干粉[3]。 3多酚氧化酶的催化机理 多酚氧化酶(PolyphenolOxidase，PP0)是从真菌到植物乃至哺乳动物体内都广泛存在的一类铜蛋白，它能有效催化多酚类化合物氧化形成相应的醌类物质。在
多酚氧化酶在食品中的应用
多酚氧化酶在食品中的研究进展 摘要：多酚氧化酶（PPO）存在于许多种类的食品中，是引起食物褐变的主要因素，酶促褐变严重影响了食品的感官品质，使得食品的保质期缩短和价值显著降低，不少新鲜食品的销售市场因此受到限制[1]。本文介绍了多酚氧化酶的酶学性质以及相应的抑制方法，并对其应用做出论述。 关键词：多酚氧化酶；性质；抑制方法；应用 多酚氧化酶（PPO）是自然界中分布十分广泛的一类末端氧化酶，属于铜金属酶类，其化学性质稳定，是植物叶子、果实等发生褐变的主要作用酶类[2]。此外，还会引起食品的褐变，损害食品的感官风味质量[3-4]。PPO普遍存在于植物、昆虫和真菌之中，甚至在腐烂的植物残渣上都还可以检测到它的存在。因此该酶与果蔬的加工品质密切相关，科学家们很早就开始对它进行深入彻底的研究[5-6]。 农产品的酶促褐变与多酚氧化酶活性和含量密切相关。这方面研究很多，酶促褐变不仅影响产品外观、风味、营养和加工性能，而且大大降低耐贮性，尤其对肉色较浅且容易碰伤的水果和蔬菜影响更为严重，产生的经济损失更大[7-9]。通常PPO 与底物被区域化分开，PPO 在质体中以潜伏状态存在，而PPO 的底物存在于液泡中。只有当植物体内发生生理紊乱或组织受损时，PPO 与底物的亚细胞区域化才被打破，PPO 底物被激活产生黑色或褐色的沉积物，这是果蔬等农产品酶促褐变的主要原因[10]。 1、多酚氧化酶的酶学性质 与多酚氧化酶酶学性质的主要研究内容有：酶的分离和纯化、测定酶促反应的速度、了解影响酶促反应的因素等等[11]。 在分离和纯化时，一般是进行纯化，再将纯度高的PPO酶液进行酶学的性质研究[12-13]。PPO活性检测则一般通过测定产物生长速度（初速度）来测定，通过采用分光光度法，即在一定波长下测定从醌生成的色素的吸光度，再根据吸光度来定义酶的活性大小[14]。目前，已知的影响PPO酶促反应速度的因素主要有：温度、同一底物不同浓度、不同的底物、pH值、激活剂、抑制剂等[15]。
植物多酚氧化酶(PPO)酶联免疫分析
植物多酚氧化酶（PPO）酶联免疫分析 试剂盒使用说明书 本试剂盒仅供研究使用。 检测范围：96T 0.1U/L – 4.0U/L 使用目的： 本试剂盒用于测定植物组织，细胞及其它相关样本中多酚氧化酶（PPO）含量。 实验原理 本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中植物多酚氧化酶（PPO）水平。用纯化的植物多酚氧化酶（PPO）抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入植物多酚氧化酶（PPO），再与HRP 标记的多酚氧化酶（PPO）抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的植物多酚氧化酶（PPO）呈正相关。用酶标仪在450nm 波长下测定吸光度（OD 值），通过标准曲线计算样品中植物多酚氧化酶（PPO）浓度。 试剂盒组成 1 30倍浓缩洗涤液20ml×1瓶 6ml×1瓶 12孔×8条 6ml×1瓶 6ml×1瓶 6ml×1/瓶7 8 9 终止液6ml×1瓶 0.5ml×1瓶 1.5ml×1瓶 1份 2 酶标试剂标准品（8.0 U/L） 标准品稀释液 3 酶标包被板 4 样品稀释液 5 显色剂A液 6 显色剂B液10 说明书 11 封板膜 12 密封袋 2张 1个 标本要求 1．标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融 2．不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。 操作步骤 1. 标准品的稀释：本试剂盒提供原倍标准品一支，用户可按照下列图表在小试管中进行稀 释。 4.0 U/L 2.0 U/L 1.0 U/L 0.5U/L 0.25U/L 5号标准品 4号标准品 3号标准品 2号标准品 1号标准品 150μl的原倍标准品加入150μl标准品稀释液 150μl的5号标准品加入150μl标准品稀释液 150μl的4号标准品加入150μl标准品稀释液 150μl的3号标准品加入150μl标准品稀释液 150μl的2号标准品加入150μl标准品稀释液 2. 加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、标准孔、
多酚氧化酶的活性测定的报告
朴东日：多酚氧化酶活性的测定。一、试验目的 本试验的目的在于掌握多酚氧化酶活性测定的一般原 理及操作技术。 二、试验原理 酚氧化酶（PPO）催化各种酚与O2氧化为醌。本实验是采用邻苯二酚为底物，在0.2M磷酸氢二钠－0.1M柠檬酸缓 冲液PH6.0的反应体系中，PPO催化邻苯二酚形成褐色 的醌，在分光光度计410nm处使反应体系的OD值产生 变化，通过OD值上升的读数变化确定PPO的酶活大小。 三、试验材料、试剂及试验用品 材料：李子样本80个（按照80个预算药品）李子处理：果实发育早期、果实发育中期、果实发育后期、发 育中期果实用1-MCP处理、发育中期果实用乙烯 处理。 药品：预冷的磷酸缓冲液（ｐＨ６．４）２０ｍＬ １ｍＬ（０．１ｍｏｌ／Ｌ）邻苯二酚 ４ｍＬ磷酸缓冲液（ｐＨ６．４） 四、实验方法：
1.ＰＰＯ的提取取１ｇ李子果肉样品，冰浴研磨，加入预冷的磷酸缓冲液（ｐＨ６．４）２０ｍＬ，在４℃下离心（４２００ｒ／ｍｉｎ）１０ｍｉｎ，取上清液为蜜柚果肉ＰＰＯ酶提取液。 2.ＰＰＯ活性测定采用比色法测定。将１ｍＬ（０．１ｍｏｌ／Ｌ）邻苯二酚加入４ｍＬ磷酸缓冲液（ｐＨ６．４）中，加入１ｍＬ酶液，立即于波长４２０ｎｍ下测定吸光度的变化，每隔２０ｓ记录１次，共记录３ｍｉｎ。以不加酶提取液的反应液做对照，以每分钟吸光度变化０．０１为１个ＰＰＯ酶活性单位。 3.最后作吸光度A与反应时间的关系曲线图，依据曲线最初直线段的斜率(ΔA/t)计算PPO活力。(注意空白为：2.5 mL缓冲液和0.5 mL 0.01 mol/L邻苯二酚溶液)一个酶活力单位定义为：以每分钟每毫升增加吸光值0.001的酶量为一个酶活力单位U。 4.多酚氧化酶酶活的计算公式：E=M×60/V (式1)式中：M—每秒钟增加的吸光值V—粗酶液的体积/mL。
沙尘气溶胶消光特性的初步研究
沙尘气溶胶消光特性的初步研究1 刘菲，牛生杰 南京信息工程大学，南京（210044） E-mail ：liufei03y@https://www.wendangku.net/doc/686112678.html, 摘 要：初步研究了沙尘粒子的辐射特性。结果表明：沙尘气溶胶的散射效率因子、消光效率因子第一主峰的位置在0.1—1.0μm 之间，值约为4，并随着波长λi 的增大，第一主峰的位置移向大r 方向。吸收效率因子随着r 的增长而逐渐增大，并向1趋近。单次反照率0? 在粒径为0.1μm －1.0μm 之间时有最大值，约为0.97。粒径在0.1μm －0.4μm 的这一部分粒子对总消光系数的贡献最大。粒子在波长440nm 处的消光能力最强，随着波长的增大，粒子的消光能力逐渐减弱。气溶胶粒子各项消光参数对复折射率虚部的变化非常敏感。 关键词：沙尘气溶胶，效率因子，消光系数，单次反照率，复折射指数 中图分类号：P422 1．引言 气溶胶作为影响气候变化的一个重要因子，引起了全世界科学界的普遍重视[1]。沙尘气溶胶，或称为矿物气溶胶，是对流层气溶胶的主要成分。我国沙尘气溶胶主要来源于新疆、甘肃、内蒙的沙漠以及黄土高原等干旱和半干旱地区。近年来，中国北方频繁发生的沙尘暴事件引起了国内外的广泛关注，沙尘暴已成为一个重要的地球环境问题。 根据IPCC [2]报告，沙尘的平均寿命约4天，平均柱垂直积分含量约32.2mg/m 2，在550nm 波长处质量消光系数0.7m 2/g 。邱金桓等[3]采用激光雷达和光度计对1988年4月北京地区的三次沙尘暴天气过程进行了综合测定。“黑河地区地气相互作用试验研究”期间野外实测沙尘气溶胶资料的分析结果也表明，4月份沙尘气溶胶消光系数或光学厚度比10月份大得多，0.1-1.0μm 的粒子是最主要的消光粒子。牛生杰等[4-8]于1996年至1999年间的4月－5月深入沙漠源地(腾格里沙漠、巴丹吉林沙漠、毛乌素沙地)对沙尘天气进行了系统观测,并利用飞机观测沙漠地区气溶胶，系统分析了贺兰山地区沙尘气溶胶微结构。张文煜等[9]2001年4～9月份在腾格里沙漠沙坡头站进行地面多波段太阳直接辐射观测，研究表明该地区的气溶胶光学厚度在不同天气状况下的变化有很大差别。辛金元[10]等也对这次观测结果进行了分析。张仁健等[11]对2000年4月6日发生的特大沙尘暴期间沙尘粒子的分析表明：沙尘暴期间的粗粒子（d>2μm ）数浓度是尘暴后的20倍以上，细粒子（d< 2μm ）数浓度是尘暴后的7倍。方宗义等[12]根据卫星探测的特点，针对这次华北地区大范围沙尘天气，具体探讨了用星载扫描辐射仪监测沙尘暴的原理和方法。 由于气溶胶时空分布的不确定及粒子物理、化学特性的多变性, 加上观测资料的严重缺乏, 使得气溶胶成为当今环境与气候变化研究中一个既重要又难以估计的不确定因子。大气气溶胶对环境与气候变化的研究在很大程度上依赖于对其时、空分布状况的了解和其辐射特性的准确估计。其中气溶胶光学厚度、消光系数、散射系数、吸收系数等是表征大气气溶胶状况的重要物理参量, 是评价大气环境污染, 研究气溶胶辐射气候效应非常关键的因子。 2．原理介绍 大气气溶胶的尺度范围常取10-3μm 的分子团到101μm 的尘粒、云滴。在本文研究的范围内，沙尘粒子的尺度相对于可见光和近红外，需运用米散射理论来处理[13]。空气中的沙 1 本课题得到高等学校博士学科点专项科研基金（项目编号：20050300002）的资助。
多酚氧化酶检测试剂盒(PPO)说明书
货号：QS1404 规格：50管/24样 多酚氧化酶检测试剂盒(PPO)说明书 可见分光光度法 正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定 测定意义： PPO（EC1.10.3.1）主要存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，是一种含铜的氧化酶，能使一元酚和二元酚氧化产生醌，从而引起褐化，与果蔬加工、茶叶品质和组培等密切相关。 测定原理： PPO能够催化邻苯二酚产生醌，后者在525nm有特征光吸收。 自备实验用品及仪器： 可见分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水。 试剂组成和配制： 提取液：液体，60mL×1瓶，4℃保存； 试剂一：液体，40mL×1瓶，4℃保存； 试剂二：液体，10mL×1瓶，4℃避光保存； 粗酶液提取： 1、细菌、细胞或组织样品的制备： 细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。 组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。 2、血清（浆）或果汁样本的处理： 按照血清（浆）或果汁体积（mL）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议取0.1mL血清（浆）或果汁加入1mL提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。 测定步骤： 1、分光光度计预热30min以上，调节波长至525nm，蒸馏水调零。 5min 第1页，共2页
多酚氧化酶培训资料
多酚氧化酶
多酚氧化酶的酶学性质及其应用 摘要：本文论述了多酚氧化酶的酶学性质和它对果蔬类食品的影响，以及如何利用它的酶学性质加以控制。 关键词：多酚氧化酶性质抑制 0引言 多酚氧化酶（polyphenol oxidase,PPO）是自然界中分布极广的一种金属蛋白酶，普遍存在于植物、真菌、昆虫的质体中，甚至在土壤中腐烂的植物残渣上都可以检测到多酚氧化酶的活性。由于其检测方便，是被最早研究的几类酶之一。自1883年Yoghid发现日本漆树液汁变硬可能和某种活性物质相关，1938年Keilin D.和Mann G.研究了蘑菇多酚氧化酶的提取和纯化，得到多酚氧化酶并将这类酶称为polyphenol oxidase。多酚氧化酶又称儿茶酚氧化酶，酪氨酸酶，苯酚酶，甲酚酶，邻苯二酚氧化还原酶，是六大类酶中的第一大类氧化还原酶[1]。 1多酚氧化酶的结构特性 多酚氧化酶是一种含有Cu2+离子的结构蛋白，可以催化酚类上的羟基，使之转化为醌或催化多酚类变为氧合醌。因为醌类具有较强的电化学性质，会发生自动氧化、蛋白质的亲核聚合反应及一些二级反应，而这些反应都会导致酶促褐变反应的发生[2]。 多酚氧化酶的共同特征是能够通过分子氧氧化酚或多酚形成对应的醌。在广义上，多酚氧化酶可分为三大类：单酚单氧化酶(酪氨酸酶 tyrosinase,EC.1.14.18.1)、双酚氧化酶(儿茶酚氧化酶catechol oxidse,EC.1.10.3.2)
和漆酶(laccase,EC.1.10.3.1)。在这三大类多酚氧化酶中，儿茶酚酶主要分布在植物中，微生物中的多酚氧化酶主要包括漆酶和酪氨酸酶。 2 多酚氧化酶的来源和制备 2.1多酚氧化酶的来源 多酚氧化酶普遍存在于植物、真菌、昆虫的质体中。 2.2多酚氧化酶的制备 制备马铃薯丙酮粉：取50g去皮切丁的马铃薯与60mL丙酮（-20℃）混合 粉碎抽滤，滤渣用-20 ℃的丙酮冲洗至白色室温下晾干。 PPO粗提液的制备： 5g马铃薯干粉与40mL粗酶提取液混合搅拌1min 静止1hr，4℃离心（4℃，15000rpm，15min）过滤取上清，即得PPO粗提液，粗酶提取液为4.2g+1000mL0.2M PB。 PPO纯化之盐析：PPO的纯化常采用盐析法。盐析主要是利用酶蛋白在高 浓度的盐溶液中溶解度减小而析出的原理。硫酸铵由于价廉、溶解度大，且能 使蛋白质稳定，故是最常用的盐析剂。 粗酶制剂加入等体积饱和(NH4)2SO4静置1hr，4℃离心（4℃，17000rpm， 10min）收集沉淀加15mL0.2MPB溶解再次离心（条件同前）收集上清，即得PPO粗酶制剂取4mL粗酶制剂于冷冻干燥机上冻干，得PPO干粉[3]。 3多酚氧化酶的催化机理 多酚氧化酶(PolyphenolOxidase，PP0)是从真菌到植物乃至哺乳动物体内都 广泛存在的一类铜蛋白，它能有效催化多酚类化合物氧化形成相应的醌类物 质。在茶儿茶素氧化PPO底物儿茶素(eatechin)类能和许多金属离子络合，Cu2+离子形成的配位物中的配位数为4或6，可以从配位体的配位键来阐明PPO的
实验四多酚氧化酶的活性的测定及酶学性质
实验四多酚氧化酶的活性的测定及酶学性质 This model paper was revised by the Standardization Office on December 10, 2020
实验四、马铃薯块茎多酚氧化酶（PPO）活性测定及酶学性质一、实验目的 1掌握分光光度法测定多酚氧化酶活性的一般原理及操作技术方法。 2了解酶的活性与植物组织褐变以及生理活动之间的关系。 二、实验原理 马铃薯不耐储藏，在加工过程中去皮切分后非常容易发生酶促褐变，使外观品质和营养价值大为降低，制约着马铃薯的开发利用。酶促褐变是马铃薯加工产业必须解决的难题。其中多酚氧化酶是导致马铃薯等果蔬发生酶促褐变的重要酶类。多酚氧化酶活性大小直接影响酶促褐变程度。 多酚氧化酶(polyphenol oxidase，PPO)又称酪氨酸酶、儿茶酚酶、酚酶等．是自然界中分布极广的一种含铜氧化酶．普遍存在于植物、真菌、昆虫的质体中。植物受到机械损伤和病菌侵染后，PPO催化酚与O2氧化形成醌，使组织形成褐变．以便损伤恢复，防止或减少感染，提高抗病能力。研究多酚氧化酶的特性对食品的加工与保藏工艺有非常重要的意义。因此，检测食品中多酚氧化酶具有重要意义。 多酚氧化酶是一种含铜的氧化酶，在一定的温度、pH条件下，有氧存在时，能使催化邻苯二酚氧化生成有色物质，单位时间内有色物质在410nm处的吸光度与酶活性强弱成正相关，在分光光度计410nm处使反应体系的OD值产生变化，通过OD值的变化确定PPO的酶活大小。 多酚氧化酶 邻苯二酚（儿茶酚）＋1∕2O 2——————→邻醌＋H 2 O
三、试验材料、试剂及试验用品 1．材料：马铃薯块茎。 2．仪器：分光光度计；离心机；恒温水浴；研钵；试管；移液管；容量瓶 3．试剂：L 磷酸缓冲液（pH=）；L邻苯二酚；L磷酸氢二钠；L磷酸二氢钠；10mmol/L 柠檬酸；10mmol/L抗坏血酸；10mmol/L乙二胺四乙酸二钠（EDTA）；10mmol/L亚硫酸钠 四、实验方法： 1.多酚氧化酶的提取 取马铃薯块茎样品，加入预冷的磷酸缓冲液（）3ml，研磨匀浆，转移到离心管中，再用7mL磷酸缓冲液冲洗研钵，合并提取液，在４℃下离心（8000r/min）5min，取上清液为多酚氧化酶提取液，并量取粗酶液体积。 2.多酚氧化酶活性测定 采用比色法测定。将ｍl邻苯二酚加入2ｍl磷酸缓冲液（ｐＨ）中，加入ｍl酶提取液，立即于波长410nm下测定吸光值，2min后再计吸光值，以不加酶提取液的反应液做对照(注意空白为： ml缓冲液和 mL邻苯二酚溶液)。以每分钟吸光度变化为1个多酚氧化酶活性单位。 表1 多酚氧化酶活性测定
多酚氧化酶(polyphenol oxidase,PPO)试剂盒说明书
货号：MS1404 规格：100管/48样多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）试剂盒说明书 微量法 正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定 测定意义： PPO（EC1.10.3.1）主要存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，是一种含铜的氧化酶，能使一元酚和二元酚氧化产生醌，从而引起褐化，与果蔬加工、茶叶品质和组培等密切相关。 测定原理： PPO能够催化邻苯二酚产生醌，后者在525nm有特征光吸收。 自备实验用品及仪器： 可见分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵、冰和蒸馏水。 试剂组成和配制： 提取液：100mL×1瓶，4℃保存； 试剂一：20mL×1瓶，4℃保存； 试剂二：5mL×1瓶，4℃保存； 粗酶液提取： 1、细菌、细胞或组织样品的制备： 细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。 组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。 2、血清（浆）或果汁样本的处理： 按照血清（浆）或果汁体积（mL）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议取0.1mL血清（浆）或果汁加入1mL提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。 测定步骤： 1、分光光度计或酶标仪预热30min以上，调节波长至525nm，蒸馏水调零。 10000g， 第1页，共3页
植物多酚
植物多酚的分类及生物活性的研究进展随着生活质量的提高，各种现代慢性疾病（包括心血管疾病、癌症、老年痴呆症等）的发病率不断上升。医学研究者发现，植物多酚对此类病症有良好治疗和预防效果，因此，植物多酚的研究引起全球极大的关注。目前研究较多的有茶多酚、葡萄多酚、苹果多酚、石榴多酚等。植物多酚是指来源于莽草酸途径和苯丙氨酸代谢途径的化合物，它具有芳环结构并结合有1个或多个羟基。植物多酚又称植物单宇，是植物体内重要的次生代谢产物，可以抵御紫外线的辐射和病原体的侵染，主要存在于植物体果实、皮、根和叶中。 1 植物多酚分类 人们最初研究的植物多酚是单宁。1920年K·Frendenberg按照单宁的化学结构特征，将单宁分为水解单宁和缩合单宁两大类，这类方法得到公认并一直沿用至今。按照多酚来源的不同，也有人将其分为茶多酚、葡萄多酚、苹果多酚、石榴多酚等。此外，按照酚环的数量以及其他环结合的结合元素的作用不同分成酚酸、类黄酮、木聚素和木酚素等，还有人将植物多酚按照其化学结构中碳原子的骨架结构进行分类，这种分类方法一目了然，使人很容易掌握植物多酚的结构。 植物多酚的主要类别见表1。
表1 植物多酚的主要类别 2植物多酚生物活性 多酚是重要的风味物质和呈色物质，广泛存在于药用植物中，可调节大部分酶和细胞接收器的活性，对癌症、心血管疾病和神经组织退化具有积极的治疗和预防作用。 2.1抗氧化合清除自由基作用 随着自由基生物学和医学研究的日趋深入和发展，研究者通过动物模型验证了植物多酚具有较强的抗氧化能力，其抗氧化性体现在：①通过还原反应降低环境中的氧含量；②作为氢供体释放出氢与环境中的自由基结合，中止自由基引发的连锁反应，从而阻止氧化过程的继续进行。同时，植物多酚能有效清除体内过剩的自由基，抑制脂质过氧化，对自由基诱发的生物大分子损伤起到保护作用，减缓人体组织器官的衰老。 2.2抑菌消炎、抗病毒作用 多酚对多种细菌、真菌、酵母菌均有明显的抑制能力，且在相应的抑制浓度下不影响动物的生长。苹果多酚可有效地防止由大肠杆菌和金黄色葡萄球菌等引起的食物中毒和其他疾病，其抑制金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的临界生长用药质量浓度分别为